专利名称：一种朊蛋白抗体及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种朊蛋白抗体及其制备方法和应用。
背景技术：
朊病毒相关疾病(又称Prion疾病)是一组表现为散发性、家族性及传播性的中枢神经系统的慢性退行性疾病，为人兽共患的新型传染病。该疾病的主要特点是中枢神经细胞大量死亡、大脑空泡化以及伴随的星型胶质细胞增生等，这些病变导致运动障碍、痴呆，最终导致患病动物死亡。目前，动物的Prion疾病有多种，除羊痒病(Scrapie)外，还包括传染性水貂脑病(TME)，鹿慢性消耗性疾病(CWD)，牛海绵状脑病(BSE)及猫海绵状脑病(FSE);人的Prion疾病有克雅氏病(CJD)，库鲁病(KURU)和格斯特曼综合征(GSS)和家族致死性失眠症(FFI)等。绵羊和山羊的痒病是Prion病的原型，疯牛病就是通过污染了痒病病原的反刍动物肉骨粉而传播的。近年来越来越多的证据支持疯牛病是人类新变异型克雅氏病(rwCJD)的病因，引起了全世界对疯牛病的恐慌，各国政府均对该病给予高度重视，我国也已将其列为法定报告动物疾病。朊病毒疾病等对人类社会的卫生、经济和食品安全都存在着严重的威胁。异常折叠的PrPse具有部分抵抗蛋白酶K消化的能力，经蛋白酶K消化后，N端被降解而C端保留，从而形成一个分子量大于为27-30kDa的片段，而正常折叠的朊蛋白经蛋白酶K消化后则被完全降解。经典的朊病毒检测方法正是基于朊蛋白以上的生物化学性质，将待测样品经蛋白酶K消化后进行western blot检测，如果有27_30kDa的条带则判断为阳性，否则为阴性。该方法已经成为确诊一个动物个体是否有朊病毒感染的金标准。目前存在若干Prion疾病的防治手段，如敲除家畜的Prion基因，制备不产生朊蛋白的家畜，但是该方法费用昂贵，转基因克隆动物存活率低，不易推广。就Prion疾病得诊断方法而言，国际上普遍采用特异性抗PrP抗体介导的免疫学检测方法。朊蛋白类疾病的检测市场异常巨大，种类繁多(各种动物肉制品、动物肉骨粉饲料、动物以及人血液制品、甚至包括有些化妆品等)，每年光涉及疯牛病牛群的检测、进出口牛肉的检测样品至少有几百万甚至几千万份，现有技术获得的朊蛋白抗体无法满足大量的检测市场的需要。因此，本领域迫切需要建立快速、准确的诊断方法，且批量生产各类抗朊蛋白抗体，为Prion疾病的诊断与防治、切断感染源,减少Prion疾病的传播提供保证。
发明内容
本发明的目的是提供一种朊蛋白抗体。本发明的另一目的是提供一种制备所述抗体的方法。本发明的另一目的是提供所述抗体方法的应用。
在本发明的第一方面，提供了一种分离的、特异性与朊蛋白结合的抗体，所述的抗体具有以下特征
(a)由不表达朊蛋白的动物所产生的，并且特异性针对该种动物的朊蛋白；(b)所述抗体与所述动物的朊蛋白的结合效价大于10000 ；其中，所述动物为家畜。在另一优选例中，所述的抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、抗血清。在另一优选例中，所述的抗体的类型为IgG。在另一优选例中，所述抗体由不表达朊蛋白的羊产生且特异性针对羊的朊蛋白。在另一优选例中，所述抗体的效价大于12000。在另一优选例中，所述抗体的效价大于15000，较佳地，所述抗体的效价为16000-25000。在另一优选例中，所述抗体是通过包括以下步骤的方法制备的(I)提供不表达朊蛋白的动物，所述动物为家畜；(2)用朊蛋白作为抗原免疫步骤(I)所述的动物，使所述动物产生所述抗体；(3)收集含有所述抗体的动物血清，获得本发明第一方面所述的抗体。在本发明的第二方面，提供了本发明第一方面所述抗体的用途，所述抗体用于(i)检测待测样本是否感染朊蛋白或朊病毒；
(ii)制备检测待测样本是否感染朊蛋白或朊病毒的试剂。在本发明的第三方面，提供了一种制备本发明第一方面所述抗体的方法，包括步骤(I)提供不表达朊蛋白的动物，所述动物为家畜；(2)用朊蛋白作为抗原免疫步骤(I)所述的动物，使所述动物产生所述抗体；(3)收集含有所述抗体的动物血清，获得本发明第一方面所述的抗体。在另一优选例中，所述不表达朊蛋白的动物为朊蛋白基因敲除的动物、朊蛋白基因沉默的动物，或朊蛋白基因突变、朊蛋白基因缺失不表达朊蛋白的动物，或其组合。在另一优选例中，所述不表达朊蛋白的动物，其朊蛋白的阅读框被外源插入的新霉素序列破坏。在另一优选例中，所述朊蛋白基因敲除动物为朊蛋白双等位基因都缺失的转基因动物。在另一优选例中，所述的不表达朊蛋白的动物选自下组猪、牛、羊、猫、兔、鹿，较佳地为牛或羊，更佳地为羊。在另一优选例中，所述的朊蛋白为外源重组的动物朊蛋白。在另一优选例中，所述的朊蛋白为原核表达的重组动物朊蛋白，较佳地，为猪、牛、羊、兔的朊蛋白，更佳地，为羊朊蛋白。在另一优选例中，所述朊蛋白是通过包括以下步骤的方法制备的(A)以家畜基因组DNA为模板，体外扩增获得朊蛋白编码基因；(B)将家畜朊蛋白编码基因插入原核表达载体，构建重组表达质粒；(C)将所述质粒转化宿主菌；(D)在合适的条件下培养家畜朊蛋白编码基因转入成功的宿主菌；(E)分离纯化步骤(Vi)所述宿主菌的表达产物，获得目的朊蛋白。在另一优选例中，原核表达载体为pET22b。
在另一优选例中，原核宿主菌为大肠杆菌。在本发明的第四方面，提供了一种检测待测样本是否感染朊蛋白或朊病毒的方法，包括步骤(A)将本发明第一方面所述的抗体与待测样本接触，以便使得所述抗体与朊蛋白形成复合物；(B)检测待测样本中是否形成所述复合物。在另一优选例中，所述的复合物包括抗体与游离的或位于朊病毒上的朊蛋白所形成的复合物。在本发明的第五方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包括有效量本发明第一方面所述的抗体。在另一优选例中，所述的药物组合物还包括至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。 图1显示了羊朊蛋白基因扩增产物电泳结果，可见扩增出700bp的羊PrP条带，与预期相符。图2显示了重组质粒pET-22b-PrP的酶切鉴定结果，可见切出700bp大小的羊PrP
条带，与预期相符。图3显示了原核表达蛋白SDS-PAGE电泳结果。图4显示了纯化重组蛋白Western-blot印迹图。图5显示了羊朊蛋白多克隆抗体应用于羊脑中朊蛋白的检测Western-blot印迹结果。图6显示了羊朊蛋白多克隆抗体应用于鼠脑中朊蛋白及朊病毒检测Western-blot 印迹结果。
具体实施例方式本发明人经过广泛而深入的研究，意外地分析，使用朊蛋白免疫不表达朊蛋白的动物，可以制备得到一种高效价的朊蛋白抗体，具体地，所述抗体具有以下特征由不表达朊蛋白的动物所产生的，并且特异性针对该种动物的朊蛋白；所述抗体与所述动物的朊蛋白的结合效价大于10000 ;其中，所述动物为家畜。本发明还提供了制备所述抗体的方法及其应用。在此基础上完成了本发明。Prion 疾病Prion疾病的致病因子是一种具有传染性的蛋白质，又称之为朊病毒。人和非人哺乳动物中存在朊蛋白基因，该基因为单拷贝基因，其编码的蛋白质即为朊蛋白(PrPe)，朊蛋白的构象发生变化后，即转变成具有感染能力的致病性朊蛋白(PrPs%也称朊病毒)。朊病毒可引发动物和人产生传染性海绵状脑病，“protein-only”学说认为朊病毒在体内复制和增殖是单纯的蛋白质过程，不涉及DNA和RNA。这一学说通过基因敲除小鼠的模型得到了证实，敲除小鼠内源性的朊蛋白基因后，小鼠不表达内源性朊蛋白，而体内接种朊病毒后，小鼠不再发病。抗体本发明还提供了一种分离的、特异性与朊蛋白结合的抗体，所述的抗体具有以下特征(a)由不表达朊蛋白的动物所产生的，并且特异性针对该种动物的朊蛋白；(b)所述抗体与所述动物的朊蛋白的结合效价大于10000 ;其中，所述动物为家畜。如本文所用，术语“抗体”包括单克隆抗体、多克隆抗体和抗血清。在另一优选例中，所述的抗体的类型为IgG。抗体的效价大于12000，较佳地，所述抗体的效价大于15000，更佳地，所述抗体的效价为16000-25000。如本文所用，术语“特异性”是指本发明的抗体能结合于朊蛋白，较佳地，指那些能与朊蛋白结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的朊蛋白结合的抗体。本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备`(见Kohler等人，Nature 256 ；495,1975 ；Kohler等人，Eur. .1.1mmunol. 6 511,1976 ；Kohler 等人，Eur.1.1mmunol. 6 292,1976 ； Hammer I ing等人，In MonoclonalAntibodies and T Cell Hybridomas, Elsevier, N. Y. , 1981)。本发明的各类抗体可以利用朊蛋白的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。免疫免疫包括皮下注射、皮内注射、肌肉注射、静脉注射、腹腔注射以及淋巴结内注射等。抗原量少，一般多采用加佐剂，淋巴结内或淋巴结周围、或足掌、或皮内、皮下多点注射。如抗原量多，则可采用皮下、肌肉、以至静脉注射。带佐剂的皮内、皮下注射，一般为间隔2-4周免疫一次。不带佐剂的皮下或肌肉注射，一般为1-2周间隔时间；肌肉或静脉免疫的，可5天左右的间隔时间。可以把各种注射途径联合起来应用，最终以达到效价要求为目的。免疫动物供免疫用的动物主要是非人哺乳动物和禽类，常选择家兔、绵羊、羊、马、骡和豚鼠等。本领域技术人员选择动物，常根据抗体的用途和量来决定，也与抗原的性质有关。免疫用的动物最好选择适龄的健康雄性动物。由于对免疫应答的个别差异，免疫时应同时选用数只动物进行免疫。抗原的免疫剂量是依照给予动物的种类、免疫周期以及所要求的抗体特性等不同而不同。剂量过低，不能引起足够强的免疫刺激，免疫剂量过多，有可能引起免疫耐受。在一定的范围内，抗体的效价是随注射剂量的增加而增高。
免疫剂量与注射途径有关，一般而言，静脉注射剂量大于皮下注射，而皮下注射又比掌内和跖内皮下注射剂量大，也可采用淋巴结内注射法。加佐剂比不加佐剂的注射剂量要小，对家兔而言，采用弗氏完全佐剂，则需注射O. 5mg-lmg/kg. /次，如采用弗氏不完全佐剂则注射剂量应大10倍以上。如要制备高度特异性的抗血清，可选用低剂量抗原短程免疫法。如需要获得高效价的抗血清，宜采用大剂量长程免疫法。免疫周期长者，可少量多次。免疫佐剂如本文所用，术语“免疫佐剂”是指非特异性免疫增生剂，其本身不具抗原性，但同抗原一起或预先注射到机体内能增强免疫原性或改变免疫反应的类型。佐剂还可以改变抗原的物理性状，延缓抗原的降解和排除，延长抗原在体内的滞留时间，避免频繁注射从而更有效地刺激免疫系统。佐剂的类型目前常应用的佐剂有氢氧化铝胶、明矾、弗氏佐剂、脂质体和石蜡等，也有采用结合杆菌等分枝杆菌、白喉杆菌以及细小棒状杆菌等。较佳地佐剂包括弗氏不完全佐剂(incomplete Freund，s adjuvant, IFA) (2)弗氏完全佐剂(complete Freund，sadjuvant, CFA) ； (3)脂质体是人工制备的类脂质的小球体，由一个或多个酷似细胞膜的类脂双分子层组成，这种结构使其能够携带各种亲水的、疏水的和两性物质，他们被包裹在脂质体内部的水相中，或插入类脂双分子层或吸附、联接在脂质体的表面，起到明显的免疫增强作用；(4)油佐剂采用植物油和矿物油均可，包括豆油、花生油、油菜油等。乳化作用将抗原与佐剂混合的过程称为乳化，乳化的方法很多，可采用研钵乳化；可直接在旋涡振荡器上乳化；可用组织捣碎器乳化。少量时，特别是弗氏佐剂与抗原乳化时，常采用注射器乳化，用两个注射器，一个吸入抗原液，一个吸入佐剂，两注射器头以胶管连接，注意一定扎紧，然后来回抽吸。当大量乳化时，可采用胶体磨进行。乳化好的标志是取一滴乳化剂滴入水中呈现球形而不分散。如出现平展扩散即为未乳化好。抗体鉴定 抗体的效价鉴定不管是用于诊断还是用于治疗，制备抗体都要求较高效价。不同的抗原制备的抗体，要求的效价不一。鉴定效价的方法很多，包括有试管凝集反应、琼脂扩散试验、酶联免疫吸附试验ELISA等。抗体的特异性鉴定抗体的特异性是指与相应抗原或近似抗原物质的识别能力。抗体的特异性高，它的识别能力就强。衡量特异性通常以交叉反应率来表示。交叉反应率可用竞争抑制试验测定。以不同浓度抗原和近似抗原分别做竞争抑制曲线，计算各自的结合率，计算各自在IC5tl时的浓度。抗体的亲和力亲和力是指抗体和抗原结合的牢固程度，亲和力的高低是由抗原分子的大小、抗体分子的结合位点与抗原决定簇之间立体构型的合适度决定的，有助于维持抗原抗体复合物稳定的分子间力有氢键、疏水键、侧链相反电荷基因的库仑力、范德华力和空间斥力。亲和力常以亲和常数K表示，通常K的范围在IO8-1OicVmol,也有多达IO14/mol ο朊蛋白多克隆抗体本发明提供一种制备动物朊蛋白多克隆抗体的方法，以及利用这种方法制备的动物朊蛋白多克隆抗体的用途。
在本发明的一个优选例中，所述制备动物朊蛋白多克隆抗体的方法包括步骤用动物重组朊蛋白为抗原，利用内源性朊蛋白失活的转基因羊为免疫动物，在其皮下注射进行多次免疫，收集被免疫动物的血液并制备血清，所得血清即为所需要的抗体。由该方法得到的抗体可用于动物内源性朊蛋白的检测及各类朊蛋白类疾病的诊断与治疗研究，还可用于阻断朊蛋白与阿尔茨海默病中β淀粉状蛋白的结合，从而起到治疗阿尔茨海默病的作用。药物组合物和给药方式本发明还提供了一种药物组合物。本发明的药物组合物可以是治疗性的或预防性的(如疫苗)。本发明的药物组合物包括有效量的本发明的多克隆抗体，以及至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在制备这些组合物时，通常将活性成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在可以胶囊或药囊形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时，它可以是固体、半固体或液体材料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因此，组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、糖浆剂、灭菌注射溶液等。合适的赋形剂的例子包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、等。制剂还可包括湿润剂、乳化剂、防腐剂(如羟基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味剂等。对于含细胞的组合物，优选形式为液态剂型。组合物可制成单元或多元剂型。各剂型包含为了产生所期望的治疗效应而计算出预定量的活性物质，以及合适的药剂学赋形剂。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)瘤内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、癌旁、或局部给药。使用药物组合物时，是将安全有效量的抗体施用于人或非人动物，其中该安全有效量通常至少约I微克抗体/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克抗体/千克体重，较佳地该剂量是约I微克-1毫克抗体/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、施用体的健康状况等因素 ，这些都是熟练医师技能范围之内的。本发明的主要优点如下(I)以本方法制备的朊蛋白多克隆抗体，效价高、特异性强、亲和性高；(2)本方法制备成本低，可以长期采集，有利于大规模应用。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook 等人，分子克隆实验室手册(New York Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。实施例1朊蛋白基因敲除羊的制备本实施例中所用的免疫用动物获自上海转基因研究中心，其详细制备方法见专利“一种制备朊蛋白基因敲除家畜的方法”，申请号=200510110773. 6。将经传代的朊蛋白基因完全敲除的羊，用于后续实验。实施例2羊免疫用重组朊蛋白抗原的制备1.羊Prnp基因的克隆
参照GENBANK，登录羊朊蛋白基因序列，其Genbank序号为EU253454。根据该序列，设计PCR扩增引物，其序列如下SEQ ID NO:1 CCCAAGCTTAAGAAGCGACCAAAACCTGG ；SEQ ID NO:2 CCGCTCGAGACTTGCCCCCCTTTGGTAAT。扩增羊PRNP (去掉N端和C端信号肽)成熟的mRNA序列，并在两端引入酶切位点，因羊PRNP基因编码区为单外显子基因，故利用羊基因组DNA作为模板，用KOD-PIus高保真酶进行扩增，反应体系见表I。表I
权利要求
1.一种分离的、特异性与朊蛋白结合的抗体，其特征在于，所述的抗体具有以下特征 (a)由不表达朊蛋白的动物所产生的，并且特异性针对该种动物的朊蛋白； (b)所述抗体与所述动物的朊蛋白的结合效价大于10000； 其中，所述动物为家畜。
2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述的抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、抗血清。
3.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体由不表达朊蛋白的羊产生且特异性针对羊的朊蛋白。
4.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体的效价大于12000。
5.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体是通过包括以下步骤的方法制备的 (1)提供不表达朊蛋白的动物，所述动物为家畜； (2)用朊蛋白作为抗原免疫步骤(I)所述的动物，使所述动物产生所述抗体； (3)收集含有所述抗体的动物血清,获得权利要求1所述的抗体。
6.权利要求1所述抗体的用途，其特征在于，用于 (i)检测待测样本是否感染朊蛋白或朊病毒； ( )制备检测待测样本是否感染朊蛋白或朊病毒的试剂。
7.一种制备权利要求1所述抗体的方法，其特征在于，包括步骤 (1)提供不表达朊蛋白的动物，所述动物为家畜； (2)用朊蛋白作为抗原免疫步骤(I)所述的动物，使所述动物产生所述抗体； (3)收集含有所述抗体的动物血清,获得权利要求1所述的抗体。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述不表达朊蛋白的动物为朊蛋白基因敲除的动物、朊蛋白基因沉默的动物，或朊蛋白基因突变、朊蛋白基因缺失不表达朊蛋白的动物，或其组合。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的朊蛋白为外源重组的动物朊蛋白。
10.一种检测待测样本是否感染朊蛋白或朊病毒的方法，其特征在于，包括步骤 (A)将权利要求1所述的抗体与待测样本接触，以便使得所述抗体与朊蛋白形成复合物； (B)检测待测样本中是否形成所述复合物。
全文摘要
本发明涉及一种朊蛋白抗体及其制备方法和应用。具体地，所述的抗体具有以下特征(a)由不表达朊蛋白的动物所产生的，并且特异性针对该种动物的朊蛋白；(b)所述抗体与所述动物的朊蛋白的结合效价大于10000；其中，所述动物为家畜。本发明还提供了制备所述抗体的方法及其应用。
文档编号C07K16/18GK103044546SQ201110377350
公开日2013年4月17日 申请日期2011年11月24日 优先权日2011年11月24日
发明者成国祥, 俞慧清, 陈建泉, 王学斌 申请人:上海转基因研究中心, 上海杰隆生物工程股份有限公司