专利名称：杂交瘤细胞株3d6及利用其制备抗甘草酸单克隆抗体的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种能够产生抗甘草酸单克隆抗体的杂交瘤细胞株，及利用其制备抗甘草酸单克隆抗体的方法。
背景技术：
甘草属植物在我国分布有18个种和3个变种，仅有乌拉尔甘草 uralensis Fish.)、胀果甘草(GBat.)和光果甘草(G Wira L.)被《中国药典》 收录为甘草药材原植物。甘草是我国重要的传统大宗药材之一，在我国不仅使用历史悠久， 而且范围广泛，有“十方九草”、“无草不成方”之说。甘草被广泛应用于食品、化工产品、烟草等行业，但是甘草的质量问题一直引起人们的普遍关注，如何准确、快速对甘草进行鉴定与质量评价成为一个关键问题。甘草酸(结构见附图1)是甘草的主要药用成分，是甘草质量评价的核心指标。目前，甘草酸的分析方法有重量法、比色法、高效液相色谱法(HPLC)、高效毛细管电泳法、薄层层析法、气相色谱法等。这些方法的主要局限是样品前处理时间长，实验设备昂贵，同时要消耗大量的甲醇、乙腈等有机溶剂；对于混合样品的测定有一定的困难，尤其是在甘草真伪的快速鉴定以及含甘草成分的复配药品或食品中含量测定方面，存在不足。 免疫检测方法(ELISA)可以快速检测某一特定物质的含量(尤其是微量成分)，是中草药鉴定的一种快速、方便的有效方法，但要把免疫检测方法应用于甘草酸，需要制备出甘草酸单克隆抗体。
发明内容
本发明的目的就在于提供一种能够产生抗甘草酸单克隆抗体的杂交瘤细胞株 3D6 ；
本发明的另一目的是提供一种利用上述杂交瘤细胞株制备抗甘草酸单克隆抗体的方法。为实现上述发明目的所采取的技术方案为
一种杂交瘤细胞株3D6，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期是2011年10月25日，保藏编号为CGMCC 5422 ；
该杂交瘤细胞株3D6是由甘草酸人工完全抗原免疫BalB/C小鼠，并通过杂交瘤技术获
得；
所述的甘草酸人工完全抗原的获得步骤是首先将甘草酸溶解在二甲基甲酰胺中，然后依次加入二环已基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，常温下反应M小时后，再与载体蛋白分别在常温下混合，反应6小时，最后将反应液用0.05mol/L PBS缓冲液透析得到甘草酸人工完全抗原；
所述载体蛋白为血蓝蛋白和卵清白蛋白；所述甘草酸用量为10-50 mg，二甲基甲酰胺用量为2-5ml ；加入二环已基碳二亚胺的量为15-25 mg ；所述加入N-羟基琥珀酰亚胺的量为2_6 g ；
上述反应液用0. 05mol/L PBS缓冲液透析3_8次，每次2_6小时； 所述由甘草酸人工完全抗原免疫BalB/C小鼠的步骤为首先将稀释、与等体积福氏完全佐剂乳化后的甘草酸人工完全抗原对BalB/C小鼠进行腹腔及皮下多点免疫，免疫剂量 50-200 μ g，随后在21天、35天和49天分别进行三次加强免疫，佐剂为福氏非完全佐剂，免疫剂量50-100 μ g，至检测免疫效价达到10000:1，并且半数抑制小于500 ppb时满足融合条件；
所述通过杂交瘤技术获得的具体步骤为
1)将BalB/C小鼠的脾脏取出、用不完全培养基清洗、剥去结缔组织后，制备成脾细胞悬液，离心处理后再将细胞沉淀用不完全培养基离心洗涤，然后重新制备成IOml细胞悬液，混勻，备用。 2)将上述制备好的脾细胞与骨髓瘤细胞按照4 1的数量，及不完全培养基充分混合后离心，弃上清液，
3 )在37°C条件下缓慢滴加37°C的50%聚乙二醇，后lmin、2min、^iin加入完全培养基， 搅动离心管使聚乙二醇彻底稀释而失去融合作用，离心，沉淀用HAT选择培养液悬起，混合均勻，最后加入到已加有饲养细胞的96孔培养细胞培养板中，在37°C，5% 二氧化碳饱和湿度温箱中培养，
4)待杂交瘤细胞长满孔底1/3-1/2时，取细胞培养上清液用ELISA检测法检测，将 ELISA检测为阳性的细胞孔，转移至M孔板中，隔天测定效价仍为阳性，则进行亚克隆，其中抑制效果最好的命名为3D6 ；
上述能够产生抗甘草酸单克隆抗体的杂交瘤细胞株3D6制备抗甘草酸单克隆抗体的方法，其步骤为
1)用液体石蜡致敏BALB/c小鼠，腹腔注射0.5ml/只；
2)一周后，取1-2 X IO6个细胞注射小鼠腹腔；
3)观察小鼠不活跃并且腹部明显肿大时，收集腹水，随后每隔1一 2天采集一次，反复采集直到老鼠自然死亡为至；
4)收集到的腹水在4°C下保藏M小时，在2000rpm离心5min后收集的上清液即为抗甘草酸单克隆抗体；
上述所得到的抗甘草酸单克隆抗体采用如下步骤进行纯化
1)将抗甘草酸单克隆抗体用5000rpm高速冷冻离心机离心lOmin，取上层清亮腹水，按 1 2的比例加入0. 05mol/L ρΗ4· 4醋酸稀释，得稀释液；
2)按每毫升稀释液加33μ 1辛酸的比例，在4°C，搅拌状态下逐滴加入辛酸，IOmin内加完，4°C静置2小时；
3)在IOOOOrpm离心15分钟，取上清液，在冰浴条件下用氨水调pH至7.4 ；
4)将上清液用0.05mol/L PBS缓冲液透析5次，每次2小时；
5)取透析处理后溶液，在冰浴下搅拌，缓慢加入等体积饱和硫酸铵，然后在4°C静置
2h ；
6)在5000rpm下离心15min，取沉淀用0.Olmol/L, pH 7. 4 PBS缓冲液复溶，并在4°C条件下用PBS透析3次，即得纯化后的抗甘草酸单克隆抗体。甘草酸是小分子物质，不具备免疫原性，不能直接刺激动物产生抗体，因此，要想制备甘草酸单克隆抗体，首先得把甘草酸与相应大分子载体蛋白偶联构建人工合成抗原， 再利用该人工合成抗原获得甘草酸免疫抗原免疫动物，然后获取能稳定分泌抗甘草酸单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备，进而获得了抗甘草酸单克隆抗体。实验证明，该抗体可应用于甘草酸的免疫组织化学方法定位和定量检测。本发明的方法可以方便快捷地获得甘草酸人工抗原，成本低，效果好，且利用抗甘草酸单克隆抗体进行甘草真伪鉴定与含量测定时，具有快速、准确、灵敏的优点。
图1甘草酸(GA)结构图2血蓝蛋白(KLH)紫外扫描图； 图3卵清白蛋白(OVA)紫外扫描图； 图4甘草酸(GA)紫外扫描图； 图5甘草酸人工抗原GA-KLH紫外扫描图； 图6甘草酸人工抗原GA-OVA紫外扫描图； 图7酶联免疫方法检测GA含量。
具体实施例方式具体说明应理解，以下实例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。实施例1
甘草酸完全抗原的合成
1、称取甘草酸(GA)39mg，溶于2ml二甲基甲酰胺(DMF)中；
2、加入二环己基碳二亚胺(DCC)9. ang，混勻，再加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 5. 5mg， 室温反应过夜；
3、量取KLH和OVA各20mg，加入上述反应液，使小分子量与蛋白摩尔比为10:1，室温反应6h ；
4,0. 05 mol/L PBS (pH7. 2)透析5次，每次2h。分别获得GA-KLH和GA-0VA偶联物， 分装_20°C备用。5、甘草酸完全抗原的鉴定将甘草酸(GA)及其免疫抗原GA-KLH和GA-OVA及KLH、 OVA进行紫外扫描，从图可以看出，GA-KLH (紫外扫描，见附图5)和GA-OVA (紫外扫描，见附图6)的吸收峰，与KLH (紫外扫描，见附图2)、0VA (紫外扫描，见附图3)、GA (紫外扫描， 见附图4)的吸收峰相比，发生了明显变化，表明完全抗原GA-KLH和GA-OVA的偶联是成功的。实施例2
杂交馏细胞株的获得
UBALB/C小鼠(购自解放军第四军医大学)免疫及检测
(1)将GA-KLH稀释到ang/ml，并与等体积福氏完全佐剂充分乳化，腹腔及皮下多点免疫，免疫剂量IOOyg ；(2)于第21d，进行第一次加强免疫，佐剂为腹水非完全佐剂，免疫剂量IOOyg;
(3)分别于第35d、49d进行第2次、第3次加强免疫，免疫方式及剂量同上；
(4)第3次加强免疫后断尾取血，测定血清中抗体免疫效价及抑制情况，免疫效价达到 10000 1，并且半数抑制小于500 ppb，满足融合条件；
(5)进行细胞融合前进行最后一次免疫，免疫方式为尾静脉注射。2、细胞融合及筛选
(1)取BALB/C小鼠，将小鼠颈椎脱臼处死，75% (体积百分含量)酒精消毒5 10min ； (2 )将小鼠移入超净工作台内，无菌取出脾脏。放入已盛有不完全培养基的无菌平皿中清冼，剥去周围结缔组织；
(3)将脾脏移入另一无菌平皿内，制备脾细胞悬液，SOOrpm离心lOmin，细胞沉淀用不完全培养基同法离心洗涤一次，然后将细胞重悬至10ml，混勻，台盼蓝染色活细胞记数后备用；
(4)取准备好的脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0，由西北农林科技大学生命科学学院动物科学系赠送)按4 1数量，加入50ml的一次性无菌离心管内，加不完全培养基至30ml充分混勻后，800rpm离心lOmin，弃上清；
(5)用手指弹击管底，使两种细胞松散均勻。将离心管置于盛有37°C蒸馏水的烧杯中， 吸取37°C预热的50%聚乙二醇(PEG)溶液Iml在60s内缓慢滴入，边加边转动离心管，静止 Imin ；
(6)分别于lmin、2min、;3min加入完全培养基，搅动离心管使PEG彻底稀释而失去融合作用；离心，沉淀用HAT选择培养液悬起，混合均勻，用八道排枪加入到已加有饲养细胞的 96孔培养细胞培养板中，每孔100 1 ；将培养板放置37°C，5% 二氧化碳饱和湿度温箱中培养。(7)待杂交瘤细胞长满孔底1/3-1/2时，取细胞培养上清液100 1，既可用建立好的ELISA方法检测上清，以SP2/0细胞上清作为阴性对照。ELISA检测为阳性的细胞孔，将其转移至M孔板中，隔天测定效价如仍为阳性，及时进行亚克隆。应用该方法获得杂交瘤细胞株3D6，并于2011年10月M日，保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存号为CGMCC M22。实施例3
甘草酸单克隆抗体的获得 1、腹水制备
(1)在接种杂交瘤细胞的前1周，先用液体石蜡致敏8-12周龄雌性BALB/c小鼠，腹腔注射0. &iil/只，共注射10只；
(2)—周后收集杂交瘤细胞，用PBS或者不完全培养基洗涤2次，取1-2X IO6个细胞注射小鼠腹腔；
(3)接种后注意观察小鼠状态，一周后小鼠不活跃并且腹部明显肿大，这时即可收集腹水，先用酒精棉球消毒腹部皮肤，用5ml注射器针头刺入腹腔，从针头另一侧有淡黄色的腹水滴出，用无菌离心管收集，每隔1一2d采集一次，多次反复采集直到老鼠自然死亡；
(4)收集到的腹水放置冰箱内4°C过夜，2000rpm离心5min，取上清，分装，标记，-70°C保存。2、抗体纯化
(1)取待纯化的腹水预先离心(高速冷冻离心机5000rpm，IOmin)去除细胞、残渣、小颗粒物质；
(2)离心后，取上层清亮腹水。按1:2比例向腹水中加入醋酸buffer (0.05mol/L pH4. 4)稀释，得稀释腹水；
(3)按每毫升稀释腹水加33μ 1辛酸的比例，4°C条件下逐滴加入辛酸，产生大量沉淀； 滴加的过程中用磁力搅拌器搅拌，IOmin内加完，4°C静置池；
(4)取出溶液离心(lOOOOrpm，15min)，取上清。在冰浴条件下用氨水调pH至7.4 ；
(5)用量筒量取透析后溶液，冰浴条件下缓慢加入等体积饱和硫酸铵(50%)，滴加的过程中用磁力搅拌器搅拌，4°C静置池；
(6)离心(5000rpm，15min)，留沉淀，弃上清。沉淀用PBS (0. 01mol/L, pH 7. 4)复溶， 4°C条件下用PBS透析，换液3次。加防腐剂(0. 05% PR0CLIN300)。3、抗体鉴定
应用ELISA方法测定腹水效价表1腹水效价
权利要求
1.一种杂交瘤细胞株3D6，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期是2011年10月M日，保藏编号为CGMCC 5422。
2.按照权利要求1所述的杂交瘤细胞株3D6，其特征在于该杂交瘤细胞株3D6是由甘草酸人工完全抗原免疫BalB/C小鼠，并通过杂交瘤技术获得。
3.按照权利要求2所述的杂交瘤细胞株3D6，其特征在于所述的甘草酸人工完全抗原的获得步骤是首先将甘草酸溶解在二甲基甲酰胺中，然后依次加入二环己基碳二亚胺和 N-羟基琥珀酰亚胺，常温下反应M小时后，再与载体蛋白分别在常温下混合，反应6小时， 最后将反应液用0. 05mol/L PBS缓冲液透析得到甘草酸人工完全抗原。
4.按照权利要求3所述的杂交瘤细胞株3D6，其特征在于所述载体蛋白为血蓝蛋白和卵清白蛋白。
5.按照权利要求3所述的杂交瘤细胞株3D6，其特征在于所述甘草酸用量为10-50mg， 二甲基甲酰胺用量为2-5ml ；加入二环己基碳二亚胺的量为15-25mg ；所述加入N-羟基琥珀酰亚胺的量为2-6g。
6.按照权利要求3所述的杂交瘤细胞株3D6，其特征在于上述反应液用0.05mol/LPBS 缓冲液透析3-8次，每次2-6小时。
7.按照权利要求2所述的杂交瘤细胞株3D6，其特征在于所述由甘草酸人工完全抗原免疫BalB/C小鼠的步骤为首先将稀释、与等体积福氏完全佐剂乳化后的甘草酸人工完全抗原对BalB/C小鼠进行腹腔及皮下多点免疫，免疫剂量50-200 μ g，随后在21天、35天和 49天分别进行三次加强免疫，佐剂为福氏非完全佐剂，免疫剂量50-100 μ g，至检测免疫效价达到10000 1，并且半数抑制小于500ppb时满足融合条件。
8.按照权利要求2所述的杂交瘤细胞株3D6，其特征在于所述通过杂交瘤技术获得的具体步骤为1)将BalB/C小鼠的脾脏取出、用不完全培养基清洗、剥去结缔组织后，制备成脾细胞悬液，离心处理后再将细胞沉淀用不完全培养基离心洗涤，然后重新制备成IOml细胞悬液，混勻，备用。2)将上述制备好的脾细胞与骨髓瘤细胞按照4 1的数量，及不完全培养基充分混合后离心，弃上清液，3)在37°C条件下缓慢滴加37°C的50%聚乙二醇，后lmin、2minJmin加入完全培养基，搅动离心管使聚乙二醇彻底稀释而失去融合作用，离心，沉淀用HAT选择培养液悬起， 混合均勻，最后加入到已加有饲养细胞的96孔培养细胞培养板中，在37°C，5%二氧化碳饱和湿度温箱中培养，4)待杂交瘤细胞长满孔底1/3-1/2时，取细胞培养上清液用ELISA检测法检测，将 ELISA检测为阳性的细胞孔，转移至M孔板中，隔天测定效价仍为阳性，则进行亚克隆，其中抑制效果最好的命名为3D6。
9.一种利用如权利要求1所述的杂交瘤细胞株3D6制备抗甘草酸单克隆抗体的方法， 其步骤为1)用液体石蜡致敏BALB/c小鼠，腹腔注射0.5ml/只；2)一周后，取1-2 X IO6个细胞注射小鼠腹腔；3)观察小鼠不活跃并且腹部明显肿大时，收集腹水，随后每隔1-2天采集一次，反复采集直到老鼠自然死亡为至；4)收集到的腹水在4°C下保藏M小时，在2000rpm离心5min后收集的上清液即为抗甘草酸单克隆抗体。
10.按照权利要求9所述的杂交瘤细胞株3D6制备抗甘草酸单克隆抗体的方法，其特征在于所得到的抗甘草酸单克隆抗体采用如下步骤进行纯化1)将抗甘草酸单克隆抗体用5000rpm高速冷冻离心机离心lOmin，取上层清亮腹水，按 1 2的比例加入0. 05mol/L ρΗ4· 4醋酸稀释，得稀释液；2)按每毫升稀释液加33μ1辛酸的比例，在4°C，搅拌状态下逐滴加入辛酸，IOmin内加完，4°C静置2小时；3)在IOOOOrpm离心15分钟，取上清液，在冰浴条件下用氨水调pH至7.4 ；4)将上清液用0.05mol/L PBS缓冲液透析5次，每次2小时；5)取透析处理后溶液，在冰浴下搅拌，缓慢加入等体积饱和硫酸铵，然后在4°C静置2h ；6)在5000rpm下离心15min，取沉淀用0.01mol/L，pH 7. 4PBS缓冲液复溶，并在4°C条件下用PBS透析3次，即得纯化后的抗甘草酸单克隆抗体。
全文摘要
本发明提供杂交瘤细胞株，及利用其制备抗甘草酸单克隆抗体的方法，本发明通过把甘草酸与相应大分子载体蛋白偶联构建人工合成抗原，再利用该人工合成抗原获得甘草酸免疫抗原免疫动物，然后获取能稳定分泌抗甘草酸单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备，进而获得了抗甘草酸单克隆抗体。实验证明，该抗体可应用于甘草酸的免疫组织化学方法定位和定量检测。本发明的方法可以方便快捷地获得甘草酸人工抗原，成本低，效果好，且利用抗甘草酸单克隆抗体进行甘草真伪鉴定与含量测定时，具有快速、准确、灵敏的优点。
文档编号C07K1/30GK102409029SQ20111037621
公开日2012年4月11日 申请日期2011年11月23日 优先权日2011年11月23日
发明者刘滨, 彭励, 徐晨, 李宏富, 王英华, 郑丽萍, 马玲悦 申请人:宁夏大学