专利名称：Ev71早期诊断方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于分子免疫学领域，特别涉及一种肠道病毒的诊断方法及试剂盒。
背景技术：
手足口病(Hand-Foot-Mouth disease, HFMD)又名发疹性水疱口腔炎，是由肠道病毒引起的全球性常见传染病。病毒学和流行病学的研究证实人肠道病毒71型 (Entrovirus 71，EV71)是近年来爆发的人手足口病的主要病原体。EV71病毒属于小RNA 病毒科，病毒颗粒为典型的正二十面体结构，其基因组为单股正链RNA，长度约为7，408个核苷酸。该病毒具有很强的感染性和传染性，除手足口病外，其还能引起无菌性脑膜炎 (aseptic meningitis)、脑干脑炎(brain stem encephalitis)等多禾中神经系统疾病。目前已经发展并使用的诊断方法包括1.RT-PCR检查病毒。能及时检查带毒者，当痊愈后，显阴性。但受到仪器设备、样品收集处理、实验场地等条件的限制，易产生较多的假阴性和假阳性而导致漏诊或误诊。2.通过临床症状综合评价诊断。这种方法在疾病的早期，因症状不典型，而无法准确诊断。在疾病的晚期，虽然可以准确诊断，但延误了对疾病的治疗。3.血清免疫检查病毒抗体(荧光免疫法或ELISA)。抗体产生需要在发病后至少 14天，因此，这种方法不能做早期诊断。但是从免疫学角度来说，机体产生病原体特异性抗体IgM较早，选择合适的抗原与之结合也可以用作诊断参考。目前正在使用的大多数是前三种方法，这些方法在临床使用过程中，不能简便、快速、准确的判断与区分患者与疑似病例。4.抗原检测(ELISA)。通过制备病原体特异性的抗体(单抗与多抗)检测病人血液或组织中病原体，该方法准确率高，操作简便，适合临床推广。但目前缺少病原体的特异性抗体。因此，本领域迫切需要开发新的更加有效的早期诊断EV71的方法和试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速、简便、准确率高的EV71检测方法和试剂盒。本发明的第一方面，提供一种源自EV71病毒的重组蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID N0:l、2、3、4、5、6、7、8或9。这些EV71特异性重组蛋白可特异性地与抗EV71病毒的抗体结
口 O本发明的第二方面，提供了一种抗体，所述抗体特异性地与本发明的EV71特异性
重组蛋白结合。在一优选例中，所述的抗体为单克隆抗体。本发明的第三方面，提供了一种检测试剂盒，它含有本发明的EV71特异性重组蛋白、抗本发明重组蛋白的抗体、或其组合。本发明的第四方面，提供了一种本发明的EV71特异性重组蛋白用于制备体外检测样品中是否存在抗EV71病毒抗体的试剂盒的用途。在一优选例中，所述样品为血清或血浆。本发明的第五方面，提供了一种抗本发明重组蛋白的抗体用于制备体外检测样品中是否存在EV71病毒的试剂盒的用途。在一优选例中，所述抗体为单克隆抗体。在另一优选例中，所述样品为血清、血浆或病毒培养上清。
图1本发明的重组蛋白的电泳图。图中箭头所示为目标蛋白，分子量marker从下往上分别是:14. 4,18. 4、25、35、45、66. 2、116kDa图2本发明的试剂盒对EV71病毒的特异性检测图3本发明的试剂盒对Vpl的灵敏度检测图4本发明的试剂盒对EV71病毒的定量检测图5试剂盒抗体组合配对的灵敏度和线性范围选择实验
具体实施例方式本发明人基于自身多年对全国不同疫区的EV71病毒的研究，结合最近与以往的文献资料，对不同EV71毒株的基因和蛋白序列进行了分析，确定所需表达的基因序列，然后采用不同的表达系统表达选定的基因序列并纯化重组蛋白(即潜在抗原靶位)，再由这些重组蛋白免疫获得抗体，研制出一种通过检测EV71病毒或抗EV71病毒抗体，进行临床早期EV71诊断的酶联免疫方法和试剂盒。本发明可显著提高诊断效率，并且简便、准确率高。已有的研究表明病毒在人体内十天左右达到复制高峰，而EV71_IgM抗体在发病 10-14天时出现并很快达到高峰，60天时约有1/3的患者仍可检测到IgM抗体，大部分患者中该抗体基本消失。IgG抗体亦可在10-14天时检测到，60天时达到高峰，90天时仍维持在高水平。所以采用抗体检测病原体可以在病人感染后最短时间内做出有效诊断采用IgM 检测可以在感染后一个星期左右做出诊断；而检测病人体内IgG则最不理想。研究证实EV71基因组编码的多聚蛋白(polyprotein)约含2，193个氨基酸，该多聚蛋白在合成的同时，不断被由其自身水解产生的蛋白酶所切割，进一步水解为P1、P2 和P3三个前体蛋白。Pl前体蛋白可降解为￥ 1、￥ 2、￥ 3和乂 4四个病毒外壳蛋白，P2和 P3前体蛋白编码7个非结构蛋白。VPl蛋白是EV71病毒主要的中和抗原决定簇，其编码基因具有与病毒血清型完全对应的遗传多样性，不仅可作为肠道病毒属内不同血清型分类的依据，也是EV71基因分型和遗传进化分析的最重要目标。因此，本发明人选择EV71的VPl蛋白作为抗原靶位的主要研究对象。在确定靶蛋白后，本发明人综合利用各种生物信息数据库及生物信息学软件对不同病毒株的VPl基因及其编码蛋白的结构和功能特性、抗原表位等进行分析，综合考虑氨基酸序列的亲水性 (高亲水性)和多级结构(多为α-螺旋，β-折叠)，优先考察那些存在于膜表面部分， 剔除包含在膜内的部分，进而从VPl蛋白的氨基酸序列中筛选出了以下多个潜在抗原位点 (表 1)。如本文所用“本发明重组蛋白”或“EV71特异性重组蛋白”指氨基酸序列如表1所示的重组蛋白。本发明重组蛋白可用本领域的常规方法进行表达和分离纯化。在本发明重组蛋白的表达过程中采用了不同的表达系统，以使制备的抗原具备更加天然的成分，以保证制备抗体的特异性。本发明重组蛋白可以直接用于检测抗EV71的抗体，也可用于与BSA等分子量的蛋白偶联，从而形成蛋白偶联物。通常，所述的偶联物由多肽、交联剂、和BSA构成，其中所述的交联剂优选戊二醒(当与本发明多肽的N-端偶联时)、EDAC(当与本发明多肽的C-端偶联时)。本发明的重组蛋白及其偶联物可用于免疫兔、鼠等动物，从而获得抗本发明重组蛋白的抗体(“本发明抗体”)。本发明抗体包括特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里“特异性”是指抗体能结合于EV71病毒、基因产物或片段。本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段。(如Fab'或(Fab)2片段)、抗体重链、抗体轻链、嵌合抗体、人源化抗体等。本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的本发明重组蛋白或偶联物，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。对于单克隆抗体，可利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256 ；495，1975 ；Kohler等人，Eur. J. Immunol. 6 :511,1976 ；Kohler 等人，Eur. J. Immunol. 6 :292,1976 ；Hammer ling 等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas, Elsevier, N. Y. , 1981)。本发明的重组蛋白、偶联物和抗体都可用检测样品中是否存在EV71病毒或抗 EV71病毒抗体，从而作为早期检测EV71的有效指标之一。除了用于检测，本发明的EV71特异性重组蛋白还可在体内与病毒竞争受体，阻止病毒与膜融合，抑制病毒感染正常细胞。此外，本发明的重组蛋白和偶联物还可用于制各治疗性的药物组合物或预防性的疫苗组合物。因此，另一方面，本发明还提供了一种组合物，它含有(a)安全有效量的本发明重组蛋白、偶联物或其组合物以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐剂、及其组合。本发明的组合物可通过常规方法进行制备。以本发明重组蛋白计，其用量例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的重组蛋白还可与其他治疗剂一起使用。本发明的主要优点在于(a)因为本发明的EV71特异性重组蛋白、多肽偶联物与抗EV71病毒抗体的亲和力高，本发明抗体与EV71病毒的亲和力高，因此，本发明的检测方法灵敏、简便、准确率高。(b)本发明的EV71特异性重组蛋白还可在体内与病毒竞争受体，阻止病毒与膜融合，抑制病毒感染正常细胞，所以本发明具有很高的临床应用价值。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook 等人，分子克隆实验室手册(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1
重组蛋白抗原的表达和纯化分离将克隆的基因序列用pET28a载体进行表达，并按照GE的HisTrap FF纯化程序进行纯化，目标蛋白的分子量约为35kDa。本发明表达、纯化和分离出的目标蛋白(图1)如表1所示。表1 本发明重组蛋白的氨基酸序列
权利要求
1.一种重组蛋白，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8或9。
2.一种抗体，其特征在于，所述抗体特异性地与权利要求1的重组蛋白结合。
3.权利要求3的抗体，其特征在于，所述抗体为单克隆抗体。
4.一种检测试剂盒，其特征在于，它含有权利要求1的重组蛋白、权利要求2的抗体、或其组合。
5.权利要求1的重组蛋白用于制备体外检测样品中是否存在抗EV71病毒抗体的试剂品.ο
6.权利要求5的用途，其特征在于，所述样品为血清或血浆
7.权利要求2的抗体用于制备体外检测样品中是否存在EV71病毒的试剂盒。
8.权利要求7的用途，其特征在于，所述抗体为单克隆抗体。
9.权利要求7的用途，其特征在于，所述样品为血清、血浆或病毒培养上清。
全文摘要
本发明涉及EV71的早期诊断方法及试剂盒。具体地，本发明使用源自EV71病毒的重组蛋白作为抗原，以及该重组蛋白免疫动物后产生的抗体(单抗、多抗)，结合酶联免疫和其他方法检测人血清样品中的早期抗EV71抗体IgM或IgG，或直接检测血清样品中EV71病原体。
文档编号C07K7/08GK102351947SQ201110314429
公开日2012年2月15日 申请日期2011年10月17日 优先权日2011年10月17日
发明者周敏, 张涛, 王华林, 王志英, 胡志红, 苏正元 申请人:湖北新纵科病毒疾病工程技术有限公司