制备杂交细胞/嵌合细胞的方法及其应用的制作方法

专利名称：制备杂交细胞/嵌合细胞的方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及杂交细胞和用于生产杂交细胞的方法。具体地,本发明涉及从至少3 个细胞的杂交产生的杂交细胞，其中至少2个细胞源自不同的谱系。本发明另外涉及杂交细胞用于表达蛋白的应用，所述蛋白可用于多种诊断用途、预防用途、治疗用途和/或研究用途。
背景技术：
在本说明书自始至终对现有技术的任何讨论，绝不能视作承认这样的现有技术是广泛已知的，或形成本领域的普通一般常识的一部分。多种不同的细胞类型目前被用于表达蛋白，所述蛋白在商业上与多种诊断用途、 预防用途、治疗用途和/或研究用途有关。目前，这样的蛋白的生产常规地在细胞中进行， 所述细胞例如细菌、酵母、真菌、昆虫和非人哺乳动物细胞。细胞经常以多种翻译后修饰来修饰蛋白，所述翻译后修饰包括、但不限于糖基化、酰化、磷酸化、甲基化、硫酸化、异戍二烯化和脂质化(Iipidation)。这些修饰是物种特异性的，且因而，目前用于生产商业上有关的蛋白的细胞表现出这样的翻译后修饰所述修饰不同于在从人细胞表达的蛋白或在人体中天然存在的蛋白上观察到的翻译后修饰。例如，许多用于生产商业上有关的蛋白的非哺乳动物细胞类型要么缺少糖基化蛋白的能力， 要么表现出这样的糖基化模式所述模式不同于在人细胞中表达的蛋白所表现出的糖基化模式。甚至在非人哺乳动物表达系统诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中，确证了与人细胞相比糖基化模式的显著差异。例如，用于重组蛋白表达的CHO细胞系缺乏功能性的(α2， 6)唾液酸转移酶，该酶用于合成在人细胞中存在的(α 2，6)-连接的末端唾液酸。此外， 在CHO-细胞表达的糖蛋白上存在的唾液酸基序易于被CHO细胞内源性的唾液酸酶降解 (Gramer 等人 Biotechnology 13(7) :692_&，1995)。作为非人表达系统的不同翻译后修饰谱(repertoires)的结果，由它们表达的蛋白可能表现出不同于人细胞-衍生的蛋白的生理化学特征和药理学特征，诸如半衰期、免疫原性、稳定性和功能性的功效。这可以在很大程度上影响这些蛋白的临床效用。还有日益增多的证据表明，除了它的物种-依赖性的性质以外，在相同的物种内， 翻译后修饰也可以是组织特异性的，甚至是细胞类型特异性的。这具体地与表现出终末糖基化的蛋白的组织特异性的表达和细胞类型特异性的表达有关(Feizi Nature 314 53-54,1985 ;Rademacher 等人 Annu Rev Biochem 57 :785-838,1988)。具体地，已经表明， 3种唾液酸转移酶(它们将末端唾液酸附着至糖蛋白糖链上)表现出在大鼠的7种组织中显著不同的表达(Paulson等人J. Biol. Chem. 264 :10931-10934，1989)。这为相同蛋白的组织特异性的糖基化提供了支持。此外，使用由来自骨髓的小鼠成纤维细胞和小鼠成骨细胞表达的高度磷酸化的糖蛋白(小鼠骨桥蛋白)的两种同工型的研究，表现出它们的磷酸化程度的主要差异，这与生物活性的差异有关。这些结果提示，由不同的细胞类型生产的骨桥蛋白的功能是不同的(Christensen 等人 J Biol. Chem. 282(27) : 19463-19472)。适用于生产表现出全人特征的生物制品的有效的细胞系统理想地应当满足许多标准，包括、但不限于
a)源自人组织；
b)在培养中高密度生长；
c)表现出商业上可行的蛋白得率；
d)允许稳定的外来基因导入；
e)允许基因扩增方法；
f)允许使用亲本细胞进行单克隆抗体生产，如在人-人杂交瘤中；
g)表现出稳定的长期蛋白表达；
h)在无血清的和无谷氨酰胺的培养基中生长的能力；
i)缺乏内肽酶活性，从而减少蛋白降解，
j)不含有致病剂，包括病毒DNA和支原体；
k)生产表现出翻译后修饰的蛋白，所述翻译后修饰在功能上与在天然存在的人蛋
白上发生的翻译后修饰类似或相同，优选地是组织和细胞特异性的。这些翻译后修饰可以包括、但不限于糖蛋白上的碳水化合物部分。尽管存在许多用于表达人蛋白的人宿主细胞或异源杂交瘤(heterohybridomas), 但它们都没有成功地满足所有上述标准。最值得注意的是，从现有的人细胞表达系统以临床上有用的得率表达和分离蛋白的尝试，已经导致有限的成功。真核细胞中的蛋白表达在多个阶段受到控制，所述阶段包括(a)调节因子对染色质中的基因的影响；(b)转录起始的调节；和(c)翻译后修饰。认为这些不同的阶段是发育阶段特异性的和/或组织特异性的。因而，当将编码所需蛋白的外源基因掺入细胞中时，所需蛋白的表达可能小于最佳量。可能产生问题，诸如缺乏稳定的表达(Li等人，Proc Natl Acad Sci USA 95 :3650-3654,1998 ;Miyaji 等人，Cytotechnology，3 :133_140，1990 ; Miyaji 等人，Cytotechnology 4 :173-180,1990 ；Miyaji 等人，Cytotechnology 4 :39-43, 1990 ;Satoh 等人，Cytotechnology 13 :79_88，1993)、低表达得率(Airoldi 等人，Cancer Research 61 :1285-1290，2001 ；Hosoi 等人 Cytotechnology 7 :25-32,1991)和非最佳的翻译后修饰(Shinkawa等人，J. Biol. Chem. 278 =3466-3473,2003)。所有这些因素都可能影响蛋白的潜在商业效用。作为一个实例，Namalwa细胞(在悬浮培养物中生长并适应没有血清和清蛋白的培养基的人B类淋巴母细胞)的一个亚系Namalwa KJM-1,被用于大规模生产α-干扰素， 后者是伯基特氏淋巴瘤细胞的内源蛋白。但是，当将G-CSF蛋白(它对于伯基特氏淋巴瘤细胞而言是外来的，但是对于B细胞而言是内源的(Airoldi等人，Cancer Research 61 1285-1290,2001))用作经由电穿孔的转染的靶向蛋白时，G-CSF表达水平在多个氨甲蝶呤 (MTX)抗性的克隆中存在不同，且最高的G-CSF生产克隆具有仅2. 4μ g/ml/天的比生产率 (当适应无血清的条件时)。此外，当细胞数目超过7xl05细胞/ml时，高密度培养抑制比生产率(Hosoi等人 Cytotechnology 7 :25-32,1991)。即使报道的最大G-CSF浓度显著提高并达到41 μ g/ml, 但为了实现它，需要广泛地并费力地操纵细胞培养条件，其中非常严紧地控制pH。也表明用于最佳生长的培养基不同于用于最佳生产的培养基，因而产生希望的高密度和高生产率之间的明显冲突，并导致工业上不可行的系统。因为真核生物中的基因表达在多个步骤中受到控制，所述步骤包括(a)染色质中的基因的调节因子的可用性和可接近性；(b)对特定转录起始速率的可及启动子的调节；和(c)随后在不同的步骤处的转录后事件，组织特异性的和发育特异性的转录因子的存在对基因的表达具有很大影响。此外，特定细胞类型的基因调节需要几种顺式作用的DNA调节序列的协同作用，所述调节序列是将分子信号传递给基因的蛋白的结合位点 (Blackwood等人,Science 281 :60-63,1998)。这些序列结合调节蛋白，以形成称作增强体 (enhanceosome)的复合物(Marika 等人,Curr Opin Genet Dev 11(2) :205-208, 2001)。 因而，当导入人谱系特异性的宿主细胞中时被靶向的基因离它的通常细胞环境越远，所需蛋白在高生产水平的稳定表达和生产越低。当用外来蛋白的基因转染Namalwa KJM-I细胞时，所述外来蛋白进一步远离谱系特异性的蛋白(对于类淋巴母细胞系而言)，诸如β干扰素(Miyaji 等人，Cytotechnology, 3 :133-140,1990 ；Miyaji 等人，Cytotechnology 4 173-180,1990)或人淋巴毒素(Miyaji 等人，Cytotechnology 4:39-43,1990)或尿激酶原 (Satoh等人，Cytotechnology 13 :79-88,1993),发现转染率和细胞生产率甚至更低。外来基因在人谱系特异性的细胞系中的有效表达也需要小心的、且有时使人厌烦的合适的增强子/启动子选择，所述增强子/启动子将含有人宿主细胞可利用的核因子的结合位点。发现这样的增强子/启动子仍然可能导致这样的启动子的有限的适合性。例如，当研究几种增强子/启动子(诸如猿猴病毒40(SV40)早期基因启动子、人巨细胞病毒(hCMV)主要立即早期基因启动子、莫洛尼鼠白血病病毒(Mo-MuLV)启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子和鸡β-肌动蛋白启动子)在Namalwa KJM-I细胞中对外来基因的更有效表达时，发现Mo-MuLV启动子是传统的SV40早期启动子的约10倍强，且高生产克隆达到 30-40 μ g/IO6 细胞 / 天的生产率(Satoh 等人，Cytotechnology 18 162-172,1996)。 但是，使用逆转录病毒载体诸如Mo-MuLV的问题是,难以用于具有倒转序列(inverting sequences)(内含子)的基因的转染，这是由于核剪接机制对它们的去除(Li等人，Proc Ntl Acad Sci USA 95:3650-3654,1998)。在由2个基因编码的蛋白(诸如抗体)的情况下，甚至进一步增加细胞和核环境之间的不匹配。此外，尽管Namalwa KJM-I细胞被用于制备人-人杂交瘤，但抗体得率使得该细胞系不适合工业生产。作为另一个实例，已经证实人胚肾细胞系293可以被外来来源的基因非常容易地转染，具有高度的稳定性。但是，源自293转染子的蛋白具有有限的用途，且通常仅适用于研究目的，这是因为293细胞包括人腺病毒AdOTNA (HEK 293细胞)。但是，在商业场合使用 293细胞的最大限制是它的贴壁性质。已经进行了许多尝试来使293细胞适合悬浮液中的有效转染，其中使用节省成本的载体诸如聚乙烯亚胺(Durocher等人，Nucleic Acids Res 30(2) :e9, 2002 ;Schlaeger 等人,Cytotechnology 30:71-83,1999)或憐酸隹丐(Girard 等人，Cytotechnology 38 :15-21, 2002 ； Jordan 等人，Cytotechnology 26 :39-47,1998 ； Meissner 等人，Biotechno I Bioeng 75(2) :197-203, 2001)。但是，这些载体仅导致重组蛋白的瞬时表达，这意味着，对于接种的培养物的每个新批次，必须重复转染。在EBV的oriP 存在于载体主链上时，为了实现悬浮生长和更高的蛋白表达，必须遗传地修饰293细胞，以稳定地表达 ElB 病毒 EBNAl 蛋白(293E) (Durocher 等人，Nucleic Acids Res 30(2) e9, 2002 ;Parham 等人，Cytotechnology 35 :181-187, 2001 ;Schlaeger 等人，Cytotechnology 30 :71-83，1999)。甚至在用EBNAl转染以后，当在无血清培养基(HEK293EBNA1)中培养(大规模生产的先决条件)时，293E细胞表现出非常差的转染率，这最可能是由于为了防止细胞集合而加入的聚阴离子(肝素，硫酸葡聚糖)的存在。已经尝试如下减轻该问题给培养基补加蛋白胨，所述蛋白胨从动物来源(诸如肉、明胶和酪蛋白)的酶促水解得到(Pham 等人，Biotechnol Bioeng 84(3) :332-42,2003) 当将 HEK293 EBNAl 细胞系用于生产 Tie-2 (血管形成素(angiopoietin)生长因子的受体酪氨酸激酶)和神经租蛋白-IED (介导神经元细胞导向的受体)时，蛋白表达受到得到的低细胞密度培养物(与在未转染的培养物中得到的那些相比)的限制。同样，得到的蛋白的>95%的纯度仅适用于研究级产物。 另外，HEK293EBNA1细胞不适用于生产单克隆抗体(mAb)。目前的生产治疗用mAb的策略包括使用哺乳动物细胞系统(即CHO或NSO转染瘤)来重组地生产由下述获得的mAbs :免疫接种携带人Ig基因的转基因小鼠(xenomice), 人源化哨齿类动物mAbs,或通过筛选人mAb文库(van Di jk等人,Curr. Opin. Chem. Biol. 5 368-374,2001)。尽管在它们的序列方面，治疗用mAb最近已经发展成嵌合抗体(啮齿类动物可变区和人恒定区)、人源化的抗体(除了啮齿类动物互补决定区以外，都是人序列) 和全人抗体(人Ab)以使变应性应答最小化，但治疗用mAb的重要方面是它的引起免疫效应子功能(诸如抗体依赖性细胞毒作用)的能力，如果mAb是由改变它的天然糖基化模式的非人宿主细胞生产的，则该能力受损(Shinkawa等人，J. Biol. Chem. 278 =3466-3473, 2003)。考虑到这些事实，理想的方案是，由人细胞生产治疗用抗体。在该情况下，全人mAb 将能够发挥人效应子功能，并因为它们的天然的人结构而具有非常有限的免疫原性。已经报道了杂交瘤或EB病毒(EBV)-转化的源自人B细胞的类淋巴母细胞系的制备(Kirman 等人，Hybrid. Hybridomics 21 :405-414,2002 ；Boerner 等人，J. Immunol. 147 86-95,1991 ;Zafiropoulos 等人，J. Tmmunol. Methods 200 :181-190,1997)。但是，关于这些mAb和系在它们的长期稳定性和生产过程的适合性(尤其是整批生产过程中的生产水平和Ig分泌的稳定性)方面的表征，存在有限的信息。尽管已经报道了在4天运行期间以 I. 2g/升的累积效价生产抗人GM-CSF的人mAb的细胞系，但这些细胞系源自原代人B细胞与异源髓淋巴瘤(heteromyelolymphoma)K6H6/B5细胞(即从人B细胞淋巴瘤和小鼠骨髓瘤细胞的杂交得到的小鼠-人细胞系)的体细胞杂交(融合)(Li等人，Proc Natl Acad Sci USA 103(10) :3557-3562,2006)。在EBV-转化的情况下，困难是，确立完全无限增殖化的人B细胞系，同时维持稳定的抗体生产。这是由于无限增殖化的低功效、细胞生长的停滞、和生产IgM的细胞的优势无限增殖化。另外，最近的报道已经表明，大多数EBV-转化的B细胞具有缩短的端粒和有限的寿命，主要是在160群体倍增水平之前(Sugimoto等人，J Virol 73 =9690-9691,1999 ； Toda等人，J Chromatogr B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 787 :197-206, 2003)。为了克服该问题，已经尝试使EBV-转化的B细胞与合适的配偶体细胞系(表达系统)杂交(或融合)，但是实际上，这些配偶体细胞系代表异源杂合体(heterohybrid)的各种组合，诸如源自小鼠-人异源杂交瘤与人B细胞的三源杂交瘤(trioma) (Ainai等人,Hum Antibodies 15 139-154, 2006 ;Kalantarov 等人，Hum Antibodies 11 :85-96, 2002 ;Karpas 等人，ProcNatl Acad Sci USA 98 :1799-1804，2001)。当将这样的三源杂交瘤与生产针对破伤风毒素 (TT)的抗体的原代EBV-转化的B细胞融合时，导致产生具有1/4的小鼠组分的四源杂交瘤 (tetroma)。尽管在连续克隆四源杂交瘤3次以后仍然可能稳定地生产针对TT的mAb，但这样的重复的细胞克隆步骤是费力的且费时的。另外，尽管由四源杂交瘤生产的mAb的量对于实验目的而言是足够的，但该水平对于作为药物的mAb的大规模生产而言是不足的。仍然有疑问的是，在有多克隆激活剂CpG 2006或者CD19或BCR的共同连接(co-ligation) 存在下，无限增殖化是否可能产生完整的系统，用于以适当的体积有效地生产用于治疗用途的特定 mAb (Hartman 等人，J Tmmunol 164 :944-953, 2000 ;Hur 等人，Cell Prolif 38: 35-45,2005 ;Traggiai 等人，Nat Med 10 :871-875,2004)。已经尝试了许多方法来使用人细胞生产生物学物质，诸如生长因子、抗体和可溶性的蛋白。本发明的一个目的是，克服或改善现有技术的至少一个缺点，或提供有用的替代方案。

发明内容
普遍认为，多融合细胞是不稳定的，且参与融合的细胞越多，得到的杂交细胞的不稳定性越大。令人惊奇地，在本发明中，由许多细胞(例如3个细胞)的融合产生的杂交细胞表现出功能稳定性。具体地，已经发现，源自不同谱系的细胞可以体细胞地 (somatically)融合或杂交，以形成基本上稳定的嵌合细胞/杂交细胞。更具体地，本发明涉及如下制备的跨谱系(cross-lineage)嵌合细胞/杂交细胞杂交至少3个亲本细胞，产生三杂交体(tri-hybrid)，其中至少2个亲本细胞源自不同的谱系，且其中在杂交中没有包括骨髓瘤细胞。还已经令人惊讶地发现，本发明的稳定的嵌合细胞/杂交细胞具有多种用途，例如，用于生产表现出希望的翻译后修饰(例如，但不限于，人糖基化模式)的蛋白。还已经令人惊讶地发现，当从本发明的嵌合细胞/杂交细胞同时地表达第二种所需蛋白时，可以增强来自本发明的稳定的嵌合细胞/杂交细胞的所需蛋白的表达水平。此外，从本发明的嵌合细胞/杂交细胞同时地表达第三种所需蛋白，可以增强2种靶蛋白的表达水平。因此，本发明提供了在杂交细胞的多方适应性和稳定性方面明显胜过以前已知的系统的优点。在一个实施方案中，通过融合2个相同的细胞或相同谱系的2个细胞以及不同谱系的I个细胞，生产本发明的杂交细胞。这样的杂合体倾向于出现指向在杂交中使用的大多数细胞类型的表型。这些杂交细胞可以特别地用于表达蛋白，其中已知组织-特异性的翻译后修饰对于蛋白功能而言是重要的。例如，从包括至少2个源自B细胞谱系的细胞的杂交细胞，可以更有效地表达已知在从B细胞表达时具有特定功能性的翻译后修饰的细胞因子，从而确保功能性的翻译后修饰。由于蛋白的翻译后修饰可能是组织特异性的或细胞类型特异性的，所以技术人员显而易见，本发明的杂交细胞也可以富含特定细胞类型或表型(如特定CD标记物的存在所证实的)，以允许表达这样的蛋白所述蛋白表现出希望的翻译后修饰或与特定细胞类型或表型有关的希望的功能性。
在一个实施方案中，本发明涉及杂交细胞，其包括使用至少一个无限增殖化的细胞。但是，本领域技术人员显而易见，本发明也涉及非无限增殖化的细胞的融合，所述细胞随后可以通过体外转化方法无限增殖化，所述方法例如导入病毒基因，例如EB病毒 (EBV)、猿猴病毒40 (SV40) T抗原、腺病毒ElA和ElB和人乳头瘤病毒(HPV) E6和E7。或者， 通过表达端粒末端转移酶逆转录酶蛋白(TERT)，可以使非无限增殖化的细胞无限增殖化。 无限增殖化的细胞也可以源自其中癌基因表达已经被修饰的细胞。无限增殖化的细胞另外可以源自诱导无限生长的能力的任何动作，包括、但不限于紫外线暴露或自发转化(其中无限增殖的机理不明)。显而易见，在一个实施方案中，本发明涉及3个个别细胞的融合。在替代实施方案中，本发明涉及3个细胞群体的融合，其中每个群体包括多个相同的细胞类型。本领域技术人员将理解，细胞群体的融合可以在大量细胞培养物中进行。然后可以通过本领域众所周知的方法，例如通过选择性培养基，诸如次黄嘌呤氨基蝶呤胸苷(HAT)培养基，鉴别和分离希望的杂交的细胞。或者，通过鉴别特定的细胞标记物，诸如CD标记物，可以鉴别和分离融合的细胞。显而易见，通过本领域众所周知的方法，诸如荧光激活细胞分选术(FACS)方法， 可以实现基于它们的标记物(诸如CD标记物)的表达以及细胞对特定细胞类型或表型的富集来分离细胞。还显而易见，可以用编码所需蛋白的DNA稳定地或瞬时地转染本发明的细胞。通过本领域众所周知的方法，诸如通过在用于转染的DNA中包含选择报道基因，可以鉴别出这些稳定地或瞬时地转染的细胞。这样的报道基因可以包括这样的基因所述基因能够使转染的细胞在化合物-缺陷型培养基中生长，例如二氢叶酸还原酶(dhFr)基因。报道基因还可包括赋予转染的细胞的目视鉴定的基因，例如，萤光素酶基因或绿色荧光蛋白(gfp) 基因。或者，报道基因可以赋予对特定化合物(例如G418)的抗性。这样的报道基因是本领域众所周知的。在一个优选的实施方案中，本发明的杂交细胞可以用于表达单克隆抗体。传统上， 已经通过融合骨髓瘤细胞和源自免疫接种的动物(诸如小鼠)的脾的B细胞，进行单克隆抗体生产。但是，骨髓瘤细胞不稳定性且尤其是基因组不稳定性可能导致所需抗体的差强人意的表达。另外，因为动物细胞被用于生产杂交瘤，所以生产的抗体表现出非人翻译后修饰。当将抗体用作人治疗剂时，具有非人翻译后修饰的抗体可能产生显著的问题。这些问题可能包括抗体的降低的效应子功能以及免疫原性，从而导致令人不满意的体内半衰期和因此导致的降低的体内功效。也有证据提示，在没有骨髓瘤细胞存在下，不能成功地生产杂合体。本发明的杂交细胞令人惊讶地表明，在没有骨髓瘤细胞存在下，可以生产稳定的杂合体。此外，由本发明的杂交细胞表达的抗体解决了与使用由杂交瘤生产的单克隆抗体有关的问题。这些抗体表现出人源化的翻译后修饰，并由表现出功能稳定性的细胞表达。根据第一个方面，本发明提供了通过杂交下述细胞而制备的杂交细胞第一个细胞，其中所述第一个细胞是干细胞或源自未定型的祖细胞的细胞；源自淋巴共同祖细胞的第二个细胞；和源自淋巴共同祖细胞的第三个细胞，且其中所述第一个细胞不是骨髓瘤细胞。
在一个实施方案中，所述第二个细胞是源自B淋巴谱系的细胞，且所述第三个细胞是源自B淋巴谱系的细胞。在另一个实施方案中，所述第二个细胞是源自T淋巴谱系的细胞，且所述第三个细胞源自T淋巴谱系。在另一个实施方案中，所述第二个细胞是源自B淋巴谱系的细胞，且所述第三个细胞是源自T淋巴谱系的细胞。优选地，所述第一个细胞是源自髓共同祖细胞的细胞。这样，显而易见，本发明提供了通过杂交I个髓共同祖细胞或I个干细胞和2个B淋巴样细胞或2个T淋巴样细胞而制备的杂交细胞。本发明也提供了通过杂交I个髓共同祖细胞或I个干细胞、I个B淋巴样细胞和I个T淋巴样细胞而制备的杂交细胞。优选地，所述源自髓共同祖细胞的细胞是骨髓单核祖细胞、单核细胞、巨噬细胞、 嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞或嗜碱性粒细胞。因此，显而易见，本发明提供了通过杂交I个骨髓单核祖细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞或嗜碱性粒细胞和2个B淋巴样细胞或2个T淋巴样细胞而制备的杂交细胞。本发明也提供了通过杂交I个骨髓单核祖细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞或嗜碱性粒细胞、I个B淋巴样细胞和I个T淋巴样细胞而制备的杂交细胞。优选地，所述源自髓共同祖细胞的细胞显示至少一种下述⑶抗原⑶16、⑶15或 ⑶14。因此，显而易见，本发明提供了通过杂交I个显示至少一种下述⑶抗原的髓共同祖细胞和2个B淋巴样细胞或2个T淋巴样细胞而制备的杂交细胞⑶16、⑶15或⑶14。本发明也提供了通过杂交I个显示至少一种下述CD抗原的髓共同祖细胞、I个B淋巴样细胞和I个T淋巴样细胞而制备的杂交细胞⑶16、⑶15或⑶14。在一个实施方案中，所述源自髓共同祖细胞的细胞是单核细胞。因此，本发明提供了通过杂交I个单核细胞和2个B淋巴样细胞或2个T淋巴样细胞而制备的杂交细胞。本发明也提供了通过杂交I个单核细胞、I个B淋巴样细胞和I个T淋巴样细胞而制备的杂交细胞。在另一个实施方案中，所述源自髓共同祖细胞的细胞是原代骨髓单核祖细胞。因此，本发明提供了通过杂交I个原代骨髓单核祖细胞和2个B淋巴样细胞或2个T淋巴样细胞而制备的杂交细胞。本发明也提供了通过杂交I个原代骨髓单核祖细胞、I个B淋巴样细胞和I个T淋巴样细胞而制备的杂交细胞。在一个实施方案中，所述源自髓共同祖细胞的细胞是无限增殖化的细胞。因此，显而易见，本发明提供了通过杂交I个选自下述的无限增殖化的细胞和2个B淋巴样细胞或2 个T淋巴样细胞而制备的杂交细胞骨髓单核祖细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、 嗜中性粒细胞、树突细胞或嗜碱性粒细胞。本发明也提供了通过杂交I个选自下述的无限增殖化的细胞、I个B淋巴样细胞和I个T淋巴样细胞而制备的杂交细胞骨髓单核祖细胞、 单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞或嗜碱性粒细胞。在另一个实施方案中，所述源自髓共同祖细胞的细胞源自脾、外周血、脐带血或骨髓。因此，显而易见，本发明提供了通过杂交I个源自脾、外周血、脐带血或骨髓的髓共同祖细胞和2个B淋巴样细胞或2个T淋巴样细胞而制备的杂交细胞。本发明也提供了通过杂交I个源自脾、外周血、脐带血或骨髓的髓共同祖细胞、I个B淋巴样细胞和I个T淋巴样细胞而制备的杂交细胞。在另一个实施方案中，所述源自B淋巴谱系的细胞是前B细胞、幼B细胞、幼稚B细胞、活化的B细胞或效应B细胞。因此，显而易见，本发明提供了通过杂交I个髓共同祖细胞或I个干细胞和2个选自下述的B淋巴样细胞而制备的杂交细胞前B细胞、幼B细胞、 幼稚B细胞、活化的B细胞或效应B细胞。本发明也提供了通过杂交I个髓共同祖细胞或干细胞、I个选自下述的B淋巴样细胞和I个T淋巴样细胞而制备的杂交细胞前B细胞、 幼B细胞、幼稚B细胞、活化的B细胞或效应B细胞。在一个实施方案中，所述效应B细胞是抗原处理过的(antigen-experienced) B-细胞或浆细胞。因此，本发明提供了通过杂交I个髓共同祖细胞或干细胞和2个选自下述的B淋巴样细胞而制备的杂交细胞抗原处理过的B-细胞或浆细胞。本发明也提供了通过杂交I个髓共同祖细胞或干细胞、I个抗原处理过的B-细胞或浆细胞和I个T淋巴样细胞而制备的杂交细胞。在一个实施方案中，所述源自B淋巴谱系的细胞显示至少一种下述⑶抗原⑶19、 ⑶20、⑶72或⑶5。因此，本发明提供了通过杂交I个髓共同祖细胞或干细胞和2个显示至少一种下述⑶抗原的B淋巴样细胞而制备的杂交细胞⑶19、⑶20、⑶72或⑶5。本发明也提供了通过杂交I个髓共同祖细胞或干细胞、I个显示至少一种下述CD抗原的B淋巴样细胞和I个T淋巴样细胞而制备的杂交细胞⑶19、⑶20、⑶72或⑶5。在一个实施方案中，所述源自T淋巴谱系的细胞是前T细胞、幼T细胞、幼稚T细胞、活化的T细胞或效应T细胞。因此，本发明提供了通过杂交I个髓共同祖细胞或干细胞、 I个B淋巴样细胞和I个选自下述的T淋巴样细胞而制备的杂交细胞前T细胞、幼T细胞、 幼稚T细胞、活化的T细胞或效应T细胞。本发明也提供了通过杂交I个髓共同祖细胞或干细胞和2个选自下述的T淋巴样细胞而制备的杂交细胞前T细胞、幼T细胞、幼稚T细胞、活化的T细胞或效应T细胞。在一个实施方案中，所述源自T淋巴谱系的细胞显示至少一种下述⑶抗原⑶3、 ⑶4、⑶5或⑶8。因此，本发明提供了通过杂交I个髓共同祖细胞或干细胞、I个B淋巴样细胞和I个显示至少一种下述⑶抗原的T淋巴样细胞而制备的杂交细胞⑶3、⑶4、⑶5或 CD8。本发明也提供了通过杂交I个髓共同祖细胞或干细胞和2个T淋巴样细胞而制备的杂交细胞，所述T淋巴样细胞选自显示至少一种下述⑶抗原的T细胞⑶3、⑶4、CD5或⑶8。在一个实施方案中，所述源自B淋巴谱系的细胞是无限增殖化的细胞。因此，本发明提供了通过杂交I个髓共同祖细胞或干细胞和2个B淋巴样细胞而制备的杂交细胞，所述B淋巴样细胞中的至少一个可以是无限增殖的细胞。本发明也提供了通过杂交I个髓共同祖细胞或干细胞、I个无限增殖的B淋巴样细胞和I个T淋巴样细胞而制备的杂交细胞。在一个实施方案中，所述源自T淋巴谱系的细胞是无限增殖化的细胞。因此，本发明提供了通过杂交I个髓共同祖细胞或干细胞、I个B淋巴样细胞和I个无限增殖的T淋巴样细胞而制备的杂交细胞。在一个实施方案中，所述源自B淋巴谱系的细胞源自淋巴组织。因此，本发明提供了通过杂交I个髓共同祖细胞或干细胞和2个源自淋巴组织的B淋巴样细胞而制备的杂交细胞。本发明也提供了通过杂交I个髓共同祖细胞或干细胞、I个源自淋巴组织的B淋巴样细胞和I个T淋巴样细胞而制备的杂交细胞。
在一个实施方案中，所述源自T淋巴谱系的细胞源自淋巴组织。因此，本发明提供了通过杂交I个髓共同祖细胞或干细胞、I个B淋巴样细胞组织和I个源自淋巴组织的T淋巴样细胞而制备的杂交细胞。在本发明的杂交细胞中所包括的B或T淋巴样细胞源自淋巴组织的情况下，所述淋巴组织优选地选自外周血、脐带血、脾、骨髓、胸腺、扁桃体、腺样体(adenoids)和局部淋巴结。在一个实施方案中，在本发明的杂交细胞的制备中包含的细胞中的至少一个是人细胞。还显而易见，在一个实施方案中，本发明的杂交细胞可以包含至少一个小鼠细胞。在一个实施方案中，所述源自髓共同祖细胞的细胞是K562细胞。因此，显而易见， 本发明提供了通过杂交I个K562细胞和2个B淋巴样细胞而制备的杂交细胞。本发明也提供了通过杂交I个K562细胞、I个无限增殖的B淋巴样细胞和I个T淋巴样细胞而制备的杂交细胞。在一个实施方案中，所述第二个细胞或所述第三个细胞是WIL2-NS细胞或M0LT4 细胞。因此，显而易见，本发明提供了通过杂交I个髓共同祖细胞或干细胞、I个WIL2-NS细胞和I个T淋巴样细胞而制备的杂交细胞。本发明也提供了通过杂交I个髓共同祖细胞或干细胞、I个B淋巴样细胞和I个M0LT4细胞而制备的杂交细胞。在一个实施方案中，所述第一个细胞是K562细胞，所述第二个细胞是WIL2-NS细胞，且所述第三个细胞是M0LT4细胞。在另一个实施方案中，所述第一个细胞是K562细胞，所述第二个细胞是原代B细胞，且所述第三个细胞是原代T细胞。在另一个实施方案中，所述第一个细胞是原代人单核细胞，所述第二个细胞是 WIL2-NS细胞，且所述第三个细胞是原代T细胞。在另一个实施方案中，所述第一个细胞是原代人骨髓单核祖细胞，所述第二个细胞是WIL2-NS细胞，且所述第三个细胞是原代人T细胞。在另一个实施方案中，所述第一个细胞是K562细胞，所述第二个细胞是WIL2-NS 细胞，且所述第三个细胞是原代T细胞。在另一个实施方案中，所述第一个细胞是原代单核细胞，所述第二个细胞是 WIL2-NS细胞，且所述第三个细胞是WIL2-NS细胞。在另一个实施方案中，所述第一个细胞是原代小鼠单核细胞，所述第二个细胞是 SP2细胞，且所述第三个细胞是原代小鼠T细胞。在另一个实施方案中，所述第一个细胞是原代小鼠单核细胞，所述第二个细胞是 SP2细胞，且所述第三个细胞是SP2细胞。在另一个实施方案中，所述第一个细胞是原代人或小鼠单核细胞，所述第二个细胞是WIL2-NS细胞，且所述第三个细胞是SP2细胞。在一个实施方案中，本发明的杂交细胞表达所需蛋白。在另一个实施方案中，本发明的杂交细胞表达超过一种所需蛋白。在某些实施方案中，本发明的杂交细胞表达2种所需蛋白。在其它实施方案中，本发明的杂交细胞表达3种所需蛋白。在一个实施方案中，所述所需蛋白是内源蛋白，且在表达超过一种所需蛋白的情况下，至少一种所需蛋白是内源蛋白。在另一个实施方案中，所述蛋白是重组蛋白，且在表达超过一种所需蛋白的情况下，至少一种所需蛋白是重组蛋白。优选地，所述蛋白是细胞因子，例如集落刺激因子或白介素。在一个实施方案中，所述蛋白是GM-CSF。在另一个实施方案中，所述蛋白是白介素2。 在另一个实施方案中，所述蛋白是受体或其片段。在一个实施方案中，所述蛋白是可溶的受体。在另一个实施方案中，所述蛋白是免疫球蛋白。在一个实施方案中，所述蛋白是人IL-4受体α链。在另一个实施方案中，所述蛋白是IgM。在另一个实施方案中，所述蛋白是IgG。在另一个实施方案中，所述蛋白是CD54。在一个实施方案中，在本发明的杂交细胞表达超过一种所需蛋白的情况下，优选地所需蛋白选自细胞因子、集落刺激因子、白介素或受体或其片段。在具体实施方案中，所需蛋白是免疫球蛋白，诸如IgM、且具体是可溶的人IgM ;细胞因子,例如白介素、且具体是白介素-2(IL-2)、且更具体地是人IL-2 ;和/或受体，具体是白介素受体、且更具体地是人白介素受体、且甚至更具体地是人白介素-4受体a (IL_4Ra)。技术人员将理解，本发明的杂交细胞不限于表达特定所需蛋白，它们也不限于表达特定数目的蛋白。此外，技术人员显而易见，从本发明的杂交细胞同时表达所需蛋白，可以导致所需蛋白表达水平的增强。在一个实施方案中，所述用于制备本发明的杂交细胞的杂交是通过电方法来实现的。在另一个实施方案中，所述制备本发明的杂交细胞的杂交是通过化学方法来实现的。在一个实施方案中，本发明的杂交细胞另外与表达目标蛋白的细胞杂交。在具体实施方案中，本发明的杂交细胞与显示CD25抗原的B淋巴细胞杂交。在特别优选的实施方案中，本发明的杂交细胞显示CD25抗原，并表达免疫球蛋白。在另一个实施方案中，本发明的杂交细胞与显示CD25抗原的B淋巴细胞杂交，且得到的细胞表达免疫球蛋白。在一个实施方案中，通过杂交3个个别细胞，进行所述用于制备本发明的杂交细胞的杂交。在另一个实施方案中，使用3个细胞群体，进行所述用于制备本发明的杂交细胞的杂交，其中每个所述群体包括多个相同的细胞类型或表型。在一个实施方案中，本发明的所述杂交细胞富含界定特定细胞类型的标记物，以允许表达表现出希望的翻译后修饰或希望的功能性的蛋白。在另一个方面，本发明提供了一种生产蛋白的方法，所述方法包括下述步骤在根据本发明的杂交细胞中表达蛋白。在另一个方面，本发明提供了在根据本发明的杂交细胞中生产的蛋白。在另一个方面，本发明提供了一种生产根据本发明的杂交细胞的方法，其中所述方法包括下述步骤杂交第一个细胞，其中所述第一个细胞是干细胞或源自未定型的祖细胞的细胞；源自淋巴共同祖细胞的第二个细胞；和源自淋巴共同祖细胞的第三个细胞，且其中所述第一个细胞不是骨髓瘤细胞。在本发明的方法的一个实施方案中，所述第二个细胞是源自B淋巴谱系的细胞， 且所述第三个细胞是源自B淋巴谱系的细胞。在本发明的方法的另一个实施方案中，所述第二个细胞是源自T淋巴谱系的细胞，且所述第三个细胞源自T淋巴谱系。在本发明的方法的另一个实施方案中，所述第二个细胞是源自B淋巴谱系的细胞，且所述第三个细胞是源自T淋巴谱系的细胞。优选地，所述第一个细胞是源自髓共同祖细胞的细胞。因此，显而易见，本发明提供了通过杂交I个髓共同祖细胞或I个干细胞和2个B淋巴样细胞或2个T淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法。本发明也提供了通过杂交I个髓共同祖细胞或I个干细胞、I个B淋巴样细胞和I个T淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法。优选地，所述源自髓共同祖细胞的细胞是骨髓单核祖细胞、单核细胞、巨噬细胞、 嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞或嗜碱性粒细胞。因此，显而易见，本发明提供了通过杂交I个骨髓单核祖细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞或嗜碱性粒细胞和2个B淋巴样细胞或2个T淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法。本发明也提供了通过杂交I个骨髓单核祖细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞或嗜碱性粒细胞、I个B淋巴样细胞和I个T淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法。优选地，所述源自髓共同祖细胞的细胞显示至少一种下述⑶抗原⑶16、⑶15或 ⑶14。因此，显而易见，本发明提供了通过杂交I个显示至少一种下述⑶抗原的髓共同祖细胞和2个B淋巴样细胞或2个T淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法⑶16、⑶15或⑶14。 本发明也提供了通过杂交I个显示至少一种下述CD抗原的髓共同祖细胞、I个B淋巴样细胞和I个T淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法⑶16、⑶15或⑶14。在一个实施方案中，所述源自髓共同祖细胞的细胞是单核细胞。因此，本发明提供了通过杂交I个单核细胞和2个B淋巴样细胞或2个T淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法。 本发明也提供了通过杂交I个单核细胞、I个B淋巴样细胞和I个T淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法。在另一个实施方案中，所述源自髓共同祖细胞的细胞是原代骨髓单核祖细胞。因此，本发明提供了通过杂交I个原代骨髓单核祖细胞和2个B淋巴样细胞或2个T淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法。本发明也提供了通过杂交I个原代骨髓单核祖细胞、I个B淋巴样细胞和I个T淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法。在一个实施方案中，所述源自髓共同祖细胞的细胞是无限增殖化的细胞。因此，显而易见，本发明提供了通过杂交I个选自下述的无限增殖化的细胞和2个B淋巴样细胞或 2个T淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法骨髓单核祖细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞或嗜碱性粒细胞。本发明也提供了通过杂交I个选自下述的无限增殖化的细胞、I个B淋巴样细胞和I个T淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法骨髓单核祖细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞或嗜碱性粒细胞。在另一个实施方案中，所述源自髓共同祖细胞的细胞源自脾、外周血、脐带血或骨髓。因此，显而易见，本发明提供了通过杂交I个源自脾、外周血、脐带血或骨髓的髓共同祖细胞和2个B淋巴样细胞或2个T淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法。本发明也提供了通过杂交I个源自脾、外周血、脐带血或骨髓的髓共同祖细胞、I个B淋巴样细胞和I个T淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法。在另一个实施方案中，所述源自B淋巴谱系的细胞是前B细胞、幼B细胞、幼稚B细胞、活化的B细胞或效应B细胞。因此，显而易见，本发明提供了通过杂交I个髓共同祖细胞或I个干细胞和2个选自下述的B淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法前B细胞、幼B 细胞、幼稚B细胞、活化的B细胞或效应B细胞。本发明也提供了通过杂交I个髓共同祖细胞或干细胞、I个选自下述的B淋巴样细胞和I个T淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法前 B细胞、幼B细胞、幼稚B细胞、活化的B细胞或效应B细胞。在一个实施方案中，所述效应B细胞是抗原处理过的B-细胞或楽:细胞。因此,本发明提供了通过杂交I个髓共同祖细胞或干细胞和2个选自下述的B淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法抗原处理过的B-细胞或浆细胞。本发明也提供了通过杂交I个髓共同祖细胞或干细胞、I个抗原处理过的B-细胞或浆细胞和I个T淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法。在一个实施方案中，所述源自B淋巴谱系的细胞显示至少一种下述⑶抗原⑶19、 ⑶20、⑶72或⑶5。因此，本发明提供了通过杂交I个髓共同祖细胞或干细胞和2个显示至少一种下述⑶抗原的B淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法⑶19、⑶20、⑶72或⑶5。本发明也提供了通过杂交I个髓共同祖细胞或干细胞、I个显示至少一种下述CD抗原的B淋巴样细胞和I个T淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法⑶19、⑶20、⑶72或⑶5。在一个实施方案中，所述源自T淋巴谱系的细胞是前T细胞、幼T细胞、幼稚T细胞、活化的T细胞或效应T细胞。因此，本发明提供了通过杂交I个髓共同祖细胞或干细胞、 I个B淋巴样细胞和I个选自下述的T淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法前T细胞、幼T 细胞、幼稚T细胞、活化的T细胞或效应T细胞。本发明也提供了通过杂交I个髓共同祖细胞或干细胞和2个选自下述的T淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法前T细胞、幼T细胞、 幼稚T细胞、活化的T细胞或效应T细胞。在一个实施方案中，所述源自T淋巴谱系的细胞显示至少一种下述⑶抗原⑶3、 ⑶4、⑶5或⑶8。因此，本发明提供了通过杂交I个髓共同祖细胞或干细胞、I个B淋巴样细胞和I个显示至少一种下述⑶抗原的T淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法⑶3、⑶4、⑶5 或CD8。本发明也提供了通过杂交I个髓共同祖细胞或干细胞和2个T淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法，所述T淋巴样细胞选自显示至少一种下述⑶抗原的T细胞⑶3、⑶4、⑶5 或 CD8。在一个实施方案中，所述源自B淋巴谱系的细胞是无限增殖化的细胞。因此，本发明提供了通过杂交I个髓共同祖细胞或干细胞和2个B淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法，所述B淋巴样细胞中的至少一个可以是无限增殖的细胞。本发明也提供了通过杂交I 个髓共同祖细胞或干细胞、I个无限增殖的B淋巴样细胞和I个T淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法。在一个实施方案中，所述源自T淋巴谱系的细胞是无限增殖化的细胞。因此，本发明提供了通过杂交I个髓共同祖细胞或干细胞、I个B淋巴样细胞和I个无限增殖的T淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法。在一个实施方案中，所述源自B淋巴谱系的细胞源自淋巴组织。因此，本发明提供了通过杂交I个髓共同祖细胞或干细胞和2个源自淋巴组织的B淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法。本发明也提供了通过杂交I个髓共同祖细胞或干细胞、I个源自淋巴组织的B淋巴样细胞和I个T淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法。
在一个实施方案中，所述源自T淋巴谱系的细胞源自淋巴组织。因此，本发明提供了通过杂交I个髓共同祖细胞或干细胞、I个B淋巴样细胞组织和I个源自淋巴组织的T淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法。在生产本发明的杂交细胞的方法中所包括的B或T淋巴样细胞源自淋巴组织的情况下，所述淋巴组织优选地选自外周血、脐带血、脾、骨髓、胸腺、扁桃体、腺样体和局部淋巴结。在一个实施方案中，在生产本发明的杂交细胞的方法中包含的细胞中的至少一个是人细胞。还显而易见，在一个实施方案中，生产本发明的杂交细胞的方法可以包含至少一个小鼠细胞。在一个实施方案中，所述源自髓共同祖细胞的细胞是K562细胞。因此，显而易见， 本发明提供了通过杂交I个K562细胞和2个B淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法。本发明也提供了通过杂交I个K562细胞、I个无限增殖的B淋巴样细胞和I个T淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法。在一个实施方案中，所述第二个细胞或所述第三个细胞是WIL2-NS细胞或M0LT4 细胞。因此，显而易见，本发明提供了通过杂交I个髓共同祖细胞或干细胞、I个WIL2-NS细胞和I个T淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法。本发明也提供了通过杂交I个髓共同祖细胞或干细胞、I个B淋巴样细胞和I个M0LT4细胞来生产杂交细胞的方法。在一个实施方案中，所述第一个细胞是K562细胞，所述第二个细胞是WIL2-NS细胞，且所述第三个细胞是M0LT4细胞。在本发明的方法的另一个实施方案中，所述第一个细胞是K562细胞，所述第二个细胞是原代B细胞，且所述第三个细胞是原代T细胞。在本发明的方法的另一个实施方案中，所述第一个细胞是原代人单核细胞，所述第二个细胞是WIL2-NS细胞，且所述第三个细胞是原代T细胞。在本发明的方法的另一个实施方案中，所述第一个细胞是原代人骨髓单核祖细胞，所述第二个细胞是WIL2-NS细胞，且所述第三个细胞是原代人T细胞。在本发明的方法的另一个实施方案中，所述第一个细胞是K562细胞，所述第二个细胞是WIL2-NS细胞，且所述第三个细胞是原代T细胞。在本发明的方法的另一个实施方案中，所述第一个细胞是原代单核细胞，所述第二个细胞是WIL2-NS细胞，且所述第三个细胞是WIL2-NS细胞。在本发明的方法的另一个实施方案中，所述第一个细胞是原代小鼠单核细胞，所述第二个细胞是SP2细胞，且所述第三个细胞是原代小鼠T细胞。在本发明的方法的另一个实施方案中，所述第一个细胞是原代小鼠单核细胞，所述第二个细胞是SP2细胞，且所述第三个细胞是SP2细胞。在本发明的方法的另一个实施方案中，所述第一个细胞是原代人或小鼠单核细胞，所述第二个细胞是WIL2-NS细胞，且所述第三个细胞是SP2细胞。定义在本发明的上下文中，词语“包含”、“包括”等应当解释为它们的包括含义(而不是它们的排除含义)，也就是“包括、但不限于”的含义。杂交细胞
杂交细胞是包含来自超过一个基因组的组分的细胞(除了合子和它们的衍生物以外)。它是从例如2个或更多个生物细胞(亲本细胞)的体细胞杂交(或全细胞杂交) 构建出的细胞。所述亲本细胞可以从相同的谱系(或物种)或不同的谱系(或物种)得到。 从相同的谱系和物种产生的杂交细胞被称作同源杂合体(auto-hybrid)，从不同的谱系产生的杂交细胞被称作异源杂合体(hetero-hybrid)。嵌合细胞嵌合细胞是使用源自2个或更多个不同物种的基因组人工生产的杂交细胞。跨谱系杂交细胞跨谱系杂交细胞是使用源自2个或更多个细胞的基因组人工生产的杂交细胞，所述细胞源自不同的细胞谱系。造血细胞被分成2个主要谱系淋巴样(T细胞、B细胞和NK 细胞)和髓样(单核细胞和巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞/血小板、树突细胞)。三杂交细胞三杂交细胞是使用源自3个细胞的基因组人工生产的杂交细胞。稳定的当提及细胞时，术语“稳定的”表示细胞的表现出下述一致性的能力给定生长或生产率参数的一致性，或细胞系的产物特征随着世代数的渐增的一致性。当关于稳定的转染子使用时，它表示在相对恒定的水平基本上无限地表达转基因的细胞系。体细胞杂交在本申请的上下文中，术语“体细胞杂交”表示以下述方式从2个或更多个二倍体 (非配子)细胞(亲本细胞)产生一个单独的活细胞的过程诱导所述细胞的质膜处于良好接触，同时诱导亲本细胞的质膜在接触点处可逆地分解，并使每个亲本细胞的实体或细胞器组合在新形成的单个细胞的包膜内。新形成的单个细胞被称作杂交的细胞或杂交细胞。干细胞术语“干细胞”表示非特化的细胞，其具有通过有丝分裂进行分裂和发育成多种不同细胞类型的能力。干细胞可以包括胚胎干细胞、源自脐带的“成体”干细胞或源自成体的干细胞。干细胞包括具有分化成所有细胞类型的非限制能力的细胞，即全能细胞。干细胞还可以包括它们的分化成特化细胞的能力受限制的细胞，例如多潜能干细胞(pluripotent stem cell)、多能干细胞(multipotent stem cell)、寡能干细胞(oligopotent stem cell)或单能干细胞(unipotent stem cell)。无限增殖化的细胞术语“无限增殖化的细胞”表示具有无限生长的能力的细胞。显而易见，无限增殖化的细胞可以源自体内恶性肿瘤或胚胎。或者，通过对细胞进行诱导无限生长能力的操作， 可以衍生出无限增殖化的细胞。这些操作可以包括，例如，体外转化过程，例如导入病毒基因诸如EB病毒(EBV)、猿猴病毒40 (SV40) T抗原、腺病毒ElA和ElB和人乳头瘤病毒(HPV) E6和E7。或者，通过表达端粒末端转移酶逆转录酶蛋白(TERT)或其它方法，可以从细胞衍生出无限增殖化的细胞。也可以从已经修饰了癌基因表达的细胞衍生出无限增殖化的细胞。无限增殖化的细胞可以源自诱导无限生长能力的任意操作，包括、但不限于紫外线暴露或自发转化(其中无限增殖的机理不明)
骨髓瘤细胞术语“骨髓瘤细胞”表示浆细胞的恶性肿瘤。杂交瘤术语“杂交瘤”表示通过杂交骨髓瘤细胞和源自免疫接种的动物的脾的B-细胞而生成的细胞。杂交瘤是具有生产单克隆抗体的能力的无限增殖化的细胞。未定型的祖细胞术语“未定型的祖细胞”表示干细胞的早期后代，其仅可以分化成有限种类的细胞，而不定向于任何特定谱系，但是它不再可以更新自身。髓共同祖细胞髓共同祖细胞是这样的造血干细胞的后代所述造血干细胞限于髓谱系，且能够产生巨核细胞/红细胞或粒细胞/巨噬细胞祖细胞，但不产生淋巴样细胞。淋巴共同祖细胞淋巴共同祖细胞是这样的造血干细胞的后代所述造血干细胞限于淋巴谱系，且产生B细胞、T细胞和天然杀伤细胞，但不产生髓样细胞。B淋巴谱系-衍生的细胞B淋巴谱系-衍生的细胞是源自淋巴共同祖细胞(在它的B谱系定型为变成任意类型的B细胞以后)的任何细胞。T淋巴谱系-衍生的细胞T淋巴谱系-衍生的细胞是源自淋巴共同祖细胞(在它的T谱系定型为变成任意类型的T细胞以后)的任何细胞。粒细胞-巨噬细胞祖细胞粒细胞-巨噬细胞祖细胞是这样的祖细胞其源自髓共同祖细胞，且定型为粒细胞和单核细胞谱系，但是没有定型为巨核细胞谱系和红细胞谱系。巨核细胞-红细胞祖细胞巨核细胞-红细胞祖细胞是这样的祖细胞其源自髓共同祖细胞，且定型为巨核细胞谱系和红细胞谱系，但是没有定型为粒细胞和单核细胞谱系。前B细胞前B细胞是这样的发育中的B细胞其处于膜结合的IgM的重链与替代轻链一起表达时的阶段。幼B细胞幼B细胞表示骨髓内的发育中的B细胞，其中在抗体的重组阶段，基因座VJ重排在L链上，且VDJ重排在H链上，表现出IgM受体表达。幼稚B细胞幼稚B细胞是这样的成熟的B细胞其通过它的表面免疫球蛋白的随机基因重排， 已经在骨髓中分化和成熟，但是尚未遇到周围的关连抗原。活化的B细胞一类成熟的B细胞，其已经通过抗原识别(经由BCR)遇到在周围的它的关连抗原，从而导致克隆增殖和以T-依赖性的或非依赖性的方式终末分化成浆细胞的组合。效应B细胞
效应B细胞经常与分泌抗体的浆细胞同义，后者是一类短寿B细胞，其分泌对特定抗原特异性的抗体以及过多的细胞因子，以吸引免疫系统的其它细胞。记忆B细胞记忆B细胞是从活化的B细胞形成的长寿B细胞，其对在初次免疫应答过程中遇到的抗原是特异性的，且能够在第二次暴露于相同抗原以后快速应答。浆细胞浆细胞是免疫系统的终末的有丝分裂后的、短寿细胞，其在CD4+淋巴细胞(Th细胞)刺激时从B细胞分化，并分泌大量抗体。前T细胞前T细胞是这样的发育中的T细胞其处于VbDbJb是完整的且TCRii链在双阴性的(⑶4TD8_)T细胞(⑶3+)中表达时的阶段。幼T细胞幼T细胞是这样的发育中的T细胞其已经从骨髓迁移至胸腺，但是尚未完成它的 TCR的重排，或针对它的TCR对在自身主要组织相容性复合体(MHC)分子背景下呈递的自身肽的结合能力的选择，或定型为T杀伤谱系或T辅助谱系，它们与细胞分别对MHC I类或 II类分子的TCR特异性精确地关联。通过共同受体分子CD8或CD4之一的表达的丧失，在表型上标记谱系定型。幼稚T细胞一种成熟的T细胞，其已经在骨髓中分化，并成功地经历了胸腺中的中心选择的正过程和负过程(重排它的TCR，并丧失共同受体分子之一)，但是尚未遇到在周围的关连抗原。活化的T细胞活化的T细胞是这样的T细胞其通过在抗原呈递细胞上的主要组织相容性复合体肽(肽MHC复合物)和B7家族成员分别对细胞表面上的TCR和CD28的衔接，开始变成抗原-特异性的效应T细胞。效应T细胞效应T细胞是一类短寿T淋巴细胞，其在接触携带对于所述细胞而言适当的肽MHC复合物的细胞时，能够立即做出应答。


图I.鉴别和分选-纯化的⑶71+K562细胞。图2. CD15和CD71阳性的K562细胞的FACS概况；(a)原始的CD71-富集的K562 细胞群体中大约18%是⑶15阳性的(Rl区域)，和(b)在培养2个月以后⑶15阳性的K562 细胞的重新分析。图3.⑶15在⑶34+AML单核的细胞上的表达。图4.⑶16的FACS概况和通过⑶14磁珠(MACS)分离的不同⑶14+细胞群体的分选门。图5.用小鼠抗-人⑶19和小鼠抗-人⑶5抗体染色的脐带血单核的细胞的FACS 概况。
图6.用小鼠抗-人⑶3和小鼠抗-人⑶5抗体染色的单核的脐带血细胞的FACS 概况。图7.用小鼠抗-人⑶20和小鼠抗-人⑶72抗体染色的骨髓单核的细胞的FACS 概况。图8.扁桃体单核的细胞的⑶3和⑶54的典型FACS概况。图9. IgM和IgG阳性的培养的淋巴细胞的鉴别；(A)在培养5天以后，18%的⑶19+ 细胞是IgM阳性的，且I %在细胞表面上具有可检测的IgG ； (B)在培养10天以后，IgM阳性的淋巴细胞的百分比降低至2%，且IgG阳性的细胞的百分比增加至15%。图10.在具有髓样和淋巴样来源的癌基因的KMW三杂交细胞上的⑶表达的FACS 概况。图11.⑶4和⑶19在原代混合的脾淋巴细胞、分选的⑶4和⑶19群体以及得到的 KBT三杂交细胞系上的表达；(a)⑶4和⑶19在原代脾淋巴细胞上的表达；(b)分选的⑶19+ 细胞的纯度概况(98. 1% ) ; (c)分选的CD4.细胞的纯度概况(96. 8% ) ； (d)CD19和CD4在三杂交细胞上的共表达。三杂交细胞群体中超过99%共表达B和T细胞的标记物。图12.⑶19、⑶3和⑶5在KBT三杂交体上的表达，所述KBT三杂交体源自I个无限增殖的髓样细胞和2个原代抗原处理过的淋巴样细胞；(a) CD 19和CD5在KBT三杂交细胞表面上的表达；(b)⑶3和⑶5在KBT三杂交体上的表达。图13.⑶4、⑶8、⑶72和⑶20在KBT三杂交细胞表面上的表达，所述KBT三杂交细胞源自I个无限增殖的髓样细胞和2个原代淋巴样细胞，所述淋巴样细胞源自骨髓和胸腺；
(a)⑶4和⑶8的表达，(b)⑶4和⑶72的表达，(c)⑶20和⑶8的表达。图14.在WTM三杂交体系上的⑶表达的FACS概况，所述WTM三杂交体系具有淋巴样来源的癌基因和来自原代细胞的CD4和CD14 ； (a) CD19和CD4在三杂交细胞上的共表达， 表现出一群具有高⑶4表达水平的⑶19细胞(⑶19⑶4h)和另一群具有低⑶4表达水平的 ⑶19细胞(⑶19⑶妁；(b)⑶4和⑶14在相同的⑶19阳性的三杂交体群体上的共表达，表现出基于高或低⑶14表达的进一步的细胞群体异质性(⑶4%0141 KD4hCD14h ;ra4tD14H)。图15.在WTM三杂交细胞上的⑶表达的典型FACS概况，所述WTM三杂交细胞具有淋巴样来源WIL2-NS的癌基因、源自抗原处理过的T细胞的CD5和源自原代单核细胞的 CD14。图16.在WTM三杂交细胞上的⑶表达的FACS概况，所述WTM三杂交细胞具有淋巴样来源WIL2-NS的癌基因、源自细胞毒性T细胞的CD8和源自原代单核细胞的CD14。图17.在WTM三杂交体上的⑶4和⑶8共表达的FACS概况，所述WTM三杂交体源自双CD阳性的T细胞。图18.源自骨髓单核祖细胞的WTM三杂交细胞的表面上的⑶表达；(A)使用⑶19、 CD4和CD15的三色染色，和(B)使用源自骨髓单核祖细胞的CD34和CD15和源自效应T细胞的CD4的三色染色。图19.源自⑶4+效应T细胞的KWT三杂交细胞的谱系特异性的标记物的表达。图20.源自双阳性的⑶4+⑶8+T细胞的KWT三杂交细胞的谱系特异性的标记物的表达。图21.源自⑶5+抗原处理过的T细胞的KWT三杂交细胞的谱系特异性的标记物的表达。图22. WWM三杂交细胞的典型⑶表达概况，所述WWM三杂交细胞源自2个各自含有淋巴样癌基因的细胞和I个原代单核细胞；(a)⑶19和⑶14在三杂交细胞上的共表达(Rl 区域)，显示了不表达⑶14的⑶19阳性细胞的独特群体(R2区域)；(b)三杂交细胞上的 CD14表达，所述三杂交细胞源自Rl区域中的分选的细胞，并在培养中增殖2个月；(c)三杂交细胞上缺乏表面CD14，所述三杂交细胞源自2个月以后的R2区域中的分选的群体。图23.从WWM三杂交细胞的不同亚群得到的⑶14的代表性的RT-PCR。图24. K562细胞的单个克隆的核型分析。结果表明，K562细胞系是三倍体，具有 69个染色体模式数。检测到下述染色体异常缺少I个X染色体；染色体2的长臂的臂内倒位，其涉及带q33和q35 ;缺少染色体3、额外的衍生染色体5,所述衍生染色体5用未知起源的额外染色体材料替代来自qll. 2的区段；染色体6的短臂在带p21. 2和p23之间的区段的重复；额外的染色体7，其具有染色体7的短臂的臂内倒位，其涉及带pl3和p22 ;缺少 I个染色体9 ;染色体9的短臂从带pl3的末端缺失；由易位产生的衍生染色体9，所述易位涉及来自2个染色体9的区段；由易位产生的染色体10的衍生物，所述易位涉及来自染色体3和10的区段；缺少染色体13 ;在一个染色体13的短臂上的未知起源的额外染色体材料；缺少染色体14 ;未知起源的额外材料，其替代在2个染色体17上来自pl3的区段；由易位产生的衍生染色体18，所述易位涉及来自染色体I和18的区段；缺少I个染色体20 ;由易位产生的衍生染色体21，所述易位涉及染色体I和21的区段；缺少I个染色体22 ；5个额外的不同的标记物染色体。图25. WIL2NS细胞系的5个克隆之一的核型分析。在该克隆(克隆I)中，检测到下述异常由易位产生的衍生染色体8，所述易位涉及来自染色体I和8的区段；染色体13 的额外同源物；由易位产生的染色体14的衍生物，所述易位涉及来自染色体5和14的区段；染色体17的来自q22_q23的区段的重复。图26. KBT-I (⑶19+)&(⑶4+)三杂交体系的核型分析，显示了接近三倍体的单个细胞克隆。由于随机丧失，染色体计数在65-66之间变化，但是具有66的染色体模式数。检测到下述的染色体异常由复杂易位形成的衍生物X，所述复杂易位涉及X染色体的短臂，并可能涉及2个其它的未鉴别的染色体；缺少I个X染色体；染色体2的长臂中的臂内倒位, 其涉及带q33和q35 ;缺少染色体3 ;缺失染色体3p ;衍生染色体4，其涉及染色体4和另一个未鉴别的染色体的区段；额外的衍生染色体5，其用未知起源的额外染色体材料替代来自qll. 2的区段；染色体6的短臂在带p21. 2和p23之间的区段的重复；额外的衍生染色体 7，其涉及染色体7的长臂和标记物3的长臂；缺少I个染色体13 ;在一个染色体13的短臂上的未知起源的额外染色体材料；缺少I个染色体14 ;缺少I个染色体15 ;未知起源的额外材料替代2个染色体17上来自pl3的区段；由易位产生的衍生染色体18，所述易位涉及来自染色体I和18的区段；缺少I个染色体20 ;由易位产生的衍生染色体21，所述易位涉及染色体I和21的区段；缺少染色体22 ；4个额外的不同的标记物染色体。图27. KBT (K562&CD20+CD72+&CD4+CD8+ 细胞)跨谱系三杂交体(或 KBT-2 跨谱系) 的核型，显示了 4个接近三倍体的克隆，(A)克隆I具有67的染色体模式数和下述的染色体异常由复杂易位形成的衍生物X，所述复杂易位涉及X染色体的短臂，并可能涉及2个其它的未鉴别的染色体；缺少I个X染色体；衍生染色体1，其包含来自染色体I的区段和最可能来自染色体4的区段；染色体2的长臂中的臂内倒位，其涉及带q33和q35 ;缺少I个染色体3 ;最可能地，缺失的染色体4可能是小衍生染色体4 ;额外的衍生染色体5，其用未知起源的额外染色体材料替代来自qll. 2的区段；染色体6的短臂在带p21. 2和p23之间的区段的重复；额外的衍生染色体7，其涉及染色体7的长臂和标记物3的长臂；缺少I个染色体9 ;染色体9的短臂从带pl3的末端缺失；由易位产生的衍生染色体9，所述易位涉及来自2个染色体9的区段；由易位产生的衍生染色体10，所述易位涉及来自染色体3和 10的区段；缺少I个染色体13 ;在一个染色体13的短臂上的未知起源的额外染色体材料； 缺少I个染色体14 ;未知起源的额外材料替代2个染色体17上来自P13的区段；由易位产生的衍生染色体18，所述易位涉及来自染色体I和18的区段；缺少I个染色体20 ;由易位产生的衍生染色体21，所述易位涉及染色体I和21的区段；缺少I个染色体22 ；4个额外的不同的标记物染色体，(B)由于随机丧失，克隆2含有65-67个染色体(染色体模式数是 67)，且具有与克隆I类似的染色体特征，例外是，克隆I的缺失的染色体4被确定的衍生染色体4置换，后者涉及染色体4和另一个未鉴别的染色体的区段，(C)克隆3与克隆I基本上相同，但是缺少衍生染色体1，且存在源自染色体I和4的区段的不同衍生染色体4。由于随机丧失，它含有67-68个染色体，模式数为67，(D)克隆4与克隆I基本上相同，但是缺少衍生染色体1，且存在由易位产生的不同衍生染色体1，所述易位涉及染色体I和4的区段。 仅存在2个正常染色体5’ s和一个衍生染色体5，后者似乎是随体化的(satellited) 5q。图28. KffT-I三杂交体系(源自无限增殖的髓样细胞和B淋巴样细胞和原代成熟的CD4+T辅助细胞的KWT三杂交体)的核型分析，显示了接近六倍体的单个克隆，其具有 129-140染色体的模式数和下述的染色体异常缺少2个X染色体；缺少I个染色体I ;缺少I个染色体2 ;染色体2的长臂中的臂内倒位,其涉及带q33和q35 ;缺少2个染色体3 ； 缺少I个染色体4 ;衍生染色体4，其用未知起源的额外染色体材料替代来自q35的区段；一个额外的染色体5同源物；染色体5的2个额外的衍生物，其用未知起源的额外染色体材料替代来自qll. 2的区段；一个额外的染色体6同源物；额外的染色体6，其具有染色体6的短臂在带P21. 2和p23之间的区段的重复；一个额外的染色体7同源物；2个染色体7，它们具有染色体7的短臂的臂内倒位，其涉及带pl3和p22 ;由易位产生的衍生染色体8，所述易位涉及来自染色体I和8的区段；缺少2个染色体9 ;染色体9的短臂从带pl3的末端缺失；2个由易位产生的衍生染色体9，所述易位涉及来自2个染色体9的区段；由易位产生的染色体10的衍生物，所述易位涉及来自染色体3和10的区段；缺少I个染色体12 ;—个染色体13，其具有在一个染色体13的短臂上的未知起源的额外染色体材料；缺少2个染色体 14 ;由易位产生的染色体14的衍生物，所述易位涉及来自染色体5和14的区段；缺少I个染色体15 ;缺少I个染色体17 ；2个染色体17，其用未知起源的额外材料替代来自2个染色体17上的pl3的区段；2个染色体17，其具有来自q22_q23的区段的重复；缺少2个染色体18 ;额外的染色体20 ;由易位产生的衍生染色体21，所述易位涉及染色体I和21的区段；缺少I个染色体22 ；7个额外的标记物染色体，它们具有标记物染色体2的2个拷贝。图29. KWT-2 (源自无限增殖的髓样细胞和B淋巴样细胞和原代记忆⑶3+⑶5+T细胞的KWT三杂交体系)的核型分析，显示了接近六倍体的单个克隆，其具有135-142染色体的模式数和下述的染色体异常缺少2个X染色体；缺少I个染色体I ;缺少I个染色体2 ； 染色体2的长臂中的臂内倒位，其涉及带q33和q35 ;缺少2个染色体3 ;缺少I个染色体4 ；衍生染色体4，其用未知起源的额外染色体材料替代来自q35的区段；一个额外的染色体5 的同源物；染色体5的2个额外的衍生物，其用未知起源的额外染色体材料替代来自qll. 2 的区段；一个额外的染色体6的同源物；额外的染色体6，其具有染色体6的短臂在带p21. 2 和P23之间的区段的重复；2个染色体7，它们具有染色体7的短臂的臂内倒位，其涉及带 pl3和p22 ;由易位产生的衍生染色体8，所述易位涉及来自染色体I和8的区段；缺少2个染色体9 ;染色体9的短臂从带pl3的末端缺失；2个由易位产生的衍生染色体9，所述易位涉及来自2个染色体9的区段；由易位产生的染色体10的衍生物，所述易位涉及来自染色体3和10的区段；缺少I个染色体12 ;—个染色体13，其具有在一个染色体13的短臂上的未知起源的额外染色体材料；缺少2个染色体14 ;由易位产生的染色体14的衍生物，所述易位涉及来自染色体5和14的区段；缺少I个染色体15 ;缺少I个染色体17 ；2个染色体17，它们用未知起源的额外材料替代在2个染色体17上的来自pl3的区段；2个染色体 17，其具有来自q22_q23的区段的重复；缺少2个染色体18 ;额外的染色体20 ;由易位产生的衍生染色体21，所述易位涉及染色体I和21的区段；缺少I个染色体22 ；8个额外的标记物染色体，它们具有标记物染色体2的2个拷贝。图30. KWT-3三杂交体系(源自无限增殖的髓样细胞和B淋巴样细胞和原代双阳性的CD4+CD8+T细胞的KWT三杂交体)的核型分析，显示了 3个克隆，它们是染色体模式数为124-139的超五倍体(hyperpentaploid)。(A)克隆I具有下述的染色体异常3个X染色体和单个Y染色体；额外的染色体I ;2个额外的染色体2 ;染色体2的长臂中的臂内倒位，其涉及带q33和q35 ;缺少I个染色体3 ;额外的由易位产生的染色体5衍生物，所述易位涉及染色体5和未知起源的染色体；额外的染色体6 ;染色体6的短臂在带p21. 2和p23 之间的区段的重复；染色体7的短臂的额外的臂内倒位，其涉及带pl3和p22 ;由易位产生的衍生染色体8，所述易位涉及来自染色体I和8的区段；染色体9的短臂从带pl3的末端缺失；由易位产生的衍生染色体9，所述易位涉及来自2个染色体9的区段；2个额外的染色体10 ;2个由易位产生的染色体10的衍生物，所述易位涉及来自染色体3和10的区段； 2个额外的染色体13 ;在一个染色体13的短臂上的额外的未知起源的染色体材料；缺少I 个染色体14 ;由易位产生的染色体14的衍生物，所述易位涉及来自染色体5和14的区段； 额外的未知起源的材料，其替换来自3个染色体17上的pl3的区段；来自q22_q23的区段中的染色体17的2个染色体重复；额外的染色体18 ;由易位产生的衍生染色体18，所述易位涉及来自染色体I和18的区段；额外的染色体19 ;缺少I个染色体20 ;由易位产生的衍生染色体21，所述易位涉及染色体I和21的区段；5个额外的标记物染色体，它们具有每个标记物染色体4和5的2个拷贝。(B)克隆2具有与克隆I类似的染色体异常，但是它丧失一个染色体9。(C)克隆3含有与克隆2相同的染色体异常，但是染色体2的长臂中的臂内倒位被替换为等臂衍生(isoderivative)染色体2，后者因涉及衍生染色体2的等臂染色体的形成而产生，所述衍生染色体2由长臂中的臂内倒位产生，其涉及带q33和q35。图31. WWM三杂交体(A)和它的⑶14富集的亚系⑶的核型分析，显示了单个优势克隆，这将它的存在从在原始的WWM三杂交体中的55%增加至在它的CD14富集的亚系中的 95%。每个具有47染色体的模式数和下述的染色体异常由易位产生的染色体8衍生物， 所述易位涉及来自染色体I和8的区段；额外的染色体13同源物；由易位产生的染色体14 衍生物，所述易位涉及来自染色体5和14的区段；染色体17的来自q22_23的区段的重复；由易位产生的衍生染色体21，所述易位涉及来自染色体3和21的区段。原始的WWM三杂交体和它的CD14+富集的亚系之间的唯一差别在于，这些异常存在于仅55%的原始WWM细胞中和95%的CD14富集的亚系细胞中。WWM三杂交体中的剩余细胞是从接近三倍体(具有随机的染色体丧失)至接近四倍体(具有随机的染色体丧失)。 图32.来自PioGM培养物的上清液的蛋白印迹。给泳道I和2分别装载未活化的和活化的4天人T淋巴细胞培养物的上清液。泳道4和5分别含有在没有或有衣霉素存在下培养的ProGM培养物的上清液。在泳道3中使用非表达-GM-CSF的细胞的上清液。作为参照，在泳道6中使用源自大肠杆菌(E. coli)的重组hGM-CSF(IOng)。图33.由ProGM杂交体系生产的人GM-CSF的凝胶电泳。从在有(泳道3和4)和没有(泳道I和2)衣霉素存在下培养的样品得到ProGM杂交体系的细胞上清液，对其进行使用大鼠抗-人GM-CSF抗体(泳道I和3)和大鼠抗-小鼠GM-CSF抗体(泳道2和4)的免疫沉淀。通过银染色，使蛋白显影。图34. CD4和CD54在ProCD54细胞系和它的CD54富集的亚系ProCD54EX的表面上的表达；(a) 100%的Pro⑶54细胞保持⑶4的表达。细胞群体中的大约72%也是⑶54阳性的，表达水平从低至高。门控和分选出42%的具有CD4+CD54+表型特征的细胞群体，所述细胞群体的⑶54表达水平从中等至高；(b)⑶4和⑶54在原始Pro⑶54的分选的⑶4+⑶54+ 亚系的表面上的表达分析表明，在培养超过6个月以后，98%的细胞仍然是两种标记物阳性的。图35.由ProCD54和ProCD54EX细胞分泌的可溶的人CD54的蛋白印迹。使用KWT 三杂交体配偶体细胞系的细胞作为对照。Pro⑶54和Pro⑶54EX细胞脱落大约82kDa的可溶形式的⑶54。图36. ProCD54 和 ProCd54EX 细胞中 ICAM-I 基因表达的 RT-PCR 分析。图37.在转染后24、48和72小时，来自用hIL4_Ra链瞬时转染的KBT三杂交细胞系的细胞提取物的蛋白印迹分析。用100ng/ml hIL4刺激的人PBML和未转染的KBT细胞分别用作hIL4-Ra链的阳性对照和阴性对照。图38.用于检测被hIL-2转染的KBT三杂交细胞中的hIL_2mRNA的PCR输出。表达水平类似于来自CD8+人T淋巴细胞和Jurkat细胞的那些。未转染的KBT细胞和K562细胞用作阴性对照。图39. (a)原始的KBT三杂交细胞和(b)KBT TR-IL2细胞中的细胞内hIL_2的FACS 分析。大约41%的KBT细胞是⑶69活化分子阳性的。92%的KBT TR-IL2细胞是细胞内 hIL-2 (R1+R2)染色阳性的。hIL-2阴性的细胞是⑶69阳性群体的一部分，而⑶69阴性的细胞都是细胞内hIL2阳性的。图40.在hGM-CSF亲和吸收以后，进行RP-HPLC得到的洗脱图。图41.在hGM-CSF亲和免疫吸收以后，进行RP-HPLC所收集的级分的SDS-PAGE(下图)和蛋白印迹(上图)。蛋白印迹揭示级分之间由Pro-GM-SF分泌的hGM-CSF的分子量概况的变化。在24-28分钟洗脱的级分对应着RP-HPLC洗脱图上的第一个峰，在29-31分钟之间收集的级分代表第二个峰，而第三个峰落进在34-36分钟之间收集的级分。图42.从PHA活化的人淋巴细胞培养物分离⑶4+细胞(A)从剩余的细胞群体门控(Rl)和分选用抗人CD4-FITC标记的细胞。进一步分析分选的细胞的纯度；(B)分选的群体中100%的细胞是⑶4阳性的。图43.源自Pro-GMsf的去糖基化的hGM-CSF的凝胶电泳。将纯化的hGM-CSF暴露于PHGase F消化不同的时间段。温育时间是泳道1-Omin， 泳道2-10min，泳道3_20min，泳道4_40min。泳道5-源自大肠杆菌的重组人GM-CSF。通过银染色，使蛋白显影。指示了分子量标记物。图44.小鼠骨髓瘤Sp2细胞系的TfR+细胞的鉴别和分选。图45.来自用抗-小鼠CD4和CD8染色的(a)外周血和(b)脾的小鼠单核的细胞的FACS概况。门控的区域Rl和R3代表单个阳性的效应辅助(CD4+CD8_) T细胞和细胞毒性 (CD8+CD4_) T细胞，而R2含有双阳性的(CD4+CD8+) T细胞。图46.通过磁珠负选择从外周血分离出的小鼠单核细胞的纯度概况。100%的分离的细胞是CDllb阳性的，且同时，这些细胞中超过98%是B220、⑶90、⑶49b和NKl. I阴性的。大约38%的⑶Ilb+细胞在它们的表面上表达低水平的Ly5G。图47.⑶138、⑶4和Cdllb在STmMm三杂交体上的表达的FACS概况，所述STmMm三杂交体源自I个Sp2的淋巴样无限增殖细胞、原代小鼠⑶4+T细胞和⑶Ilb+单核细胞。通过 ⑶138在100%的三杂交细胞上的表达(a)和(b)，证实B淋巴谱系的表型。细胞群体中至少82%表达所有3个⑶标记物，仅5%的细胞是⑶138阳性的，而不共表达⑶4或⑶lib。图48.⑶138、⑶8和⑶Ilb在STmMm三杂交体上的表达的典型FACS概况，所述 STmMm三杂交体源自I个Sp2的小鼠淋巴样无限增殖细胞、原代小鼠细胞毒性CD8+T细胞和小鼠⑶IIb+单核细胞。尽管在97-100%的三杂交细胞上证实了小鼠⑶138的表达(a)和
(b)，分别在三杂交细胞群体中的56%和57%上检测到T细胞和单核细胞标记物的共表达。 整个三杂交体群体中的大约40%共表达所有3个标记物(c)，且仅14%在它们的表面上既不表达⑶8也不表达⑶I lb。图49.⑶138、⑶8和⑶Ilb在STmMm三杂交体上的表达的典型FACS概况，所述 STmMm三杂交体源自I个Sp2的小鼠淋巴样无限增殖细胞、I个原代小鼠双阳性的CD4+CD8+T 细胞和I个原代小鼠⑶Ilb+单核细胞。三杂交细胞群体中的98-100%是⑶138阳性的， 群体中的93%也是⑶8阳性的(b)。整个细胞群体中的大约57-60%同时是⑶138、⑶8和 CDllb阳性的。图50. CD4和CD8在STmMm三杂交体表面上的表达的典型概况，所述STmMm三杂交体源自I个Sp2的小鼠淋巴样无限增殖细胞、I个原代小鼠双阳性的⑶4+⑶8+T细胞和I个原代单核细胞。尽管95%的细胞是CD8阳性的，但三杂交体群体中的仅50%共表达CD4和 ⑶8。值得注意的是，实际上整个⑶4+群体也是⑶8阳性的。图51.⑶138和⑶Ilb在SSMm三杂交体表面上的表达的典型概况，其中三杂交体群体中的93%显示出⑶138阳性染色，70%的细胞共表达⑶lib。图52.人⑶71和小鼠TfR在SWMm(a)和SWMh (b)三杂交体表面上的表达的典型概况。不论单核细胞的小鼠或人来源，100%的三杂交体是人和小鼠运铁蛋白受体阳性的。图53.小鼠CD 138以及小鼠CDllb或人CD14在SWMm (a)和SWMh (b)三杂交体上的表达的典型概况。小鼠⑶138的表达似乎依赖于单核细胞的小鼠或人来源。尽管84%的 SWMm三杂交体是小鼠⑶138阳性的，但仅29%的SWMh在它们的表面上具有小鼠⑶138。图54.人⑶19和人⑶14在SWMh嵌合的三杂交体的表面上的表达的FACS概况，显示了 96%的细胞表达人⑶19，66%共表达人⑶14。图55. —个单细胞操作/递送系统。图56. —个玻璃微量移液管。图57. —个微电极。图58. 2个平行的微电极。图59.在组织培养板的孔中的2个微电极。图60.含有处于2微电极中间的3个细胞的孔的顶视图。图61.图60的孔的侧视图。图62.在用第二种蛋白hIL-2稳定转染之前(A)和之后(B)，CD25和slgM在杂交细胞表面上的表达，所述杂交细胞通过杂交I个KBT细胞和I个shIgM+CD25+B细胞而产生。
具体实施例方式参考附图，下面的非限制性实施例进一步描述了本发明的优选的实施方案。实施例II.细胞选择、细胞操作和单细胞克隆下面的实施例描述了细胞制备，包括用于产生跨谱系三杂交体和用于表达所需蛋白的哺乳动物细胞系和原代细胞的选择和分离(或分选)。特定选择技术的挑选，无论如何不是限制性的，而是指示性的，所述选择技术用于得到具有特定特征的细胞的纯群体，或使用特定标记物(或多个标记物)来分离具有特定表型的细胞。其它细胞标记物或分选程序可以用于产生类似的结果。I. I.从哺乳动物细胞系选择细胞作为癌基因来源在标准的(正常的)条件下，在CO2培养箱中，在37 °C，在湿润的5 % CO2气氛中， 使用改良的RPMI1640 (Roswell Park Memorial Institute培养基)，悬浮培养所有无限增殖的细胞系(参见下面)，所述培养基含有NaHCO3 (JRH Biosciences)、20mM Hepes(Sigma), 4mM L-谷氨酰胺(Sigma),并补加了 10%胎牛血清FCS (JRH Biosciences)。除非另外说明， 这里描述的组织培养基(TC培养基)是用于培养本发明的所有无限增殖细胞系、原代癌细胞、原代细胞培养物和确立的三杂交细胞系的标准培养基。一般而言，在不含抗生素的环境中培养使用的所有细胞系、原代癌细胞和原代细胞。但是，当怀疑存在细菌和/或真菌污染的高风险时，在标准培养基中包含2%青霉素(5000单位)/链霉素(5mg)溶液(Sigma)。人细胞系可以用于本发明中的人细胞系如下a)髓共同祖细胞谱系，K562(源自人慢性髓细胞性白血病的细胞系)，b) T淋巴谱系，M0LT4 (人T淋巴母细胞)，和c) B淋巴谱系，WIL2NS (人B淋巴母细胞)。非人细胞系可以用于本发明中的非人细胞系是小鼠骨髓瘤细胞系_Sp2 (B淋巴细胞浆细胞)。I. I. I.单细胞递送系统细胞分离或分选、细胞操作和单细胞克隆是本发明自始至终的基本过程。在这里， 我们描述了为了操作和/或克隆单个目标细胞而确立的单细胞递送系统。所述细胞递送系统(图55)主要由玻璃微量移液管、Iml注射器和一维粗操作器(coarse manipulator)组成。图56显示了用于获得单个目标细胞的L-形玻璃微量移液管。移液管由血细胞比容毛细管制成,其长度为75毫米(mm),外径和内径分别为I. 5mm和I. 10mm。通过加热,拉伸管的一个末端，从而得到这样的尖端(I):其具有大约250-300微米(μπι)的内径，尖端壁厚为大约30 μ m。微量移液管的另一个末端保持未改变(2)。在所述的细胞递送系统(图 55)中，注射器(4)安装在粗操作器上，后者又安装在磁性架(16)上。该系统以这样的方式工作注射器的柱塞(6)可以被迫相对于注射器非常缓慢地向前或向后移动。为了操作单个目标细胞，必须使用柔性的医学级管(3)，将注射器连接至微量移液管的未改变的末端 (2)，如图所示。必须通过用70%乙醇冲洗几次，将单细胞递送系统灭菌，最后没有气泡地充入适当的组织培养基或溶液(根据无论什么需要)，然后进行任何细胞操作。I. I. 2.单细胞克隆通过单细胞克隆，确立来自每个细胞系的细胞的克隆。下面描述了在本发明中使用的克隆或操作任意生物学细胞的单个细胞(例如，K562细胞系的细胞)的技术。将5μ I Κ562细胞的细胞悬浮液从它的对数期培养物取出，并放入组织培养 96-孔板(TC板，Becton and Dickinson或BD)的孔中，所述孔含有150 μ I TC培养基。该孔被命名为“细胞储存孔”。将板放在倒置显微镜(Axiovert 40C, Carl Zeiss)的XY显微镜载物台上。在单细胞操作/克隆过程前，给微量移液管(图56)没有气泡地完全充满 TC培养基。将单细胞递送系统的微量移液管、管和注射器(图55)安装在一维粗操作器 (Narishege)上。以使尖端位于显微镜的光学视野中心的方式，排列微量移液管尖端(I)。 为了操作和克隆单个K562细胞，将微量移液管插入细胞储存孔中。通过在抽吸方向非常缓慢地移动注射器的柱塞，将单个K562细胞放置在微量移液管中。从细胞储存孔收回微量移液管。通过使显微镜载物台从细胞储存孔侧向移动至邻近的孔(命名为“克隆孔”)，并随后将微量移液管插入该克隆孔中，然后将微量移液管中的单个细胞轻轻从微量移液管释放出来。这通过在释放方向非常缓慢地移动注射器的柱塞来实现。将从细胞储存孔取出单个细胞并将所述单个细胞放入克隆孔中的过程重复多次，直到每个TC板得到60个单细胞克隆。在运行于37°C、5% CO2的湿润培养箱(Thermoline Scientific)中温育克隆板10天的时段。在温育时间段过程中，定期地用新鲜的TC培养基补充每个克隆孔中的培养基。每 24小时，记录来自每个克隆孔的每个克隆的细胞增殖。在温育时间段结束时，确立K562细胞的许多克隆。选择具有最闻增殖速率或最闻目标标记物(其在细胞表面上表达，例如，在 K562细胞上的CD71运铁蛋白受体)水平的克隆，用于三杂交体生产或其它实验。I. 1.3. CD71+细胞的分选作为一个实例，下面的方法描述了使用荧光激活细胞分选仪(FACS)从K562细胞系中进行CD71阳性细胞的细胞选择和分选。与20 μ I藻红蛋白(PE)缀合的抗-CD71 (BD Pharmingen)或PE缀合的同种型对照抗体IgG2a, K (BD Pharmingen) 一起,将悬浮于100 μ I磷酸盐缓冲溶液(Dulbeco PBS) 中的1χ105Κ562细胞在暗处在室温温育30分钟，所述磷酸盐缓冲溶液含有2 %牛血清清蛋白BSA(Sigma)。用Iml PBS稀释温育混合物，且通过在300g离心10分钟，收集染色的细胞。在用Iml PBS洗涤另外一次以后，将染色的细胞悬浮于Iml PBS中，并立即使用FACS (BD FACSCalibur)进行分析。图I显示了 K562细胞系的⑶71+细胞的概况。门控并分选⑶71+阳性的细胞(图Ia)。原始的K562群体中大约65%是CD71阳性的。将分选的细胞在300g 离心10分钟，并悬浮于Iml PBS中，用于进一步的实验。收集IOOml悬浮的⑶71+-分选的细胞用于纯度分析，如图Ib所示。得到CD71+分选的细胞的99%纯度。在细胞分选以后， 将K562细胞系的CD71+细胞用于进一步的实验，或置于在标准培养条件下的培养物中，并标记为^71-富集的1(562细胞。使用相同的方法，确立⑶71-富集的WIL2NS和⑶71-富集的M0LT4培养物。I. I. 3. I.从K562培养物分选骨髓单核细胞谱系的⑶71+细胞为了确保用于细胞杂交实验的细胞的骨髓单核细胞表型，使用FACS分析和随后的分选，进一步富集⑶71+K562细胞中的⑶15+细胞。为此目的，用PE抗-人CD71和FITC抗-人CD15 (BD Pharmingen)标记从在第 I. I. 3部分中所述的方法得到的⑶71-富集的K562细胞。与20 μ I抗-人⑶71-ΡΕ和抗-人CD15-FITC抗体或阴性同种型对照抗体或FITC和PE标记的阴性同种型对照抗体一起，将悬浮于100 μ I含有2 % BSA的PBS中的IxlO5洗过的⑶71-富集的Κ562细胞在暗处在室温温育30分钟。用Iml PBS稀释温育混合物，且通过在300g离心10分钟，收集染色的细胞。在用Iml PBS洗涤另外一次以后，将染色的细胞悬浮于Iml PBS中，且立即使用 FACSCalibur (BD)进行分析。典型的FACS概况示于图2a。在培养5个月以后，99%的⑶71-富集的K562细胞保持⑶71阳性，其中大约18%表达表面⑶15。门控⑶71和⑶15阳性的细胞(图2a)，并分选。通过在300g离心10分钟，收集分选的细胞，并悬浮于Iml PBS中，用于进一步实验。 收集100 μ I悬浮的⑶71+⑶15+分选的细胞，用于纯度分析。在2个月培养以后，关于⑶71 和CD15的共表达，重新分析分选的细胞(图2b)。结果表明，大约98%的纯化的细胞保持 ⑶71和⑶15。已经发现，一些在早期在表面上表达⑶71和⑶15的细胞已经丧失它们的 CD15表达(图2b)，从而提示，K562细胞中向骨髓单核细胞谱系的定型是不稳定的和可逆的。I. I. 4.从小鼠Sp2细胞系选择运铁蛋白受体阳性的细胞当在三杂交体的产生中使用小鼠骨髓瘤细胞系Sp2时，该群体富集表达小鼠运铁蛋白受体(TfR)(人CD71的类似物)的细胞。遵循与第I. I. 3部分(其描述了人细胞系中⑶71+细胞的富集)基本上相同的规程，但是使用FITC-缀合的大鼠抗-小鼠TfR抗体(Abcam)替代PE-缀合的小鼠抗-人 ⑶71。相应地调节同种型对照。图44显示了 Sp2细胞系的TfR+细胞的概况。门控并分选TfR+阳性的细胞(图 44a)。原始的Sp2群体中大约45%是TfR阳性的。将分选的细胞在300g离心10分钟，并悬浮于Iml PBS中，用于进一步实验。收集IOOml悬浮的TfR+-分选的细胞用于纯度分析， 如图44b所示。得到TfR+分选的细胞的99. 5%纯度。在细胞分选以后，将Sp2细胞系的 TfR+细胞用于进一步的实验，或置于在标准培养条件下的培养物中，并标记为TfR-富集的 Sp2细胞。I. 2.从原代癌细胞选择细胞作为癌基因来源作为一个实例，下面的方法描述了从急性髓细胞性白血病(AML)患者得到的骨髓样品的髓性谱系选择转化的细胞。相同的方法也适用于从对应的血液恶性肿瘤的骨髓样品选择其它谱系的细胞。在知情同意以后，从AML患者得到骨髓抽吸物。从患者提取样品，所述患者在进行实验以前已经确诊AML。使用与第I. 3. I部分所述相同的密度梯度离心程序，分离出AML单核的细胞，并使用FACS，从样品分选或分离CD34+细胞。为了染色或标记上面得到的单核的细胞，将10 μ I小鼠抗-人⑶34-ΡΕ抗体(BD Pharmingen)或PE同种型对照抗体(BD Pharmingen)添加到IxlO6单核的细胞在染色培养基(PBS+5% BSA)中的100 μ I给定的等分试样中。对于给定的等分试样，在冰上温育染色混合物30分钟。将IOml冰冷的染色培养基添加到细胞沉淀中，并在350g和4°C离心7min。 抽吸上清液，然后通过轻打管，重新悬浮细胞沉淀，向其中添加同等体积的冰冷的染色培养基。将染色的细胞离心，且在冰冷的染色培养基中再洗涤一次。将标记的细胞悬浮于染色培养基中，并应用FACS。在设定CD34+细胞群体的适当分选门以后，收集细胞级分。对于富集培养物，将40xl03细胞的CD34+-富集的细胞铺平板于用合成的胞外基质预包被的12孔板中。在补加了 57mM β-巯基乙醇(Sigma)、ImM氢化可的松和20ng/ml人 IL-3和人G-CSF的完全TC培养基中，增殖细胞。培养48小时以后，使用FACS，针对⑶15 表达来进一步选择细胞。对于荧光-细胞染色，使用小鼠抗-人CD15_FITC(BD Pharmingen)和小鼠抗-人 CD34-PE (BD Pharmingen)，且也采用在在该部分前面的内容中描述的类似的细胞染色方法。使用FACS，分析染色的样品。在为⑶34和⑶15阳性的细胞群体(⑶34+CD15+)或为 ⑶34阳性和⑶15阴性的细胞群体(⑶34+⑶15_)设定适当的分选门以后，收集级分。培养48小时以后⑶15在⑶34+AML细胞上的表达的概况显示于图3中。大约54% 的AML单核的细胞被测试为CD15阳性的，同时维持它们的CD34表达，而细胞群体的剩余部分保持它的CD34表达，没有定型为骨髓单核细胞谱系。在该实验中使用CD34+CD15+细胞， 用于确立三杂交体。1.3.原代细胞原代细胞可以源自任意淋巴组织，诸如外周血、脐带血、脾、骨髓、胸腺、扁桃体和局部淋巴结。作为第一步，处理所有淋巴组织，以分离单核的细胞。1.3.1.从骨髓、外周血或脐带血分离人单核的细胞在知情同意以后，从健康个体收集外周血样品。将每个血液样品收集在肝素化 (heparinised)的管(Vacutainer, BD)中，合并，并在 RPMI 1640 中稀释。从经历骨髓活组织检查且具有正常骨髓、没有任何血液异常的患者，得到人骨髓抽吸物。以I : 3的比例，用RPMI 1640稀释样品。在知情同意以后，从正常的足月产道分娩，得到人脐带血样品。在分娩婴儿和结扎脐带以后，在娩出胎盘之前，用肝素化的60ml注射器，收集每份脐带血。在RPMI1640中稀释每份样品。通过在Ficoll-Paque (Amersham Pharmacia)上的密度离心，制备外周血单核细胞(PBMC)、骨髓单核的细胞(BMMC)和脐带血单核的细胞(UCBMC)。简而言之，使用附着至 20ml注射器的套管，在20ml细胞悬浮液下,分层IOml Ficoll-Paque。在I, 700rpm(700g) 在4°C离心样品细胞40分钟。收集在界面中的细胞，且通过在2，OOOrpm(1，OOOg)离心10 分钟，在50ml RPMI 1640中洗涤。抛弃上清液，将沉淀的细胞重新悬浮于40ml RPMI 1640中，并在I, 300rpm(400g)离心10分钟。如下分别取出红血细胞和血小板用O. 83% (wt/ VoDNH4Cl裂解，并在用PBS以I 2比率稀释的Ficoll-Paque上进行第二次离心。分离的单核的细胞用于培养或分析，并通过FACS或磁珠分离系统，分选成细胞特异性的级分。1.3.2.从实体淋巴组织分离人单核的细胞下面的方法描述了在本发明中使用的从脾、胸腺、扁桃体或局部淋巴结分离单核的细胞的程序。也给出了用于细胞染色和分选的方法。遵循国家伦理方针，从器官移植供体得到脾样品。在分离脾细胞之前，将各自大约 2x 2x 3cm的脾块于4°C保存在RPMI 1640中。使用注射器的柱塞，穿过无菌筛目，将每个块切成小块。然后通过用在完全培养基中的20U/ml VII型胶原酶(Sigma)和20U/ml DNA 酶(Sigma)在室温消化30分钟，酶促地解离细胞。通过添加EDTA达到10mM，并在室温搅拌5分钟，进一步解离细胞团块。然后用完全培养基洗涤脾细胞2次，以停止酶促消化，并重新悬浮于RPMI 1640中。与非酶促解离程序(McIlroy等人1995)相比，这些条件不影响表面分子表达。通过在第I. 3. I部分中描述的密度梯度离心(但是红血细胞的取出除外)， 从这些脾细胞悬浮液分离脾单核的细胞。将脾单核的细胞重新悬浮于RPMI1640中，且将细胞浓度调节至IxlO6细胞/ml。通过锥虫蓝排除，测得细胞生存力超过98%。在他们的父母知情同意以后，从经历心脏外科手术的儿童获得胸腺。如下从胸腺分离出胸腺细胞破裂胸腺组织，并使用填充了 RPMI1640培养基的注射器，冲洗胸腺细胞脱离组织。通过上述的密度梯度-离心，纯化胸腺细胞。在知情同意以后，从因为炎性病症而经历扁桃体切除术的患者得到扁桃体。将组织样品保存在冰上的完全培养基和250 μ g/ml庆大霉素中，并在3小时内处理。在去除上皮层以后，将扁桃体组织切成块，并通过截断转移移液管，轻轻抽吸组织块。然后使用与前面在脾单核细胞的分离中所述相同的程序，分离扁桃体细胞。I. 3. 3.从源自各种组织的单核的细胞分离谱系特异性的原代细胞使用FACS分析和细胞分选或磁性细胞分选，通过标准程序，分离B淋巴谱系、T淋巴谱系和髓谱系的人细胞。下面给出了用于从各种组织分离谱系特异性的原代细胞的细胞染色和分选的非限制性实例。I. 3. 3. I.从人脾和外周血分离B细胞、辅助T细胞和骨髓单核细胞如第I. 3. I部分所述，初步处理组织样品，以提取单核的细胞群体。然后在分离单核的细胞群体的4小时内，进行荧光-细胞染色，继之以细胞分选。在标准培养条件下(参见第I. I部分)，将细胞悬浮于完全培养基中，直到染色。I. 3. 3. I. I.源自各种组织的原代成熟B细胞、效应T细胞和骨髓单核细胞的细胞染色和分选下面是来自原代细胞的B和T细胞的染色和分选的实例。通常，B细胞和辅助T 细胞的选择分别基于CD19和CD4的表面表达，而骨髓单核细胞的选择是基于CD14和/或 ⑶16的表面表达。简而言之，将各10 μ I的小鼠抗-人CD19-FITC抗体(BD Pharmingen)和小鼠抗-人CD4-PE抗体(BD Pharmingen)或适当的同种型对照添加到单核的细胞在染色培养基(PBS+5% BSA)中的IOOy I等分试样中，每份等分试样含有IxlO5细胞。对于单核的细胞群体的给定的等分试样，在冰上温育染色混合物30分钟。将IOml冰冷的染色培养基添加到染色混合物中，且在350g和4°C离心7分钟。抽吸上清液，且然后通过轻打管，重新悬浮细胞沉淀，向其中添加同等体积的冰冷的染色培养基。将染色的细胞离心，且在冰冷的染色培养基中再洗涤一次。对于其它等分试样，重复该过程。使用FACS，分析染色的细胞。对于每个样品，分析至少20，000个门控的事件。在为⑶19阳性的B细胞群体(CD19+CD4_)或为CD4阳性的T细胞群体(CD4+CD19_)设定适当的分选门以后，收集级分。收集Iml每个级分用于纯度分析，并将每个级分的剩余部分重新悬浮于完全培养基中，用于进一步实验。I. 3. 3. I. 2.分选的细胞群体的回收和分析使用适当的衔接头，将少数细胞(S5X105细胞)直接地分选进微量离心管中。 在分选之前，向回收管中添加小体积(O. 1-0. 2ml)的补料RPMI 1640，以与分选的样品混合，并提高分选的细胞的生存力。在分选以后，只要回收的细胞的数目允许，用染色培养基以I : 10稀释20 μ I每个分选的细胞样品用于重新分析，以验证它的纯度。可接受的纯度是彡95%。添加另外20-40μ1 FCS/ml的分选的样品，且随后在350g、4°C离心7min。然后将细胞重新悬浮于标准的组织培养基中。如果可得到足够的细胞，则对它们计数，以测定得率。用抗-人⑶19-FITC和抗-人⑶4-PE标记的脾样品的FACS概况示于图11a，而分选的⑶19+B细胞和⑶4+T细胞的纯度分析的概况示于图Ilb和Ilc (参见KBT杂交体表征)。级分中的细胞纯度超过98% (对于⑶19+细胞而言)和96% (对于⑶4+细胞而言)。来自外周血的⑶19+和⑶4+细胞的分选和纯度概况与来自脾样品的那些基本上类似，仅得到更少数目的每种细胞群体。对于人单核细胞和骨髓单核细胞的分离，首先根据生产商的说明书，使用人CD14 磁珠MACS (Mi ltenyi Biotec GmbH)，排除单核的细胞群体中的⑶14阴性的细胞。用小鼠抗-人 CD16-PE (BD Pharmingen)和小鼠抗-人 CD14_PerCP (BD Pharmingen)抗体,进一步染色或标记阳性地选择的CD14细胞。上面已经描述了细胞染色和分选以及回收分选的细胞的方法(参见第I. 3. 3. I. I部分和第I. 3. 3. I. 2部分)。使用FACS，分析染色的样品。分析至少20，000个门控的事件。使用MACS珠关于 CD14阳性选择的总细胞中的大约86%是CD14阳性的。基于CD16的表达，将CD14+群体进一步分成3个组代表大部分⑶14+细胞的⑶14hCD16_ KDHtDieL和⑶14HCD16H细胞的少数群体。级分中的细胞纯度超过98% (对于⑶14HCD16_而言)、96% (对于⑶14%0161 而言)和92% (对于CD14HCD16H而言)。在设定适当的分选门以后，收集下述细胞群体 ⑶14HCD16_、⑶14%0161和⑶14tD16H细胞级分。图4显示了用小鼠抗-人⑶16-PE和小鼠抗-人⑶14-PerCP标记的⑶14富集的样品的FACS概况。来自脾组织的CD14+细胞的细胞分选和纯化的方法与来自外周血样品的那些基本上相同，但是得到更少数目的每个细胞群体。I. 3. 3. 2.从人脐带血分离⑶5阳性的(抗原处理过的)B细胞和⑶5阴性的(幼稚)B细胞如在第I. 3. I部分中所述，从脐带血样品制备单核的细胞。在单核的细胞群体分离的4小时内，进行荧光-细胞染色，继之以细胞分选。在该具体实施例中，根据前面(第 I. 3. 3. I. I部分)所述的方法，使用小鼠抗-人⑶5-FITC抗体(BD Pharmingen)、小鼠抗-人CD19-PE抗体(BDPharmingen)或适当的同种型对照,从人脐带血分选CD5阴性的(幼稚)B 细胞和⑶5阳性的(抗原处理过的)B细胞。使用FACS，分析染色的样品。对于每个样品，分析至少20，000门控的事件。在为 ⑶5阴性的B细胞群体(⑶19+CD5_)或为⑶5阳性的B细胞群体(⑶19+⑶5+)群体设定适当的分选门以后，收集许多级分。图5显示了用小鼠抗-人CD19和小鼠抗-人CD5染色的样品的典型概况。样品中B细胞的百分比范围是4-19. 2 %，且⑶5+B细胞占总循环的淋巴细胞的 O. 8-7. 2%。I. 3. 3. 3.从人脐带血分离⑶5阳性的(抗原处理过的)T细胞和⑶5阴性的(幼稚)T细胞使用与在第I. 3. I部分中所述类似的方法，从脐带血样品提取单核的细胞。在单核的细胞群体分离的4小时内，进行荧光-细胞染色，继之以细胞分选。在该具体实施例中，根据前面(第I. 3. 3. I. I部分)所述的细胞方法，使用小鼠抗-人CD5-FITC抗体(BD Pharmingen)、小鼠抗-人⑶3-PE抗体(BD Pharmingen)或适当的同种型对照，从人脐带血分选CD5阳性的(抗原处理过的)T细胞和CD5阴性的(幼稚)T细胞。使用FACS，分析染色的细胞。分析至少20，000门控的事件。设定分选门，以收集含有CD5阴性的T细胞 (CD3+CD5-)或CD5阳性的T细胞(CD3+CD5.)的级分。图6显示了用小鼠抗-人CD3和小鼠抗-人CD5抗体染色的样品的典型概况。回收和分析分选的群体实际上，用于回收和分析分选的群体的相同方法已经描述在第I. 3. 3. I. 2部分中。样品中T细胞的百分比范围是I. 7-13. 5%，且⑶5+T细胞占总循环的淋巴细胞的
O.4-1. 3%。I. 3. 3. 4.基于⑶20和⑶72表达从人骨髓单核的群体分离早期B细胞、活化的和静息B细胞使用前面(第1.3. I部分)所述的方法，从骨髓提取单核的细胞。在单核的细胞群体分离的4小时内，进行荧光-细胞染色，继之以细胞分选。活化的B细胞的染色和分选以前描述在第1.3.3. I. I部分。具体地，使用10 μ I小鼠抗-人⑶72-FITC抗体(BD Pharmingen)和20 μ I小鼠抗-人⑶20-ΡΕ抗体(BD Pharmingen)或适当的同种型对照(PE 小鼠IgG2b，K抗体)。使用FACS，分析染色的细胞。设定分选门，以收集含有下述群体的级分包含前B细胞、静息和活化的B细胞、滤泡树突细胞的⑶20阳性群体(⑶20+⑶72_)，或包含早期B细胞(⑶20TD72+)或活化的B细胞(⑶20+CD72+)的⑶72阳性的细胞群体。图 7显示了用小鼠抗-人CD20和小鼠抗-人CD72抗体染色的样品的典型概况。回收和分析分诜的群体实际上，将在第I. 3. 3. I. 2部分中描述的相同方法用于回收和分析分选的群体。通常，骨髓单核的细胞群体中的大约10-15%是⑶20和⑶72阳性的；9_12%的细胞是⑶20阳性的，但是⑶72阴性的；且仅大约8%是⑶72阳性的。1.3. 3. 5.通过磁珠分选分离出胸腺细胞亚群使用MACS CD4 Multisort 试剂盒(Miltenyi Biotec GmbH),根据生产商的说明书，分选⑶4TD8_双阴性的胸腺细胞、⑶4+⑶8+双阳性的胸腺细胞和⑶4+和⑶8+单阳性的胸腺细胞群体。简而言之，与⑶4Multisort⑶4微珠一起，温育使用与在第I. 3. 2部分中所述类似的方法收集的胸腺细胞30分钟。用在PBS中的5mM EDTA和O. 5% BSA洗涤以后， 在磁性柱上分离标记的细胞。阳性选择的胸腺细胞(其保持在磁性柱上)含有CD4+单阳性的和CD4+CD8+双阳性的细胞群体，而CD4排除的细胞群体(其通过柱洗脱)含有CD8+单阳性的和CD4_CD8_双阴性的细胞。为了从CD4阳性地选择的细胞群体去除微珠，将细胞与 MACS Multisort释放试剂温育。20分钟以后，停止消化，且用⑶8微珠标记细胞30分钟。 通过阳性选择，得到CD4+CD8+双阳性的胸腺细胞，而CD4+单阳性的细胞存在于排除的细胞群体中。将CD4排除的细胞群体与CD8微珠温育30分钟。在将标记的细胞应用于磁性柱以后，CD8+单阳性的细胞可以与CD4_CD8_双阴性的胸腺细胞分离开。通过流式细胞术分析， 评价4个不同的胸腺细胞亚群的纯度。可接受的纯度是超过95%。I. 3. 3. 6.从人扁桃体分离CD54+T细胞。使用在第I. 3. 2部分中所述的方法，从人扁桃体提取单核的细胞。在单核的细胞群体分离的4小时内，进行荧光-细胞染色，继之以细胞分选。使用小鼠抗-人CD3-PE抗体(BD Pharmingen)和小鼠抗-人⑶54-FITC抗体(BD Pharmingen)或适当的同种型对照，从单核的扁桃体细胞群体提取CD54+T细胞(细胞间粘附分子-I或ICAM-1)，使用在第
1.3.3.I. I部分中所述的细胞染色/分选方法进行选择。使用FACS，分析染色的细胞。设定分选门，以收集含有⑶3+T细胞(即⑶3+⑶54_细胞)或活化的⑶54+T细胞(即⑶3+⑶54+ 细胞)的级分。图8显示了用小鼠抗-人⑶3和小鼠抗-人⑶54抗体染色的样品的FACS 概况。使用⑶3+细胞产生跨谱系三杂交体，而⑶54+活化的T细胞用于表达实验。结果表明，尽管T细胞占从扁桃体分离的单核的细胞的大多数(82%)，但仅9%是 CD54+T 细胞。1.3. 4小鼠单核的细胞的分离将8-12周龄的BALB/c小鼠维持在无特定病原动物设施中。在组织提取之前，通过CO2暴露，对小鼠实施安死术。通过腋动脉或股动脉穿刺，得到外周血，并收集在肝素包被的管中。使用与在第I. 3. I部分中关于人外周血单核的细胞的分离所述相同的规程，分离单核的细胞群体。机械地破裂小鼠脾，并使用在第I. 3. 2部分中所述的人脾单核的细胞的分离的程序，分离单核的细胞。1.3.5.从小鼠单核的细胞分离谱系特异性的原代细胞使用FACS分析和细胞分选或磁性细胞分选，通过标准程序，分离T淋巴谱系和髓谱系的小鼠细胞。下面给出了用于分离谱系特异性的原代小鼠细胞的细胞染色和分选的非限制性实例。I. 3. 5. I.从小鼠脾和外周血分离效应T细胞不同的效应T细胞的选择基于⑶4和⑶8的表面表达。 将10 μ I每种小鼠抗-小鼠OM-PE抗体(BD Pharmingen)和大鼠抗-小鼠 CD8-FITC抗体(BD Pharmingen)或适当的同种型对照添加到脾或外周血单核细胞在染色培养基(PBS+5% BSA)中的100μ I等分试样中，每份等分试样含有IxlO5细胞。对于单核的细胞群体的给定的等分试样，在冰上温育染色混合物30分钟。将IOml冰冷的染色培养基添加到染色混合物中，且在350g和4°C离心7分钟。抽吸上清液，且然后通过轻打管，重新悬浮细胞沉淀，向其中添加同等体积的冰冷的染色培养基。将染色的细胞离心，且在冰冷的染色培养基中再洗涤一次。对于其它等分试样，重复该过程。使用FACS，分析染色的细胞。对于每个样品，分析至少20，000个门控的事件。染色的小鼠外周血和脾单核的细胞的典型FACS概况分别显示于图45 (a)和45 (b)中。淋巴组织含有单阳性的⑶4或⑶8T细胞和双阳性的T细胞，但是细胞表现存在差异。例如，外周血中的最大群体含有CD8+CD4—细胞毒性T细胞(43% )，而单核的脾细胞主要表现为⑶4+CD8_辅助或调节T细胞(42% )。在为CD4阳性群体(区域Rl)、为CD8阳性群体(区域R3)或为双阳性的细胞群体(区域R2) 设定适当的分选门以后，收集级分。收集Iml每个级分用于纯度分析，并将每个级分的剩余部分重新悬浮于完全培养基中，用于进一步实验。每个级分的纯度大于98%。1.3. 5. 2.从小鼠外周血分离单核细胞通过使用磁珠(Miltenyi Biotec)的负选择,从外周血单核群体分离小鼠单核细胞。将单核的细胞悬浮于磁性细胞分选缓冲液(PBS，01% wt/vol BSA，和O. 5mM EDTA)中， 并根据生产商的规程，与包括针对T细胞(⑶90)、B细胞(B220)和NK细胞(⑶49b)的抗体的抗体微珠(MicroBeads)混合物一起温育。然后将细胞通过LD-负选择柱运行。收集阴性的(单核细胞)级分。为了测定纯度，用PE缀合的针对CDllb的抗体和FITC缀合的针对 CD90、B220、CD49b、NKl. I和Ly6G的抗体(BD Pharmingen)，对细胞染色。将单核细胞鉴别为⑶llb+ra9(TB220TD49b-NK I. rLy6G-/(ffi)，并通过FACS验证纯度概况。小鼠单核细胞群体的纯度概况示于图46。100%的细胞是⑶Ilb阳性的，而它们中超过98%是B220、⑶90、 ⑶49b和NKl. I阴性的。大约38%的CDllb阳性的细胞在低水平表达Ly6G。实施例22.分泌所需蛋白的原代细胞的产生在下面的部分中，给出了用于产生分泌所需蛋白的原代人细胞的方法。这些细胞被用于细胞杂交实验，或用作分析实验的对照，或用作在三杂交体表达系统中表达的蛋白的分析参照。2. I.分泌人GM-CSF的淋巴细胞的产生首先，通过如在第I. 3. I部分中所述的梯度密度离心，分离脐带血淋巴细胞，然后在含有植物凝集素(PHA)的培养物中活化，继之以在IL-2(1000U/ml)中进行细胞增殖。通过ELISA，分析人GM-CSF的生产。生产的浓度范围是15_40ng/ml/106细胞。将共300，000PHA-活化的人淋巴细胞与根据生产商的说明书的浓度的与FITC缀合的小鼠抗-人⑶4抗体(Sigma)在暗处在4°C温育30min。使用FACS(FACS VantageSE, BD)，分析和选择活化的人T细胞。图42 (a)显示了 PHA-活化的淋巴细胞培养物中CD4+T细胞的典型概况，而图42(b)显示了⑶4+分选的细胞的100%纯度。2. 2.分泌IgM和IgG的人淋巴细胞的产生将纯化的B细胞(参见第I. 3. 3. I部分)以3. 75x10s细胞/ml接种在用小鼠抗-人 ⑶154抗体(BD Pharmingen)包被的96圆底孔板(Corning)的孔中。在完全RPMI1640培养基中培养细胞，所述完全RPMI1640培养基补加了 10%热灭活的超低IgG FBS(Gibco/BRL) 和100U/ml白介素4(IL-4) (R&D systems),并在培养3天后添加50ng/ml白介素10 (IL10)。 通过每2-3天更换一半培养基，补充培养物。使用血细胞计数器，通过锥虫蓝排除，一式三份地评价细胞生存力和计数。在第5天和第10天，收获培养的淋巴细胞，在PBS中洗涤2次，并使用小鼠抗-人⑶19-PE、小鼠抗-人IgM-FITC或小鼠抗-人IgG-FITC抗体(都来自BDPharmingen),通过FACS进行分析。使用I μ g每种抗体/IxlO6细胞,在4°C进行所有染色。在所有分析中，超过95%的细胞是双阴性的(使用根据同种型-匹配的阴性对照染色的标记物集合)。从分析中排除含有死细胞和碎片的区域。通过门控5000-10000活细胞，进行所有分析。培养的淋巴细胞中IgM和IgG阳性的细胞的典型概况示于图9。在培养5天以后， 18%的⑶19+细胞是IgM阳性的，且仅I %在表面上具有可检测的IgG，而在10天以后，IgM 阳性的淋巴细胞的百分比降低至仅2%，同时IgG阳性的细胞的百分比增加至15%。在设定适当的门以后，分选IgM阳性的和IgG阳性的级分，用于Ig表达实验。通过标准的ELISA，使用96ELISA孔板和塑料吸附的山羊-亲和纯化的针对人μ 和Y链的抗体，测定培养物中的IgM和IgG浓度。用HRP-缀合的绵羊抗-人Ig抗体揭示结合的抗体。所有抗体来自Sigma。将ABTS用作底物，并在405nm测量光密度。表I总结了在5和10天以后在B淋巴细胞培养物中检测到的IgM和IgG水平。表I
培养时间段IgM, ng/ΙΟ6 细胞IgG，ng/106 细胞5天2480±182850±9210天1215±2601914±101在培养5天以后，IgM的生产下降，而IgG生产增加。实施例33.体细胞杂交几种体细胞杂交方法是本领域众所周知的。它们包括、但不限于例如，使用融合病毒诸如仙台病毒的生物学方法(Kohler和Milstein，1975)，使用聚乙二醇(PEG)的化学方法(Wojciezsyn,等人，1983),及使用电场的电方法(Neil,和Zimmermann, 1993)。每种方法可以诱导或造成目标细胞的质膜可逆地可透过和杂交。无论采用上述的哪种细胞杂交方法，原则上，为了实现细胞杂交，需要2个基本步骤。首先，必须使要杂交的细胞的质膜发生良好的细胞膜接触。其次，必须同时地诱导质膜在接触点处可逆的破裂。关于电细胞杂交方法，通过使用具有适当电场频率的交流电电场(AC场)，可以使目标细胞发生良好的细胞膜接触，然后当用AC场使它们同时地暴露于短电脉冲时，诱导杂交。为了进一步详细地说明，电细胞杂交涉及下述的物理现象介电电泳(DEP)和浆细胞膜的电破裂。介电电泳(Pohl，1978)是这样的现象其描述了介电颗粒(诸如生物细胞)当悬浮于适当的溶液中并施加适当频率的不均匀的AC电场时的运动。已经确定地记载，细胞的运动可以描述为(i)介电颗粒的平移或迁移，例如，对于悬浮于IOOmM山梨糖醇中的Sp2 细胞，在O. 5-2. O兆赫(MHz)之间的电场效率(Mahaworasilpa，1992)，和(ii)介电颗粒的旋转(MahaworasiIpa, 1992),例如对于悬浮于IOOmM山梨糖醇中的Sp2细胞,在2_10千赫 (kHz)之间的电场频率。通过在一对电极(例如，圆柱状电线，其可以排列成许多构型)之间施加电场，可以产生不均匀的场。最广泛使用的构型是平行的电极构型(图58)。在有不均匀的场存在下，DEP可以造成介电颗粒(即生物细胞)彼此吸引，并同时向最强场的区域迁移。结果，它形成细胞的链或串，并又诱导良好的细胞膜接触。显而易见，当将细胞悬浮于适当的低导电性溶液中时，强烈地促进细胞的相互吸引。当将悬浮于合适的杂交溶液中的细胞暴露于具有适当脉冲振幅和宽度的电脉冲时，可以诱导细胞膜的电破裂(Zimmermann，1982)。广泛地使用一定范围的脉冲宽度，例如， 1-200微秒(μ sec)的矩形脉冲，这取决于要杂交的细胞的类型。3. I.电细胞杂交系统在本发明的某些实施方案中，电细胞技术可以用于产生杂交的细胞，诸如三杂交体。3. I. I.细胞操作系统为了在细胞杂交之前操作个别目标细胞，在本发明自始至终使用在前面(第
I.I. I部分)描述的单细胞操作/递送系统。3. 1.2.微电极在本发明中，使用2个L-形微电极。图57显示了直径为128μπι的、由未包被的镍合金制成的微电极(7)。微电极的轴被外径为I. 5mm的血细胞比容毛细管⑶覆盖。微电极的L-形部分(9和10)构造成允许电极的水平段和垂直段的表面的相容区域暴露于培养基或适当的溶液中(Mahaworasilpa，1992)。在细胞杂交过程之前，将2个微电极安装在 2个精致的显微操作器上，每个显微操作器安装一个微电极。以得到每个电极的平行电极构型的方式，排列这些微电极(图58)。每个精致的显微操作器由液压驱动，并允许在X、Y或 Z方向做出精细至O. 5μπι的运动。3. 1.3.细胞室和构型图59显示了在标准的96-孔TC板的孔中的2个平行的电极，在本发明的某些实施方案中，所述孔用作细胞杂交室。为了进行细胞杂交，将微电极浸没在适当的培养基(11) 中，所述培养基包含在标准的96-孔组织培养板的孔(12)内。图60和图61分别显示了平行的电极构型的顶视图和侧视图，其中，将例如3个预选择的要杂交的细胞放在平行的电极之间，其方式使得它们在有适当AC电场存在下可以被诱导列成一行或形成细胞链。实施例44.通过电细胞杂交方法生产跨谱系三杂交体的实施例下面的部分提供了产生三杂交细胞系的实施例，所述三杂交细胞系通过杂交来自不同的谱系或细胞类型的细胞、或来自相同的谱系/或细胞类型但是具有不同表型的细胞而得到。对每个稳定的三杂交体进行分析，以证实它同时具有亲本细胞的表型特征。所述证实基于谱系特异性的细胞表面标记物的分析、谱系特异性的标记物的细胞内表达、谱系特异性的标记物的RNA转录物的存在、核型分析和/或谱系特异性的蛋白的分泌。下面的实施例例证了跨谱系三杂交体的最典型的表型特征。但是，这些实施例绝不限于选择的特定标记物。4. I.从源自髓谱系、T淋巴谱系和B淋巴谱系的3个无限增殖细胞生产跨谱系三杂交体——KMW。通过杂交I个髓样K562细胞、I个T淋巴样M0LT4细胞和I个B淋巴样WIL2NS细胞，产生这类跨谱系三杂交体。这样得到的跨谱系三杂交体被标记为KMW系(继之以它的系列号)。下面描述了在本发明中使用的KMW跨谱系三杂交体生产的过程的下述步骤、溶液 (杂交培养基、培养培养基和恢复培养基)和参数。4. I. I.用于KMW跨谱系三杂交体生产的细胞制备在我们的标准培养基(参见第I. I部分)中，培养K562、WIL2NS和M0LT4细胞系。 作为惯例，每3天传代每个细胞系。在细胞杂交之前，使用在第I. I. 2部分中描述的程序， 确立每个细胞类型的稳定克隆，其具有最高增殖速率。在有些实验中，使用如在第I. I. 3部分中所述确立的⑶71+-富集的细胞群体。同样，在一些场合，使用⑶71+-富集的K562群体的CD15+细胞(第I. I. 3. I部分)。4. 1.2.用于KMW跨谱系三杂交体生产的细胞杂交规程将TC 96-孔板的几个孔用作细胞杂交孔。给每个孔装填大约150μ I杂交培养基，其由 240mM 山梨糖醇(Sigma)、2· OmM KH2PO4(Sigma)、0· 4mM CaCl2(Sigma)、0· 2mM Mg (C2H3O2) 2 (Sigma)和 0. 2mM Ca (C2H3O2) 2 (Sigma)组成，并补加了 0. 2 % 牛血清清蛋白 BSA(Sigma)。在电细胞杂交之前，在杂交培养基中洗涤每个细胞类型的预选择的克隆的细胞一次，进行几分钟，并转移至含有新鲜的杂交培养基的孔中。该孔被命名为预杂交孔。在细胞杂交过程之前，根据第I. I. I部分，操作每个选择的克隆的单个且洗过的细胞，从而使得仅3个细胞(一个细胞来自一个选择的克隆)位于一对相同的平行的电极之间，所述电极浸没至孔底(如图61所示)。电极的间距设定为400微米(即400 μ m)。为了实现电细胞杂交，首先，在电极之间施加交流电(AC)场几秒，所述交流电场具有O. 8MHz的频率和大约50-60千伏/米(例如50_60kV/m)的场强，直到3个细胞被介电电泳DEP诱导成彼此吸引，并形成细胞串。该过程造成细胞产生良好的细胞膜接触。以使K562细胞处于细胞排列的中间的方式,排列细胞(参见图60或61)。然后,用AC场同时施加2个矩形电脉冲，在脉冲之间时间间隔3秒。使用具有大约170kV/m的强度和75微秒(例如75ysec)的脉冲宽度的每个脉冲。在第二个矩形脉冲结束以后，使AC场保持连续另外5秒，从而导致细胞杂交成单个跨谱系三杂交的细胞。对于本发明的某些实施方案， 观察到，3个细胞的杂交可能不同时地发生，即经常先发生3个细胞中的2个的杂交，然后与第三个细胞杂交。在有些情况下，需要额外的矩形脉冲来达到完全的3细胞杂交。然后将新产生的跨谱系三杂交细胞从杂交孔转移至恢复孔，后者位于与杂交孔不同的行中。每个恢复孔含有150 μ I标准的TC培养基(参见第11部分)。在湿润的培养箱(运行在37°C 和5% CO2含量)中，温育每个新确立的跨谱系三杂交细胞7天，每个恢复孔一个跨谱系三杂交细胞。发现大多数跨谱系三杂交体在细胞杂交事件以后的36小时内分裂。在温育时间段结束时，用新鲜的标准培养基适当地补充每个恢复孔中的培养基。这刺激每个跨谱系三杂交体克隆的细胞增殖。2或3天以后，从每个恢复孔鉴别出分裂的细胞或存活的细胞， 并铺平板进标准的24-孔TC板的孔中，产生一组跨谱系三杂交体克隆。在24-孔板中培养每个跨谱系三杂交体克隆另外一周，然后转移进25cm2TC瓶，该瓶含有10毫升(ml)我们的标准的培养基(参见第I. I部分)，并适当地标记，用于进一步分析。为了产生一批稳定的跨谱系三杂交细胞,重复电细胞杂交和跨谱系三杂交体恢复过程的整个过程许多次。
4. I. 3. KMW跨谱系三杂交体状态的确认CD标记物的表汰下面给出了确立的KMW跨谱系三杂交细胞系的确认实施例。在已经在正常培养条件下确立KMW跨谱系三杂交细胞系6个月以后，分析跨谱系三杂交细胞群体的谱系特异性的CD标记物的表达。使用三色FACS分析来验证下述⑶标记物的共表达源于WIL2NS的⑶19、源于 K562 的 CD 15 和源于 M0LT4 的 CD4。简而言之，以Ix IO6细胞/ml的浓度，将100 μ I在含有5% BSA的PBS中的KMW跨谱系三杂交细胞悬浮于100 μ I PBS中，并在4°C与O. 5mg/100ml小鼠抗-人CD15_PerCP、 O. 25mg/100ml小鼠抗-人CD4-PE和I. 0mg/100ml小鼠抗-人CD19-FITC抗体或适当的同种型对照一起温育30min。从BD Pharmingen得到所有小鼠抗-人抗体。在用PBS充分洗涤以后，使用FACSCalibur流式细胞仪和CellQuest Pro软件，分析标记的细胞。图10显示了 KMW跨谱系三杂交细胞系的FACS概况，其间接表明，KMW跨谱系三杂交细胞(其中谱系特异性的特征来自无限增殖的表型)含有混合表型的异质细胞群体，其中髓样表型是优势的。但是，62%的KMW细胞具有髓样表型和T淋巴样表型，且28%的KMW 细胞表达T淋巴样表型和B淋巴样表型。4. 2.从I个无限增殖的髓样细胞和2个原代淋巴样细胞生产跨谱系三杂交体-
KBT 通过I个髓样K562细胞、I个原代人B细胞和I个原代人T细胞的体细胞杂交，产生跨谱系三杂交体。所述跨谱系三杂交体被称作KBT继之以系列号。4. 2. I.用于KBT跨谱系三杂交体生产的细胞制备在前面(第4. I. I部分)已经描述了在产生KBT跨谱系三杂交体之前制备K562 细胞。在KBT跨谱系三杂交体的产生中使用的原代细胞包括(i)源自脾、外周血或脐带血的成熟的B细胞(CD19+);源自骨髓的早期B细胞(CD20—CD72+);源自骨髓的活化的B细胞 (CD20+CD72.);抗原处理过的源自脐带血的B细胞(CD19+CD5.)，和(ii)源自脾、外周血、脐带血和胸腺的辅助T细胞(CD4+)，源自脾、外周血、脐带血和胸腺的细胞毒性T细胞(CD8+)； 抗原处理过的源自脐带血的T细胞(CD3+CD5+);源自脐带血的CD3+T细胞；源自胸腺的双阴性的T细胞(CD3+CD4_CD8_)，源自胸腺的双阳性的T细胞(CD3+CD4+CD8+)，将它们用于实验中。在前面在第I. 3部分中已经描述了来自各种淋巴组织的各种原代淋巴样细胞的分离。4. 2.2.用于KBT跨谱系三杂交体生产的细胞杂交规程用于KBT跨谱系三杂交体生产的细胞杂交规程类似于用于KMW跨谱系三杂交体生产的规程(第4. I. 2部分)，但是培养基和AC电场和脉冲不同。在这些实验中使用的杂交培养基由 230mM 山梨糖醇、I. 8mM ΚΗ2Ρ04、0· 5mM CaCl2,0. 2mM Mg (C2H3O2)JPO. 3mM Ca (C2H3O2) 2 组成，补加了 0. 3% BSA。同时施加0. 5MHz和65_75kV/m的AC场，其具有3秒时间间隔的 3个矩形脉冲串，每个矩形脉冲具有100 μ sec的脉冲宽度和175-185kv/m的强度。在第三个矩形脉冲结束以后，将AC场连续接通另外5秒，从而导致细胞的杂交，以生产跨谱系三杂交细胞。在第4. I. 2部分中描述了该新形成的跨谱系三杂交细胞的稳定系的回收和确立的规程。4. 2. 3. KBT跨谱系三杂交体状态的确认
CD标记物在细朐表面h的表汰从I个无限增殖的髓样(K562)细胞、I个原代成熟的B细胞和I个原代效应T辅助细胞确立的KBT跨谱系三杂交细胞系在例如已经在正常培养条件下确立跨谱系三杂交细胞系几个月以后，分析该细胞系的谱系特异性的CD标记物的表达。使用与杂交之前在细胞制备中所述相同的规程(第
1.3.I. I部分)，用小鼠抗-人⑶19和⑶4抗体标记KBT细胞系的细胞。图11(d)显示了从I个无限增殖的骨髓单核细胞和2个原代细胞确立的KBT跨谱系三杂交细胞系的FACS概况(⑶19和⑶4标记)。一般，这样的稳定的跨谱系三杂交体中超过95%的细胞表达B和 T细胞的CD标记物，具有与亲本、原代细胞类似的密度。从I个无限增殖的髓样细胞(K562)和2个原代抗原处理过的淋巴样细胞(B和T 细胞)确立的KBT跨谱系三杂交细胞系在另一个实施方案中，确立了源自I个K562细胞、I个抗原处理过的B细胞和I个抗原处理过的T细胞的细胞杂交的KBT细胞系。使用FACS，分析细胞的⑶19、⑶3和⑶5的
共表达。简而言之，使用与细胞杂交之前在细胞制备中相同的规程(第1.3. I. I部分)，用小鼠抗-人⑶5-FITC和小鼠抗-人⑶19-PE或小鼠抗-人⑶4-PE抗体标记细胞。图12 显示了这样的KBT跨谱系三杂交细胞系的细胞的FACS概况。结果表明，5-10%的KBT细胞群体通过维持CD5分子的细胞表面表达，同时是CD3和/或CD 19阳性的，来保持它的抗原暴露记忆。同样，⑶5阴性的细胞群体中的至少83%共表达B谱系(⑶19)和T谱系(⑶3) 标记物。从I个无限增殖的髓样细胞(K562)、I个活化的B细胞和I个原代双阳性的未定型的效应T细胞确立的KBT跨谱系三杂交细胞系在另一个实施方案中，确立了源自I个K562、l个分离自胸腺的T细胞(⑶4+和 ⑶8+双阳性的)和I个分离自骨髓的活化的B细胞(⑶20+和⑶72+)(在第I. 3. 34部分中解释)的细胞杂交的KBT细胞系。关于⑶4、⑶8、⑶20和⑶72在细胞表面上的共表达，分析细胞。简而言之，使用与关于原代淋巴细胞的分离所述的相同规程(第1.3.3. I. I部分)，用小鼠抗-人⑶4-PE和小鼠抗-人⑶72-FITC抗体、或小鼠抗-人⑶20-PE和小鼠抗-人⑶8-FITC抗体、或小鼠抗-人⑶4-PE和小鼠抗-人⑶8-FITC抗体的抗体组合，标记KBT跨谱系三杂交细胞。图13显示了这样的跨谱系三杂交细胞的FACS概况。结果(参见图13)表明，99%的KBT跨谱系三杂交细胞在它的表面上表达双阳性的T细胞衍生的⑶4或⑶8中的任一种，其中66-71%的细胞是⑶4阳性的，且88-89%的细胞是⑶8阳性的。在这些细胞的60%中，⑶4和⑶8的表达是并行的。在是源自双阳性的胸腺细胞的CD4阳性的同时，61%的细胞也是源自骨髓的活化B细胞的CD72阳性的。但是，跨谱系三杂交体群体中的94%在它们的表面上表达⑶72。另一方面，31%的⑶8阳性的跨谱系三杂交细胞共表达⑶20。⑶20阳性的细胞的总数是39%。4. 3.从I个无限增殖的淋巴样细胞、I个原代淋巴样细胞和I个原代骨髓单核细胞生产跨谱系三杂交体——WTM这是从I个无限增殖的人B淋巴样细胞(WIL2NS)、I个原代人T细胞和I个原代人单核细胞产生跨谱系三杂交细胞系的实施例。跨谱系三杂交体系被标记为WTM继之以系列号。4. 3. I.用于WTM跨谱系三杂交体生产的细胞制备在前面在第4. I. I部分中描述了在WTM跨谱系三杂交体的产生中使用的WIL2NS 细胞的制备。原代细胞包括源自脾和外周血的⑶14+⑶16—或⑶14+00161单核细胞；源自脾、外周血、脐带血和胸腺的辅助T细胞(CD4+);源自脾、外周血、脐带血和胸腺的细胞毒性 T细胞(⑶8+);源自脐带血的抗原处理过的T细胞(⑶3+CD5+)和⑶3+T ;源自胸腺的双阴性的T细胞(CD3+CD4TD8_)和双阳性的T细胞(⑶3+⑶4+CD8+)，它们用于这些实验中。在前面 (第I. 3. 3部分)已经描述了从各种淋巴组织分离各种原代淋巴样细胞。在某些实施方案中，使用源自骨髓的CD34+CD15+骨髓单核祖细胞替代CD14阳性的单核细胞。4. 3. 2.用于WTM跨谱系三杂交体生产的细胞杂交规程用于WTM跨谱系三杂交体生产的细胞杂交规程类似于用于KMW跨谱系三杂交体生产的规程(参见第4. I. 2部分)，但是培养基不同。在这些实验中使用的杂交培养基由 235mM 山梨糖醇、I. 8mM KH2PO4、O. 5mM CaCl2、O. 3mM Mg(C2H3O2)2 和 O. 25mM Ca(C2H3O2)2(Sigma)组成，并补加了 O. 3% BSA。使用完全如第4. 2. 2部分所述的电规程，生产WTM。在第4. I. 2部分中描述了该新形成的跨谱系三杂交细胞的稳定系的回收和确立的规程。4. 3. 3. WTM跨谱系三杂交体状态的确认CD标记物的表汰从I个无限增殖的淋巴样细胞(WIL2NS)、1个原代T细胞和I个原代单核细胞确立的WTM跨谱系三杂交细胞系确立了源自I个WIL2NS细胞、I个原代T细胞和I个单核细胞的细胞杂交的WTM 细胞系。在已经在正常条件(参见第I. I部分)下培养跨谱系三杂交细胞系6个月以后，分析该跨谱系三杂交细胞群体的谱系特异性的CD标记物的表达。使用三色FACS分析，以验证源于WIL2NS的⑶19、源于原代单核细胞的⑶14和源于原代T细胞的⑶4的共表达(当这些原代T细胞被用于杂交时)。简而言之，以IxlO6细胞/ml的浓度，将IOOml在含有5% BSA的PBS中的WTM跨谱系三杂交细胞悬浮于100 μ I PBS中，并与标记的单克隆抗体(O. 5mg/100ml CD14_PerCP、
O.25mg/100ml CD4-PE和 I. 0mg/100ml CD19-FITC，都来自 BD Pharmingen)或适当的同种型对照在4°C温育30min。在用PBS彻底洗涤以后，使用FACSCalibur流式细胞仪和CellQuest Pro软件,分析标记的细胞。WTM跨谱系三杂交细胞的FACS概况示于图14。尽管源自无限增殖细胞的⑶19标记物在跨谱系三杂交细胞群体中的表达水平似乎是一致的，但源于原代细胞的标记物的表达似乎是变化的。在该具体实施例中，基于CD14和CD4表达强度，可以将细胞群体分成3个亚群(i)CD4HCD14L ； (ii)CD4HCD14H ； (iii) CD4LCD14H。随后，通过标准技术诸如 FACS、MACS 或单细胞克隆等，可以分离这些群体中的每一个，并增殖成单独的跨谱系三杂交体培养物， 它们形成彼此不同的表型特征，同时维持在培养物中的同质性。从I个无限增殖的淋巴样细胞(WIL2NS)、1个原代抗原处理过的T细胞和I个原代单核细胞确立的WTM跨谱系三杂交细胞系
当使用⑶5+抗原处理过的T细胞来产生WTM跨谱系三杂交细胞系时，通过使用三色FACS分析，验证⑶5与⑶19和⑶14并行的表达。该规程与上面所述的规程基本上相同， 但是采用小鼠抗-人⑶19-PE和小鼠抗-人⑶5-FITC抗体替代小鼠抗-人⑶19-FITC和小鼠抗-人⑶4-PE抗体。这些⑶在跨谱系三杂交细胞上的表达的FACS概况示于图15。分析表明，尽管源自无限增殖细胞且负责B细胞表型的CD19表达水平在细胞群体的约91-99% 中似乎是一致的，但源自抗原处理过的T细胞的⑶5和源自原代单核细胞的⑶14的表达， 在WMT杂交细胞中存在差异。仅63%的⑶19阳性细胞也是⑶5阳性的，且79%的⑶19阳性细胞是CD14阳性的。值得注意的是，在这样的WMT跨谱系三杂交细胞中，CD14表达水平从低到高变化。另一方面，所述细胞群体明显地分成⑶5+和⑶5_跨谱系三杂交细胞。从I个无限增殖的淋巴样细胞(WIL2NS)、1个原代细胞毒性T细胞和I个原代单核细胞确立的WTM跨谱系三杂交细胞系当使用细胞毒性的CD8阳性的T细胞来产生WTM跨谱系三杂交体系时，使用与在本部分前面所述相同的三色标记规程，进行FACS分析来验证⑶19、⑶8和⑶14的共表达。 图16显示了⑶19、⑶8和⑶14在该WTM跨谱系三杂交细胞系的细胞上的表达的FACS概况。 ⑶19的表达和它的水平在这些WMT跨谱系三杂交细胞中保持恒定，而这些细胞中仅46%在低水平共表达源自原代细胞毒性T细胞的⑶8，且41%共表达源自原代单核细胞的⑶14。 值得注意的是，这些WMT细胞中的CD14表达水平从低到高变化。从I个无限增殖的淋巴样细胞(WIL2NS)、I个原代双阳性的T细胞和I个原代单核细胞确立的WTM跨谱系三杂交细胞系当使用源自胸腺的双CD阳性的T细胞(CD4+CD8+)来产生WTM跨谱系三杂交细胞系时，除了分析⑶19、⑶8和⑶14表达以外，还分析⑶4和⑶8共表达。图17显示了⑶4 和CD8在跨谱系三杂交细胞系的细胞上的共表达的FACS概况。在该使用双阳性的T细胞的情况下，96%的WTM跨谱系三杂交细胞是⑶4和⑶8阳性的。⑶19和⑶14在源自⑶4+⑶8+ 阳性的T细胞的WTM跨谱系三杂交细胞上的表达概况，与源自细胞毒性的CD8阳性的效应 T细胞的那些WTM跨谱系三杂交细胞基本上类似。从I个无限增殖的淋巴样细胞(WIL2NS)、I个原代T细胞和I个原代骨髓单核祖细胞确立的WTM跨谱系三杂交细胞系当使用源自骨髓的⑶34+CD15+骨髓单核细胞来产生WTM跨谱系三杂交细胞系时， 分析了 CD 19 (B谱系)、CD3 (T谱系)、CD15 (髓谱系)和CD34 (祖细胞)的表面标记物。简而言之，用小鼠抗-人CD19-PE、小鼠抗-人CD4-FITC(BD Pharmingen)和小鼠抗-人CD15_PerCP 抗体的组合，或用小鼠抗-人⑶34-PE、小鼠抗-人⑶4-FITC和小鼠抗-人⑶15-PerCP抗体的组合，标记该WMT跨谱系三杂交细胞系的细胞。根据前面(第I. 3. 3. I. I部分)所述的规程，进行细胞染色。源于CD34+CD15+骨髓单核祖细胞的WTM跨谱系三杂交细胞的典型表达概况示于图18。分析表明，大约81%的WTM跨谱系三杂交细胞共享B谱系和骨髓单核细胞表型(CD19+CD15+)，且61 %的CD19+也是CD4T谱系标记物阳性的。34%的CD4+跨谱系三杂交细胞也在它们的表面上保持⑶34，且68%的⑶34+三杂交细胞表达⑶15。令人感兴趣地，28%的⑶34+跨谱系三杂交细胞不保留⑶15的表达，即使⑶34和⑶15来自相同来源(骨髓单核祖细胞)。4. 4.从I个无限增殖的髓样细胞、I个无限增殖的淋巴样细胞和I个原代淋巴样T细胞生产跨谱系三杂合体——KffT通过I个无限增殖的髓样细胞(K562)、I个无限增殖的B淋巴样细胞(WIL2NS)和 I个原代人T细胞的细胞杂交，产生这类跨谱系三杂交体生产。这类跨谱系三杂交体被称作 KWT继之以系列号。4. 4. I.用于KWT跨谱系三杂交体生产的细胞制备在第4. I. I部分中已经描述了用于这些细胞杂交实验的K562和WIL2NS细胞的制备。在细胞杂交之前，使用在第1.1.1部分中所述的规程序，确立表现出最高增殖速率的每个细胞类型的稳定克隆。在某些实施方案中，使用如在第I. I. 3部分中描述的CD71+-富集的细胞群体。在其它实施方案中，使用如在第I. 1.3. I部分中所述选择的CD71+-富集的K562群体的⑶15+细胞。用于产生KWT跨谱系三杂交体的原代细胞包括源自脾、外周血、脐带血和胸腺的辅助T细胞(CD4+);源自脾、外周血、脐带血和胸腺的细胞毒性T细胞 (CD8+);抗原处理过的源自脐带血的T细胞(CD3+CD5+)和CD3+T细胞；源自胸腺的双阴性的 T细胞(CD3+CD4_CD8_)和双阳性的T细胞(⑶3+⑶4+⑶8+)，它们用于这些实验中(参见第I. 3 部分)。 4. 4. 2.用于KWT跨谱系三杂交体生产的细胞杂交规程用于KWT跨谱系三杂交体生产的细胞杂交规程类似于KMW跨谱系三杂交体生产的规程(参见第4. I. 2部分)。4. 4. 3. KffT跨谱系三杂交体状态的确认CD标记物的表汰从I个无限增殖的髓样细胞(K562)、I个无限增殖的淋巴样细胞(WIL2NS)和I个原代T细胞确立的KWT跨谱系三杂交细胞系确立了源自I个K562细胞、I个WIL2NS细胞和I个原代T细胞的细胞杂交的KWT 细胞系。在已经在正常培养条件下稳定跨谱系三杂交细胞系6个月以后，分析跨谱系三杂交细胞群体的谱系特异性的CD标记物的表达。使用三色FACS分析，以鉴别源于K562的 ⑶15、源于WIL2NS的⑶19和源于原代效应T辅助细胞的⑶4的共表达。用于KWT跨谱系三杂交细胞的细胞染色的规程与关于KMW跨谱系三杂交体所述的规程(部分4. I. 3)基本上相同。源自⑶4+效应T细胞的KWT跨谱系三杂交细胞的FACS概况示于图19。大部分KWT 跨谱系三杂交细胞表现出骨髓单核谱系、B淋巴谱系和T淋巴谱系的混合表型特征。100% 的KWT跨谱系三杂交细胞在细胞表面上表达⑶4 (即T淋巴谱系的标记物)，其源自原代效应T细胞，而这些细胞中的54%同时是B谱系标记物⑶19 (其源自无限增殖的细胞WIL2NS 系)阳性的，且这些⑶4+CD19+细胞中的24%是⑶15 (其源自无限增殖的骨髓单核祖细胞系K562)阳性的。从I个无限增殖的髓样细胞(K562)、无限增殖的淋巴样细胞(WIL2NS)和I个双阳性的T细胞确立的KWT跨谱系三杂交细胞系当使用双阳性的T细胞(CD4+⑶8+细胞)来产生KWT跨谱系三杂交体系时，也分析了源自原代胸腺细胞的CD4和CD8的表达概况。用于CD概况分析的规程与上面关于源自 CD4+T细胞的KWT跨谱系三杂交体所述的规程基本上相同，但是使用小鼠抗-人CD8-FITC 抗体替代小鼠抗-人CD19-FITC抗体。源自双阳性的(CD4+CD8+)T细胞的跨谱系三杂交细胞的典型CD表达概况示于图20。结果表明，99%的KWT跨谱系三杂交细胞是CD4+阳性的，且69 %是⑶8阳性的，26 %的⑶4+细胞是⑶15骨髓单核细胞标记物阳性的，且23 %的⑶8+ 细胞是CD15阳性的，这意味着，CD4+CD8+CD15+细胞占总细胞群体的大约23% (因为几乎 100%的细胞是⑶4+，双阳性的⑶8+⑶15+群体也是⑶4阳性的)。象在源自⑶4+效应T细胞的KWT三杂交体中一样，⑶19+细胞占总细胞群体的52 %，它们中的22 %共表达⑶15。因而，整个⑶15+细胞群体共表达⑶4、⑶8和⑶19，意味着22-23%。从I个无限增殖的髓样细胞(K562)、无限增殖的淋巴样细胞(WIL2NS)和⑶5阳性的抗原处理过的T细胞确立的KWT跨谱系三杂交细胞系当使用⑶5阳性的抗原处理过的T细胞来产生KWT跨谱系三杂交体系时，分析了 CD5的表达。除了在小鼠抗-人CD19和小鼠抗-人CD5抗体之间的荧光缀合物的颠倒 (reversion)以外，使用与分析WTM跨谱系三杂交体所用相同的规程(部分4. 6),用小鼠抗-人⑶19-FITC和小鼠抗-人⑶5-PE抗体标记KWT杂交细胞。在图21中所示的结果表明，90%的KWT跨谱系三杂交细胞是⑶5 (源自抗原处理过的T细胞)阳性的，且49%的⑶5 细胞也是⑶19(源于WIL2NS细胞(B细胞))阳性的。⑶19+细胞在跨谱系三杂交细胞中的总百分比是约56%。4. 5.从2个无限增殖的淋巴样细胞(WIL2NS)和I个原代单核细胞生产跨谱系三杂交体-WWM通过2个无限增殖的淋巴样细胞(WIL2NS)和I个原代人单核细胞的体细胞杂交， 产生这类跨谱系三杂交体生产。跨谱系三杂交体被标记为WWM继之以系列号。4. 5. I.用于WWM跨谱系三杂交体生产的细胞制备以与在第4. I. I部分中所述相同的程序，培养WIL2NS细胞系。在某些实施方案中，使用如在第I. I. 3部分中所述确立的⑶71+-富集的细胞群体。从源自脾、外周血或脐带血的混合淋巴细胞，分离出人单核细胞。单核细胞的分离基于 ⑶14标记物的表达，和在有些情况下，基于⑶16的低表达水平(FACS或磁珠)，如前面在第
1.3.3. I. I部分中所述。当使用来自不同淋巴组织的单核细胞时，杂交参数或得到的跨谱系三杂交体似乎没有差异。4. 5. 2.用于WWM跨谱系三杂交体生产的细胞杂交规程用于WWM跨谱系三杂交体生产的细胞杂交规程与用于KBT跨谱系三杂交体生产的规程(参见第4. 2. 2部分)类似。4. 5. 3. WWM跨谱系三杂交体状态的确认CD标记物的表汰在已经在正常培养条件(参见第I. I部分)下稳定WffT跨谱系三杂交细胞系6个月以后，分析跨谱系三杂交细胞群体的谱系特异性的CD标记物的表达。施加小鼠抗-人⑶19-FITC和小鼠抗-人⑶14-PE抗体的双重染色或标记，以描绘得到的跨谱系三杂交体的跨谱系标记物表达。图22a显示了这样的跨谱系三杂交细胞的典型CD概况。癌基因-关联的标记物CD19的表达似乎在跨谱系三杂交细胞中是恒定的。 尽管一些部分的细胞(23. 5%)在它们的表面上确实表达⑶14，但剩余的72. 7%是⑶14表面表达阴性的。4.6.使用非人哺乳动物细胞的跨谱系三杂交体生产下面的实施例表明，使用除了人细胞以外的哺乳动物细胞(具体地，小鼠细胞)，可以产生跨谱系三杂交体。应当理解，相同的原理可以用于从其它哺乳动物细胞产生跨谱系三杂交体。4. 6. I.从I个无限增殖的小鼠淋巴样细胞、I个原代小鼠淋巴样细胞和I个原代
小鼠单核细胞生产跨谱系三杂交体本部分描述了从I个无限增殖的小鼠B淋巴样细胞(Sp2)、1个原代小鼠T细胞和 I个原代小鼠单核细胞产生跨谱系三杂交细胞系。该跨谱系三杂交体系被标记为STmMm继之以系列号。4. 6. I. I.用于STmMm跨谱系三杂交体生产的细胞制备在前面在第11. 4部分中描述了用于产生STmMm跨谱系三杂交体的Sp2细胞的制备。在这些实验中使用原代小鼠细胞，包括源自外周血的CDllb+CD90-B22(TCD49b-NKl. FL y6G_/ffi单核细胞；源自脾或外周血的小鼠辅助T细胞(CD4+);源自脾或外周血的小鼠细胞毒性T细胞(⑶8+);和源自脾或外周血的双阳性的T细胞(⑶4+CD8+)。在前面(第I. 3. 5部分)已经描述了从脾和外周血分离各种原代小鼠淋巴样细胞。4. 6. 1.2.用于STmMm跨谱系三杂交体生产的细胞杂交规程用于STmMm跨谱系三杂交体生产的细胞杂交规程类似于用于WTM跨谱系三杂交体生产的规程(参见部分4. 3. 2)，但是培养基和AC电场和脉冲不同。也就是说，在这些实验中使用的杂交培养基由265mM山梨糖醇、I. 5mM KH2PO4、O. 4mM CaCl2和O. 3mM Mg(C2H3O2)2(Sigma)组成，补加了 O. 2% BSA0 同时施加 O. 5MHz 和 65_75kV/m 的 AC 场，其具有3秒间隔的3个矩形脉冲串，每个矩形脉冲具有70 μ sec的脉冲宽度和250_280kV/m的强度。在第4. I. 2部分中描述了该新形成的跨谱系三杂交细胞的稳定系的回收和确立的规程。4. 6. I. 3. STmMm跨谱系三杂交体状态的确认确立了源自I个Sp2细胞、I个原代小鼠T细胞和I个小鼠单核细胞的细胞杂交的STmMm细胞系。在已经在正常条件(参见第I. I部分)下培养跨谱系三杂交细胞系6个月以后，分析跨谱系三杂交细胞群体的谱系特异性的CD标记物的表达。使用三色FACS分析，以验证源于Sp2细胞的⑶138、源于原代小鼠单核细胞的⑶IIb和源于原代小鼠T细胞的CD4的共表达(当这些原代T细胞用于杂交时)。简而言之，以IxlO6细胞/ml的浓度，将100 μ I在含有5% BSA的PBS中的STmMm 跨谱系三杂交细胞悬浮于100 μ I PBS中，并与标记的针对小鼠⑶138-ΡΕ、⑶I Ib-FITC和 OM-PerCP的大鼠单克隆抗体(BD Pharmingen)或适当同种型对照一起在4°C温育30min。 在用PBS彻底洗涤以后，使用FACSCalibur流式细胞仪和CellQuest Pro软件，分析标记的细胞。STmMm跨谱系三杂交细胞的FACS概况示于图47。尽管⑶138 (即源自B谱系无限增殖细胞的标记物)的表达水平在跨谱系三杂交细胞群体中似乎是一致的，源于原代细胞的标记物的表达似乎是不同的。在该具体实施例中，存在相对较小百分比的不共表达CD4 或⑶I Ib之一与⑶138的细胞(参见图47a和b)。当分析STmMm细胞的⑶4和⑶I Ib的共表达时(参见图47c)，大约82%的细胞共表达。实际上，细胞群体中的82%表达所有3个 ⑶标记物，仅5%的细胞是⑶138阳性的，不共表达⑶4或⑶Ilb之一。随后通过标准技术诸如FACS、MACS或单细胞克隆等，可以分离这些不同群体中的每一个，并增殖成单独的跨谱系三杂交体培养物,它们形成彼此不同的表型特征，同时维持在培养物中的同质性。当使用细胞毒性的⑶8阳性的淋巴细胞来产生STmMm三杂交体时，使用大鼠抗-小鼠⑶8-PerCp抗体替代抗-⑶4-PerCp，用于在得到的三杂交细胞上共表达⑶。如从图48可见，97-100%的三杂交细胞是⑶138阳性的(图48a和b)，同时这些细胞中的56% 或57%共表达⑶8 (图48b)或⑶I Ib (图48a)。三杂交体群体中的至少40%表达所有3种标记物 CD 138、CD8 和 CDllb (图 48c)。在双阳性的CD4+CD8+T细胞的情况下，以与细胞毒性T细胞相同的方式进行第一次分析。图49显示了得到的三杂交体上的⑶138、⑶Ilb和⑶8表达的FACS概况。98-100% 的三杂交细胞是⑶138阳性的，整个群体中的57-60%是所有3个谱系标记物阳性的(图 49c)。在93%的细胞上，检测到⑶138和⑶8的共表达(图49b)。在第二步中，检查三杂交细胞的⑶8和⑶4的共表达。用大鼠抗-小鼠⑶8-PE和大鼠抗-小鼠⑶4-FITC抗体(BD Pharmingen)标记细胞。图50显示了⑶8和⑶4表达的FACS概况。尽管95%的三杂交细胞在表面上表达⑶8，但仅50%的细胞同时共表达⑶4。值得注意的是，实际上整个⑶4阳性群体也是⑶8阳性的。4. 6. 2.从2个无限增殖的小鼠淋巴样细胞和I个原代小鼠单核细胞生产跨谱系三杂交体本实施例详述了从2个无限增殖的小鼠B淋巴样细胞(Sp2)和I个原代小鼠单核细胞产生跨谱系三杂交细胞系。跨谱系三杂交体系被标记为SSMm继之以系列号。4. 6. 2. I.用于SSMm跨谱系三杂交体生产的细胞制备在前面在第I. I. 4部分中描述了用于产生SSMm跨谱系三杂交体的Sp2细胞的制备。在这些实验中使用源自外周血的原代小鼠CDllb+CD90-B220XD49b-NKl. rLy6G-/ffi单核细胞。在前面(第I. 3. 5部分)已经描述了从外周血分离原代小鼠单核细胞。4. 6. 2. 2.用于SSMm跨谱系三杂交体生产的细胞杂交规程用于SSMm跨谱系三杂交体生产的细胞杂交规程与用于STmMm跨谱系三杂交体生产的规程相同(参见第4. 6. I. 2部分)。4. 6. 2. 3. SSMm跨谱系三杂交体状态的确认在已经在正常培养条件(参见第11部分)下稳定SSMm跨谱系三杂交细胞系6个月以后，分析跨谱系三杂交细胞群体的谱系特异性的CD标记物的表达。施加大鼠抗-小鼠CD138-PE和大鼠抗-小鼠CDllb-FITC抗体(BD Pharmingen) 的双重染色或标记，以描绘得到的跨谱系三杂交体的跨谱系标记物表达。图51显示了这样的跨谱系三杂交细胞的典型CD概况。癌基因-关联的标记物CD138的表达似乎在跨谱系三杂交细胞中是恒定的，仅7%的细胞是CD138阴性的。大部分细胞(70%)确实也在它们的表面上表达⑶11b，尽管剩余的23%的⑶138阳性的细胞是⑶IIb表面表达阴性的。4.7.使用人和非人哺乳动物细胞生产跨谱系嵌合三杂交体本实施例详述了使用人和非人哺乳动物细胞(具体地，小鼠)产生跨谱系嵌合三杂交体。应当理解，相同的原理可以用于从其它哺乳动物细胞产生跨谱系三杂交体。4. 7. I.从I个无限增殖的小鼠淋巴样细胞、I个无限增殖的人淋巴样细胞和I个原代小鼠或人单核细胞生产跨谱系嵌合三杂交体从I个无限增殖的小鼠B淋巴样细胞(Sp2)、l个无限增殖的人B淋巴样细胞(WIL2NS)和I个原代小鼠或人单核细胞产生跨谱系嵌合的三杂交细胞系。跨谱系三杂合体系被标记为SWMm (在使用小鼠单核细胞的情况下)和SWMh (在使用人单核细胞的情况下)。 在每个情况下，三杂交体的缩写名称后面跟着系列号。4. 7. 1.1.用于SWMm和SWMh跨谱系嵌合三杂交体生产的细胞制备在前面在第I. I. 4部分和第I. I. 3部分中，分别描述了用于产生SWMm和SWMh跨谱系嵌合三杂交体的Sp2和WIL2NS细胞的制备。在这些实验中，使用源自外周血的原代小鼠CDllb+CD90_B220_CD49b_NKl. rLy6GVffi单核细胞。在前面(第I. 3. 5部分)已经描述了从外周血分离原代小鼠单核细胞。从源自脾、外周血或脐带血的混合淋巴细胞，分离出人单核细胞。单核细胞的分离基于CD14标记物的表达，和在有些情况下，基于CD16的低表达水平(FACS或磁珠)，如前面在第I. 3. 3. I. I部分中所述。当使用来自不同淋巴组织的单核细胞时，杂交参数或得到的跨谱系三杂交体似乎没有差异。4. 7. 1.2.用于SWMm和SWMh跨谱系嵌合三杂交体生产的细胞杂交规程用于SWMm和SWMh跨谱系三杂交体生产的细胞杂交规程与用于STmMm跨谱系三杂交体生产的规程相同(参见第4. 6. I. 2部分)。4. 7. I. 3. SWMm和SWMh跨谱系嵌合三杂交体状态的确认在已经在正常培养条件(参见第I. I部分)下稳定SWMm和SWMh跨谱系嵌合的三杂交细胞系6个月以后，分析跨谱系嵌合的三杂交细胞群体的谱系特异性的CD标记物的表达。针对人CD71和小鼠TfR的表达进行双染色，以确立得到的三杂交体的嵌合状态。 图52显示了这样的分析的典型FACS概况，100%的细胞是人和小鼠运铁蛋白受体阳性的。 这指示三杂交体对小鼠和人细胞分裂控制的依赖性。依赖于原代单核细胞的小鼠或人来源，施加大鼠抗-小鼠CD138-PE和大鼠抗-小鼠 CDllb-FITC 抗体(BD Pharmingen)或大鼠抗-小鼠 CD138-PE 和小鼠抗-人 CD14-FITC 抗体(BD Pharmingen)的双重染色或标记，以描绘得到的跨谱系嵌合三杂交体的跨谱系标记物表达。图53显示了这样的跨谱系嵌合三杂交细胞的典型CD概况。癌基因-关联的标记物CD138(源自小鼠Sp2细胞系)的表达似乎依赖于单核细胞的小鼠或人来源。小鼠CD138 阳性的细胞的百分比从在SWMm三杂交体中的84%下降至在SWMh三杂交体中的29%。但是，96%的SWMh嵌合的三杂交细胞是人CD19(源自WIL2NS)阳性的(参见图54)，而在SWMm 嵌合的三杂交体中的细胞都不表达人CD19。实施例55.基于CD标记物的分布来富集具有特定跨谱系表型的细胞的跨谱系三杂交体下面的部分提供了基于不同的表型特征来确立跨谱系三杂交细胞系的亚系的实施例。所述方法基于谱系特异性的细胞表面标记物的分析、谱系特异性的标记物的细胞内表达、谱系特异性的标记物的RNA转录物的存在、核型分析和/或谱系特异性的蛋白的分泌。通过FACS，从一般群体分离出具有希望的特征的跨谱系三杂交细胞。下面的实施例基于WWM跨谱系三杂交体，其具有2个基于CD14表达(阳性的和阴性的)的三杂交体群体。 但是，该实施例绝不限于选择的特定跨谱系三杂交体或标记物。将WWM跨谱系三杂交细胞分选成CD14阳性的和CD14阴性的级分，增殖每个级分， 并单独地维持培养3个月。图22b表明，超过95%的跨谱系三杂交细胞保持⑶14表达，而图22c中的细胞群体继续是CD14阴性的。这表明，可能分离和确立源自相同跨谱系三杂交体系的不同的同质细胞群体。通讨RT-PCR确认跨谱系三杂夺体为了验证产生的亚系的跨谱系三杂交体性质，对原始的跨谱系三杂交细胞, ⑶19+CD14+富集的传代培养物和⑶14阴性的传代培养物进行关于⑶14的RT-PCR测定。使用人CD14+单核细胞作为阳性对照。使用在前面(第I. 3. 3部分)描述的FACS，从外周血分离对照细胞。简而言之，使用RNeasy试剂盒(RNeasy Mini kit, Qiagen),从培养的细胞制备总 RNA。根据生产商的规程，使用cDNA-Kit (Amersham Pharmacia),进行cDNA合成,且基本上如Sewing等人所述,进行PCR。通过琼脂糖凝胶(2% )电泳,分析PCR反应混合物,并通过溴化乙锭染色来显影。寡核苷酸引物对具有序列5，-引物 5，-CACACTCGCCTGCCTTTTCC-3，(SEQ ID NO 1)和3，-引物 5，GATTCCCGTCCAGTGTCAGG-3’ (SEQ ID NO 2)用于扩增450bp的PCR产物。如图23所示，RT-PCR揭示CDHmRNA转录物在含有细胞的原始WWM培养物中和在原始WWM培养物的CD14+富集的传代培养物中的存在。在缺少表面CD14的WWM传代培养物中也检测到CD14mRNA，其水平与人CD14+单核细胞的水平相当。实施例66.核型分析进行跨谱系三杂交体的核型分析，以确立跨谱系三杂交体的细胞发生特征，并证实它们的杂交体起源。6. I.原始细胞系的核型分析作为一个实例，对K562和WIL2NS细胞系的细胞的早期传代和晚期传代进行核型分析，以记录原始细胞系的任何染色体不稳定性。经发现，对于给定的细胞系，例如K562 系，新鲜解冻的系的核型与在正常培养条件下维持几个月的细胞系的核型相同。图24和25分别描绘了 K562和WIL2NS细胞的典型核型。在两种情况下，在400bphs 检查到共20个具有G带的中期细胞。核型分析结果表明，K562细胞系含有具有三倍体特征的单个克隆，即具有69染色体的模式数，具有各种染色体异常。相比而言，WIL2NS细胞系含有5个二倍体克隆，具有 47-48的染色体数目，与K562细胞相比具有明显不同的染色体异常。WIL2NS细胞系中的克隆的表现如下克隆I 占 10%克隆2 占 55%克隆3 占 10%克隆4 占 20%克隆5占5%表2(下面)总结了 K562和WIL2NS细胞系的复杂核型。2个细胞系之间没有共享的异常。用蓝色突出显示在WIL2NS细胞系的所有克隆中存在的染色体异常。
6.2.用于蛋白表达的跨谱系三杂交体的核型分析对跨谱系三杂交体进行了核型分析，所述跨谱系三杂交体源自3个不同谱系的无限增殖细胞和原代细胞的各种组合，并进一步用于表达所需蛋白。还将这些核型与用于产生跨谱系三杂交体的原始无限增殖细胞系的核型进行了对比。
权利要求
1.通过杂交下述细胞而产生的杂交细胞第一个细胞，其中所述第一个细胞是干细胞或源自未定型的祖细胞的细胞；源自淋巴共同祖细胞的第二个细胞；和源自淋巴共同祖细胞的第三个细胞，且其中所述第一个细胞不是骨髓瘤细胞。
2.根据权利要求I所述的杂交细胞，其中所述第二个细胞是源自B淋巴谱系的细胞，且所述第三个细胞是源自B淋巴谱系的细胞。
3.根据权利要求I所述的杂交细胞，其中所述第二个细胞是源自T淋巴谱系的细胞，且所述第三个细胞是源自T淋巴谱系的细胞。
4.根据权利要求I所述的杂交细胞，其中所述第二个细胞是源自B淋巴谱系的细胞，且所述第三个细胞是源自T淋巴谱系的细胞。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的杂交细胞，其中所述第一个细胞是源自髓共同祖细胞的细胞。
6.根据权利要求5所述的杂交细胞，其中所述源自髓共同祖细胞的细胞是骨髓单核祖细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞或嗜碱性粒细胞。
7.根据权利要求5所述的杂交细胞系，其中所述源自髓共同祖细胞的细胞显示至少一种下述CD抗原⑶16、CD15或⑶14。
8.根据权利要求5所述的杂交细胞，其中所述源自髓共同祖细胞的细胞是单核细胞。
9.根据权利要求5所述的杂交细胞，其中所述源自髓共同祖细胞的细胞是原代骨髓单核祖细胞。
10.根据权利要求5所述的杂交细胞，其中所述源自髓共同祖细胞的细胞是无限增殖化的细胞。
11.根据权利要求5所述的杂交细胞，其中所述源自髓共同祖细胞的细胞源自脾、外周血、脐带血或骨髓。
12.根据权利要求2或权利要求4所述的杂交细胞，其中所述源自B淋巴谱系的细胞是前B细胞、幼B细胞、幼稚B细胞、活化的B细胞或效应B细胞。
13.根据权利要求12所述的杂交细胞，其中所述效应B细胞是抗原处理过的B-细胞或浆细胞。
14.根据权利要求2或权利要求4所述的杂交细胞，其中所述源自B淋巴谱系的细胞显示至少一种下述⑶抗原⑶19、⑶20、⑶72或⑶5。
15.根据权利要求3或权利要求4所述的杂交细胞，其中所述源自T淋巴谱系的细胞是前T细胞、幼T细胞、幼稚T细胞、活化的T细胞或效应T细胞。
16.根据权利要求3或权利要求4所述的杂交细胞，其中所述源自T淋巴谱系的细胞显示至少一种下述⑶抗原⑶3、⑶4、⑶5或⑶8。
17.根据权利要求2或权利要求4所述的杂交细胞，其中所述源自B淋巴谱系的细胞是无限增殖化的细胞。
18.根据权利要求3或权利要求4所述的杂交细胞，其中所述源自T淋巴谱系的细胞是无限增殖化的细胞。
19.根据权利要求2或权利要求4所述的杂交细胞，其中所述源自B淋巴谱系的细胞源自淋巴组织。
20.根据权利要求3或权利要求4所述的杂交细胞，其中所述源自T淋巴谱系的细胞源自淋巴组织。
21.根据权利要求19或权利要求20所述的杂交细胞，其中所述淋巴组织选自外周血、脐带血、脾、骨髓、胸腺、扁桃体、腺样体和局部淋巴结。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的杂交细胞，其中至少一个细胞是人细胞。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的杂交细胞，其中至少一个细胞是小鼠细胞。
24.根据权利要求5所述的杂交细胞，其中所述源自髓共同祖细胞的细胞是K562细胞。
25.根据权利要求I所述的杂交细胞，其中所述第二个细胞或所述第三个细胞是 WIL2-NS细胞或M0LT4细胞。
26.根据权利要求2或权利要求4所述的杂交细胞，其中所述源自B淋巴谱系的细胞是 WIL2-NS 细胞。
27.根据权利要求3或权利要求4所述的杂交细胞，其中源自所述T淋巴谱系的细胞是 M0LT4细胞。
28.根据权利要求I或权利要求4所述的杂交细胞，其中所述第一个细胞是K562细胞， 所述第二个细胞是WIL2-NS细胞，且所述第三个细胞是M0LT4细胞。
29.根据权利要求I或权利要求4所述的杂交细胞，其中所述第一个细胞是K562细胞， 所述第二个细胞是原代B细胞,且所述第三个细胞是原代T细胞。
30.根据权利要求I或权利要求4所述的杂交细胞，其中所述第一个细胞是原代人单核细胞，所述第二个细胞是WIL2-NS细胞，且所述第三个细胞是原代T细胞。
31.根据权利要求I或权利要求4所述的杂交细胞，其中所述第一个细胞是原代人骨髓单核祖细胞，所述第二个细胞是WIL2-NS细胞，且所述第三个细胞是原代人T细胞。
32.根据权利要求I或权利要求4所述的杂交细胞，其中所述第一个细胞是K562细胞， 所述第二个细胞是WIL2-NS细胞，且所述第三个细胞是原代T细胞。
33.根据权利要求I或权利要求2所述的杂交细胞，其中所述第一个细胞是原代单核细胞，所述第二个细胞是WIL2-NS细胞，且所述第三个细胞是WIL2-NS细胞。
34.根据权利要求I或权利要求4所述的杂交细胞，其中所述第一个细胞是原代小鼠单核细胞，所述第二个细胞是SP2细胞，且所述第三个细胞是原代小鼠T细胞。
35.根据权利要求I或权利要求2所述的杂交细胞，其中所述第一个细胞是原代小鼠单核细胞，所述第二个细胞是SP2细胞，且所述第三个细胞是SP2细胞。
36.根据权利要求I或权利要求2所述的杂交细胞，其中所述第一个细胞是原代人或小鼠单核细胞，所述第二个细胞是WIL2-NS细胞，且所述第三个细胞是SP2细胞。
37.根据权利要求1-36中任一项所述的杂交细胞，其中所述杂交细胞表达所需蛋白。
38.根据权利要求1-36中任一项所述的杂交细胞，其中所述杂交细胞表达超过一种所需蛋白。
39.根据权利要求38所述的杂交细胞，其中所述杂交细胞表达2种所需蛋白。
40.根据权利要求38所述的杂交细胞，其中所述杂交细胞表达3种所需蛋白。
41.根据权利要求37所述的杂交细胞，其中所述蛋白是内源蛋白。
42.根据权利要求38-40中任一项所述的杂交细胞，其中所述蛋白中的至少一种是内源蛋白。
43.根据权利要求37所述的杂交细胞，其中所述蛋白是重组蛋白。
44.根据权利要求38-40中任一项所述的杂交细胞，其中所述蛋白中的至少一种是重 组蛋白。
45.根据权利要求36-44中任一项所述的杂交细胞，其中所述蛋白是细胞因子。
46.根据权利要求37-44中任一项所述的杂交细胞，其中所述蛋白是集落刺激因子。
47.根据权利要求37-44中任一项所述的杂交细胞，其中所述蛋白是白介素。
48.根据权利要求37-44或46中任一项所述的杂交细胞，其中所述蛋白是GM-CSF。
49.根据权利要求37-44或47中任一项所述的杂交细胞，其中所述蛋白是白介素2。
50.根据权利要求37-44中任一项所述的杂交细胞，其中所述蛋白是受体或其片段。
51.根据权利要求37-44或50中任一项所述的杂交细胞，其中所述蛋白是可溶的受体。
52.根据权利要求36-44或50中任一项所述的杂交细胞，其中所述蛋白是人IL-4受体 a链。
53.根据权利要求36-44或50中任一项所述的杂交细胞，其中所述蛋白是免疫球蛋白。
54.根据权利要求53所述的杂交细胞，其中所述免疫球蛋白是IgM。
55.根据权利要求53所述的杂交细胞，其中所述免疫球蛋白是IgG。
56.根据权利要求37-44或51中任一项所述的杂交细胞，其中所述蛋白是CD54。
57.根据权利要求1-56中任一项所述的杂交细胞，其中所述杂交通过电方法来实现。
58.根据权利要求1-56中任一项所述的杂交细胞，其中所述杂交通过化学方法来实现。
59.根据权利要求1-58中任一项所述的杂交细胞，其进一步与表达目标蛋白的细胞杂交。
60.如权利要求1-58中任一项所述的杂交细胞，其中所述杂交通过杂交3个个别细胞 来实现。
61.如权利要求1-58中任一项所述的杂交细胞，其中所述杂交使用3个细胞群体来实 现，其中每个所述群体包括多个相同的细胞类型。
62.根据权利要求1-61中任一项所述的杂交细胞，其中所述杂交细胞富含界定特定细 胞类型的标记物，以允许表达表现出希望的翻译后修饰或希望的功能性的蛋白。
63.—种生产根据权利要求1-62中任一项所述的杂交细胞的方法，其中所述方法包括 下述步骤杂交第一个细胞，其中所述第一个细胞是干细胞或源自未定型的祖细胞的细胞；源自淋巴共同祖细胞的第二个细胞；和 源自淋巴共同祖细胞的第三个细胞，且其中所述第一个细胞不是骨髓瘤细胞。
64.一种生产蛋白的方法，所述方法包括下述步骤在根据权利要求1-62中任一项所 述的杂交细胞中表达蛋白。
65.在根据权利要求1-62中任一项所述的杂交细胞中生产的蛋白。
全文摘要
本发明涉及杂交细胞和用于生产杂交细胞的方法。具体地，本发明涉及从至少3个细胞的杂交产生的杂交细胞，其中至少2个细胞源自不同的谱系。本发明另外涉及杂交细胞用于表达蛋白的应用，所述蛋白可用于多种诊断用途、预防用途、治疗用途和/或研究用途。
文档编号C12N5/16GK102612556SQ201080035457
公开日2012年7月25日 申请日期2010年6月10日 优先权日2009年6月10日
发明者G·卡塞科, T·L·马哈沃拉西尔帕 申请人:Bts研究国际股份有限公司