专利名称：一种大豆分离蛋白酶解产物中的天冬氨酸蛋白酶抑制剂的制备方法
技术领域：
一种大豆分离蛋白酶解产物中的天冬氨酸蛋白酶抑制剂的制备方法，具体说是采用木瓜蛋白酶在特定条件下酶解大豆分离蛋白，酶解液经过热处理，高速离心，DEAE-52离子交换层析，获得纯化的天冬氨酸蛋白酶抑制剂，属于生物制品分离纯化技术领域。
背景技术：
酶制剂已广泛应用在食品、酿造、制药、有机酸、淀粉糖、饲料工业、纺织、皮革、洗涤剂及保健品等各个领域，应用领域越来越广泛，食品与人们的生活密切相关，因此酶在食品工业中的应用价值越来越重要，目前在烘焙、奶制品、肉类加工、新型营养食品和蛋白质的水解中得到很大的体现。酶解蛋白质生产多肽已成为当今热门研究，通过不同的酶切方式可以获得不同功能的活性多肽，尤其是开发一些寡肽物质，成为蛋白质研究中的一个新领域。天冬氨酸蛋白酶，属于一种蛋白水解酶家族，广泛分布于自然界，病毒、真菌、植物及动物中均有存在。这个家族主要包括胃蛋白酶、组织蛋白酶D、蛋白酶A、血管紧张素原酶和艾滋病毒蛋白酶等，它们均含两个高度保守的天冬氨酸残基的活性位点。有些天冬氨酸蛋白酶已被证实参与某些病理过程，例如，艾滋病毒的复制过程中HIV-I蛋白酶起着重要作用，肿瘤细胞的转移也需求不同的蛋白酶。此外，他们参与许多生理过程，如食品消化， 溶酶体降解，信号转导通路等，也可以调解感染性生物最初的入侵步骤，由于蛋白酶催化肽键水解基本上是不可逆转的，因此，蛋白酶抑制剂广泛的监管网络在确保蛋白酶的空间和时间上的精确活动中起着重要作用。蛋白酶抑制剂泛指对蛋白酶有抑制作用的一类物质，能参与控制体内蛋白的酶解活动，对维持正常的生命活动具有重要意义。已有研究发现一些天冬氨酸蛋白酶抑制剂对 HIV和高血压的临床治疗有益，在癌症，肥胖，心血管疾病，炎症，神经退行性疾病以及各种传染病和寄生虫病中也有潜在的应用价值。目前报道的天冬氨酸蛋白酶抑制剂多是通过化学法合成的，安全性得不到保证，因此研究从天然生物中提取的抑制剂将具有更大的实际应用价值。我国动植物蛋白的利用已经有了很大的发展，如大豆蛋白、酪蛋白、乳清蛋白等已经得到了广泛的应用。作为三大作物之一的大豆，每年生产的大豆蛋白数量很大，且大豆分离蛋白中蛋白质含量在90%以上，利用生物酶技术将提纯后的蛋白水解，制备具有生物活性的多肽，是提高大豆蛋白附加值的另一种途径。
发明内容
本发明目的是提供大豆分离蛋白特定条件下酶解产物中一种天冬氨酸蛋白酶抑制剂的制备方法，采用木瓜蛋白酶在特定条件下酶解大豆分离蛋白，将酶解液进行热处理， 高速离心获得粗天冬氨酸蛋白酶抑制剂，再经DEAE-52离子交换层析，获得较纯的天冬氨酸蛋白酶抑制剂，对胃蛋白酶(2800U)的半抑制浓度IC5tl值约为56. 5飞8. 6 μ g/mL,回收率 75% 79%，对胃蛋白酶的最佳抑制反应时间为20 min ；在40°C 90°C范围内，胃蛋白酶抑制剂热稳定性良好；PH稳定范围为2 11。对其进行底物特异性分析，知该抑制剂对同为天冬氨酸族蛋白酶的胃蛋白酶和凝乳酶都有较高的抑制活性，而对几种属于其它家族的蛋白酶(半胱氨酸族的木瓜蛋白酶、丝氨酸族的胰蛋白酶、金属蛋白酶族的中性蛋白酶等)几乎都没有抑制活性。本发明技术方案一种大豆分离蛋白酶解产物中的天冬氨酸蛋白酶抑制剂的制备方法，采用木瓜蛋白酶在特定条件下酶解大豆分离蛋白，将酶解液进行热处理，高速离心， 上清液经DEAE-52离子交换层析得纯化的天冬氨酸蛋白酶抑制剂，再经真空冷冻干燥得天冬氨酸蛋白酶抑制剂干粉；其工艺为
A筛选酶类优化酶解条件
(1)大豆分离蛋白购自安阳漫天雪食品制造有限公司；
(2)酶解配置质量浓度5%的大豆分离蛋白溶液100mL，分别用相同酶活单位(每克大豆分离蛋白加入的蛋白酶量为8000U)的木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶在各自最适温度、PH条件下酶解相同的时间，结果如图1所示，三种不同的蛋白酶酶解大豆分离蛋白200 min。峰a、b、c所对应的抑制活性分别为3.6、1.5、0.9 IU/mL。木瓜蛋白酶酶解大豆蛋白 60 min，在峰a处对胃蛋白酶有最大的抑制活性。故选取木瓜蛋白酶酶解大豆分离蛋白60 min的产物为研究对象；
(3)木瓜蛋白酶酶解大豆分离蛋白确定木瓜蛋白酶为酶解大豆分离蛋白的最适蛋白酶，酶解条件为每克大豆分离蛋白加入的木瓜蛋白酶量为8000U，pH 6.5。55°C下水浴酶角军60 min ；
B大豆分离蛋白酶解后上清液的制备
(4)高速离心将酶解液以8000r/min、4°C下离心30 min，取上清液；
(5)热处理将上清液进行70°C下水浴20min,8000 r/min离心30 min，取上清； C天冬氨酸蛋白酶抑制剂的分离制备
(6)离子交换层析DEAE-52离子交换色谱柱规格为30cmX2. 2 cm，平衡缓冲液为10 mmol/L的磷酸钠缓冲液(pH 6.8)。洗脱模式以平衡缓冲液洗脱2倍柱体积后，再以平衡缓冲液依次分别加含有不同浓度0.2，0.4，0.6，0.8 mol/L NaCl的磷酸缓冲液进行阶段洗脱，流速为1.5 mL/min，进样量20 mL,280 nm波长紫外检测，结果如图2显示0. 2 mol/L NaCl的磷酸缓冲液梯度下收集的峰1，峰2对属天冬氨酸族蛋白酶的胃蛋白酶具有较强的抑制活性，其它梯度下收集的峰则无抑制活性；
(7)干燥成粉采用真空冷冻干燥的方法将DEAE-52离子交换层析中以含0.2mol/ L NaCl的磷酸缓冲液梯度洗脱下收集的峰液进行冷冻干燥，即为天冬氨酸蛋白酶抑制剂干粉。抑制剂底物特异性分析用上述步骤(7)中得到的抑制剂冷冻粉配成1 mg/mL的溶液，测定其对不同蛋白酶的抑制活性，从酶解大豆分离蛋白液中所产的抑制剂对两种天冬氨酸蛋白酶族中的胃蛋白酶和凝乳酶均有较强的抑制活性，抑制单位分别为8. 3 IU/mL 和9. 2 IU/mL，对木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶等几乎没有抑制活性。抑制剂热稳定性分析用上述步骤(7)中得到的抑制剂冷冻粉配成1 mg/mL的溶液，在不同的温度条件下放置30 min后冷却至室温，测定其对胃蛋白酶的抑制活性，结果显示在40°C 90°C范围内，该抑制剂热稳定性良好。较高的温度稳定性对提取、加工和保藏均有较大好处。最佳抑制反应时间的确定当抑制剂与胃蛋白酶反应时间低于20 min时，抑制率随反应时间的增加而增大，反应时间为20 min时抑制率达到最大，时间更长对抑制率影响很小。综合测定时间和抑制率的双重影响，选择20 min为抑制剂与胃蛋白酶的最佳作用时间。酶活测定方法胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶活力测定采用常规蛋白酶活力测定法；凝乳酶活力测定采用Arima法。酶活定义40°C时，每分钟分解血红蛋白产Iymol酪氨酸所需酶量即为一个酶活单位，单位用U表示。抑制单位定义依上述方法测定酶活，按抑制率=(抑制前酶活-抑制后酶活)/抑制前酶活X100%计算抑制率，规定在上述条件下，对胃蛋白酶抑制率达10%的抑制剂活性为一个抑制单位，单位用IU表示。IC50值定义在最适条件下，对一定量蛋白酶抑制率达50%时的抑制剂添加量。
图1不同蛋白酶对大豆分离蛋白的酶解产物对胃蛋白酶的抑制活性比较。图2大豆分离蛋白的酶解产物DEAE-52离子交换色谱图。图3 —种大豆分离蛋白酶解产物中的天冬氨酸蛋白酶抑制剂的制备流程。具体实例方式实施例1
配置5%的大豆分离蛋白溶液300 mL，①取100 mL的溶液加入40000 U酶量的木瓜蛋白酶，PH调至6. 5，在55°C条件下水浴200 min，每隔20 min，测其对胃蛋白酶的抑制活性； ②取100 mL的溶液加入40000 U酶量的风味蛋白酶，pH调至3. 0，在37°C条件下水浴200 min，每隔20 min，测其对胃蛋白酶的抑制活性；③取100 mL的溶液加入40000 U酶量的胰蛋白酶，PH调至7. 5，在37°C条件下水浴200 min，每隔20 min，测其对胃蛋白酶的抑制活性。结果显示木瓜蛋白酶酶解大豆分离蛋白60 min，对胃蛋白酶有最大的抑制活性，抑制活性为3. 6 IU/mL;风味蛋白酶酶解大豆分离蛋白60 min，对胃蛋白酶有最大的抑制活性，抑制活性为1. 5 IU/mL ；胰蛋白酶酶解大豆分离蛋白120min，对胃蛋白酶有最大的抑制活性， 抑制活性为0.9 IU/mL，所以选取木瓜蛋白酶酶解大豆分离蛋白60 min的产物为研究对象。实施例2
配置5%的大豆分离蛋白溶液100 mL，加入40000 U酶量的木瓜蛋白酶，调pH 6. 5，在 55°C条件下水浴60 min，以8000 r/min、4°C下离心30 min，得上清液98 mL，将上清液在 70°C下进行水浴20 min，冷却至室温，8000 r/min、4°C下离心30 min，得上清液92 mL，对胃蛋白酶的抑制活性约为3. 3 IU/mL，将上清液进行离子交换层析，每次取20 mL粗抑制剂进行DEAE-52离子交换层析，为30 cmX2.2 cm，平衡缓冲液为10 mmol/L的磷酸钠缓冲液 (pH 6.8)。洗脱模式以平衡缓冲液洗脱2倍柱体积后，再以平衡缓冲液依次加0.2，0. 4， 0.6,0.8 mol/L不同浓度的NaCl的磷酸缓冲液进行阶段洗脱，流速为1.5 mL/min,280 nm波长紫外检测。收集含0.2 mol/L NaCl的磷酸缓冲液梯度下的峰1，峰2共35 mL，对胃蛋白酶(2800U)的半抑制浓度IC5tl值约为56. 5 yg /mL，对胃蛋白酶的抑制活性约为8. 5 IU/mL，回收率约为77 %。
实施例3
配置5%的大豆分离蛋白溶液150 mL，加入60000 U酶量的木瓜蛋白酶，调pH 6. 5，在 55°C条件下水浴60 min，以8000 r/min、4°C下离心30 min，得上清液147 mL，将上清液在 70°C下进行水浴20 min，冷却至室温，8000 r/min、4°C下离心30 min，得上清液138 mL，对胃蛋白酶的抑制活性约为3. 4 IU/mL，将上清液进行离子交换层析，每次取20 mL粗抑制剂进行DEAE-52离子交换层析，为30 cmX2.2 cm，平衡缓冲液为10 mmol/L的磷酸钠缓冲液 (pH 6.8)。洗脱模式以平衡缓冲液洗脱2倍柱体积后，再以平衡缓冲液依次加0.2，0. 4， 0. 6,0. 8 mol/L不同浓度的NaCl的磷酸缓冲液进行阶段洗脱，流速为1. 5 mL/min,280 nm 波长紫外检测。收集0.2 mol/L NaCl的磷酸缓冲液梯度下的峰1，峰2共35 mL，对胃蛋白酶(2800U)的半抑制浓度IC5tl值约为57. 6 yg /mL，对胃蛋白酶的抑制活性约为8. 6 IU/ mL，回收率约为76 %。
权利要求
1. 一种大豆分离蛋白酶解产物中的天冬氨酸蛋白酶抑制剂的制备方法，其特征为采用木瓜蛋白酶酶解大豆分离蛋白，将酶解液进行热处理，高速离心，上清液经DEAE-52离子交换层析得纯化的天冬氨酸蛋白酶抑制剂，再经真空冷冻干燥得天冬氨酸蛋白酶抑制剂干粉；其工艺为A筛选酶类优化酶解条件(1)大豆分离蛋白市售；(2)酶解配置质量浓度5%的大豆分离蛋白溶液100mL，分别用相同酶活单位的木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶在各自最适温度、PH条件下酶解相同的时间，研究酶解产物对胃蛋白酶的抑制活性，确定选用木瓜蛋白酶；(3)木瓜蛋白酶酶解大豆分离蛋白确定木瓜蛋白酶为酶解大豆分离蛋白的最适蛋白酶，酶解条件为每克大豆分离蛋白加入的木瓜蛋白酶量为8000U，pH 6. 5，55°C下水浴酶角军60 min ；B大豆分离蛋白酶解后上清液的制备(4)高速离心将酶解液以8000r/min、4°C下离心30 min，取上清液；(5)热处理将上清液进行70°C下水浴20min,8000 r/min离心30 min，取上清；C天冬氨酸蛋白酶抑制剂的分离制备(6)离子交换层析DEAE-52离子交换色谱柱规格为30cmX2.2 cm，平衡缓冲液为pH 6.8,10 mmol/L的磷酸钠缓冲液；洗脱模式以平衡缓冲液洗脱2倍柱体积后，再以平衡缓冲液依次分别加含有不同浓度0.2、0.4、0.6、0.8 mol/L NaCl的磷酸缓冲液进行阶段洗脱，流速为1. 5 mL/min，进样量为20 mL，280 nm波长紫外检测；(7)干燥成粉采用真空冷冻干燥的方法将DEAE-52离子交换层析中以含0.2mol/ L NaCl的磷酸缓冲液梯度洗脱下收集的峰液进行冷冻干燥，即为天冬氨酸蛋白酶抑制剂干粉。
全文摘要
一种大豆分离蛋白酶解产物中的天冬氨酸蛋白酶抑制剂的制备方法，属于生物制品分离纯化技术领域。本发明涉及采用木瓜蛋白酶酶解大豆分离蛋白，得到一种天冬氨酸蛋白酶抑制剂粗品。该粗品继续采用将酶解液进行热处理，高速离心，上清液经DEAE-52离子交换层析分离得到天冬氨酸蛋白酶抑制剂，再经真空冷冻干燥得天冬氨酸蛋白酶抑制剂干粉。本发明所制备的天冬氨酸蛋白酶抑制剂对天冬氨酸蛋白酶家族中胃蛋白酶、凝乳酶有较高的抑制活性，从酶解后的大豆分离蛋白这种天然植物类加工材料中提取的天冬氨酸蛋白酶抑制剂不仅具备特异性较好、稳定性好、且应用相对安全，在医药保健、食品添加剂及病虫害防治等领域都会有广泛的应用前景。
文档编号C07K1/18GK102367467SQ20111037558
公开日2012年3月7日 申请日期2011年11月23日 优先权日2011年11月23日
发明者张国强, 田亚平 申请人:江南大学