专利名称：Fbxl15蛋白及其抑制剂以及它们的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及FBXL15蛋白及其抑制剂以及它们的应用。
背景技术：
蛋白质是构成生命体内细胞和组织的基本物质，几乎所有的蛋白质都处在不断合成与降解的动态平衡之中。与蛋白质的合成相比，蛋白质的降解同样重要，机体内短寿命的、错误折叠的以及机体自身不需要的蛋白都需要通过降解途径来清除。其中泛素-蛋白酶体系统⑴biquitin-Proteasome System,UPS)就是真核生物体内普遍存在的具有高度选择性的蛋白质降解系统，主要由蛋白质泛素化和蛋白酶体降解两个过程组成。该系统的生物学功能非常广泛，参与调控细胞内几乎各个方面的生命活动，其异常与炎症、癌症及神经退行性疾病等密切相关。泛素化修饰通过由泛素激活酶(ubiquitin activating enzyme，El)、泛素结合 Sl (ubiquitin conjugating enzyme, E2)禾口泛素连接 Sl (ubi qui tin-protein ligase, E3) 参与介导的酶促级联反应完成，最后经蛋白酶体降解。其中E3决定底物识别的特异性，是蛋白质泛素化领域的研究热点。E3可以分为两大类含有RING(really interesting new gene)锌指结构和 HECT (homologous to E6AP C-terminus)结构域的 E3。RING类E3中的大多数是基于Cullins蛋白的多亚基复合体，其中基于Cullinl所形成的SCF(Skpl-Cullinl-F-boX)复合体是研究最多、最深入的RING类E3复合体。它以支架蛋白Cullinl为中心，C端结合RING锌指蛋白Rocl，N端结合接头蛋白Skp 1，Skpl又进一步募集不同的F-box蛋白，F-box蛋白担当底物识别亚基的角色，这样SCF复合体就利用不同的F-box蛋白形成不同复合体，从而结合不同的底物，在细胞周期调控、细胞生长及肿瘤发生等多种生物学过程中发挥着重要作用。F-box蛋白是一个大的蛋白家族，其家族成员数量在不同的物种中差别很大，酵母中约有20种，果蝇中有27种，而在人中则有69个成员。人中的F-box蛋白家族根据其C端所含结构域的不同，可以分为三类含有WD40结构域的FBXW亚家族，含有LRR区的FBXL亚家族，以及含有其它结构域的统称为FBM)亚家族， 它们分别通过WD40、LRR及其它结构域与底物蛋白发生相互作用，介导SCF复合体的结合。相对于RING类E3，HECT类E3数量上约占人类E3的5 %，共有观种，其功能与机制研究相对较少，认识大多来自对于Nedd4(neural precursor cell-expressed developmentally downregulated gene 4)家族的研究。人中Nedd4家族共有9个成员， 根据进化关系上的远近又可分为4个亚家族NedcMs :Nedd4-l, Nedd4_2/Nedd4L ；Smurfs Smurfl, Smurf2 ；AIPs :AIP2/WWP2, AIP4, AIP5/WWP1 ；NEDLs :NEDL1, NEDL2。各亚家族成员间的序列和结构的相似性更高，同源性更强。Nedd4家族成员的结构域组成及模式呈现规律性的特点N端均含有C2结构域，能结合磷脂，介导质膜定位；中间为2 4个Wff结构域， 每个Wff结构域由约40个氨基酸组成，其中因含有两个标志性的色氨酸残基(Try，W)而得名，WW结构域能与PY模序结合，介导蛋白与蛋白间的相互作用，决定底物的特异性；C端为 HECT催化结构域。
Smurfl (Smad ubiquitination regulatory factor 1)白勺HMft·， 与同家族的Smurf2高度同源。Smurfl最早在线虫中出现，人源Smurfl是发现的第一个能够降解Smads的E3，其发现将TGF-β /BMP通路与泛素-蛋白酶体通路联系起来。研究发现，Smurfl可以通过降解经典BMP通路的受体型Smads (如Smadl、Smad5)和BMP受体、负调控BMP通路。随后有研究揭示Smurfl可以靶向Smad不依赖的BMP-MEKK2-JNK通路中的 MEKK2激酶，负调控骨形成。Smurfl+小鼠随年龄增长则表现出骨量的不断上升，Smurfl与 Smurf2双敲除则导致小鼠胚胎致死。这些研究表明，Smurfl是骨形成、胚胎发育乃至肿瘤发生的重要调控分子。发明内容
本发明的目的是提供FBXL15蛋白及其抑制剂以及它们的应用。
本发明保护FBXL15蛋白、所述FBXL15蛋白的编码基因或含有所述编码基因的重组表达载体在如下①或②中的应用①促进成骨细胞的分化；②制备促进所述成骨细胞分化的产品。所述成骨细胞具体可为UMR106细胞。
FBXL15蛋白或其编码基因还可用于促进Smurfl蛋白的降解或制备促进Smurfl蛋白降解的产品。FBXL15蛋白或其编码基因还可用于促进Smurfl蛋白的泛素化或制备促进 Smurfl蛋白泛素化的产品。FBXL15蛋白或其编码基因还可用于增强BMP通路活性或制备增强BMP通路活性的产品。所述FBXL15蛋白具体可通过抑制所述Smurfl蛋白增强BMP通路活性。
本发明还保护一种核酸，为序列表的序列9所示核酸、序列表的序列10所示核酸或序列表的序列11所示核酸。
本发明还保护FBXL15蛋白的抑制剂在降低FBXL15蛋白的编码基因的表达量中的应用。
本发明还保护FBXL15蛋白的抑制剂在如下如下(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、 (VI)、(VII)或(VIII)中的应用(I)延长细胞和/或组织和/或生物体内源Smurfl蛋白的半衰期；(II)抑制所述Smurfl蛋白的降解；(III)抑制所述Smurfl蛋白的泛素化；(IV) 抑制BMP通路活性；(V)制备延长细胞和/或组织和/或生物体内源Smurfl蛋白的半衰期的产品；(VI)制备抑制所述Smurfl蛋白降解的产品；(VII)制备抑制所述Smurf 1蛋白泛素化的产品；(VIII)制备抑制BMP通路活性的产品；
所述FBXL15蛋白的抑制剂具体可为所述核酸。
所述FBXL15蛋白是如下(a)或(b)
(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质。
所述FBXL15蛋白的编码基因是如下(1)或⑵或(3)所述的DNA分子
(1)序列表中序列2所示的DNA分子；
(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能的蛋白的DNA 分子；
(3)与⑴限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码具有相同功能的蛋白的DNA分子。所述Smurfl蛋白是如下(C)或(d)(c)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(d)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列3衍生的蛋白质。FBXL15本身能明显增强成骨细胞的分化，即促进骨形成，可用于治疗骨质疏松等疾病。骨硬化症，又称石骨症，骨密度升高伴随骨形态变化，由于失去了中空髓腔反而使骨头脆性增加，更容易骨折。本发明提供的FBXL15蛋白的抑制剂可以抑制成骨细胞的分化， 即抑制骨形成，可用于作为石骨症的候选药物。
图1为FBXL15结构域组成示意图。图2为FBXL15蛋白的细胞表达谱及亚细胞定位分析；A :FBXL15蛋白的细胞表达谱；B :FBXL15蛋白的亚细胞定位分析。图3为FBXL15形成功能性SCF复合体促进Smurfl蛋白的降解；A =FBXL 15与 SkpUCullinl和Rocl存在相互作用；B =FBXL 15降低Smurfl (WT/C699A)的稳定性(1为无 FBXLl5, 2为FBXL15低剂量，3为FBXL15高剂量)；C 野生型FBXL15，而不是FBXL15截短体促进Smurfl降解(1代表第一组，2代表第二组，3代表第三组，4代表第四组)；D :FBXL15 特异性降解Smurfl。图4为敲低FBXL15增强内源Smurfl蛋白水平；A 3条独立的FBXL15 siRNA敲低效率检测；B 2#、3# siRNA有效敲低内源FBXL15蛋白水平；C 敲低FBXL15上调内源Smurfl 水平；D和E 敲低FBXL15后增强Smurfl半衰期。图5为SCFfbxu5复合体增强Smurfl泛素化水平；A =FBXL 15促进Smurfl体内泛素化水平(1代表第一组，2代表第二组，3代表第三组，4代表第四组，5代表第五组)；B 敲低 CullinU RocU FBXL15 减低 Smurfl 泛素化水平。图6为FBXL15拮抗Smurfl对BMP通路的抑制效应；A =Smurfl能明显降低底物 Smadl/5的蛋白水平(1至12依次代表第一组至第十二组)。B 敲低FBXL15可以抑制BMP 通路的活化(1代表取样时间为0小时，2代表取样间隔时间为0. 5小时，3代表取样间隔时间为1小时，4代表取样间隔时间为2小时，5代表取样间隔时间为4小时。)；C:敲低FBXL15 可以抑制BMP通路靶基因IDl和Smad6的表达(*表示P < 0. 05)。图7为实施例5中各组细胞的碱性磷酸酶ALP染色后照片。图8为实施例5中各组细胞的ALP活性分析结果，*表示P < 0. 05。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。Western Blot条带通过kion Image软件定量。BMP-2即大鼠骨成型蛋白2 购自PEPR0TECH公司，目录号120-02。UMR106细胞(大鼠成骨样细胞系)购自美国标准菌种保藏中心(ATCC)，目录号为CRL-1661。HEK293T 细胞北京协和细胞资源中心，编号为3111C0001CCC000091 ；为人胚肾细胞(SV40T基因修饰)。pFlag-CMV-2 表达载体Sigma，目录号为 E7398。pCMV-Myc 表达载体Clontech 公司。pCMV-HA表达载体Clontech公司。！fepG2细胞(肝癌细胞系)北京协和细胞资源中心，编号为 3111C0001CCC000035。。
限制性内切酶、T4连接酶均购自NEB公司。质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒均购自Promega公司。反转录试剂盒及实时定量荧光染料STOR Green PCR Mix购自东洋纺公司。双荧光素酶报告基因试剂盒购自Promega公司。RNA提取试剂Trizol购自hvitrogen 公司。大肠杆菌感受态细胞DH5ci购自天根公司。细胞培养相关的胎牛血清、DMEM培养液、双抗及胰酶均购自Hyclone公司。转染试剂Lipofectamine 2000购自hvitrogen公司。蛋白酶体抑制剂(MG132)购自Sigma公司。蛋白合成抑制剂cycloheximide (CHX)购自Sigma公司。蛋白酶抑制剂(cocktail)购自Roche公司。。Protein A/G agarose购自 Santa Cruz ^b]。
Flag抗体购自Sigma公司。Myc抗体购自MBL公司。GAPDH抗体购自ProteiniTech 公司 Smurfl 抗体(ab57573)和 Smurf2 (ab53316)抗体购自 Abcam 公司。Cullinl 抗体、 Skpl抗体、Rocl抗体和CyclinA/Bl抗体购自hvitrogen公司。Smadl/5抗体和磷酸化 Smadl/5 (S463/465)抗体购自 Cell Signaling 公司。Smadl/5 抗体=CellSignaling, 97430 5111&(12/3抗体刃611 Signaling，3102。
实施例1、FBXL15蛋白的基本特征描述
一、序列的生物信息学分析
FBXL15蛋白由F_box结构域和6个亮氨酸富含区(LRR)所组成(图1)。LRR是一大类介导蛋白相互作用的结构域，根据长度及序列特征可以分为6类，FBXL15及Skp2 等F-box蛋白属于其中的CC(cysteine-containing)亚类。FBXL15在进化上较为保守，在果蝇、疟蚊等无脊椎动物及鱼类、鸟类等脊椎动物以及哺乳动物中都存在FBXL15的同源基因，其中哺乳动物中FBXL15高度保守，人与其它哺乳动物的同源性高达95%以上，与鱼类、 鸟类的同源性在60%左右，与无脊椎动物的进化距离较远，只有30%左右。从FBXL15与其它FBXL亚类的蛋白的进化树关系分析，FBXL15分支独立于大多数FBXL亚类蛋白，提示 FBXL15的功能可能比较保守。
二、正常及癌细胞系中的FBXL15蛋白的编码基因的表达水平
在获得FBXL15抗体后，在Hela (人子宫颈癌细胞)、MCF_7 (乳腺癌细胞)、U20S (骨肉瘤细胞)、HEK293T (人胚肾细胞)、H印G2 (肝癌细胞)、K562 (粒细胞来源白血病细胞)、 STOY(神经母细胞瘤细胞)、HCT-15(结肠癌细胞)中检测FBXL15的表达水平。结果显示，FBXL15在各细胞系中均有表达，但在K562白血病细胞系中表达特别高(图2A)，在 Jurkat (淋巴细胞白血病)中也检测到高表达。
三、FBXL15蛋白的细胞定位分析
在带有载玻片直径为30mm的confocal专用培养皿中，接种MCF-7细胞，培养至合适汇合度后分别转染GFP-FBXL15、Myc_FBXL15。细胞培养24h后，转染GFP-FBXL15细胞直接在荧光显微镜下观察，转染Myc-FBXL15细胞进行以下处理(1)4%多聚甲醛固定， 室温 IOmin ； (2)PBS 洗涤，0. 2 % Triton-PBS 渗透，室温 IOmin ； (3)PBS 洗涤，PBST (1%0Tween20+3 % BSA)封闭，37 °C 30min ； (4)弃封闭液，加入一抗(PBST 1 50 稀释)， 37°C 3 4h或4°C过夜；(5) PBST洗涤三次，5min/次，静置即可；(6)避光操作加入FITC标记二抗，Ih以内否则荧光易淬灭；(7)避光操作PBST洗涤三次；(S)DAPI染核，观察。结果见图2B，结果显示FBXL15主要定位于胞质中。实施例2、重组质粒的制备一、重组质粒Flag_FBXL15的制备1、根据NCBI (美国国立生物技术信息中心)网站查到人FBXL15基因 (NM_024326. 3)的编码区序列，设计扩增该基因的引物对如下正向引物5，-eg gaattc aatggagccaccgatggag-3'(斜体为 EcoR I 酶切位点)；反向弓丨物5‘-cgggatcctcagacctgcaggttgacaaa-3‘(斜体为 BamH I 酶切位点)。2、提取HEK293T细胞的总RNA，反转录为cDNA。3、以步骤2的cDNA为模板，用步骤1设计的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物。4、用限制性内切酶EcoR I和BamH I双酶切步骤3的PCR扩增产物，回收酶切产物。5、用限制性内切酶EcoR I和BamH I双酶切pFlag-CMV_2表达载体，回收载体骨架(约 4. 7kb)。6、将步骤4的酶切产物和步骤5的载体骨架连接，得到重组质粒Flag_FBXL15。根据测序结果，对重组质粒Flag-FBXL15进行结构描述如下在pFlag-CMV-2表达载体的EcoR I和BamH I酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的人FBXL15基因(序列表的序列2 所示的人FBXL15基因编码序列表的序列1所示的人FBXL15蛋白)。重组质粒Flag_FBXL15 可以表达Flag-FBXL15融合蛋白(蛋白分子量约为38kDa)。二、重组质粒 Flag-FBXL15_ Δ F 的制备1、设计引物对如下正向引物5’-eg gaa ttc, aggtccgcagatcccg-3‘(斜体为 EcoR I 酶切位点)；反向弓丨物5 ‘ -cggga tcc tcagacctgcaggttgacaaa-3 ‘(斜体为 BamH I 酶切位点)。2、以重组质粒Flag_FBXL15为模板，用步骤1设计的引物对进行PCR扩增，回收 PCR扩增产物。3、用限制性内切酶EcoR I和BamH I双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。4、用限制性内切酶EcoR I和BamH I双酶切pFlag-CMV_2表达载体，回收载体骨架(约 4. 7kb)。5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒 Flag-FBXL15-AF。根据测序结果，对重组质粒Flag-FBXL15_ Δ F进行结构描述如下在 pFlag-CMV-2表达载体的EcoR I和BamH I酶切位点之间插入了序列表的序列2自5’末端第211至903位核苷酸所示的人FBXL15-AF基因。重组质粒Flag-FBXL15_ Δ F可以表达 Flag-FBXL15-AF融合蛋白(蛋白分子量约为^kDa)。三、重组质粒Flag-FBXL15-F_box的制备1、设计引物对如下
正向弓I物5，_cg 贫 aat tea atg gag cca ccg atg gag(斜体为 EcoR I Bl切位占).
反向弓I物5，-eg 從a tcc tea cac ctg cgc ggc ate gaa(斜体为 BamH I 酶切位点)O
2、以重组质粒Flag_FBXL15为模板，用步骤1设计的引物对进行PCR扩增，回收 PCR扩增产物。
3、用限制性内切酶EcoR I和BamH I双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。
4、用限制性内切酶EcoR I和BamH I双酶切pFlag-CMV_2表达载体，回收载体骨架(约 4. 7kb)。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒 Flag-FBXL15-F-boX。根据测序结果，对重组质粒Flag-FBXL15-F-boX进行结构描述如下 在pFlag-CMV-2表达载体的EcoR I和BamH I酶切位点之间插入了序列表的序列2自5’ 末端第1至210位核苷酸所示的人FBXL15-F-box基因。重组质粒Flag-FBXL15-F-boX可以表达Flag-FBXL15-F-boX融合蛋白(蛋白分子量约为IlkDa)。
四、重组质粒Myc_FBXL15的制备
1、设计引物对如下
正向引物5，-cg卵a cggatggagccaccgatggag-3，(斜体为EcoR I 酶切位点)；
反向弓丨物5，-ccgctcgag atcagacctgcaggttgacaaa-3，(斜体为 Xho I 酶切位点)ο
2、以重组质粒Flag_FBXL15为模板，用步骤1设计的引物对进行PCR扩增，回收 PCR扩增产物。
3、用限制性内切酶EcoR I和Bio I双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。
4、用限制性内切酶EcoR I和Bio I双酶切pCMV_Myc表达载体，回收载体骨架(约 3. 8kb)。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒Myc_FBXL15。根据测序结果，对重组质粒Myc-FBXL15进行结构描述如下在pCMV_Myc表达载体的EcoR I和 Xho I酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的人FBXL15基因。重组质粒Myc_FBXL15 可以表达Myc-FBXL15融合蛋白(蛋白分子量约为38kDa)。
五、重组质粒Flag-Smurfl (WT)的制备
1、根据NCBI (美国国立生物技术信息中心)网站查到人Smurfl基因 (NM_181349. 2)的编码区序列，设计扩增该基因的引物对如下
正向引物5，-ccaa^rii;atgtcgaaccccgggaca-3，(斜体为Hind III 酶切位点)；
反向弓I物5‘-cggaattctcactccacagcaaacccgca-3‘(斜体为 EcoR I 酶切位点)。
2、提取HEK293T细胞的总RNA，反转录为cDNA。
3、以步骤2的cDNA为模板，用步骤1设计的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物。
4、用限制性内切酶Hind III和EcoR I双酶切步骤3的PCR扩增产物，回收酶切产物。
5、用限制性内切酶Hind III和EcoR I双酶切pFlag-CMV-2表达载体，回收载体骨架(约4. 7kb)。6、将步骤4的酶切产物和步骤5的载体骨架连接，得到重组质粒 Flag-Smurfl (WT)。根据测序结果，对重组质粒Flag-Smurfl (WT)进行结构描述如下在 pFlag-CMV-2表达载体的Hind III和EcoR I酶切位点之间插入了序列表的序列4所示的人 Smurfl基因(序列表的序列4所示的人Smurfl基因编码序列表的序列3所示的人Smurfl 蛋白)。重组质粒Flag-Smurf 1 (WT)可以表达Flag-Smurf 1 (WT)融合蛋白(蛋白分子量约为 ^kDa)。六、重组质粒Flag-Smurfl (C699A)的制备1、设计引物如下正向弓I 物 1 :5，-co aagctt atgtcgaaccccgggaca-3'(斜体为 Hind III 醇切位
占). /、、、 / 反向弓丨物 1 :5，-atccggttaaatgcggtatgggcc-3，；正向弓丨物 2 :5，-ggcccataccgcatttaaccggat-3，；反向弓I物 2 :5，-eg gaattc tcactccacagcaaacccgca-3，(斜体为 EcoR I 酶切位点)ο2、提取HEK293T细胞的总RNA，反转录为cDNA。3、以重组质粒Flag-Smurfl (WT)为模板，分别用步骤1设计的引物对1 (由正向引物1和反向引物1组成)和引物对2 (由正向引物2和反向引物2组成)进行PCR扩增，分别回收PCR扩增产物。4.将步骤3回收得到的PCR产物混合，以混合物为模板，以引物对3 (由正向引物 1和反向引物2组成)进行PCR扩增，回收PCR扩增产物。5、用限制性内切酶Hind I和EcoR I双酶切步骤4的PCR扩增产物，回收酶切产物。6、用限制性内切酶Hind III和EcoR I双酶切pFlag-CMV-2表达载体，回收载体骨架(约4. 7kb)。7、将步骤5的酶切产物和步骤6的载体骨架连接，得到重组质粒 Flag-Smurfl (C699A)。根据测序结果，对重组质粒Flag-Smurfl (C699A)进行结构描述如下与重组质粒Flag-Smurfl (WT)相比，重组质粒Flag-Smurfl (C699A)的差异仅在于将序列表的序列4所示的DNA自5，末端第2095-2097位核苷酸由“tgc”突变为了 “gca”；引起序列表的序列3所示蛋白质自N末端第699位氨基酸残基由半胱氨酸突变为了丙氨酸，从而失去活性。重组质粒Flag-Smurf 1 (C699A)可以表达Flag-Smurf 1 (C699A)融合蛋白(蛋白分子量约为85kDa)。七、重组质粒HAIb的制备1、根据NCBI (美国国立生物技术信息中心)网站查到人证基因 (NM_001135592. 2)的编码区序列，设计扩增该基因片段的引物对如下正向引物:5，-CCgtcgac catgcagattttcgtgaaa-3，(斜体为 Sal I 酶切位点)；反向弓丨物5‘-ccggcggccgc ttaccaccacgaagtctc-3‘(斜体为 Not I 酶切位点)。2、提取HEK293T细胞的总RNA，反转录为cDNA。
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3、以步骤2的cDNA为模板，用步骤1设计的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物。
4、用限制性内切酶Ml I和Not I双酶切步骤3的PCR扩增产物，回收酶切产物。
5、用限制性内切酶Ml I和Not I双酶切pCMV-HA表达载体，回收载体骨架(约 3. 8kb)。
6、将步骤4的酶切产物和步骤5的载体骨架连接，得到重组质粒HA-Ub。根据测序结果，对重组质粒HA-Ub进行结构描述如下在pCMV-HA表达载体的Ml I和Not I酶切位点之间插入了序列表的序列5所示的人证基因片段。
八、重组质粒Myc-Smadl的构建
1、根据NCBI (美国国立生物技术信息中心)网站查到人Smadl基因 (NM_001003688. 1)的编码区序列，设计扩增该基因的引物对如下
正向引物5，-CCCtCgagi gtatgaatgtgacaagttta-3，(斜体为 Xho I 酶切位点)；
反向引物5，-ccg^r^grc^rttaagatacagatgaaat-3，(斜体为 Not I 酶切位点)。
2、提取HEK293T细胞的总RNA，反转录为cDNA。
3、以步骤2的cDNA为模板，用步骤1设计的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物。
4、用限制性内切酶Bio I和Not I双酶切步骤3的PCR扩增产物，回收酶切产物。
5、用限制性内切酶Bio I和Not I双酶切pCMV-Myc表达载体，回收载体骨架(约 3. 8kb)。
6、将步骤4的酶切产物和步骤5的载体骨架连接，得到重组质粒Myc-Smadl。根据测序结果，对重组质粒Myc-Smadl进行结构描述如下在pCMV_Myc表达载体的Β ο I和 Not I酶切位点之间插入了序列表的序列6所示的Smadl基因。重组质粒Myc-Smadl可以表达Myc-Smadl融合蛋白(蛋白分子量约为55kDa)。
九、重组质粒Myc_Smad3的构建
1、根据NCBI (美国国立生物技术信息中心)网站查到人Smad3基因 (NM_001145102. 1)的编码区序列，设计扩增该基因的引物对如下
正向引物5，-cg卵a cggatggagctgtgtgagttc-3，(斜体为EcoRI 酶切位点)；
反向弓丨物5，-ccgcic^,actaagacacactggaaca-3，(斜体为 Xho I 酶切位点)。
2、提取HEK293T细胞的总RNA，反转录为cDNA。
3、以步骤2的cDNA为模板，用步骤1设计的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物。
4、用限制性内切酶EcoR I和Bio I双酶切步骤3的PCR扩增产物，回收酶切产物。
5、用限制性内切酶EcoR I和Bio I双酶切pCMV_Myc表达载体，回收载体骨架(约 3. 8kb)。
6、将步骤4的酶切产物和步骤5的载体骨架连接，得到重组质粒Myc-Smad3。根据测序结果，对重组质粒Myc-Smad3进行结构描述如下在pCMV_Myc表达载体的EcoRI和 Xho I酶切位点之间插入了序列表的序列7所示的Smad3基因。重组质粒Myc-Smad3可以表达Myc-Smad3融合蛋白(蛋白分子量约为40kDa)。
十、重组质粒Myc_Smad5的构建
1、根据NCBI (美国国立生物技术信息中心)网站查到人Smad5基因 (NM_001001419. 1)的编码区序列，设计扩增该基因的引物对如下正向引物5，-coctcgag\ gtatgacgtcaatggccagc-3，(斜体为 Xho I 酶切位点)；反向引物-.W-观 gcggccgc ttatgaaacagaagatat-3，(斜体为 Not I 酶切位点)。2、提取HEK293T细胞的总RNA，反转录为cDNA。3、以步骤2的cDNA为模板，用步骤1设计的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物。4、用限制性内切酶Bio I和Not I双酶切步骤3的PCR扩增产物，回收酶切产物。5、用限制性内切酶Bio I和Not I双酶切pCMV_Myc表达载体，回收载体骨架(约
3.8kb)。6、将步骤4的酶切产物和步骤5的载体骨架连接，得到重组质粒Myc-Smad5。根据测序结果，对重组质粒Myc-Smad5进行结构描述如下在pCMV_Myc表达载体的Β ο I和 Not I酶切位点之间插入了序列表的序列8所示的Smad5基因。重组质粒Myc-Smad5可以表达Myc-Smad5融合蛋白(蛋白分子量约为55kDa)。实施例3、FBXL15形成SCF复合体并反式调控Smurfl蛋白稳定性一、FBXL15 形成 SCF 复合体绝大多数F-box均可与Skpl、Cullinl、R0cl等形成SCF复合体参与对底物的识别和降解，但其中也有例外，如FBX045则不能形成经典的SCF复合体，而是与PAM等蛋白形成其它类型的复合体，有的F-box蛋白甚至不能形成复合体。设置三组处理如下第一组(空载体组)在HEK293T细胞中转染pFlag-CMV-2表达载体，转染剂量为
4.Oug质粒/IX IO6细胞；第二组(Flag-FBXL15组)在HEK293T细胞中转染重组质粒Flag_FBXL15，转染剂量为4. Oug质粒/IX IO6细胞；第三组(Flag-FBXL15_AF组)在HEK293T细胞中转染重组质粒 Flag-FBXL15- Δ F，转染剂量为4. Oug质粒/1 X IO6细胞。转染3 后加入蛋白酶体抑制剂(20 μ Μ)处理他，然后收集细胞。向细胞中补加450μ1 HEPES裂解液，并补加蛋白酶抑制剂(20 μ 1)和磷酸酶抑制剂(IOmM NaF和 ImMNa3VO4),冰上裂解并短暂超声至裂解液清亮。4°C 12000rpm离心lOmin，取上清。50 μ 1 上清(Iys样本)进行western blot分析。剩余的上清加入Flag抗体约2 μ g，4°C旋转混合3_4h后加入protein A/G agarose 40 μ 1孵育过夜，离心收集agarose，经裂解液洗涤3 次后煮样(IP样本)进行western blot分析。western blot分析的一抗分别采用Cullinl 抗体、Skpl抗体、Rocl抗体和Flag抗体。结果见图3A。各组细胞的上清中，均可检测到Cullinl、Skpl和Rocl。第二组和第三组的上清中都可以检测到Flag。第二组的IP样本中可以检测到Cullinl、Skpl和 Rocl，第三组的IP样本中没有检测到Cullinl、Skpl和Rocl。结果表明，FBXL15在体内确实能与Cullinl、Skpl和Rocl形成经典的SCF复合体，为其发挥E3功能奠定基础，而 Flag-FBXL15 Δ F因缺失募集Skpl的关键F_box模序无法与Cullinl、Skpl和Rocl形成SCF 复合体。
13
二、FBXL15下调外源Smurfl蛋白稳定性1、实验 1设置六组处理如下第一组(无FBXL15)在HEK293T细胞中转染重组质粒Flag-Smurfl (WT)，转染剂量为0. 5ug质粒/IX IO6细胞；第二组(FBXL15低剂量)在HEK293T细胞中转染重组质粒Flag-Smurf 1 (WT)和重组质粒Flag-FBXL15，重组质粒Flag-Smurfl (WT)的转染剂量为0. 5ug质粒/1 X IO5细胞， 重组质粒Flag-FBXL15的转染剂量为1. Oug质粒/1 X IO5细胞；第三组(FBXL15高剂量)在HEK293T细胞中转染重组质粒Flag-Smurf 1 (WT)和重组质粒Flag-FBXL15，重组质粒Flag-Smurfl (WT)的转染剂量为0. 5ug质粒/1 X IO5细胞， 重组质粒Flag-FBXL15的转染剂量为2. Oug质粒/1 X IO5细胞；第四组(无FBXL15)在HEK293T细胞中转染重组质粒Flag-Smurf 1 (C699A)，转染剂量为0. 5ug质粒/1 X IO5细胞；第五组(FBXL15低剂量)在HEK293T细胞中转染重组质粒Flag-Smurfl (C699A) 和重组质粒Flag-FBXL15，重组质粒Flag-Smurf 1 (C699A)的转染剂量为0. 5ug质粒/1 X IO5 细胞，重组质粒Flag-FBXL15的转染剂量为1. Oug质粒/1 X IO5细胞；第六组(FBXL15高剂量)在HEK293T细胞中转染重组质粒Flag-Smurfl (C699A) 和重组质粒Flag-FBXL15，重组质粒Flag-Smurf 1 (C699A)的转染剂量为0. 5ug质粒/1 X IO5 细胞，重组质粒Flag-FBXL15的转染剂量为2. Oug质粒/1 X IO5细胞。转染M小时后，每组细胞分成两组(其中一组加入蛋白酶体抑制剂)，继续培养 12小时，然后将各组细胞进行western blot分析。western blot分析的一抗采用Flag抗体。以GAPDH抗体检测的结果作为对照。结果见图;3B。随着Flag-FBXL15转染剂量的增加，外转Smurfl (WT)蛋白(野生型)水平逐步减低，这说明FBXL15可降低Smurfl(WT)蛋白的稳定性，而该效应可被蛋白酶体抑制剂MG132所阻断，说明FBXL15对Smurfl (WT)蛋白的降解依赖蛋白酶体。随着 Flag-FBXL15转染剂量的增加，外转Smurfl (C699A)蛋白(失活型突变体)水平逐步减低， 说明FBXL15对Smurfl蛋白的降解不依赖Smurfl自身的E3活性(cis activity)，而很有可能为反式降解(trans activity)。2、实验 2设置四组处理如下第一组在HEK293T细胞中转染重组质粒Flag-Smurfl (WT)，转染剂量为0. 5ug质粒/IX IO5细胞；第二组在HEK293T细胞中转染重组质粒Flag-Smurfl (WT)和重组质粒 Flag-FBXL15,重组质粒Flag-Smurfl (WT)的转染剂量为0. 5ug质粒/1 X IO5细胞，重组质粒Flag-FBXL15的转染剂量为2. Oug质粒/1 X IO5细胞；第三组在HEK293T细胞中转染重组质粒Flag-Smurfl (WT)和重组质粒 Flag-FBXL15- Δ F，重组质粒Flag-Smurfl (WT)的转染剂量为0. 5ug质粒/1 X IO5细胞，重组质粒Flag-FBXL15- Δ F的转染剂量为2. Oug质粒/1 X IO5细胞；第四组在ΗΕΚ293Τ细胞中转染重组质粒Flag-Smurfl (WT)和重组质粒
14Flag-FBXL15-F-box,重组质粒 Flag-Smurfl (WT)的转染剂量为 0. 5ug 质粒 /IX IO5 细胞， 重组质粒Flag-FBXL15-F-box的转染剂量为2. Oug质粒/1 X IO5细胞。
转染M小时后，每组细胞分成两组(其中一组加入蛋白酶体抑制剂)，继续培养 12小时，然后将各组细胞进行western blot分析。western blot分析的一抗采用Flag抗体。以GAPDH抗体检测的结果作为对照。
结果见图3C。FBXL15的突变体FBXL15-Δ F、FBXL15_F_box因不能形成功能性的 SCF复合体而无法降低Smurfl的稳定性，初步说明FBXL15发挥降解功能依赖其SCF复合体的完整性。
3、实验 3
另外，又考察了其它的F-box蛋白，如FBXL亚类的Skp2、FBXL3、FBXL5及FBXL21， FBXff 类的 β -Trcpl，FBXO 类的 FBX042 对 Smurfl 的影响。ΗΕΙ^93Τ 细胞转染 Flag-Smurfl 和不同的F-box蛋白真核表达载体(BXL、FBXff, FBXO亚类的几个蛋白真核表达载体均购自 Origene公司)，细胞收获后检测Smurfl水平。发现除FBXL15外，其它F_box蛋白均不能降解Smurf 1，说明FBXL15对Smurfl的调控是特异的(图3D)。
三、通过抑制FBXL15上调内源Smurfl蛋白水平
为了在内源条件下更真实的反映FBXL15及其复合体对内源Smurfl蛋白水平的影响，拟考察FBXL15及复合体其它组分敲低后Smurfl内源水平的变化。
1、设计合成如下siRNA
靴向人中FBXL15蛋白的编码基因的siRNA(FBXL15 siRNA)
1#(序列表的序列 9) :5，-CACCCUGGAGCUUCAAAUATT-3，；
2#(序列表的序列 10) :5，-GGAACUGCCCAGAACUCCATT-3，；
3#(序列表的序列 11) :5，-GCCUGAGCCGCUUGCGGAATT-3，；
阴性对照 s iRNA 5，-UUCUCCGAAC⑶⑶CAC⑶TT-3，。
siRNA均由上海吉玛公司负责合成。
2、实验 1
借助Lipofectamine 2000转染试剂分别将步骤1合成的l#siRNA(1#组)、姊 siRNA(2#组)、3# siRNA(3#组)和阴性对照siRNA(NC组)分别与重组质粒Flag_FBXL15 共转染HEK293T细胞，观察siRNA对外源表达的FBXL15蛋白的敲低效率。siRNA的转染剂量为ΙΟΟηΜ/1 X IO5细胞，重组质粒Flag_FBXL15转染量为0. 5ug质粒/1 X IO5细胞。
转染48小时后，收取细胞。将各组细胞进行western blot分析。western blot 分析的一抗采用Flag抗体，以GAPDH抗体检测的结果作为对照。western blot分析结果见图4A，结果表明，2#、3# siRNA均可有效敲低内源的FBXL15。
3、实验 2
借助Lipofectamine 2000转染试剂分别将步骤1合成的^siRNA (2#组)、 3#siRNA (3#组)和阴性对照siRNA (NC组)转染HEK293T细胞，siRNA的转染剂量为 ΙΟΟηΜ/ΙΧ IO5细胞，观察2#、3# siRNA对内源FBXL15蛋白的敲低效率。
转染48小时后，收取细胞。将各组细胞进行western blot分析。western blot 分析的一抗采用FBXL15多克隆抗体(人FBXL15多克隆抗体由北京博尔迈生物技术公司负责制备；抗原表位为序列表的序列1所示的FBXL15蛋白自N末端第1-17位氨基酸残基组成的多肽“MEPPMEPSGGEQEPGAVC”;将抗原表位与KLH载体蛋白偶联后免疫新西兰大耳兔获得抗血清，亲和纯化后得到多克隆抗体)，以GAPDH抗体检测的结果作为对照。western blot 分析结果见图4B。结果表明，2#、3#siRNA均可有效敲低内源FBXL15的表达，其中姊siRNA 敲低效果更好。4、实验 3借助Lipofectamine 2000转染试剂分别将步骤1合成的邶siRNA (2#组)、 3# siRNA (3#组)和阴性对照siRNA (NC组)转染HEK293T细胞，siRNA的转染剂量为 ΙΟΟηΜ/ΙΧΙΟ5细胞。转染48小时后，收取细胞。将各组细胞进行western blot分析。 western blot分析的一抗分别为Smurfl抗体和FBXL15多克隆抗体。以GAPDH抗体检测的结果作为对照。western blot分析结果见图4C。结果表明，结果显示敲低FBXL15后内源 Smurfl蛋白水平呈现2-3倍不同程度的上调。5、实验 4借助Lipofectamine 2000转染试剂分别将步骤1合成的邶siRNA (2#组)、 3# siRNA (3#组)和阴性对照siRNA (NC组)转染HEK293T细胞，siRNA的转染剂量为 ΙΟΟηΜ/1 X IO5细胞，转染48小时后，在细胞中加入放线菌酮(cyclohemixde ；CHX)，使其终浓度为50 μ g/ml (放线菌酮的作用为终止细胞合成新的Smurfl蛋白)，分别于加入CHX后 0、4、8和12小时取细胞进行western blot分析。western blot分析的一抗分别为Smurfl 抗体和FBXL15多克隆抗体。以GAPDH抗体检测的结果作为对照。结果见图4D。从加入放线菌酮开始，细胞内的Smurfl蛋白量变化见图4E，蛋白量下降至初始时刻蛋白量的50%的时间即为Smurfl蛋白的半衰期。结果表明，加入siRNA后内源Smurfl的半衰期从Mi延长至9h左右。综合以上实验说明，FBXL15确实影响Smurfl的内源蛋白稳定性，并且该功能的发挥依赖其形成的SCF复合体。四、SCFfbxu5复合体促进Smurfl的泛素化1、实验 1设置五组处理如下第一组在HEK293T细胞中转染重组质粒HA-Ub，转染剂量为2. Oug质粒/1 X IO6 细胞；第二组在HEK293T细胞中转染重组质粒HA-Ub和重组质粒Flag-Smurfl (WT)，重组质粒HA-Ub的转染剂量为2. Oug质粒/1 X IO6细胞，重组质粒Flag-Smurfl (WT)的转染剂量为3. Oug质粒/1 X IO6细胞；第三组在HEK293T细胞中转染重组质粒HA_Ub、重组质粒Flag-Smurfl (WT)和重组质粒Myc-FBXL15，重组质粒HA-Ub的转染剂量为2. Oug质粒/1 X IO6细胞，重组质粒 Flag-Smurfl (WT)的转染剂量为3. Oug质粒/1 X IO6细胞，重组质粒Myc_FBXL15的转染剂量为2. Oug质粒/IX IO6细胞；第四组在HEK293T细胞中转染重组质粒HAIb和重组质粒Flag-Smurfl (C699A)， 重组质粒HA-Ub的转染剂量为2. Oug质粒/1 X IO6细胞，重组质粒Flag-Smurfl (C699A)的转染剂量为3. Oug质粒/1 X IO6细胞；第五组在HEK293T细胞中转染重组质粒HA_Ub、重组质粒Flag-Smurfl (C699A)重组质粒HA-Ub的转染剂量为2. Oug质粒/1 X IO6细胞，重组质粒 Flag-Smurfl (C699A)的转染剂量为3. Oug质粒/1 X IO6细胞，重组质粒Myc_FBXL15的转染剂量为2. Oug质粒/1 X IO6细胞；
转染3 后加入蛋白酶体抑制剂(20 μ M)处理他，然后收集细胞。向细胞中补加 450 μ 1 RIPA 裂解液(IOmM ρΗ 7.5 Tris-HCl,5mM EDTA, 150mM NaCl, 1% Nonidet P-40， 1% sodium deoxycholate,0. 025% SDS)，并补加蛋白酶抑制剂(20 μ 1)和磷酸酶抑制剂 (IOmM NaF和ImM Na3VO4)，冰上裂解并短暂超声至裂解液清亮。4°C 12000rpm离心lOmin， 取上清。50 μ 1上清(Iys样本)进行western blot分析。剩余的上清加入Flag抗体约 2μ g，4°C旋转混合3-4h后加入protein A/G agarose 40 μ 1孵育过夜，离心收集agarose， 经裂解液洗涤3次后煮样(IP样本)进行western blot分析。western blot分析的一抗分别采用Flag抗体和Myc抗体。
结果见图5A。弥散状泳道显示泛素化。在没有外源FB)(L15条件下，Smurfl (WT)存在自身泛素化，Smurfl (C699A)也能检测到微弱的泛素链，说明存在内源FBXL15对Smurfl 的泛素化。当引入外源表达的FBXL15时，Smurfl (包括野生型和C699A突变型)的泛素化水平均得到明显的增强。
2、实验 2
靶向人中Cullinl蛋白编码基因的siRNA(Cullinl siRNA)
1# :5，-G⑶UAUAUCA⑶UGUCUAA-3，；
2# 5，-CAACGAAGAGUUCAG⑶UU-3，。
靴向人中Rocl蛋白编码基因的siRNA(Rocl siRNA)
1# 5，-GAAGCGCUUUGAA⑶GAAA-3，；
2# 5，-GCAUAGAAU⑶CAAGCUAA-3，。
借助Lipofectamine 2000 转染试剂分别将 Cullinls iRNA(l# 和 2#)、Rocl 8士1 離(1#和姊)、步骤三的1制备的FBXL15 SiRNA ( 和3#)和步骤三的1制备的阴性对照 siRNA (NC组)和重组质粒HA-Ub共转染HEK293T细胞，siRNA的转染剂量均为luM/1 X IO6 细胞，重组质粒HA-Ub的转染剂量为2. Oug质粒/1 X IO6细胞。
转染3 后加入蛋白酶体抑制剂(20μΜ)处理他，然后收集细胞。向细胞中补加450μ1 RIPA裂解液，并补加蛋白酶抑制剂(20μ 1)和磷酸酶抑制剂(IOmM NaF和 ImMNa3VO4)，冰上裂解并短暂超声至裂解液清亮。4°C 12000rpm离心lOmin，取上清，加入 Smurfl抗体约4 μ g，4°C旋转混合3_4h后加入protein A/G agarose 40 μ 1孵育过夜，离心收集agarose，经裂解液洗涤3次后煮样进行western blot分析。western blot分析的一抗采用Smurfl抗体。
结果见图5B。转染siRNA后，SCFfbxu5复合体各组分Cullinl、Rocl及FBXL15蛋白水平均敲低，内源Smurfl的泛素化水平削弱，这就证明FBXL15确实能够增强Smurfl的泛素化水平。
实施例4、FBXL15反式调控Smurfl的功能研究(FBXL15拮抗Smurfl对BMP通路的抑制效应)
一、实验 1
设置十二组处理如下17
第一组在HEK293T细胞中转染重组质粒Myc-Smadl，转染剂量为0. 2ug质粒 /IX IO5 细胞；第二组在HEK293T细胞中转染重组质粒Myc-Smadl和重组质粒 Flag-Smurfl (WT)，重组质粒Myc-Smadl的转染剂量为0. 2ug质粒/1 X IO5细胞，重组质粒 Flag-Smurfl (WT)的转染剂量为0. 4ug质粒/1 X IO5细胞；第三组在HEK293T细胞中转染重组质粒Myc-Smadl、重组质粒Flag-Smurfl (WT) 和重组质粒Flag-FBXL15，重组质粒Myc-Smadl的转染剂量为0. 2ug质粒/1 X IO5细胞，重组质粒Flag-Smurfl (WT)的转染剂量为0. 4ug质粒/1 X IO5细胞，重组质粒Flag_FBXL15的转染剂量为0. Sug质粒/1 X IO5细胞；第四组在HEK293T细胞中转染重组质粒Myc-Smadl、重组质粒Flag-Smurfl (WT) 和重组质粒Flag-FBXL15，重组质粒Myc-Smadl的转染剂量为0. 2ug质粒/1 X IO5细胞，重组质粒Flag-Smurfl (WT)的转染剂量为0. 4ug质粒/1 X IO5细胞，重组质粒Flag_FBXL15的转染剂量为1. 2ug质粒/1 X IO5细胞；第五组在HEK293T细胞中转染重组质粒Myc_Smad3，转染剂量为0. 2ug质粒 /IX IO5 细胞；第六组在HEK293T细胞中转染重组质粒Myc_Smad3和重组质粒 Flag-Smurfl (WT)，重组质粒Myc_Smad3的转染剂量为0. 2ug质粒/1 X IO5细胞，重组质粒 Flag-Smurfl (WT)的转染剂量为0. 4ug质粒/1 X IO5细胞；第七组在HEK293T细胞中转染重组质粒Myc_Smad3、重组质粒Flag-Smurfl (WT) 和重组质粒Flag-FBXL15，重组质粒Myc_Smad3的转染剂量为0. 2ug质粒/1 X IO5细胞，重组质粒Flag-Smurfl (WT)的转染剂量为0. 4ug质粒/1 X IO5细胞，重组质粒Flag_FBXL15的转染剂量为0. Sug质粒/1 X IO5细胞；第八组在HEK293T细胞中转染重组质粒Myc_Smad3、重组质粒Flag-Smurfl (WT) 和重组质粒Flag-FBXL15，重组质粒Myc_Smad3的转染剂量为0. 2ug质粒/1 X IO5细胞，重组质粒Flag-Smurfl (WT)的转染剂量为0. 4ug质粒/1 X IO5细胞，重组质粒Flag_FBXL15的转染剂量为1. 2ug质粒/1 X IO5细胞；第九组在HEK293T细胞中转染重组质粒Myc_Smad5，转染剂量为0. 2ug质粒 /IX IO5 细胞；第十组在HEK293T细胞中转染重组质粒Myc_Smad5和重组质粒 Flag-Smurfl (WT)，重组质粒Myc_Smad5的转染剂量为0. 2ug质粒/1 X IO5细胞，重组质粒 Flag-Smurfl (WT)的转染剂量为0. 4ug质粒/1 X IO5细胞；第十一组在HEK293T细胞中转染重组质粒Myc_Smad5、重组质粒 Flag-Smurfl (WT)和重组质粒Flag_FBXL15，重组质粒Myc_Smad5的转染剂量为0. 2ug质粒 /1 X IO5细胞，重组质粒Flag-Smurfl (WT)的转染剂量为0. 4ug质粒/1 X IO5细胞，重组质粒Flag-FBXL15的转染剂量为0. 8ug质粒/1 X IO5细胞；第十二组在HEK293T细胞中转染重组质粒Myc_Smad5、重组质粒 Flag-Smurfl (WT)和重组质粒Flag_FBXL15，重组质粒Myc_Smad5的转染剂量为0. 2ug质粒 /1 X IO5细胞，重组质粒Flag-Smurfl (WT)的转染剂量为0. 4ug质粒/1 X IO5细胞，重组质粒Flag-FBXL15的转染剂量为1. 2ug质粒/1 X IO5细胞；
转染36小时后，收取细胞。将各组细胞进行western blot分析。western blot 分析的一抗分别为Myc抗体和Flag抗体。以GAPDH抗体检测的结果作为对照。western blot分析结果见图6A。结果显示，Smurfl能明显降低底物Smadl/5的蛋白水平，对非底物 Smad3没有影响。随着FBXL15的梯度增强，Smurfl蛋白水平下调，Smadl/5蛋白水平则明显回升，说明FBXL15的表达可拮抗Smurfl对底物的降解效应。
二、实验 2
设置两组处理如下
第一组在H印G2细胞中转染实施例3的步骤三的1制备的阴性对照siRNA，siRNA 转染剂量为80ηΜ/1Χ105细胞。
第二组在H印G2细胞中转染实施例3的步骤三的1制备的^siRNA，siRNA转染剂量为80ηΜ/1Χ105细胞。
转染4 后，加入BMP-2(50ng/ml)刺激H印G2细胞lh，然后更换新的细胞培养基， 并在不同时间点取样检测Smadl/5的磷酸化水平，来说明BMP通路被激活的程度。将各时间点(从更换培养基开始计时)取样的细胞进行western blot分析。western blot分析的一抗分别为磷酸化Smadl/5抗体、Smadl/5抗体、Smurfl抗体和FBXL15多克隆抗体。以 GAPDH抗体检测的结果作为对照。
western blot分析结果见图6B。当敲低FBXL15后，Smurfl蛋白水平在刺激后期有较明显的上升，而磷酸化Smadl/5的水平则明显减弱，说明BMP通路的活化程度被明显削弱。
三、实验3
设置三组处理如下
第一组在H印G2细胞中转染实施例3的步骤三的1制备的阴性对照siRNA(NC 组)，siRNA的转染剂量为50nM/5X IO4细胞。
第二组在H印G2细胞中转染实施例3的步骤三的1制备的^isiRNA( 组)， siRNA的转染剂量为50nM/5X IO4细胞。
第三组在H印G2细胞中转染实施例3的步骤三的1制备的3# siRNA(3#组)， siRNA的转染剂量为50nM/5X IO4细胞。
转染3 后，每组分成两个小组，其中一组加入BMP-2 (50ng/ml)刺激!fepG2细胞 Ih (第1组)，另一组不加入BMP-2 (第2组)。刺激结束后，!fepG2细胞经Trizol裂解后提取RNA，后反转录成cDNA。以cDNA为模板，通过实时定量PCR检测BMP通路靶基因IDl和 Smad6的相对变化(借助GAPDH基因调整各组细胞至相同浓度)。qRCR在Bio-Rad IQ5系统上进行，结果通过Pfaffl法进行分析。
检测GAPDH基因的引物对如下
5，-GGGAAGGTGAAGGTCGGAGT-3，；5，-TTGAGGTCAATGAAGGGGTCA-3，。
检测IDl基因的引物对如下
5’ -AGGCTGGATGCAGTTAAGGG-3，；5，-GACGATCGCATCTTGTGTCG-3，。
检测Smad6基因的引物对如下
5，-TGCAACCCCTACCACTTCA-3，；5，-CGAGGAGACAGCCGAGAGT-3，。
以NC组不加入BMP-2的小组中目的基因的表达量作为100%，计算各个处理组的19相对表达量，见图6C。结果显示，在BMP刺激条件下，敲低FBXL15后BMP通路靶基因(如 IDl、Smad6)的表达水平受到明显抑制。以上这些实验证实，FBXL15确实可通过抑制Smurfl 来增强BMP通路的活性，是BMP通路的一个正向调控因子。
实施例5、FBXL15增强成骨细胞的分化
1、在24孔板中加入含10%胎牛血清(GIBCO)的α -MEM培养基(Hyclone)，每孔 500微升，然后每孔接种0. 5 X IO5个UMR106细胞。
2、待细胞生长至汇合度约70%时，设置以下三组处理(每组设置三个复孔)
第一组(Flag-FBXL15-Δ F 组；第 1 组)利用 Lipofectamine 2000 转染试剂 (Invitrogen)将重组质粒Flag_FBXL15_ Δ F转染细胞，细胞数与质粒比例为1 X IO5个细胞Iyg质粒；
第二组(Flag_FBXL15组；第2组)利用Lipofectamine 2000转染试剂将重组质粒Flag-FBXL15转染细胞，细胞数与质粒比例为1 X IO5个细胞= Iyg质粒；
第三组(pFlag-CMV-2组；第3组)利用Lipofectamine 2000转染试剂将 pFlag-CMV-2表达载体转染细胞，细胞数与质粒比例为1 X IO5个细胞1 μ g质粒。
3、转染4 后，吸弃上清，每孔加入500微升诱导培养基(含100 μ g/ml维生素C、 5mM β-甘油磷酸钠、100ng/ml BMP-2的α-MEM培养基)进行诱导。
4、诱导7 后，用4%多聚甲醛固定细胞，然后用ALP染色试剂盒(Sigma，产品目录号为86-C)染色并用ALP活性测定试剂盒(WakhLabAssay ALP)进行活性测定(ALP染色和活性检测方法均按试剂盒说明书进行)。
空白孔不接种细胞且不转染质粒，其它同上。
ALP染色后的细胞照片见图7。可见与第三组相比，第一组(Flag-FBXL15_ Δ F组) 成骨细胞的数量显著降低，第二组(Flag-FBXL15组)成骨细胞的数量显著升高，即FBXL15 蛋白促进成骨细胞分化，FBXL15-AF蛋白抑制成骨细胞分化。
ALP活性检测试剂盒利用对硝基苯酚磷酸盐(p-Nitrophenylphosphate)在pH9. 8 缓冲液中可被碱性磷酸酶(ALP)水解为对硝基苯酚(p-Nitrophenol)和磷酸盐，释放的对硝基苯酚在溶液中呈现黄色的特性，通过测定黄色溶液的吸光度来反映对硝基苯酚的浓度从而表征ALP的活性。因此ALP活性测定试剂盒得到的原始结果为405nm波长下溶液的吸光值(A)。用对硝基苯酚制作标准曲线，函数式为y (吸光值)=1.2Xx(对硝基苯酚浓度)。
ALP的相对活性通过下面公式换算得到
ALP 舌个生(nmol p-NP/min/mg protein) = C*a/t*c ；
C 样品中对硝基苯酚的浓度，A样品-Ase (nmol/uL)；
a:样品的稀释倍数；
t 反应时间(min)；
c 样品中蛋白含量(mg/uL)；
pFlag-CMV-2 组的 ALP 活性为 105. 5士 10. 3，Flag_FBXL15_ΔF 组的 ALP 活性为 94. 7 士 14. 7，Flag-FBXL15 组的 ALP 活性为 170. 7 士 18. 5。
各组的ALP活性比较见图8。结果显示，FBXL15表达能明显增强成骨细胞的分化， FBXL15-Δ F则表现出显性负效应，一定程度上抑制成骨细胞的分化。
权利要求
1.FBXL15蛋白、所述FBXL15蛋白的编码基因或含有所述编码基因的重组表达载体在如下①或②中的应用①促进成骨细胞的分化；②制备促进所述成骨细胞分化的产品； 所述FBXL15蛋白是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质；所述FBXL15蛋白的编码基因是如下⑴或⑵或(3)所述的DNA分子(1)序列表中序列2所示的DNA分子；(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能的蛋白的DNA分子；(3)与(1)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码具有相同功能的蛋白的 DNA分子。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述成骨细胞为UMR106细胞。
3.FBXL15蛋白或其编码基因在如下③或④中的应用③促进Smurfl蛋白的降解；④制备促进所述Smurfl蛋白降解的产品； 所述FBXL15蛋白是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质；所述FBXL15蛋白的编码基因是如下⑴或⑵或(3)所述的DNA分子(1)序列表中序列2所示的DNA分子；(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能的蛋白的DNA分子；(3)与(1)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码具有相同功能的蛋白的 DNA分子；所述Smurfl蛋白是如下(c)或(d)(c)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(d)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列3衍生的蛋白质。
4.FBXL15蛋白或其编码基因在如下⑤或⑥中的应用⑤促进Smurfl蛋白的泛素化；⑥制备促进所述Smurfl蛋白泛素化的产品； 所述FBXL15蛋白是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质；所述FBXL15蛋白的编码基因是如下⑴或⑵或(3)所述的DNA分子 (1)序列表中序列2所示的DNA分子；(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能的蛋白的DNA分子；(3)与(1)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码具有相同功能的蛋白的 DNA分子；所述Smurfl蛋白是如下(c)或(d)(c)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(d)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列3衍生的蛋白质。
5.FBXL15蛋白或其编码基因在如下⑦或⑧中的应用⑦增强BMP通路活性；⑧制备增强所述BMP通路活性的产品；所述FBXL15蛋白是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质；所述FBXL15蛋白的编码基因是如下⑴或(2)或(3)所述的DNA分子(1)序列表中序列2所示的DNA分子；(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能的蛋白的DNA分子；(3)与(1)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码具有相同功能的蛋白的 DNA分子。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述FBXL15蛋白通过抑制Smurfl蛋白增强BMP通路活性；所述Smurfl蛋白是如下(c)或(d)(c)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(d)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列3衍生的蛋白质。
7.核酸，为序列表的序列10所示核酸、序列表的序列11所示核酸或序列表的序列9所示核酸。
8.FBXL15蛋白的抑制剂在降低FBXL15蛋白的编码基因的表达量中的应用；所述FBXL15蛋白是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质。
9.FBXL15 蛋白的抑制剂在如下(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)或(VIII)中的应用(I)延长细胞和/或组织和/或生物体内源Smurfl蛋白的半衰期；(II)抑制所述Smurfl蛋白的降解；(III)抑制所述Smurfl蛋白的泛素化；(IV)抑制BMP通路活性；(V)制备延长细胞和/或组织和/或生物体内源Smurfl蛋白的半衰期的产品；(VI)制备抑制所述Smurfl蛋白降解的产品；(VII)制备抑制所述Smurfl蛋白泛素化的产品；(VIII)制备抑制BMP通路活性的产品； 所述FBXL15蛋白是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质；所述Smurfl蛋白是如下(c)或(d)(c)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(d)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列3衍生的蛋白质。
10.如权利要求8或9所述的应用，其特征在于所述抑制剂为权利要求7所述的核酸。
全文摘要
本发明公开了一种FBXL15蛋白及其抑制剂以及它们的应用。本发明保护FBXL15蛋白、所述FBXL15蛋白的编码基因或含有所述编码基因的重组表达载体在促进成骨细胞的分化中的应用。FBXL15蛋白或其编码基因还可用于促进Smurf1蛋白的降解、促进Smurf1蛋白的泛素化、增强BMP通路活性。所述FBXL15蛋白是由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。FBXL15本身能明显增强成骨细胞的分化，即促进骨形成，可用于治疗骨质疏松等疾病。
文档编号C07K14/47GK102504021SQ201110375338
公开日2012年6月20日 申请日期2011年11月23日 优先权日2011年5月3日
发明者何珊, 崔宇, 张令强, 贺福初, 邢桂春 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所