专利名称：一种含有医用水蛭素基因的重组真核汉逊酵母工程菌株的构建及重组水蛭素的生产工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种胞外型蛋白表达基因的真核汉逊酵母工程菌的构建，更具体地说，涉及一种含有水蛭素基因的工程菌株及其构建、生产水蛭素的方法。
背景技术：
水蛭在我国中医已有几千年的使用历史，是一种不可缺少的活血中药。水蛭素是水蛭唾液腺分泌的具有强抗凝活性的小分子蛋白质，主要为一种含65个氨基酸的多肽，分子量在7000左右，含3个二硫键，已分离鉴定7种异构体。水蛭素因为具有与凝血酶极强的亲和力，在很低的浓度下就能中和凝血酶，起到抗凝作用，可广泛应用于器官移植等手术。 水蛭素具有的溶纤作用使其具有较强的溶栓作用，能够抑制各种动物实验中的DIC(弥漫性血管内凝血)的形成。通过家兔试验证实水蛭素对预防和治疗动脉粥样硬化具有潜在的应用价值。此外水蛭素对促进脑血肿吸收，减轻周围脑组织炎症反应及水肿，缓解颅内压增高，并改善出血水肿局部血液循环，保护脑组织免遭破坏以及抑制肿瘤细胞的生长都有显著作用。利用基因工程技术获得有重要生物学活性的蛋白质是现代生物技术的重要目标。 在实现体外表达蛋白质的过程中，努力提高表达量的同时，最大限度地保持产物的空间结构和生物学活性与天然蛋白一致是很重要的。酵母表达系统是研究真核蛋白质表达和分析的有力工具，拥有转录后加工修饰功能，适合于稳定表达具有一定功能的外源蛋白质。具有表达系统操作简便，成本低廉，可大规模进行发酵等优点，是最理想的重组真核蛋白质生产制备用工具。中国专利申请“一种重组水蛭素编码基因与应用”(申请号2008101031M. 8， 申请日2008年3月31日，
公开日2008年8月27日)公开了一种利用多形汉逊酵母进行水蛭素的生产，但是其外源蛋白的表达量和分泌效率较低，且会产生过度糖基化现象，因而在适应于大规模发酵生产方面存在严重不足。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种含有医用水蛭素基因的重组真核汉逊酵母工程菌株及其构建方法。本发明的目的还在于提供一种利用上述重组工程菌株生产水蛭素的生产方法。本发明的技术目的通过下述技术方案予以实现本发明提供的一种重组医用水蛭素编码基因，其序列是序列表中SEQ ID No. 1所述的核苷酸序列；其编码的多肽，其特征是具有序列表中SEQ ID No. 2所述的氨基酸序列。本发明提供一种重组水蛭素编码基因的重组表达载体，其为如附图2所示的表达载体 PMPiTaRBHV。本专利提供的一种水蛭素真核汉逊酵母工程菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No. 5227，保藏日期为2011年9月7日，分类命名为异常毕赤酵母Pichia anomala。细胞为球形和伸长的球形(1. 5-4. 6) X (1. 9-5. 3) μ m,以单个、成对或成群的方式出现。生长的菌落为奶油样tarmish白。在同化培养基表面生长偶而产生非常薄的膜。在生态琼脂Dalmau板25°C培养七天后在盖玻片下可探测出菌丝和假菌丝。所述水蛭素真核汉逊酵母工程菌的出发菌株为汉逊多型宿主细胞株RB-Il (直接购自德国莱茵生物公司)。RB-Il细胞株为LR9细胞株的改良衍生株(Roggenkamp. R et al. ，1986 Transformation of the methylotrophic yeast Hanseunla polymorphs by autonomous replication and integration vectors, Mol. Gen Genet 202 :302-308)。 RB-Il细胞株为5'-乳清酸核苷磷酸脱羧酶缺陷型突变株，已被广泛应用与工业重组菌的构建。所述重组表达载体导入汉逊多型宿主细胞株(如RB-11)中可获得含有重组水蛭素编码基因的重组菌，其外源蛋白表达为[iieSThi^-es位脱硫基水蛭素。本发明公开了水蛭素真核汉逊酵母工程菌的构建方法，按照下述步骤进行(1)构建含有重组水蛭素基因及酿酒酵母信号肽基因序列的穿梭质粒pUCaRBHV ；(2)构建含有目的基因序列的表达载体pMPTaRBHV ；(3)将步骤(2)的表达载体pMPTaRBHV用完整细胞转化法转化汉逊酵母菌，经筛选获得含有水蛭素的汉逊酵母高表达工程菌株。其中所述汉逊酵母菌优选为汉逊酵母菌(Hansenula)RB-ll。RB-Il直接购自德国莱茵生物公司)。RB-Il细胞株为LR9细胞株的改良衍生株(Roggenkamp. Ret al. ，1986Transformation of the methylotrophic yeast Hanseunla polymorphs by autonomous replication and integration vectors, Mol. Gen Genet 202:302-308)。 RB-Il细胞株为5'-乳清酸核苷磷酸脱羧酶缺陷型突变株，已被广泛应用与工业重组菌的构建。所述含有水蛭素的汉逊酵母高表达工程菌株编号为RBHV145-6，已于2011年 9月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏号为 CGMCCNo. 5227。本发明还提供一种利用工程菌株进行医用水蛭素生产的方法，按照下述步骤进行(1)利用含有水蛭素的汉逊酵母高表达工程菌株RBHV145-6进行培养，选出高品质亚克隆细胞株，对菌株进行遗传性的全面鉴定，制成原始菌株；(2)将部分原始菌株进行培养后冷冻保藏，作为日后生产使用的细胞种子库；(3)将步骤( 冷冻保藏的生产使用的菌株在转速为IOOrpm的条件下，37°C培养预发酵40h，然后将预发酵的发酵液接种到装有7. 5L培养基的10L发酵罐中，设定pH为 4 士 0. 2，转速为500rpm，换气量为10L/min，温度为30°C ；(4)以甘油单碳源来控制生长分泌在发酵开始的20 30h内，酵母生长的OD6tltlnm 值达到40左右，氧分压下降到不到10% ；接下来一直到发酵结束的过程中，pH为4士0.3， 转速和换气量分别为700rpm和15L/min，设定氧分压为40 %左右，根据发酵过程中氧分压的变化进行补料；(5)待发酵结束后，采用扩张柱床阳离子交换层析和反相层析的方法进行产品的分离和纯化。所述步骤(4)中，接下来一直到发酵结束的过程为去阻遏过程，用时约为 110-115h，最佳为 112h。利用本发明的技术方案进行生产和纯化后，用Angilent 1100型高效液相检测其水蛭素的含量达到1. 5g/L。用Angilent 1100型高效液相及C8柱检测分离出来的产品，大部分是由65个氨基酸组成的水蛭素，其含量占整个蛋白含量的95%，这一步水蛭素总的收率为68%。由反相层析出来的中间品经冻干浓缩后，很好的保持了重组水蛭素的比活性，重复生产十余批，比活性均保持在18，000ATU/mg以上。经对多批中试产品全面自检，DNA重复测序证实65个氨基酸序列正确，氨基酸测序证实N-末端15个aa序列正确。质谱分析显示分子量为7000Da左右，且几批中试产品肽图分析基本一致。ELSA测量几批中试品德残余宿主蛋白小于0. 1% ；残余DNA小于10ng/20mgo本发明通过基因克隆，构建了含有医用水蛭素基因的真核汉逊酵母工程菌，将其编号定为RBHV145-6。与国内同类型菌株相比，具有以下优点(1)含有水蛭素基因的外源基因表达盒完全整合到宿主细胞染色体上，种子库细胞、传代40、80代后的细胞中均无游离质粒存在。(2)水蛭素基因以多拷贝的形式拷贝到宿主细胞的染色体上，且拷贝数保持稳定， 在现行的冻存、复苏条件下，种子细胞株至少稳定十年以上。(3)水蛭素基因整合到汉逊酵母染色体后在有丝分裂中保持稳定，在发酵前后在宿主细胞内也保持稳定。(4)外源蛋白的表达量和分泌效率比酿酒酵母高10倍，特别和国内的多型汉逊酵母相比水蛭素外源蛋白的表达量高35. 8%，且没有过度糖基化现象，因此适合于大规模发酵生产目的蛋白。
图1穿梭质粒pUC19的物理图谱图2表达载体pMPTaRBHV的构建示意3有丝分裂电泳结果图4发酵前后外源蛋白基因电泳结果图5本发明水蛭素外源蛋白表达量的高效液相图谱图6现有技术中水蛭素外源蛋白表达量的高效液相图谱本发明涉及的生物材料的保藏日期为2011年9月7日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC)，保藏号为CGMCC No. 5227。具体实施方法下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。首先，构建含有水蛭素基因的真核汉逊酵母工程菌利用全人工合成方法合成序列表中序列1 (SEQ ID No. 1)所示的DNA序列。其中序列1的自5'末端第7-261位序列编码酿酒酵母α信号肽；序列1的自5'末端第262-459 位序列编码水蛭素基因的编码序列，编码序列表中SEQ ID No. 2的蛋白。DNA用EcoRI和 BamHI酶不完全消化，经琼脂糖凝胶电泳后回收，在T4-DNA连接酶的作用下与同样经双酶切的载体pUC19(图1)连接(《分子克隆实验室指南》，2002[美]J.萨姆布鲁克著)，得到含有重组水蛭素基因及酿酒酵母信号肽基因序列的载体pUCaRBHV。用EcoRI和BamHI酶切载体pUCaRBHV，低熔点琼脂糖凝胶电泳回收片段，在 T4-DNA连接酶的作用下与同样经双酶切的质粒pMPT121连接(《分子克隆实验室指南》， 2002 [美]J.萨姆布鲁克著)，构建成含有水蛭素表达盒的表达载体pMPTaRBHV (如图2)，如图所示，其中含有水蛭素基因的片段为MFa-RBHV。其次，建立转化细胞株水蛭素表达载体pMPhRBHV转化大肠杆菌E. Coli HBlOl细胞株，并传代扩增，运用标准程序分离纯化扩增的质粒DNA(《分子克隆实验室指南》，2002 [美]J.萨姆布鲁克著)。再利用扩增的质粒转化汉逊多型宿主细胞株RB-Il (直接购自德国莱茵生物公司)。 RB-Il 细胞株为 LR9 细胞株的改良衍生株(Roggenkamp. Ret al.，1986 Transformation of the methylotrophic yeast Hanseunla polymorpha by autonomous replication and integration vectors, Mol. Gen Genet 202 :302-308)。RB-11 细胞株为 5'-乳清酸核苷磷酸脱羧酶缺陷型突变株，已被广泛应用与工业重组菌的构建。转化细胞株的建立按以下步骤进行(1)配制培养基、转化液(均为水溶液)转化液A :lmol/L 山梨醇；10mmol/L N, N- 二羟乙基甘氨酸 pH 为 8. 35 ；3% (ν/ν)乙二醇B 40% (v/v)PEG1000 ；200mmol/L N, N- 二羟乙基甘氨酸 pH 为 8. 35C :15(toimol/L 氯化钠；10mmol/L N, N- 二羟乙基甘氨酸 pH 为 8. 35培养基ΥΝΒ-0. 14% (w/v)酵母氮源；0. 5% (w/v)硫酸铵；用氢氧化钠溶液调pH至7. 0YPD-2% (w/v)蛋白胨 190 (w/v)酵母提取物；2% (w/v)葡萄糖(2)制备感受态细胞RB-Il宿主细胞经37°C摇床(140rpm)培养至最佳光密度(OD6tltlnm)为0. 8士0. 1后， 转移至离心管IOOOg室温离心5min后，细胞颗粒由转化液A清洗后再离心，重悬于转化液 A中(重选后的浓度为初始浓度的50倍)，承装于2ml小管中，在-70°C中保存至少lh。(3)转化将感受态细胞从_70°C转移至冰盒，在每管冻结细胞中迅速加入IOyg质粒DNA (pMPTaRBHV)。经37°C剧烈振摇5min后，加入Iml转化液B，混勻后在37°C中孵化lh。孵化完成后在室温下200g离心5min得到的细胞沉淀，重悬于Iml转化液C。再次离心后重悬于0.2ml转化液C。转化细胞用YNB选择培养基(含0. 2%葡萄糖；1. 8%琼脂)铺平皿。 37°C孵化4-5天后将生长出的单个汉逊多型转化克隆再接种于;3mlYNB(含2%葡萄糖)液体培养基中。第三，转化细胞的选择单个汉逊多型转化克隆个体在YNB培养基中37°C震摇孵化2天(OD6tltlnm 7 9)， 随后以此培养基中的汉逊酵母为起始，连续接种和培养8次(相当于80个遗传世代)。经过如此选择传代培养后，水蛭素表达载体全部以多倍体的形式整合于宿主细胞的染色体中。在传代期间，表达载体自发地主要以线性多聚体的形式整合于细胞的染色体中。在传代结束时，大多数表达载体分子是整合于染色体中，只有少数仍以游离质粒的形式存在于细胞中。在选择培养基生长以后，接着转入非选择培养基YPD传代生长20至30个遗传世代，在此期间，细胞将丢失掉非整合表达载体。单克隆个体转化细胞株接种于YNB (含1 %甘油)培养基中，37°C孵化2天后，室温下IOOOg离心;3min。使用凝血酶抑制剂法检测离心上清液中水蛭素的表达量。将筛选出来的水蛭素表达量最高的克隆细胞株命名为RBHV145-6，重悬于YPD (含17%甘油)培养基中，保存于_70°C。第四，外源蛋白基因的稳定性测试使用BIOER Little Genius PCR 仪扩增表达载体 pMPI^aRBHV 中的 MFa-RBHV 基因， 片段长约^Obp,扩增宿主细胞RB-Il中的MOX基因，片段长约2070bp。取1 μ 1约5ng上述DNA为模板，分别扩增表达载体pMPTaRBHV、宿主细胞RB-11、生产种子、40代传代细胞和 80代传代细胞。PCR扩增产物用0.7%琼脂糖电泳观察，得到结果如下。(1)经PCR检测，水蛭素外源基因拷贝数达到190 200个，此尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母基因工程宿主菌汉逊酵母菌RBHV145-6于2011年9月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No. 5227。(2)外源基因整合后在有丝分裂中的稳定性将生产种子、40代传代细胞、80代传代细胞的PCR产物系列稀释电泳观察，根据电泳条带亮度可知生产种子库细胞经过40代、 80代传代培养，外源基因表达盒子整合到宿主基因组上保持稳定，外源基因拷贝数保持不变，有丝分裂的稳定性大于80个遗传代，如图3。如图3所示，各电泳条带从左至右分别为分子量标记、宿主细胞RB-Il、表达载体pMPTaRBHV、生产种子、生产种子1 8稀释、生产种子1 64稀释、40代传代细胞、40代传代细胞1 8稀释、40代传代细胞1 64稀释、80 代传代细胞、80代传代细胞1 8稀释、和80代传代细胞1 64稀释。(3)发酵前后外源基因在宿主细胞中的稳定性将生产种子细胞和发酵前后的细胞电泳观察，根据电泳条带亮度可知发酵前后外源基因拷贝数不变，保持稳定，如图4，图中各个电泳条带与图3所示相同。(4)外源蛋白的表达量与酿酒酵母相比，外源蛋白的表达量高十倍以上，和多型汉逊酵母表达量最有可比性，多型汉逊酵母水蛭素表达量为69. 36μ g/ml，本发明的水蛭素表达量为80. 61 μ g/ml。与多型汉逊酵母相比，本发明的外源蛋白表达量提高了 35. 8%，如图5中的A峰和图6中的B峰。最后，进行重组水蛭素的生产工艺及纯化利用汉逊酵母表达系统来表达重组水蛭素，具有以下特点(1)拷贝数达到190 200个，可确保工程菌发酵生产和种子批的稳定性。(2)发酵过程中不产生乙醇，粘度小，细胞高密度繁殖，每升发酵液的细胞干重达经计算达到60g。(3)发酵上清液中蛋白表达量达1. 9g/L，发酵液最终可得到水蛭素纯度大于98% 的发酵液，其表达量为0. 6g/L，最终得到纯度达到95%的外用水蛭素0. 3g/L。(4)发酵过程均用化学合成的培养基，不需用蛋白胨和酵母粉等营养成分，发酵、 原材料容易实现国产化，生产成本低。
一、建立生产种子细胞库细胞株RBHV145-6经培养后选出高品质亚克隆细胞株，对菌株进行遗传性的全面鉴定，制成原始菌株，冻存于_70°C的冰箱中取_70°C冻存的原始菌株一管经室温解冻后，加入200ml YNB培养基进行预培养， 至0D6QQnm为6士 1左右时，接种到2L含YPD培养基的三角瓶中，pH为5. 5，30°C培养1 后细胞密度OD6tltlnm达到17.6。收取上述细胞液加入100%甘油至甘油终浓度为50%，分装于冻存管中(冻存200 管，每管2. Oml)，冷却冻存于_70°C的冰箱中，作为日后生产用的细胞种子库。二、发酵从-70°C冰箱中取4管生产菌种，分别接种于两个分装有500ml培养基的细颈瓶中 (瓶子用胶塞和铝箔封口)，在转速为IOOrpm的条件下，37°C培养预发酵40h。将预发酵的发酵液接种到装有7. 5L培养基的IOL发酵罐中，设定pH为4士0. 2，转速为500rpm，换气量为lOL/min，温度为30°C。以甘油单碳源来控制其生长分泌。在发酵开始的20 30h内，酵母生长的OD6tltlnm值达到40左右，这是一个阻遏过程，此阶段消耗了大量的甘油，氧分压下降到不到10%。接下来一直到发酵结束(112h)为去阻遏过程，pH为4士0. 3，转速和换气量分别为 700rpm和15L/min。设定氧分压为40%左右，当发酵过程中氧分压超过这个值时开始补料， 随着料的补进氧分压又开始下降，当下降到一定值时，随着补进料的耗尽，这样反复进行着氧分压上升、下降的过程。发酵结束后，用Angilent 1100型高效液相检测其水蛭素的含量达到1. 5g/L。三、扩张柱床阳离子交换层析汉逊酵母表达的水蛭素直接分泌到细胞培养基中，一般的工艺是先用离心或超滤的方法，去掉细胞，再进行下一步的离子交换层析。而在我们的工艺中，我们采用了瑞典法玛西亚的技术，利用扩张柱离子交换层析，把去掉细胞与离子交换层析合二为一，这不仅简化了工艺，而且减少了产品的丢失。扩张柱阳离子交换层析胶，颗粒较大，一定体积的胶在一定条件下其体积可以均勻地扩大，胶与胶之间的距离也随着变大，这时从柱底部加入已调到一定PH值和一定电导的细胞发酵液，细胞从胶与胶之间的空隙穿过，直接从柱上部排出，而带有正电荷的水蛭素被胶吸附，当发酵液加完后，加入上样缓冲液把残留的细胞完全冲出来，接着把扩张的胶压成扩张前的胶体积，并且用洗脱液从株上边向下洗脱，接受第一个峰，即为重组水蛭素产品。用C8柱检测其纯度达到65%以上，其收率达到70%以上。四、反相层析我们需要的水蛭素是由65个氨基酸组成，汉逊酵母表达的水蛭素主要由3种蛋白组成，分别含63个、65个和71个氨基酸，其中以65个氨基酸组成的蛋白为主。经过上一步的扩张柱床阳离子交换层析以后，由65个氨基酸组成的水蛭素其纯度达到65%以上，根据这种情况我们选用了反相层析的方法效果颇佳。我们所使用的是GE Healthcare生产的AKTA-explorer 100纯化系统，缓冲液A为 0.1 % TFA溶液、缓冲液B为40%异丙醇；0.1% TFA溶液。其梯度洗脱数据如下表所示时间(min)缓冲液B含量(％)0-300-3530-27035-65270-28565-100用Angilent 1100型高效液相及C8柱检测分离出来的产品，大部分是由65个氨基酸组成的水蛭素，其含量占整个蛋白含量的95%，这一步水蛭素总的收率为68%。最后对重组水蛭素性质进行测试由反相层析出来的中间品经冻干浓缩后，很好的保持了重组水蛭素的比活性，重复生产十余批，比活性均保持在18，000ATU/mg以上。经对多批中试产品全面自检，DNA重复测序证实65个氨基酸序列正确，氨基酸测序证实N-末端15个aa序列正确。质谱分析显示分子量为7000Da左右，且几批中试产品肽图分析基本一致。ELSA测量几批中试品德残余宿主蛋白小于0. 1% ；残余DNA小于10ng/20mgo委托大连医科大学药理室进行的药效学实验，应用大鼠电刺激颈总动脉血栓形成模型、Rayer’s下腔静脉结扎静脉血栓模型、家兔凝血时间参数(TT、PT和APTT)测定和家兔体外血栓形成模型分别就基因重组水蛭素对大鼠动脉血栓形成的抑制作用、大鼠静脉血栓形成的抑制作用、家兔血凝时间参数和家兔体外血栓形成时间进行研究。结果表明，受试重组水蛭素均具有显著的抗动脉血栓和静脉血栓形成的作用，且呈剂量依赖性。抑制静脉血栓形成所需剂量为12. 5 100 μ g/kg，远低于抑制动脉血栓形成所需剂量(0. 25 2. Omg/ kg)，两者差异达20倍左右，且抗静脉血栓作用强度约为肝素的4倍。对凝血时间参数TT 和APTT均有延长作用，且明显强于同剂量的肝素，以TT计强约20倍以上，以APTT计强约 2倍以上。对家兔体外血栓形成也具有明显的抑制作用。委托大连市药检所药理室进行了基因重组水蛭素在大鼠体内药代动力学研究， 应用ELISA法，使用3P97程序软件拟合，结果符合开放二室模型一级动力学过程，数据结果显示药物自中央室向外周室分布很快，血浆消除率也很快。各脏器的药物含量远低于血浆药物浓度，各组织含量随静脉给药后时间延长而下降，1小时后肾脏含量最高为 24. 39士39. 71ng/g，3 小时后肝脏含量最高为 7. 56士 11. 34ng/go委托辽宁药品新技术研究所进行了一般药理学实验、小鼠急性毒性实验、大鼠长期毒性试验和安全性试验。药理学实验结果显示基因重组水蛭素不同给药剂量对小鼠自主活动未见有明显的影响。在1小时内对猫的心率、血压、心电、呼吸的影响与给药前比较均未见明显改变。急性毒性实验结果表明小鼠重组水蛭素给药的最大剂量大于200mg · kg—1。 长期毒性试验内容为基因重组水蛭素以不同给药剂量对80只大鼠连续21天给药，停药后恢复2周，做组织学检查和血液生化学检查。结果表明基因重组水蛭素的毒性主要表现为脏器出血，主要出血脏器为肝、脑、肾、心脏，恢复2周后症状减轻，但未全部恢复；血液生化学指标结果显示对肝功能影响较大，但停药2周后恢复；2mg · kg—1剂量为无毒性剂量。以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。
权利要求
1.一种医用水蛭素编码基因，其特征在于，具有序列表中SEQ ID No. 1所述的核苷酸序列。
2.一种医用水蛭素基因编码的多肽，其特征在于，具有序列表中SEQ ID No. 2所述的氨基酸序列。
3.一种包含权利要求1所述基因的重组载体，其特征在于，将权利要求1所述基因加入到pMPT121质粒中，所述重组载体为pMPTaRBHV。
4.一种包含权利要求3所述重组载体的重组菌，其特征在于，所述重组菌的宿主菌为汉逊酵母菌RB-Il。
5.一种包含权利要求3所述重组载体的重组菌，其特征在于，所述重组菌的外源蛋白表达为[11411^=-63位脱硫基水蛭素。
6.一种水蛭素真核汉逊酵母工程菌，其特征在于，于2011年9月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No. 5227，分类命名为异常毕赤酵母Pichia anomala。
7.—种水蛭素真核汉逊酵母工程菌的构建方法，按照下述步骤进行(1)构建含有重组水蛭素基因及酿酒酵母信号肽基因序列的穿梭质粒PUCaRBHV；(2)构建含有目的基因序列的表达载体pMPTaRBHV；(3)将步骤( 的表达载体pMPTaRBHV用完整细胞转化法转化汉逊酵母菌，经筛选获得含有水蛭素的汉逊酵母高表达工程菌株；其中所述汉逊酵母菌优选为汉逊酵母菌(HansenuIa)RB-Il ；所述含有水蛭素的汉逊酵母高表达工程菌株编号为RBHV145-6，已于2011年9月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No. 5227，分类命名为异常毕赤酵母 Pichia anomala。
8.一种利用权利要求6所述的工程菌株进行医用水蛭素生产的方法，其特征在于，按照下述步骤进行(1)利用含有水蛭素的汉逊酵母高表达工程菌株RBHV145-6进行培养，选出高品质亚克隆细胞株，对菌株进行遗传性的全面鉴定，制成原始菌株；(2)将部分原始菌株进行培养后冷冻保藏，作为日后生产使用的细胞种子库；(3)将步骤( 冷冻保藏的生产使用的菌株在转速为IOOrpm的条件下，37°C培养预发酵40h，然后将预发酵的发酵液接种到装有7. 5L培养基的IOL发酵罐中，设定pH为4士0. 2， 转速为500rpm，换气量为lOL/min，温度为30°C ；(4)以甘油单碳源来控制生长分泌在发酵开始的20 30h内，酵母生长的OD6tltlnm值达到40左右，氧分压下降到不到10% ；接下来一直到发酵结束的过程中，pH为4士0.3，转速和换气量分别为700rpm和15L/min，设定氧分压为40%左右，根据发酵过程中氧分压的变化进行补料；(5)待发酵结束后，采用扩张柱床阳离子交换层析和反相层析的方法进行产品的分离和纯化。
9.根据权利要求8所述的医用水蛭素的生产方法，其特征在于，所述步骤中，接下来一直到发酵结束的过程为去阻遏过程，用时约为110-115h，最佳为112h。
全文摘要
本发明公开了一种含有医用水蛭素基因的重组真核汉逊酵母工程菌株的构建及重组水蛭素的生产工艺。其中采用汉逊多型宿主细胞株RB-11为出发菌株来构建适用于生产的含有水蛭素的汉逊酵母高表达工程菌株RBHV145-6，并通过培养、发酵来获得高纯度和高含量的水蛭素。在本发明中，水蛭素基因以多拷贝的形式拷贝到宿主细胞的染色体上，且拷贝数保持稳定，含有水蛭素基因的外源基因表达盒完全整合到宿主细胞染色体上，种子库细胞、传代40、80代后的细胞中均无游离质粒存在，外源蛋白的表达量和分泌效率比酿酒酵母高10倍，特别和国内的多型汉逊酵母相比水蛭素外源蛋白的表达量高35.8％，且没有过度糖基化现象，因此适合于大规模发酵生产目的蛋白。
文档编号C07K14/815GK102373216SQ20111033470
公开日2012年3月14日 申请日期2011年10月28日 优先权日2011年10月28日
发明者元昊, 杨力 申请人:元昊, 杨力