专利名称：抗N3pGlu淀粉样蛋白BETA肽抗体及其用途的制作方法
抗N3pGlu淀粉样蛋白BETA肽抗体及其用途本发明涉及能选择性结合N3pGlu淀粉样蛋白Beta肽的抗体以及它们在淀粉样蛋白Beta (A^ ,也称为Abeta)肽相关疾病的治疗中的用途。循环形式的AP肽是由前体蛋白即淀粉样蛋白前体蛋白(APP)裂解而产生的38-43个氨基酸(大部分为38、40或42个氨基酸)组成。A P从可溶性形式向具有高P -片层含量的不溶性形式的转化以及这些不溶性形式作为神经炎性斑块和脑血管斑块在脑部沉积，已证明与各种疾病和病况相关，包括阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease) (AD)、唐氏综合症(Down’s Syndrome)和脑淀粉样蛋白血管病(CAA)。斑块中存在的沉积物主要由AP肽的不均匀混合物组成。N3pGlu AP，也称为N3pE或APp3_42，是仅见于斑块的A3肽截短形式。N3pGlu 缺乏N-端的头2个氨基酸残基并具有源自第3个氨基酸位置的谷氨酸的焦谷氨酸。尽管N3pGlu 肽是脑中沉积的AP的少量成分,但研究已经证明N3pGlu 肽具有侵袭性聚集(aggressiveaggregation)性质并在沉积级联早期积累。尽管先前已经描述了靶向N3pGlu A3肽的多克隆抗体和单克隆抗体(US7，122，374和冊2010/009987)，但仍然需要高亲和力抗吧 6111 单克隆抗体，以在体内结合靶标(即斑块结合)并随之降低斑块水平。另外，假如氨基-端和羧基-端的抗A3抗体导致脑淀粉样蛋白血管病(CAA)相关的微出血增加，就需要不会导致微出血增加的抗N3pGlu 抗体，即使慢性治疗导致沉积斑块明显减少。本发明范围之内的抗体是具有多种所需性质的治疗上有用的N3pGlu 肽拮抗齐U。本发明的抗体以高亲和力结 合人N3pGlu 肽并表现出剂量依赖性体内斑块减少，而不增加脑淀粉样蛋白血管病(CAA)相关的微出血。本发明提供人工程化抗N3pGlu 抗体或其抗原-结合片段，其25°C时对于人N3pGlu 肽的Kd小于I X 10_9 M0在一个优选的实施方案中，本发明提供人工程化抗N3pGlu 抗体或其抗原-结合片段，其25°C时对于人N3pGlu 肽的Kd小于9 x 10,M。在另一个优选的实施方案中，本发明提供人工程化抗N3pGlu 抗体或其抗原-结合片段，其25°C时对于人N3pGlu 肽的Kd小于7 x 10, M。在另一个优选的实施方案中，本发明提供人工程化抗N3pGlu 抗体或其抗原-结合片段，其25°C时对于人N3pGlu肽的Kd介于9 X 10, M和I X 10, M之间。在另一个优选的实施方案中，本发明提供抗N3pGlu 抗体或其抗原-结合片段，其25°C时对于人N3pGlu 肽的Kd介于9 x 10,M 和 I X 1(T10 M 之间。本发明还提供人工程化抗N3pGlu 抗体或其抗原-结合片段，其25°C时对于人N3pGlu 肽的Kd小于I X I(T9 M，或小于9 x 1(T10 M，或小于7 x 1(T10 M，或介于9 x
10,M和I x 10, M之间，并能在体内减少斑块。在再一个优选的实施方案中，本发明提供人工程化抗N3pGlu 抗体或其抗原-结合片段，其25°C时对于人N3pGlu 肽的Kd小于 I X 10_9 M，或小于 9 X 10_1Q M，或小于 7 X 10_1Q M，或介于 9 x 10_1Q M 和 I x 10_1Q M之间，并能在体内减少斑块，而不增加CAA相关的微出血。本发明也提供人工程化抗N3pGlu A ^抗体或其抗原-结合片段，其包含LCVR和hcvr，其中 LCDRi 是 Ksx1X2SllysrX3Ktyln (seq id no 51)，lcdr2 是 avsklx4s (seq idNO: 52)，LCDR3 是 VQGTHYPFT (SEQ ID NO: 5)，HCDRl 是 GYX5FTX6YnN (SEQ ID NO: 53)，HCDR2 是 WINPGSGNTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 8)，HCDR3 是 EGX7TVY (SEQ ID NO: 54)，其中 X1是S或T，X2是Q或R，X3是G或S，X4是D或G，X5是D或T，X6是R或D，X7是1、T、E或V。本发明提供人工程化抗N3pGlu 抗体或其抗原-结合片段，其包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中所述LCVR包含IXDRl、IXDR2、IXDR3多肽，HCVR包含HCDR1、HCDR2、HCDR3 多肽，其选自
a)LCDRl 是 KSSQSLLYSRGKTYLN (SEQ ID NO: 3)，LCDR2 是 AVSKLDS (SEQ ID NO: 4)，LCDR3 是 VQGTHYPFT (SEQ ID NO: 5)，HCDRl 是 GYDFTRYYIN (SEQ ID NO: 6)，HCDR2 是WINPGSGNTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 8)，HCDR3 是EGITVY (SEQ ID NO: 9)；
b)LCDRl 是 KSSQSLLYSRGKTYLN (SEQ ID NO: 3)，LCDR2 是 AVSKLDS (SEQ ID NO: 4)，LCDR3 是 VQGTHYPFT (SEQ ID NO: 5)，HCDRl 是 GYTFTRYYIN (SEQ ID NO: 7)，HCDR2 是WINPGSGNTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 8)，HCDR3 是EGITVY (SEQ ID NO: 10)；
c)LCDRl 是 KSSQSLLYSRGKTYLN (SEQ ID NO: 3)，LCDR2 是 AVSKLDS (SEQ ID NO: 4)，LCDR3 是 VQGTHYPFT (SEQ ID NO: 5)，HCDRl 是 GYTFTDYYIN (SEQ ID NO: 40)，HCDR2 是WINPGSGNTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 8)，HCDR3 是EGETVY (SEQ ID NO: 41)；
d)LCDRl 是KSSQSLLYSRGKTYLN (SEQ ID NO: 3)，LCDR2 是AVSKLGS (SEQ ID NO: 35)，LCDR3 是 VQGTHYPFT (SEQ ID NO: 5)，HCDRl 是 GYTFTRYYIN (SEQ ID NO: 7)，HCDR2 是WINPGSGNTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 8)，HCDR3 是 EGITVY (SEQ ID NO: 10);和
e)LCDRl 是KSTRSLLYSRSKTYLN (SEQ ID NO: 45)，LCDR2 是AVSKLDS (SEQ ID NO: 4)，LCDR3 是 VQGTHYPFT (SEQ ID NO: 5)，HCDRl 是 GYTFTDYYIN (SEQ ID NO: 40)，HCDR2 是WINPGSGNTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 8)，HCDR3 是 EGVTVY (SEQ ID NO: 46)。在一个实施方案中，本发明提供人工程化抗N3pGlu AP抗体或其抗原-结合片段，其包含 LCVR 和 HCVR，其中 LCDRl 是 SEQ ID NO: 3，LCDR2 是 SEQ ID NO: 4，LCDR3 是SEQ ID NO: 5，HCDRl 是 SEQ ID NO: 6，HCDR2 是 SEQ ID NO: 8，HCDR3 是 SEQ ID NO: 9。在一个实施方案中，本发明提供人工程化抗N3pGlu 抗体或其抗原-结合片段，其包含LCVR 和 HCVR，其中 LCDRl 是 SEQ ID NO: 3，LCDR2 是 SEQ ID NO: 4，LCDR3 是 SEQ ID NO:5，HCDRl 是 SEQ ID NO: 7，HCDR2 是 SEQ ID NO: 8，HCDR3 是 SEQ ID NO: 10。在一个优选的实施方案中，本发明提供人工程化抗N3pGlu 抗体或其抗原-结合片段，其包含LCVR和 HCVR，其中 LCDRl 是 SEQ ID NO: 3，LCDR2 是 SEQ ID NO: 4，LCDR3 是 SEQ ID NO: 5，HCDRl 是 SEQ ID NO: 40，HCDR2 是 SEQ ID NO: 8，HCDR3 是 SEQ ID NO: 41。在一个优选的实施方案中，本发明提供人工程化抗N3pGlu 抗体或其抗原-结合片段，其包含LCVR和HCVR，其中 LCDRl 是 SEQ ID NO: 3，LCDR2 是 SEQ ID NO: 35，LCDR3 是 SEQ ID NO: 5，HCDRl是 SEQ ID NO: 7，HCDR2 是 SEQ ID NO: 8，HCDR3 是 SEQ ID NO: 10。在一个优选的实施方案中，本发明提供人工程化抗N3pGlu 抗 体或其抗原-结合片段，其包含LCVR和HCVR，其中 LCDRl 是 SEQ ID NO: 45，LCDR2 是 SEQ ID NO: 4，LCDR3 是 SEQ ID NO: 5，HCDRl 是SEQ ID NO: 40，HCDR2 是 SEQ ID NO: 8，HCDR3 是 SEQ ID NO: 46。在另一个实施方案中，本发明提供人工程化抗N3pGlu 抗体或其抗原-结合片段，其包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中所述LCVR和HCVR是选自以下的多肽
a.SEQ ID NO: 11 的 LCVR 和 SEQ ID NO: 12 的 HCVR ;
b.SEQ ID NO: 11 的 LCVR 和 SEQ ID NO: 13 的 HCVR ;
c.SEQ ID NO: 11 的 LCVR 和 SEQ ID NO: 42 的 HCVR ;
d.SEQ ID NO: 36 的 LCVR 和 SEQ ID NO: 37 的 HCVR ;和
e.SEQ ID NO: 47 的 LCVR 和 SEQ ID NO: 48 的 HCVR。在一个实施方案中，本发明提供抗N3pGlu 单克隆抗体或其抗原-结合片段，其包含SEQ ID NO: 11的LCVR和SEQ ID NO: 12的HCVR。在一个实施方案中，本发明提供抗N3pGlu 单克隆抗体或其抗原-结合片段，其包含SEQ ID NO: 11的LCVR和SEQ IDNO: 13的HCVR。在一个实施方案中，本发明提供抗N3pGlu 单克隆抗体或其抗原-结合片段，其包含SEQ ID NO: 11的LCVR和SEQ ID NO: 42的HCVR。在一个优选的实施方案中，本发明提供抗N3pGlu 单克隆抗体或其抗原-结合 片段，其包含SEQ ID NO: 36的LCVR和SEQ ID NO: 37的HCVR。在一个优选的实施方案中，本发明提供抗N3pGlu 单克隆抗体或其抗原-结合片段，其包含SEQ ID NO: 47的LCVR和SEQ ID NO: 48的HCVR。本发明也提供抗N3pGlu 单克隆抗体，其包含轻链(LC)和重链(HC)，其中所述LC多肽和HC多肽选自
a)SEQ ID NO: 14 的 LC 和 SEQ ID NO: 15 的 HC ;
b)SEQ ID NO: 14 的 LC 和 SEQ ID NO: 16 的 HC ;
c)SEQ ID NO: 14 的 LC 和 SEQ ID NO: 44 的 HC ;
d)SEQ ID NO: 38 的 LC 和 SEQ ID NO: 39 的 HC ;和
e)SEQ ID NO: 49 的 LC 和 SEQ ID NO: 50 的 HC。在一个实施方案中，本发明提供抗N3pGlu 单克隆抗体或其抗原-结合片段，其包含SEQ ID NO: 14的LC和SEQ ID NO: 15的HC。在一个实施方案中，本发明提供抗N3pGlu 单克隆抗体或其抗原-结合片段，其包含SEQ ID NO: 14的LC和SEQ ID NO:16的HC。在一个实施方案中，本发明提供抗N3pGlu 单克隆抗体或其抗原-结合片段，其包含SEQ ID NO: 14的LC和SEQ ID NO: 44的HC。在一个优选的实施方案中，本发明提供抗N3pGlu 单克隆抗体或其抗原-结合片段，其包含SEQ ID NO: 38的LC和SEQID NO: 39的HC。在一个优选的实施方案中，本发明提供抗N3pGlu 单克隆抗体或其抗原-结合片段，其包含SEQ ID NO: 49的LC和SEQ ID NO: 50的HC。在一个优选的实施方案中，所述抗N3pGlu 单克隆抗体包含两条轻链和两条重链，其中每条LC是SEQ ID NO: 14的多肽，每条HC是SEQ ID NO: 15的多肽。在一个优选的实施方案中，所述抗N3pGlu 单克隆抗体包含两条轻链和两条重链，其中每条LC是SEQ ID NO: 14的多肽，每条HC是SEQ ID NO: 16的多肽。在一个优选的实施方案中，所述抗N3pGlu 单克隆抗体包含两条轻链和两条重链，其中每条LC是SEQ ID NO: 14的多肽，每条HC是SEQ ID NO: 44的多肽。在一个优选的实施方案中，所述抗N3pGlu A3单克隆抗体包含两条轻链和两条重链，其中每条LC是SEQ ID NO: 38的多肽，每条HC是SEQID NO: 39的多肽。在一个优选的实施方案中，所述抗N3pGlu 单克隆抗体包含两条轻链和两条重链，其中每条LC是SEQ ID NO: 49的多肽，每条HC是SEQ ID NO: 50的多肽。本发明也提供药物组合物，其包含本发明抗N3pGlu 单克隆抗体或其抗原-结合片段。在一个优选的实施方案中，所述药物组合物包含本发明抗N3pGlu 单克隆抗体或其抗原-结合片段，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在另一个优选的实施方案中，所述药物组合物还额外包含一种或多种治疗成分。再一方面，本发明提供治疗AP肽活性相关病况的方法，其包括给予有需要的人类患者本发明的抗N3pGlu 单克隆抗体或抗原-结合片段。再一方面，本发明提供治疗选自以下的病况的方法临床或临床前阿尔茨海默病、前驱阿尔茨海默病、唐氏综合症、和临床或临床前CAA，所述方法包括给予有需要的人本发明的抗N3pGlu 单克隆抗体或其抗原-结合片段。在一个优选的实施方案中，本发明提供治疗阿尔茨海默病的方法。再一方面，本发明提供用于治疗的抗N3pGlu 单克隆抗体或其抗原-结合片段。在一个优选的实施方案中，本发明提供用于治疗选自以下的病况的抗N3pGlu 单克隆抗体或其抗原-结合片段临床或临床前`阿尔茨海默病、前驱阿尔茨海默病、唐氏综合症或临床或临床前CAA。在一个更优选的实施方案中，本发明提供用于治疗阿尔茨海默病的抗N3pGlu 单克隆抗体或其抗原-结合片段。在另一个优选的实施方案中，本发明提供用于预防选自以下的病况的抗N3pGlu 单克隆抗体或其抗原-结合片段临床或临床前阿尔茨海默病、前驱阿尔茨海默病、临床或临床前CAA。在一个更优选的实施方案中，本发明提供用于预防阿尔茨海默病的抗N3pGlu 单克隆抗体或其抗原-结合片段。再一方面，本发明提供抗N3pGlu 单克隆抗体或其抗原-结合片段在制备用于治疗选自以下的病况的药物中的用途临床或临床前阿尔茨海默病、前驱阿尔茨海默病、唐氏综合症和临床或临床前CAA。在一个优选的实施方案中，本发明提供抗N3pGlu AP单克隆抗体或其抗原-结合片段在制备用于治疗阿尔茨海默病的药物中的用途。全长抗体是包含由二硫键相连的2条重(H)链和2条轻(L)链的免疫球蛋白分子。每条链的氨基端部分包括大约100-110个氨基酸的可变区，其主要是通过其中所含的互补决定区(CDR)而负责抗原识别。每条链的羧基-端部分限定了恒定区，其主要负责效应子功能。CDR分散在称为构架区(FR)的保守区域。每个轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)是由3个⑶R和4个FR组成，从氨基-端到羧基-端按以下顺序排列FR1、⑶R1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。轻链的 3 个 CDR 称为 “LCDRl、LCDR2 和 LCDR3”，重链的 3 个 CDR称为“HCDR1、HCDR2和HCDR3”。⑶R含有与抗原形成特异性相互作用的大部分残基。LCVR区和HCVR区内CDR氨基酸残基的编号和位置依照众所周知的Kabat编号规定。轻链分为kappa或lambda，其特征在于如本领域已知的特定恒定区。重链分为gamma、mu、alpha、delta 或 epsilon,并定义抗体的同种型分别为 IgG、IgM、IgA、IgD 或 IgE。IgG抗体还可进一步分为亚类,例如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4。每一重链类型的特征在于具有本领域众所周知的序列的特定恒定区。本文所用的术语“单克隆抗体(Mab) ”是指源自或分离自单拷贝或克隆的抗体，包括例如任何真核生物克隆、原核生物克隆或噬菌体克隆，而不是指所产生的方法。本发明的Mab优选存在为均匀或基本均匀的群体。完整的Mab含有2条重链和2条轻链。术语“抗原-结合片段”包括例如Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段和单链Fv片段。本发明的单克隆抗体及其抗原-结合片段可通过例如重组技术、噬菌体展示技术、合成技术例如CDR-移植、或这些技术的组合、或本领域已知的其它技术而产生。例如,可用人抗N3pGlu 或其片段来免疫小鼠，回收和纯化所得抗体，然后可通过基本如下述实施例所公开的方法评价，以确定它们是否具有与本文所公开的抗体化合物类似或相同的结合和功能性质。抗原-结合片段也可通过常规方法来制备。制备和纯化抗体和抗原-结合片段的方法是本领域众所周知的，并可参见例如 Harlow 和 Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York,第 5-8 和 15 章，ISBN 0-87969-314-2。术语“人工程化抗体”是指具有本发明的结合和功能性质、其构架区基本上是人或完全是人的、并围绕着源自非人类抗体的CDR的单克隆抗体。这样的人工程化抗体的“抗原-结合片段”包括例如Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段和单链Fv片段。“构架区”或“构架序列”是指构架区1-4中的任一个。本发明的人工程化抗体和其抗原-结合片段包括这样的分子其中构架区1-4中的任一个或多个基本上是人或完全是人的，即其中存在着个体基本上或完全是人构架区1-4的任何可能组合。例如,这包括这样的分子其中构架区I和构架区2、构架区I和构架区3、构架区1、2和3等，基本上是人或完全是人的。基本上是人的构架是与已知人种系构架序列具有至少大约80%序列同一性的那些。优选地，基本上是人的构架与已知人种系构架序列具有至少大约85%、大约90%、大约95%或大约99%序列同一,I"生。
完全人构架是与已知人种系构架序列相同的那些。人构架种系序列可得自 ImMunoGeneTics (IMGT),通过他们的网址 http://imgt. cines. fr,或得自 TheImmunoglobulin FactsBook,Marie-PauIe Lefranc矛口Gerard Lefranc, Academic Press,2001，ISBN 012441351。例如，种系轻链构架可选自:A11、A17、A18、A19、A20、A27、A30、L1、L11、L12、L2、L5、L15、L6、L8、012、02 和 08，种系重链构架区可选自VH2-5、VH2-26、VH2_70、VH3-20、VH3-72、VH1-46、VH3-9、VH3-66、VH3-74、VH4-31、VH1-18、VH1-69、V1-13-7、VH3-11、VH3-15、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-48、VH4-39、VH4-59 和 VH5-5I。除了本文所公开的具有本发明类似功能性质的那些，人工程化抗体也可用若干不同方法来产生。本文所公开的具体抗体化合物可用作模板或亲代抗体化合物，以制备额外的抗体化合物。在一种方法中，将亲代抗体化合物CDR移植到与亲代抗体化合物构架具有高度序列同一性的人构架中。新构架的序列同一性通常将与亲代抗体化合物中相应构架序列具有至少大约80%、至少大约85%、至少大约90%、至少大约95%、或至少大约99%同一性。这种移植可导致结合亲和力下降，与亲代抗体相比。如果在这种情况下，可在某些位置上将构架回复突变至亲代构架，根据以下文献所公开的具体标准Queen等(1991) Proc. NatLAcad. Sc1. 88:2869。描述可用于使小鼠抗体人源化的方法的额外参考文献包括美国专利号 4，816，397 ;5，225，539 ;和 5，693，761 ;计算机程序 ABMOD 和 ENCAD,描述于 Levitt(1983) J. Mol. Biol. 168:595-620 ;和以下的方法Winter及其合作者(Jones 等(1986)Nature 321:522-525 ;Riechmann 等(1988) Nature 332:323-327 ;和 Verhoeyen 等(1988)Science 239:1534-1536。对考虑用于回复突变的残基的鉴定可如下进行
当一个氨基酸落入以下范畴时，所用的人种系序列的构架氨基酸(“受体构架”)被来自亲代抗体化合物的构架的构架氨基酸(“供体构架”)取代；(a)受体构架的人构架区氨基酸对于人构架在该位置而言是不常见的，而供体免疫球蛋白中的相应氨基酸对于人构架在该位置而言却是典型的；
(b)氨基酸位置紧邻⑶R中的一个；或
(c)在三维免疫球蛋白模型中，构架氨基酸的任何侧链原子在CDR氨基酸任何原子的大约5-6埃(中心-到-中心)之内。当受体构架的人构架区中的每个氨基酸和供体构架中相应氨基酸对于人构架在该位置而言通常是不常见的时，这样的氨基酸可被对于人构架在该位置而言是典型的氨基酸取代。这样的回复突变标准使得能够恢复亲代抗体化合物的活性。具有本文所公开抗体化合物的类似功能性质的人工程化抗体的另一制备方法包括在移植的CDR内随机突变氨基酸，而不改变构架，然后筛选具有与亲代抗体化合物同样良好或更好的结合亲和力和其它功能性质的所得分子。也可将单一突变引入每个CDR内的每个氨基酸位置，然后评价这类突变对结合亲和力和其它功能性质的影响。可将产生改进的性质的单一突变组合起来，以评价它们彼此组合的影响。此外，前述两种方法的组合是可能的。CDR移植之后，可回复突变特定构架区，除了将氨基酸变化引入CDR内。该方法学描述于Wu等(1999) J Mol. BioL 294:151-162。应用本发明教导，本领域技术人员可使用通用技术，例如定点诱变，以取代本文所公开的CDR和构架序列内的氨基酸并由此产生其它源自本发明序列的可变区氨基酸序列。所有备选的天然发生的氨基酸都可引入特定取代位点。然后，本文所公开的方法可用于筛选这些额外的可变区氨基酸序列，以鉴定具有指定体内功能的序列。按照此方式，可鉴定出适于制备本发明的人工程化抗体及其抗原-结合部分的更多的序列。优选地，构架内的氨基酸取代限制在本文所公开的4轻链中的任一或多个和/或重链构架区之内的1、2或3个位置。优选地，⑶R内 的氨基酸取代限制在3轻链中的任一或多个和/或重链⑶R之内的1、2或3个位置。上述这些构架区和⑶R内的多种改变的组合也是可能的。术语“治疗”(或“处理”)是指包括减缓、打断、停止、控制、终止、减少或逆转抗N3pGlu 抗体相关的现有症状、病症、病况或疾病的进程或严重程度的过程，但不一定包括完全消除所有疾病相关的症状、病况或病症。本发明的抗体可用作人类医学中的药物，其通过各种途径给予。最优选地，这类组合物用于胃肠外给药。这类药物组合物可通过本领域众所周知的方法制备{参见例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy, % 19IK (1995), A. Gennaro 等,Mack Publishing Co.),并且包含本文所公开的抗体或其抗原-结合片段，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。以下测定的结果证明本发明的单克隆抗体和其抗原-结合片段可用于治疗A3肽活性相关的病况，例如阿尔茨海默病、唐氏综合症和CAA。实施例1:抗体的产生
起始抗体的产生FVB转基因小鼠用在37°C预处理过夜以形成聚集体的N-端截短的和焦谷氨酸-修饰的人淀粉样蛋白P肽3-42 (N3pGlu)免疫接种。收获小鼠脾细胞，AP 1-40反应性B细胞经MACS耗尽。分选剩余细胞与聚集的N3pGlu 肽的结合。从所选B细胞中分离RNA，并使用oligo dT转化为cDNA。使用抗体信号序列引物通过PCR获取抗体重链可变区和轻链可变区，并通过Kunkel诱变克隆到噬菌体载体中，以制备Fab文库。通过单点ELISA (SPE)筛选Fab文库与聚集的N3pGlu肽的结合，并针对AP 1-40进行反向筛选。通过DNA测序、fab表达和与N3pGlu 肽的结合、以及不与可溶性AP 1_40或AP 1_42肽结合来表征阳性克隆。构建单个氨基酸突变文库并通过SPE筛选与聚集的N3pGlu A3肽、但不与A3 1-42的结合。将有益突变组合到组合文库中。选择亲和力优化的组合变体并转化到小鼠IgGl中，用于通过BIAC0RE 的亲和力测量和通过免疫组织化学的AP斑块结合。从所鉴定的克隆，以小鼠IgGl (mE8)和IgG2a (mE8c)同种型的形式制备mAb蛋白，用于体内功效研究。mE8不与小鼠N3pGlu AP序列(mpE3_16)或人AP 1-42结合。人种系构架VH1-69/JH6和Vk_A18/JK2用于起始的人源化。将mE8抗体的CDR(具有4个亲和力突变)移植到人构架中，得到抗体hE8-C6。对hE8-C6主链进行进一步亲和力优化，并将有益突变组合，以制备高亲和力的人源化变体R5、R17、R24和2420。
第二轮优化，以改讲药物可开发件(developability) 2种人源化变体,hE8_C6和R17，被选作主链，用于第二轮优化，以便通过降低与细胞的非特异性结合以改进抗体的血清半衰期，并增加抗体与可溶性N3pGlu 肽的亲和力。合成由N3pGlu 的N-端14个氨基酸(PE3-16B)组成的生物素化可溶性肽并且评价其与N3pGlu 肽对于抗体mE8结合的等价性。开发了使用PE3-16B的高通量filter life测定并用于所有后续文库筛选。来自filter lift筛选的所有命中(hit)都通过与聚集的N3pGlu 的结合而得以证实。使用filter lift测定再次筛选hE8_C6变体文库，鉴定一组有益突变。将它们的亚组用于制备组合文库。4个组合变体(CoI1-ElO、CoI1-G2、C0I1-G8和CoI1-E2)选自该方法。计算机建模用于创建hE8_C6、R17、R24和其它变体的V-区结构模型。结构模型分析鉴定为亲和力优化而引入并簇集在结合位点的正电荷，这是抗体与细胞的非特异性结合的潜在原因。根据建模，选择若干位置用于引入变化，以平衡表面静电压。通过将来自文库筛选的某些有益突变和结构建模所限定的改变组合而合成组合文库。从这样的工作中选出3个变体(R17m-B4、R17m_A12和R17m_B12)用于进一步研究。结构模型分析也发现轻链构架残基Y36和重链CDR3中的残基之间的立体冲突。将突变Y36L弓丨A hE8-C6轻链，得到变体hE8L。发现仅该构架变化同时对抗体亲和力的增加和非特异性细胞结合的减少具有显著影响。其它工作是测试不同人构架，用于人源化。将mE8抗体的⑶R移植到构架VH5-51/VK02和VH3-23/VKA2上。经测定，在N3pGlu 结合中，具有VH5-51/VK02的人源化Fab(hE8-5102)相当于(如果不是优于)hE8-C6。将额外有益突变引入hE8_5102中，得到组合变体 C1-A1、C1-B6、C1-C7 和 C1-B8。经过所有体外测定(包括用于抗体特异性和亲和性的ELISA和BIAC0RE ，非特异性细胞结合，和IHC染色)之后，选择5种变体mAb即B12L、C1-C7、hE8L、R17L和R17。可基本上按照以下所述来制备和纯化抗体。合适的宿主细胞，例如HEK 293、EBNA或CH0，经过用表达系统瞬时或稳定转染，用于分泌抗体，使用优化的预定HC:LC载体比例或者同时编码HC例如SEQ ID NO: 56和SEQ ID NO: 43、以及LC例如SEQ ID NO: 55的单个载体系统。使用多种通用技术中的任一种对其中已分泌抗体的澄清培养基进行纯化。例如，可将培养基方便地上样到蛋白A或G琼脂糖FF柱(其已用相容的缓冲液例如磷酸缓冲盐水(pH 7.4)平衡)。洗涤柱子，以除去非特异性结合成分。洗脱结合的抗体，例如通过PH梯度(例如0.1 M磷酸钠缓冲液pH 6. 8至0.1 M柠檬酸钠缓冲液pH 2. 5)。检测抗体流分，例如通过SDS-PAGE，然后将其合并。根据预期用途，任选进一步纯化。可使用常规技术将抗体浓缩和/或对其进行无菌过滤。可通过常规技术有效去除可溶性聚集体和多聚体，所述技术包括大小排阻、疏水性相互作用、离子交换或羟基磷灰石色谱。经过这些色谱步骤之后，抗体纯度大于99%。可将产物在_70°C立即冷冻或可冻干。本发明的这些抗体的氨基酸序列提供如下
表1-抗体SEQ ID NO
权利要求
1.人工程化抗N3pGlu单克隆抗体或其抗原-结合片段，其包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中所述LCVR包含IXDR1、IXDR2和IXDR3多肽，HCVR包含HCDRl、HCDR2和HCDR3多肽，其选自a)LCDRl 是KSSQSLLYSRGKTYLN (SEQ ID NO: 3)，LCDR2 是 AVSKLDS (SEQ ID NO: 4)，LCDR3 是 VQGTHYPFT (SEQ ID NO: 5)，HCDRl 是 GYDFTRYYIN (SEQ ID NO: 6)，HCDR2 是WINPGSGNTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 8)，和 HCDR3 是 EGITVY (SEQ ID NO: 9)；b)LCDRl 是 KSSQSLLYSRGKTYLN (SEQ ID NO: 3)，LCDR2 是 AVSKLDS (SEQ ID NO: 4)，LCDR3 是 VQGTHYPFT (SEQ ID NO: 5)，HCDRl 是 GYTFTRYYIN (SEQ ID NO: 7)，HCDR2 是WINPGSGNTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 8)，和 HCDR3 是 EGITVY (SEQ ID NO: 10)；c)LCDRl 是 KSSQSLLYSRGKTYLN (SEQ ID NO: 3)，LCDR2 是 AVSKLDS (SEQ ID NO: 4)，LCDR3 是 VQGTHYPFT (SEQ ID NO: 5)，HCDRl 是 GYTFTDYYIN (SEQ ID NO: 40)，HCDR2 是WINPGSGNTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 8)，和 HCDR3 是 EGETVY (SEQ ID NO: 41)；d)LCDRl 是KSSQSLLYSRGKTYLN (SEQ ID NO: 3)，LCDR2 是AVSKLGS (SEQ ID NO: 35),LCDR3 是 VQGTHYPFT (SEQ ID NO: 5)，HCDRl 是 GYTFTRYYIN (SEQ ID NO: 7)，HCDR2 是WINPGSGNTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 8)，和 HCDR3 是 EGITVY (SEQ ID NO: 10);和e)LCDRl 是KSTRSLLYSRSKTYLN (SEQ ID NO: 45)，LCDR2 是AVSKLDS (SEQ ID NO: 4)，LCDR3 是 VQGTHYPFT (SEQ ID NO: 5)，HCDRl 是 GYTFTDYYIN (SEQ ID NO: 40)，HCDR2 是WINPGSGNTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 8)，和 HCDR3 是 EGVTVY (SEQ ID NO: 46)。
2.权利要求1的人工程化抗N3pGlu单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中所述LCVR和HCVR是选自以下的多肽a)SEQ ID NO: 11 的 LCVR 和 SEQ ID NO: 12 的 HCVR ;b)SEQ ID NO: 11 的 LCVR 和 SEQ ID NO: 13 的 HCVR ;c)SEQ ID NO: 11 的 LCVR 和 SEQ ID NO: 42 的 HCVR ;d)SEQ ID NO: 36 的 LCVR 和 SEQ ID NO: 37 的 HCVR ;和e)SEQ ID NO: 47 的 LCVR 和 SEQ ID NO: 48 的 HCVR。
3.权利要求1-2的人工程化抗N3pGlu单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含轻链(LC)和重链(HC)，其中所述LC多肽和HC多肽选自a)SEQ ID NO: 14 的 LC 和 SEQ ID NO: 15 的 HC ;b)SEQ ID NO: 14 的 LC 和 SEQ ID NO: 16 的 HC ;c)SEQ ID NO: 14 的 LC 和 SEQ ID NO: 44 的 HC ;d)SEQ ID NO: 38 的 LC 和 SEQ ID NO: 39 的 HC ;和e)SEQ ID NO: 49 的 LC 和 SEQ ID NO: 50 的 HC。
4.权利要求3的人工程化抗N3pGlu单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含两条轻链和两条重链，其中每条轻链和每条重链是选自以下的多肽a)SEQ ID NO: 14 的 LC 和 SEQ ID NO: 15 的 HC ;b)SEQ ID NO: 14 的 LC 和 SEQ ID NO: 16 的 HC ;c)SEQ ID NO: 14 的 LC 和 SEQ ID NO: 44 的 HC ;d)SEQ ID NO: 38 的 LC 和 SEQ ID NO: 39 的 HC ;和e)SEQ ID NO: 49 的 LC 和 SEQ ID NO: 50 的 HC。
5.一种药物组合物，其包含权利要求1-4中任一项的人工程化抗体或其抗原-结合片段，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
6.权利要求5的药物组合物，其还额外包含一种或多种治疗成分。
7.治疗AP肽活性相关病况的方法，其包括给予有需要的人类患者权利要求5或6的药物组合物。
8.治疗选自以下的病况的方法临床或临床前阿尔茨海默病、前驱阿尔茨海默病、唐氏综合症、和临床或临床前淀粉样蛋白血管病(CAA);所述方法包括给予有需要的人权利要求5或6的药物组合物。
9.治疗阿尔茨海默病的方法，所述方法包括给予有需要的人权利要求5或6的药物组合物。
10.用于治疗的权利要求1-4中任一项的人工程化抗体或其抗原-结合片段。
11.用于治疗々0肽活性相关病况的权利要求1-4中任一项的人工程化抗体或其抗原-结合片段。
12.用于治疗选自以下的病况的权利要求1-4中任一项的人工程化抗体或其抗原-结合片段临床或临床前阿尔茨海默病、前驱阿尔茨海默病、唐氏综合症或者临床或临床前CAA。
13.用于治疗阿尔茨海默病的权利要求12的人工程化抗体或其抗原-结合片段。
全文摘要
本发明提供抗N3pGluAβ抗体或其抗原-结合片段。另外，本发明提供抗N3pGluAβ抗体或其抗原-结合片段在阿尔茨海默病的治疗中的用途。
文档编号C07K16/18GK103068848SQ201180039876
公开日2013年4月24日 申请日期2011年8月9日 优先权日2010年8月12日
发明者J.卢, Y.唐, R.B.德马托斯 申请人:伊莱利利公司