Fab糖基化抗体的制作方法

专利名称：Fab糖基化抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗体领域。具体而言，提供了在Fab部分连接有高度唾液酸化的聚糖的抗体。进一步地，本发明提供了用于通过Fab唾液酸化而控制抗体的循环半衰期方法。
背景技术：
现今，抗体是医疗和研究领域广泛使用的试剂。在医疗用途中，其在许多不同领域有所应用。例如，抗体用作检测特定标记物的标记试剂，其允许进行疾病的诊断和/或预后或对具体身体参数如特定激素的存在情况或浓度进行确定。进一步地，抗体还用作多种疾病如癌症、心血管疾病、炎性疾病、黄斑退化、移植排斥、多发性硬化及病毒感染的治疗和预防中的治疗试剂。在这些疗法中，可以是抗体本身具有治疗活性，例如通过阻断受体或信使分子，由此抑制其疾病相关的功能，或其通过募集并激活患者免疫系统组分而具有治疗活性。备选地，抗体可偶联至另一种具有治疗活性的试齐U。具体而言在对癌症和感染的治疗中， 所述的其他试剂具有细胞杀伤活性并可以为例如放射性同位素或细胞毒素。在另一项应用中，抗体可用于通过将合适的抗体转移至患者循环系统而被动地免疫患者。抗体的体内应用，特别是其治疗用途的一个关键方面是抗体留存在患者体内的时间，即，抗体的循环半衰期。许多增加蛋白质的循环半衰期的方法包括对蛋白质进行人工修饰，如将其与其他增加半衰期的分子结合或将其融合到其他增加半衰期的蛋白质或肽上。然而，这些方法包括特定的不利之处。其通常包括复杂的生产过程，并且在其生物利用率和药物许可上常常出现问题。此外，这些修饰经常对抗体的生物学活性有害，特别是对其抗原结合特性及其下游信号传导如抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)及补体依赖细胞毒性(CDC)有害。进一步地,对于糖蛋白如FSH,在一些情况下连接于所述糖蛋白的碳水化合物链上的唾液酸的量会影响糖蛋白的清除速率，并因此影响其循环半衰期。然而，根据现有技术水平，此原则不适用于抗体。首先，连接于IgG抗体Fe区域的碳水化合物链的高度唾液酸化负面影响了抗体的生物学活性。具体而言，由于Fe区域与相应Fe受体的亲和力下降，抗体的ADCC极大地减少(见例如，Scallon, B.J.等人(2006)MolecularImmunology44, 1524-1534)。进一步地，连接于Fab区域糖基化位点的碳水化合物链的唾液酸化程度被认为对抗体的循环半衰期无影响，但是影响了抗原结合(见例如，Huang, L.等人(2006) Analytical Biochemistry349, 197-207, Millward, Τ.Α.等人(2008)Biologicals36, 41-47, Jefferis, R.(2009)Methods in Molecular Biology483, 223-238,R Sola, R.J.等人(2010) Biodrugs24, 9-21)。在另一方面，具有低的循环半衰期的抗体对一些应用也是很重要的。例如，用于诊断目的使用放射性影像方法时，使用了结合于放射性核素的抗体。由于成像步骤是在相对短的时间内进行的，而且结合于抗体的放射性核素具有特定的不利副作用，所以将结合物从患者循环系统中快速清除会很有利。因此，本领域有对不使用化学结合物或融合蛋白质而调控(具体是增加或降低)抗体尤其是可用于治疗或诊断的抗体的循环半衰期的需要。发明概述本发明者已发现连接于抗体Fab部分的一个或多个糖基化位点的碳水化合物链上的唾液酸的量极大地影响了抗体的循环半衰期。此原则可用于控制循环半衰期并由此控制抗体尤其是可用于治疗或诊断的抗体的生物利用率。能够单个地调整多种抗体的循环半衰期是有利的，例如有利于优化治疗效力及平衡抗体的治疗效应和可能的不利副作用。进一步地，出于诊断目的，调整抗体的循环半衰期至低水平以避免不利副作用是有利的。因此，在第一方面，本发明针对用于控制抗体或其功能片段或其衍生物的循环半衰期的方法，其包括步骤(a)对于增加循环半衰期
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(al)在包含抗体或其功能片段或衍生物的组合物中增加连接于存在于所述抗体或其片段或衍生物的Fab部分中的至少一个糖基化位点的碳水化合物中的唾液酸的量；及/或(a2)移除存在于抗体或其功能片段或衍生物的Fab部分中的一个或多个糖基化位点；及/或(a3)在包含抗体或其功能片段或衍生物的组合物中降低连接于存在于所述抗体或其片段或衍生物的Fab部分中的至少一个糖基化位点的碳水化合物中的游离半乳糖单元的量；或(b)对于降低循环半衰期(bl)在包含抗体或其功能片段或衍生物的组合物中降低连接于存在于所述抗体或其片段或衍生物的Fab部分中的至少一个糖基化位点的碳水化合物中的唾液酸的量；及/或(b2)向抗体或其功能片段或衍生物的Fab部分中引入一个或多个糖基化位点；和/或(b3)在包含抗体或其功能片段或衍生物的组合物中增加连接于存在于所述抗体或其片段或衍生物的Fab部分中的至少一个糖基化位点的碳水化合物中的游离半乳糖单元的量。在第二方面，本发明提供了抗体组合物，其包含抗体或其功能片段或衍生物，其特征在于所述抗体或其功能片段或衍生物包含存在于其Fab部分中的至少一个糖基化位点，并特征在于所述组合物中连接于所述抗体或其功能片段或衍生物的Fab部分的碳水化合物中至少65%携带至少一个末端唾液酸残基和/或连接于所述抗体或其功能片段或衍生物的Fab部分的碳水化合物中少于35%携带至少两个游离半乳糖单元。进一步地，本发明提供了特异的抗体组合物及其用于医疗的用途。在第三方面，本发明提供了用于生产包含具有所需的循环半衰期的抗体或其功能片段或衍生物的抗体组合物的方法，其包括的步骤为:在宿主细胞中表达所述抗体或其功能片段或衍生物，其中根据本发明的用于控制抗体或其功能片段或衍生物的半衰期的方法是使用所述方法的步骤(al)、步骤(a3)、步骤(bl)或步骤(b3)进行的及/或所述宿主细胞表达通过根据本发明使用步骤(a2)或(b2)的用于控制抗体或其功能片段或衍生物的半衰期的方法获得的抗体或其功能片段或衍生物。
在优选的实施方式中，由本发明提供的抗体此外还具有得到极大改进的诱导免疫系统不同活性(尤其是ADCC)的能力。这是通过抗体的优化糖基化形式实现的，除了控制的循环半衰期外还产生改进的抗体活性，特别是改进的Fe受体结合和激活。因此，本发明在另一方面提供了包含具有增加的循环半衰期及提高的ADCC活性的抗体组合物，以及用于生产这些抗体的方法。这些抗体尤其适合用于治疗用途，因为其生物利用率及其生物学活性有所增加，这二者都有助于增加治疗效力。因此，本发明的另一个优势是能够提供同时具有增加的循环半衰期及增加的生物学活性的抗体。循环半衰期的增加优选地是通过根据本发明第一方面的方法实现的。此外，生物学活性的增加优选地是增加的ADCC活性，特别是由对相应的Fe受体的结合更强造成的。这种增加的ADCC活性可通过优化抗体的糖基化形式，例如通过减少连接于存在于抗体Fe部分中的至少一个糖基化位点的碳水化合物中果糖残基的量而实现。本领域技术人员会从以下描述及附随的权利要求更清楚地理解本发明的其他目标、特征、优势及方面。然而应当理解的是以下描述、附随的权利要求及具体实施例指出了本申请的优选实施方式，其只是以说明的方式给出的。本发明技术人员通过阅读以下描述会很容易地清楚所公开的发明的精神和范围内的多种变化和修饰。定义 如本文所使用的，以下词语通常优选地具有下文提出的意义，除非在其使用的上下文中有另外指出。如本文所使用的，词语“包含”除了其字面的意义外还包括并具体指代词语“大体上由……构成”及“由……构成”。因此，词语“包含”指代这样的实施方式，其中主语物体“包含”具体列出的元素，而不包含其他元素，还指代这样的实施方式，其中主语物体“包含”具体列出的元素，也可/或确实包含其他元素。类似地，词语“具有”应当像词语“包含”一样理解，也是包括并具体指代词语“大体上由……构成”及“由……构成”。术语“抗体”具体而言指的是至少包含由二硫键连接的两条重链和两条轻链的蛋白质。术语“抗体”包括天然发生的抗体也包括抗体的所有重组形式，例如，表达于原核细胞的抗体、非糖基化抗体、人源化抗体和嵌合抗体。每条重链都由一个重链可变区(VH)和一个重链恒定区(CH)组成。每条轻链都由一个轻链可变区(VL)和一个轻链恒定区(CL)组成。重链恒定区包含三个或在IgM或IgE型抗体的情况下包含四个重链恒定结构域(CH1、CH2、CH3和CH4)，其中第一个恒定结构域CHl与可变区相邻，并可通过一个铰链区与第二恒定结构域CH2相连。轻链恒定区只由一个恒定结构域构成。可变区可进一步划分为超变区(称为互补决定区(⑶R))，其中分散有更保守的区域(称为骨架区(FR))。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括多种免疫系统细胞(例如效应子细胞)及经典补体系统的第一补体(Clq)。然而根据本发明的术语“抗体”还包括抗体如重链抗体(即仅由一条或多条，尤其是两条重链组成的抗体)以及纳米抗体(即仅由单个单体可变结构域构成的抗体)。具体而言，抗体可为任何同种型如IgA、IgD、IgE、IgG或IgM，包括任何亚型如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl或IgA2。优选地，抗体为IgGl或IgG2抗体，更优选地为IgGl抗体。重链恒定区可为任何类型如、-、δ-、α-、μ-或ε-型重链。进一步地,轻链恒定区也可为任何类型如K-或λ-型轻链。优选地，抗体的轻链为K-链。
为表明重链和轻链可变区的氨基酸位置,本文使用了 Kabat编号系统(Kabat, E.A.等人(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edition, NIHPublication N0.91-3242)。根据所述系统，重链包含的氨基酸位置是从0号位-113号位，包括位置35A、35B、52A-52C、82A-82C及100A-100K。根据Kabat编号，重链可变区的CDR位于位置31-35B (CDRl)、50_65(CDR2)及95-102 (CDR3)。剩余的氨基酸位置形成了骨架区FR1-FR4。轻链可变区包含位置0-109，包括位置27A_27F、95A_95F和106A。CDR位于位置24-34 (CDRl )、50-56 (CDR2)及89-97 (CDR3)。根据抗体的特异基因的起始形成，并非所有这些位置都必须存在于给定的重链可变区或轻链可变区中。在本文中提到重链或轻链可变区中氨基酸位置的情况下，除非另有指出，其都指代根据Kabat编号的位置。抗体或其片段或衍生物的“Fab部分”具体而言指代抗体的一部分，其包含重链和轻链可变区(VH和VL)及第一重链和轻链恒定区(CHl和CL)。在其中抗体或其片段或衍生物不包含所有这些区域的情况下，术语“Fab部分”仅指代存在于所述抗体或其片段或衍生物中的VH、VL、CH1和CL。“Fab部分”指代抗体的一部分，其对应于木瓜蛋白酶消化天然抗体获得的含有抗体的抗原结合活性的片段。具体而言，抗体或其片段或衍生物的Fab部分包括其抗原结合位点或抗原结合能力。优选地，Fab部分至少包含抗体的VH区域。抗体或其片段或衍生物的“Fe部分”具体而言指代抗体的一部分，其包含重链恒定区2、3，在适当的时候还包括4 (CH2、CH3和CH4)。在其中抗体或其片段或衍生物不包含所有这些区域的情况下，术语“Fe部分”仅指代存在于所述抗体或其片段或衍生物中的CH2、CH3和CH4。优选地，“Fe部分”指代抗体的一部分，其对应于木瓜蛋白酶消化天然抗体获得的不含有抗体的抗原结合活性的片段。具体而言，抗体或其片段或衍生物的Fe部分能够结合Fe受体并因此例如包含Fe受体结合位点或Fe受体结合能力。进一步地,其优选地能够诱导ADCC。优选地，Fe部分至少包含抗体的CH2区域。在图21A中可见IgG类型的抗体示意图，包括Fab部分和Fe部分。

根据本发明，术语“嵌合抗体”具体而言指代一种抗体，其中恒定区来源于人抗体或人抗体保守序列，其中至少一个，优选地两个可变区都来源于非人抗体，尤其是来源于小鼠抗体。根据本发明，术语“人源化抗体”具体而言指代一种抗体，其中至少一个CDR来源于非人抗体，其中(若其存在)恒定区及可变区的至少一个骨架区来源于人抗体或人抗体保守序列。优选地，重链可变区的所有CDR，更优选地，重链可变区和轻链可变区的所有CDR都来源于非人抗体。进一步地，优选地，重链可变区的所有骨架区，更优选地，重链可变区和轻链可变区的所有骨架区都来源于人抗体或人抗体保守序列。这些CDR优选地来源于相同的非人抗体。可变区的前三个或所有骨架区都优选地来源于相同的人抗体或人抗体保守序列，然而，重链可变区的骨架区不必来源于与轻链可变区的骨架区相同的人抗体或人抗体保守序列。在具体优选的实施方式中，人源化抗体能够结合于相同抗原，具体而言结合于与一种或多种CDR来源的非人抗体相同的表位。优选地，人源化抗体中来源于非人抗体的CDR与所述非人抗体的CDR同一。进一步地，人源化抗体中来源于人抗体或人抗体保守序列的骨架区可与所述抗体或人抗体保守序列的骨架区同一。在另一个实施方式中，人源化抗体的骨架区相比与其来源的人抗体或人抗体保守序列具有一个或多个氨基酸置换。所置换的氨基酸残基优选地由一种或多种CDR所来源的非人抗体中对应氨基酸残基所取代(特别是根据Kabat编号位于相同位置的那些对应的氨基酸残基)。具体而言，人源化抗体的可变区(重链可变区和/或轻链可变区)的骨架区优选地包含不超过30个氨基酸置换，优选地不超过25、不超过20、不超过15、不超过
12、不超过10或不超过8个氨基酸置换。在优选的实施方式中，人源化抗体重链可变区的所有骨架区在总体上与其来源的人抗体或人抗体保守序列的重链可变区的骨架区共有的同源性或同一性为至少70%、优选地至少75%、至少80%、至少85%或至少90%。进一步地，人源化抗体轻链可变区的所有骨架区在总体上与其来源的人抗体或人抗体保守序列的轻链可变区的骨架区共有的同源性或同一性为至少70%、优选地至少75%、至少80%、至少85%或至少90%。所述嵌合或人源化抗体的恒定区可来源于任何人抗体或人抗体保守序列。具体而言，重链恒定区可为任何类型如、-、δ_、α-、μ-或ε-型重链。嵌合或人源化抗体因此可为任何同种型如IgA、IgD、IgE、IgG或IgM,包括任何亚型如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl或IgA2。优选地,所述嵌合或人源化抗体为IgGl或IgG2抗体、更优选地为IgGl抗体。进一步地，轻链恒定区也可为任何类型如K-或λ-型轻链。优选地，所述嵌合或人源化抗体的轻链为K链。如果靶标氨基酸序列在其全长上与参考氨基酸序列的对应部分共有的同源性或同一性为至少60%、优选地至少70%、至少75%、更优选地为至少80%、至少85%、至少90%、至少93%、至少95%或至少97%，则所述靶标氨基酸序列“来源”于参考氨基酸序列。例如，如果人源抗体的骨架区来源于具体人抗体的可变区，那么所述人源化抗体的骨架区氨基酸在其全长上与所述人抗体的对应骨架区共有的同源性或同一性为至少60%、优选地至少70%、至少75%、更优选地至少80%、至少85%、至少90%、至少93%、至少95%或至少97%。“对应部分”或“对应骨架区”指的是例如靶标抗体的重链可变区的骨架区I(FRHl)对应着参考抗体重链可变区的骨架区I。对于？冊2、？冊3、？冊4、？虬1、？虬2、？虬3和？虬4也成立。在具体实施方式
中，“来源”于参考氨基酸的靶标氨基酸序列在其全长上于参考氨基酸序列的对应部分为100%同源，或特别是1 00%同一。抗体的“片段或衍生物”特别是来源于所述抗体并能与所述抗体结合于相同抗原，特别是结合于相同表位的蛋白质或糖蛋白。因此，本文的抗体片段或衍生物一般指代功能片段或衍生物。抗体的功能片段或衍生物具体而言能够与所述抗体结合于相同的抗原，尤其是结合于相同表位。在具体优选的实施方式中，抗体的片段或衍生物包含重链可变区。据显示，抗体的抗原结合功能可由全长抗体的片段或其衍生物进行。抗体的片段或衍生物的实例包括(i)Fab片段，由每条重链和轻链的可变区和第一恒定区构成的单价片段；(ii)F(ab)2片段，包含由铰链区二硫桥相连的两个Fab片段的双价片段；(iii)Fd片段，由重链的可变区及第一恒定结构域CHl构成；(iv)Fv片段，由抗体单臂的重链和轻链可变区构成；
(v)scFv片段，由单一多肽链构成的Fe片段；(vi)(Fv)2片段，由两个共价连接在一起的Fv片段构成；(vii)重链可变结构域；及(viii)多价抗体，由以如下方式共价连接在一起的重链可变区和轻链可变区构成:重链和轻链可变区的结合只能在分子间而不能在分子内发生。这些抗体片段和衍生物是使用本领域技术人员已知的常规技术获得的。“特异性结合”优选地指代试剂如抗体对靶标如其特异的表位的结合比结合于另一种靶标更强。如果试剂结合于第一种靶标的解离常数(Kd)比对第二种靶标的解离常数更低，则该试剂对第一种靶标比对第二种靶标的结合更强。优选地，对该试剂特异性结合的靶标的解离常数比对该试剂并非特异性结合的靶标的解离常数低超过2倍、优选地超过5倍、更优选地超过10倍、甚至更优选地超过20倍、50倍、100倍、200倍、500倍或1000倍。术语“唾液酸”具体而言指代神经氨酸的任何N-或O-置换的衍生物。其优选地指代5-N-乙酰神经氨酸和5-N-羟乙酰神经氨酸羟乙酰神经氨酸二者，更优选地只指代5-N-乙酰神经氨酸。唾液酸，尤其是5-N-乙酰神经氨酸，优选地经由2，3-或2，6-连接与糖蛋白的碳水化合物链相连。优选地，本文描述的抗体组合物中存在2，3-以及2，6-连接的唾液酸。如本文提到的术语“游离半乳糖单元”具体而言指代经由其还原性末端连接于碳水化合物结构且在其6号位不携带唾液酸的半乳糖单元。具体而言，游离半乳糖单元在其6号位不携带任何糖单元。在特定实施方式中，游离半乳糖单元在其6号位不携带任何化学修饰或取代基。具体而言，半乳糖单元在其2号位、3号位、4号位、5号位和6号位中的任何位置上不携带唾液酸，优选地不携带任何糖、更优选地不携带任何化学修饰或取代基。在这点上，不认为半乳糖单元的氢及氢氧根残基为化学修饰或取代基。
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术语“糖基化位点”具体而言指代能由能够催化单糖单元或碳水化合物链连接于肽链的酶识别的任何氨基酸序列。优选地，糖基化位点包括其上连接有单糖单元或碳水化合物链的氨基酸残基。优选的糖基化位点为N-糖基化位点，特别是包含精氨酸残基作为连接位点的N-糖基化位点以及O-糖基化位点，特别是包含丝氨酸或苏氨酸残基作为连接位点的O-糖基化。优选的N-糖基化位点包含氨基酸序列Asn XaaSer/Thr，其中Xaa为任何氨基酸，优选地，除了 Pro以外。此氨基酸序列指代三个连续氨基酸的序列，其中第一个氨基酸残基为天冬氨酸残基、第二个氨基酸残基可为任何氨基酸残基，特别是除了脯氨酸外的任何天然发生的氨基酸残基，第三个氨基酸残基为丝氨酸或苏氨酸。当糖基化时，碳水化合物链连接于天冬氨酸残基上。本文给出的数字，特别是特异糖基化特性的相对量优选地应理解为近似数字。具体而言，这些数字优选地可为高出和/或低多至10%，特别是高出和/或低多至9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2% 或 1%。术语“核酸”包括单链和双链核酸及核糖核酸和脱氧核糖核酸。其可包含天然发生的以及人工合成的核苷酸，可以为天然或人工修饰的，例如通过甲基化、5’-和/或3’帽化得到修饰。根据本发明，术语“宿主细胞”涉及任何可用外源核酸转化或转染的细胞。术语“宿主细胞”根据本发明包含原核(例如大肠杆菌(E.coli))或真核细胞(例如哺乳动物细胞，尤其是人细胞，酵母细胞和昆虫细胞)。对哺乳动物细胞如来自人、小鼠、仓鼠、猪、山羊或灵长类动物的细胞有特别的偏好。细胞可来源于多种组织类型并包含原代细胞和细胞系。优选地,宿主细胞为人细胞,特别是永生化人细胞,优选地为永生化人血细胞如永生化人髓细胞或永生化人髓性白血病细胞。进一步地，宿主细胞还可为永生化的人肿瘤细胞。核酸可以单一拷贝或两份或多份拷贝的形式存在于宿主细胞，在一个实施方式中，其在宿主细胞中表达。术语“患者”根据本发明指的是人类、非人灵长类或另一种动物，尤其是哺乳动物如奶牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫或啮齿类如小鼠和大鼠。在一个具体的优选的实施方式中，患者为人类。根据本发明的术语“癌症”具体而言包含白血病、精原细胞瘤、黑色素瘤、畸胎瘤、淋巴瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、肾上腺癌、甲状腺癌、血液癌、皮肤癌、脑癌、子宫颈癌、肠癌、肝癌、结肠癌、胃癌、肠癌、头颈部癌、胃肠道癌、淋巴结癌、食道癌、大肠癌、胰脏癌、耳、鼻和喉(ENT)癌、乳腺癌、前列腺癌、子宫癌、卵巢癌和肺癌及其转移肿瘤。其实例为肺腺癌、结肠腺癌、头颈部腺癌以及上述癌症类型或肿瘤的转移肿瘤。根据本发明，术语癌症还包含癌症转移肿瘤。通过“肿瘤”指的是一组由调控错误的细胞增殖形成的细胞或组织，尤其指代癌。肿瘤可显示出部分或完全失去结构组织及与正常组织的功能协作，经常形成有区别的一团组织，其可以为良性或恶性的。具体而言，术语“肿瘤”指代恶性肿瘤。根据一个实施方式，术语“肿瘤”或“肿瘤细胞”还指代非固体癌及非固体癌的细胞如白血病细胞。根据另一个实施方式，术语“肿瘤”和“肿瘤细胞”不包括相应的非固体癌或其细胞。通过“转移”，指的是癌细胞从其原始位点向身体的另一部分扩散。转移的形成是非常复杂的过程，通常涉及癌细胞从原发性肿瘤的脱离，进入身体循环系统并在体内其他地方的正常组织中沉积并生长。当肿瘤细胞转移时，新肿瘤称为二级或转移肿瘤，其细胞通常与原始肿瘤相似。这意味着例如如果乳腺癌转移至肺，则二级肿瘤是由异常乳腺癌细胞而不是由异常非细胞构成。肺中的肿瘤于是称为转移乳腺癌，而非肺癌。术语“药用组合物”具体而言指代适合施用于人或动物的组合物，S卩，含有药用可接受组分的组合物。优选地，药用组合物包含活性化合物或其盐或前体药物，以及载体、稀释剂或药用辅料如缓冲液、防腐剂及渗透压调节剂。术语“抗体组合物”具体而言指代任何包含抗体或其片段或衍生物的组合物。该抗体组合物可为液体或固体组合物，还包括冻干或配制的抗体组合物。优选地，使用了液体组合物，更优选地为水溶液组合物。其优选地进一步包含溶剂如水、用于调节PH值的缓冲液，并可选地包含其他用于稳定抗体防止抗体降解的试剂。抗体组合物优选地包含合理量的抗体，特别是至少Ifmol、优选地至少lpmol、至少Inmol或至少Iymol的抗体或其片段或衍生物。然而，在特定实施方式中，也包括只包含一种抗体分子或其片段或衍生物的抗体组合物。包含特异抗体或其片段或衍生物的组合物可另外包含其他抗体或其片段或衍生物。然而，优选地，包含特异抗体或其片段或衍生物的组合物除了所述特异抗体或其片段或衍生物的组合物外不包含其他抗体或其片段或衍生物。具体而言，抗体组合物中至少75%、优选地至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%，优选地为至少100%的抗体针对或结合于相同抗体或表位。根据本发明，“每条碳水化合物链的唾液酸残基的平均量”指代平均存在于一组碳水化合物链的碳水化合物链中的唾液酸残基的数量。具体而言，其指代连接于一组碳水化合物链的碳水化合物链中的唾液酸残基总数除以所述组中碳水化合物链的总数。每条碳水化合物链的唾液酸残基的平均量为1.0指的是在一组碳水化合物链中，每条碳水化合物链平均包含1.0个唾液酸残基。术语“碳水化合物链”在这一点上优选地指代连接于抗体的多肽链的碳水化合物链。所述的一组碳水化合物链的碳水化合物链优选地指代抗体组合物中存在的所有抗体的所有 碳水化合物链，或指代抗体组合物中所有特异类型的抗体的所有碳水化合物链，或指代、抗体组合物中所有(特异类型的)抗体的特异部分中或特异糖基化位点处存在的碳水化合物链。术语“循环半衰期”优选地指代在试剂施用于活体(特别是人体)循环系统后直到只有试剂的施用量的一半存在于循环系统中所经过的时间。在治疗活性试剂的情况下，通常较长的循环半衰期是可取的，因为这样该试剂具有较长的持久疗效。“清除速率”优选地指代试剂从活体(特别是人体)的循环系统中移除的速率。较高的清除速率因此通常导致较低的循环半衰期。发明详述本发明基于这样的发现:与在先技术的教义相反，连接于具有在Fab部分中的糖基化位点的抗体的Fab部分的碳水化合物链中唾液酸的量决定了所述抗体的循环半衰期并因此决定了其生物利用率。具体而言，Fab部分的高度唾液酸化导致抗体在患者循环系统中的高半衰期。类似地，Fab部分的较低的唾液酸化度导致较短的循环半衰期。然而，还发现当移除抗体Fab部分中的糖基化位点并由此移除任何Fab糖基化时,抗体的循环半衰期与具有中度到高度唾液酸化Fab部分的抗体类似。因此，唾液酸化很弱的抗体的循环半衰期不能仅仅通过增加唾液酸的量而增加，但如果存在有相应的糖基化位点则可通过移除抗体Fab部分中的糖基化位点而增加。进一步地,本发明者意外地发现调整Fab部分的糖基化中唾液酸含量经常不影响抗体的抗原结合特异性，而且进一步地，也经常对抗体的下游生物学特异性如ADCC和CDC活性没有负面效应。在其中唾液酸含量变化对抗原结合有负面影响的情况下，还可移除Fab部分中的糖基化位点以增加循环半衰期和/或可在Fab部分中的另一位置引入其他糖基化位点，此新引入的Fab糖基化中唾液酸含量可根据本文的教义而调整。本发明者发现的进一步的优势是有可能增加Fab糖基化的唾液酸化而同时将Fe部分的唾液酸保 持最小。因此，抗体的ADCC和CDC活性也不受Fab部分唾液酸化增加的影响。用于控制抗体循环半衰期的方法鉴于这些发现，本发明提供了用于控制抗体组合物中抗体或其功能片段或衍生物的循环半衰期的方法，包括在包含抗体或其功能片段或衍生物的组合物中调整连接于存在于所述抗体或其片段或衍生物的Fab部分中的至少一个糖基化位点的碳水化合物中的唾液酸的量及/或在抗体或其片段或衍生物Fab部分中移除或引入一个或多个糖基化位点。因此，还可能生成相应于抗体预期用途而量身定制的循环半衰期。这提供了调整抗体循环半衰期的灵活性，无需使用化学修饰(如PEG或HES)或融合蛋白质。具体而言，在第一个方面，本发明提供了控制抗体或其功能片段或衍生物的循环半衰期的方法，包括以下步骤(a)对增加循环半衰期(al)在包含抗体或其功能片段或衍生物的组合物中增加连接于存在于所述抗体或其片段或衍生物Fab部分中的至少一个糖基化位点的碳水化合物中唾液酸的量；及/或(a2)移除存在于抗体或其片段或衍生物的Fab部分中的一个或多个糖基化位点；及/或(a3)在包含抗体或其功能片段或衍生物的组合物中降低连接于存在于所述抗体或其片段或衍生物Fab部分中的至少一个糖基化位点的碳水化合物中游离半乳糖单元的
量;或
(b)对降低循环半衰期(bl)在包含抗体或其功能片段或衍生物的组合物中降低连接于存在于所述抗体或其片段或衍生物Fab部分中的至少一个糖基化位点的碳水化合物中唾液酸的量；及/或(b2)向抗体或其片段或衍生物的Fab部分中引入一个或多个糖基化位点；及/或(b3)在包含抗体或其功能片段或衍生物的组合物中增加连接于存在于所述抗体或其片段或衍生物Fab部分中的至少一个糖基化位点的碳水化合物中游离半乳糖单元的量。因此，当使用根据本发明的方法时，有可能通过调整抗体Fab部分中已经存在的或人工引入的糖基化位点上的唾液酸化度和/或游离半乳糖单元度及/或通过在Fab部分中移除或引入糖基化位点而单独控制给定抗体的循环半衰期。抗体的碳水化合物链中的唾液酸在碳水化合物结构的非还原性末端连接于半乳糖单元。因此，唾液酸量的增加还导致游离半乳糖单元的降低，反之亦然。增加或降低游离半乳糖单元的量可例如分别通过降低或增加唾液酸的量而实现。然而，游离半乳糖单元的量还可通过将其他残基连接至游离半乳糖单元如乙酰残基、葡萄糖醛酸或硫酸及/或通过从碳水化合物中移除游离半乳糖单元而降低。类似地，增加游离半乳糖单元的量可通过降低唾液酸的量及/或将其他半乳糖单元连接至未完全半乳糖基化的碳水化合物而实现。增加循环半衰期 为根据本发明增加抗体或其片段或衍生物的循环半衰期，可增加连接于组合物中抗体或其片段或衍生物的Fab部分中一个或多个糖基化位点的碳水化合物中唾液酸的量。在优选的实施方式中，增加唾液酸的量以使组合物中连接于存在于Fab部分中的至少一个糖基化位点的碳水化合物中至少50%包含至少一个唾液酸残基。优选地的，在组合物中连接于Fab部分中的一个或多个糖基化位点的碳水化合物中至少60%、更优选地至少65%、至少68%、至少70%或最优选地至少75%包含至少一个唾液酸残基。在特定实施方式中，增加唾液酸的量以使组合物中连接于存在于Fab部分中的至少一个糖基化位点的碳水化合物中至少20%包含至少两个唾液酸残基。优选地，在组合物中连接于Fab部分中的一个或多个糖基化位点的碳水化合物中至少25%、更优选地至少30%、至少35%、至少40%或最优选地至少45%包含至少两个唾液酸残基。优选地，增加唾液酸的量以使组合物中连接于存在于Fab部分中的至少一个糖基化位点并含有至少一个唾液酸残基的碳水化合物的相对量增加至少5个百分点、更优选地增加至少7个百分点、至少10个百分点、至少15个百分点、至少20个百分点、至少25个百分点、至少30个百分点、至少35个百分点、至少40个百分点、至少45个百分点，或至少50个百分点。组合物中连接于存在于Fab部分中的至少一个糖基化位点并含有至少一个唾液酸残基的碳水化合物的相对量为组合物中所有连接于存在于Fab部分中的至少一个糖基化位点的碳水化合物中包含至少一个唾液酸残基的碳水化合物的百分比。例如，10个百分点的增加指代这样的实施方式，其中组合物中连接于存在于Fab部分中的至少一个糖基化位点并含有至少一个唾液酸残基的碳水化合物的相对量的百分比值在步骤(al)中增加了10，即，步骤(al)前相对量为X%，而步骤(al)后相对量为(X+10) %。在包含抗体或其功能片段或衍生物的组合物中，连接于存在于所述抗体或其片段或衍生物的Fab部分中的至少一个糖基化位点的碳水化合物中唾液酸的量增加至少5个百分点。优选地，在组合物中连接于Fab部分中的一个或多个糖基化位点的碳水化合物中至少60%、更优选地至少65%、至少68%、至少70%或最优选地至少75%包含至少一个唾液酸残基。连接于存在于Fab部分中的至少一个糖基化位点的碳水化合物中唾液酸的量的增加还包括增加组合物中连接于存在于所述抗体或其片段或衍生物的Fab部分中的至少一个糖基化位点并已经包含至少一个唾液酸残基的碳水化合物中唾液酸的数量。具体而言，根据本发明的方法步骤(al)的唾液酸量的增加优选地指代组合物中连接于存在于所述抗体或其片段或衍生物的Fab部分中的至少一个糖基化位点的碳水化合物中每条碳水化合物链的唾液酸残基的平均量的增加。优选地，所述每条碳水化合物链的唾液酸残基的平均量增加了至少0.01、更优选地增加了至少0.05、至少0.1、至少0.15、至少0.2、至少0.3或最优选地增加了至少0.5。在优选的实施方式中，增加唾液酸的量以使组合物中连接于存在于所述抗体或其片段或衍生物的Fab部分中的至少一个糖基化位点的碳水化合物中每条碳水化合物链的唾液酸残基的平均量为至少0.5、优选地至少0.6、至少0.7、至少0.8、至少0.9、至少1.0、至少1.05或至少1.1。所述Fab部分中的一个或多个糖基化位点可以在增加其循环半衰期步骤前就已经存在于抗体中，或一个或多个糖基化位点可以作为根据本发明的方法的一部分引入抗体的Fab部分。因此，在特定实施方式中，增加连接于所述抗体或其片段或衍生物的Fab部分中的一个或多个糖基化位点的碳水化合物中唾液酸的量的步骤包括将一个或多个糖基化位点引入Fab部分的步骤。这些新引入的糖基化位点在糖基化时优选地携带碳水化合物，其中组合物中所述的碳水化合物中至少50%、更优选地至少60%、至少65%、至少68%、至少70%或最优选地至少75%包含至少一个唾液酸残基。将糖基化位点向抗体或其片段或衍生物的Fab部分的引入在下文有更详细的描述。在特定实施方式中，连接于Fab部分中的一个或多个糖基化位点的碳水化合物中的唾液酸的量增加，而未显著 增加连接于所述抗体或其片段或衍生物的Fe部分中的一个或多个糖基化位点的碳水化合物中的唾液酸的量。优选地，在进行了根据本发明的方法后，组合物中连接于所述抗体或其片段或衍生物的Fe部分中的一个或多个糖基化位点的碳水化合物中的唾液酸的量低于20%、更优选地低于15%、低于10%、低于8%或最优选地低于7%。具体而言，连接于抗体的Fe部分中的糖基化位点的碳水化合物中低于20%、优选地低于15%低于10%或低于8%、最优选地低于7%包含一个或多个唾液酸。在特定实施方式中，降低游离半乳糖单元的量以使组合物中连接于存在于Fab部分中的至少一个糖基化位点的碳水化合物中低于50%包含至少两个游离半乳糖单元。优选地,组合物中连接于存在于Fab部分中的至少一个糖基化位点的碳水化合物中低于40%、低于30%、低于20%、低于15%、低于10%、低于7%或低于5%包含至少两个游离半乳糖单元。进一步地，组合物中连接于存在于Fab部分中的至少一个糖基化位点的碳水化合物中低于95%包含至少一个游离半乳糖单元。更优选地，组合物中连接于存在于Fab部分中的一个或多个糖基化位点的碳水化合物中低于90%、低于85%、低于80%、低于75%、低于70%、低于65%、低于60%、低于55%、低于50%、低于45%或低于40%包含至少一个或多个游离半乳糖单
J Li ο优选地，降低游离半乳糖单元的量以使组合物中连接于存在于Fab部分中的至少一个糖基化位点并包含至少一个游离半乳糖单元，优选地包含至少两个游离半乳糖单元的碳水化合物的相对量降低至少5个百分点、更优选地降低至少7个百分点、至少10个百分点、至少15个百分点、至少20个百分点、至少25个百分点、至少30个百分点、至少35个百分点、至少40个百分点、至少45个百分点，或至少50个百分点。组合物中连接于存在于Fab部分中的至少一个糖基化位点并包含至少一个游离半乳糖单元，优选地包含至少两个游离半乳糖单元的碳水化合物的相对量为组合物中连接于存在于Fab部分中的至少一个糖基化位点的所有碳水化合物中包含至少一个游离半乳糖单元，优选地包含至少两个游离半乳糖单元的碳水化合物的百分比。例如，降低至少10个百分点指代这样的实施方式，其中组合物中连接于存在于Fab部分中的至少一个糖基化位点并包含至少一个游离半乳糖单元，优选地包含至少两个游离半乳糖单元的碳水化合物的百分比值在步骤(a3)中降低了10，S卩，步骤(a3)之前相对量为X%，步骤(a3)之后相对量为(X_10)%。连接于存在于Fab部分中的至少一个糖基化位点的碳水化合物中游离半乳糖单元的量的降低还包括降低组合物中连接于存在于所述抗体或其片段或衍生物的Fab部分中的至少一个糖基化位点并包含超过一个游离半乳糖单元的碳水化合物中游离半乳糖单元的数量。具体而言，根据本发明的方法步骤(a3)的游离半乳糖单元的量的降低优选地指代组合物中连接于存在于所述抗体或其片段或衍生物的Fab部分中的至少一个糖基化位点的碳水化合物中每条碳水化合物链的游离半乳糖单元的平均量的降低。优选地，所述每条碳水化合物链的游离半乳糖单元的平均量增降低了至少0.01、更优选地增加了至少0.05、至少0.1、至少0.15、至少0.2、至少0.3或最优选地增加了至少0.5。在优选的实施方式中，降低游离半乳糖单元的 量的量以使组合物中连接于存在于所述抗体或其片段或衍生物的Fab部分中的至少一个糖基化位点的碳水化合物中每条碳水化合物链的游离半乳糖单元的平均量为低于1.5、优选地低于1.4、低于1.3、低于1.2、低于1.1、低于1.0、优选地低于0.9、低于0.8、低于0.7、低于0.6或低于0.5。优选地，游离半乳糖单元的量的降低是通过增加唾液酸的量而实现的。唾液酸量的增加和/或游离半乳糖单元的量的降低可通过任何已知方式实现，包括在具有高唾液酸化活性的细胞或细胞系中表达所述抗体或其片段或衍生物。具有高唾液酸化度的细胞系可例如通过选择合适的细胞系单克隆或通过遗传改造细胞系而获得。具有高的唾液酸化活性的细胞系具体而言可以通过对适用于表达抗体的细胞系进行诱变筛选而获得，其中选择了具有高的唾液酸化活性的细胞克隆。进一步地，可在所述细胞或细胞系中诱导或增强负责糖蛋白唾液酸化的酶的表达，例如通过诱导或增加内源的酶的表达及/或通过诱导所述酶的外源表达盒。适合的酶为例如负责将唾液酸残基转移至碳水化合物链的唾液酸转移酶、控制唾液酸残基或其前体转运到细胞中的相关区段或细胞器的转运子或参与唾液酸合成的酶。具体的实例为唾液酸基转移酶如α2，6_和α 2，3-唾液酸基转移酶、转运子如CMP-唾液酸转运子、表异构酶如UDP-N-乙酰葡萄糖胺-2-表异构酶、激酶如N-乙酰甘露糖胺激酶和N-乙酰葡萄糖胺激酶、N-乙酰神经氨酸-9-Ρ-合成酶、N-乙酰神经氨酸-9-Ρ-磷酸酶和CMP-N-乙酰神经氨酸合成酶。进一步地，可在表达过程中使用产生高唾液酸化度的培养条件。合适的方法在本领域已知并在例如W02005/080585中有描述。备选地或此外地，可以使用体外唾液酸化，特别是使用唾液酸基转移酶和适合的底物进行酶唾液酸化，或使用适合的化学反应物进行化学唾液酸化。能够提供高的唾液酸化度的示例性细胞系为GT-5s，其根据布达佩斯协议于2010年7月28日以登记号DSMACC3078保藏于德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), Inhoffenstra β e7B, 38124Braunschweig (DE)),保藏人为 GlycotopeGmbH, Robert-RoSSle -Str.10，13125Berlin (DE))，或为来源于其的细胞系或与其同源的细胞系。GT-5s是一种来源于K562细胞的细胞系，由于具有高的唾液酸化活性而选择。K562是一种人髓性白血病细胞系，存在于美国模式培养物保藏中心(ATCC CCL-243)。GT_5s及来源于其的细胞系可在已知的适合K562的条件下培育和维持。来源于GT-5s的细胞系可例如通过随机或特异性地从GT-5s培养物中选择单一克隆或一组细胞而获得，可选地在之前已经对GT-5s细胞进行了增强突变率的处理，或通过遗传改变GT-5s细胞系而获得。所选择的克隆或一组细胞可进一步如上文所述的方法进行处理并/或可进行其他的筛选轮。同源于GT-5s的细胞系特别是永生化人类髓细胞系。优选地，来源于或同源于GT-5s的细胞系能够提供的抗体具有的糖基化形式类似于获自GT-5s的形式。优选地，由来源于或同源于GT-5s的细胞系产生的抗体具有一种或多种本文所描述的糖基化特征，特别是高的唾液酸度，优选地为在Fab部分有高的唾液酸度。在一个优选的实施方式中，来源于或同源于GT-5s的细胞系进一步地能够生产本文描述的具有低度果糖基化的抗体，特别是在其Fe部分具有低度果糖基化。由来源于或同源于GT-5s的细胞系生产的抗体的类似的糖基化形式与获自GT-5s的糖基化形式差异为20%或更少、更优选地为15%或更少、10%或更少或5%或更少，具体而言差异在于一种或多种，优选地为所有选自以下的糖基化特性:携带bisGlcNAc的碳水化合物的百分比量、唾液酸化碳水化合物的百分比量、携带游离半乳糖残基的碳水化合物的百分比量、2，6-偶联的唾液酸的百分比量及携带果糖的碳水化合物的百分比量。在具体优选的实施方式中，所述类似的糖基化特性不包含携带果糖的碳水化合物的百分比量。细胞系GT-5s以及来源于其的细胞系及与其同源的细胞系尤其有优势，因为它们提供了非常稳定和均一的蛋白质生产，尤其是就抗体而言。它们具有很好的批次一致性，即，从不同生产运行中获得的或以不同规模和/或用不同培养步骤所产生的蛋白质及其糖基化形式是类似的。除了增加连接于所述抗体或其片段或衍生物的Fab部分中的一个或多个糖基化位点的碳水化合物中的唾液酸含量的增加和/或游离半乳糖单元含量的降低外，还可通过移除存在于所述抗体或其片段或衍生物的Fab部分中的一个或多个糖基化位点而增加所述抗体或其片段或衍生物的循环半衰期。通过移除所述(多个)糖基化位点，防止所述抗体或其片段或衍生物的Fab部分中具有低度唾液酸化及/或高度游离半乳糖单元的碳水化合物。由于这些低唾液酸化的碳水化合物造成从患者循环系统中对抗体的快速速率，移除抗体的Fab部分中相应的(多个)糖基化位点增加其循环半衰期。
在优选的实施方式中，糖基化位点的移除是通过遗传改造编码抗体或其片段或衍生物的核酸完成的。具体而言，糖基化位点是通过改变编码抗体或其片段或衍生物的核酸序列而移除的。优选地，突变了编码糖基化位点氨基酸的一个或多个密码子以在糖基化位点中形成至少一个氨基酸的置换、添加或删除。具体而言，将碳水化合物链连接所在的氨基酸删除或置换，优选地由不能起碳水化合物受体功能的氨基酸置换。备选地或此外地，还可置换或删除糖基化位点的另一个氨基酸，或者可将一个或多个其他的氨基酸添加到所述糖基化位点，以使改变的氨基酸序列不能起酶催糖基化识别位点的作用。要从其Fab部分移除一个或多个糖基化位点的抗体或其片段或衍生物在Fab部分中的糖基化位点可为任意数量，如在Fab部分只有一个糖基化位点、至少两个糖基化位点或至少三个糖基化位点。在根据本发明的方法中，并非抗体或其片段或衍生物的Fab部分的所有糖基化位点都必须移除。然而，优选地移除存在于抗体或其片段或衍生物的Fab部分中的所有糖基化位点以最大化增加循环半衰期。降低循环半衰期根据本发明，为降低抗体或其片段或衍生物的循环半衰期，可降低所述组合物中连接于所述抗体或其片段或衍生物的Fab部分中的一个或多个糖基化位点的碳水化合物中的唾液酸的量。在优选的实施方式中，降低唾液酸的量以使组合物中连接于存在于Fab部分中的至少一个糖基化位点的碳水化合物中低于50%包含至少一个唾液酸残基。优选地，组合物中连接于存在于Fab部分中的一个或多个糖基化位点的碳水化合物中低于40%、低于30%、低于20%、低于15%、低于10%、低于7%、低于5%、低于3%、低于2%或低于1%包含一个或多个唾液酸残基。根据一个实施方式，降低唾液酸的量以使组合物中连接于存在于Fab部分中的至少一个糖基化位点的碳水化合物中大约0%包含至少一个唾液酸残基。在特定实施方式中，降低唾液酸的量以使组合物中连接于存在于Fab部分中的至少一个糖基化位点的碳水化合物中低于30%包含至少两个唾液酸残基。优选地，在组合物中连接于存在于Fab部分中的一个或多个糖基化位点的碳水化合物中低于25%、低于20%、低于15%、低于10%、低于7%、低于5%、低于3%、低于2%或低于1%，更优选地0%包含两个或更多个唾液酸残基。优选地，降低唾液酸的量以使组合物中连接于存在于Fab部分中的至少一个糖基化位点并含有至少一个唾液酸残基的碳水化合物的相对量减少至少5个百分点、更优选地减少至少7个百分点、至少10个百分点、至少15个百分点、至少20个百分点、至少25个百分点、至少30个百分点、 至少35个百分点、至少40个百分点、至少45个百分点，或至少50个百分点。组合物中连接于存在于Fab部分中的至少一个糖基化位点并含有至少一个唾液酸残基的碳水化合物的相对量为组合物中所有连接于存在于Fab部分中的至少一个糖基化位点的碳水化合物中包含至少一个唾液酸残基的碳水化合物的百分比。例如，10个百分点的降低指代这样的实施方式，其中组合物中连接于存在于Fab部分中的至少一个糖基化位点并含有至少一个唾液酸残基的碳水化合物的相对量的百分比值在步骤(bl)中增加了IO，即，步骤(b I)前相对量为X%，而步骤(b I)后相对量为(X-10) %。连接于存在于Fab部分中的至少一个糖基化位点的碳水化合物中唾液酸的量的降低还包括降低组合物中连接于存在于所述抗体或其片段或衍生物的Fab部分中的至少一个糖基化位点并包含超过一个唾液酸残基的碳水化合物中唾液酸的数量。具体而言，根据本发明的方法步骤(bl)的唾液酸量的降低优选地指代组合物中连接于存在于所述抗体或其片段或衍生物的Fab部分中的至少一个糖基化位点的碳水化合物中每条碳水化合物链的唾液酸残基的平均量的降低。优选地，所述每条碳水化合物链的唾液酸残基的平均量降低了至少0.01、更优选地降低了至少0.05、至少0.1、至少0.15、至少0.2、至少0.3或最优选地降低了至少0.5。在优选的实施方式中，降低唾液酸的量以使组合物中连接于存在于所述抗体或其片段或衍生物的Fab部分中的至少一个糖基化位点的碳水化合物中每条碳水化合物链的唾液酸残基的平均量低于0.8、优选地低于0.7、低于0.6、低于0.5、低于0.4、低于0.3、低于0.2、低于0.1或低于0.05。在特定实施方式中，增加游离半乳糖单元的量以使组合物中连接于存在于Fab部分中的至少一个糖基化位点的碳水化合物中至少50%包含至少一个游离半乳糖单元、优选地至少两个游离半乳糖单元。优选地，组合物中连接于Fab部分中的一个或多个糖基化位点的碳水化合物中至少60%、更优选地至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%会最优选地至少98%包含至少一个游离半乳糖单元、优选地至少两个游离半乳糖单 元。优选地，增加游离半乳糖单元的量以使组合物中连接于存在于Fab部分中的至少一个糖基化位点并包含至少一个游离半乳糖单元，优选地包含至少两个游离半乳糖单元的碳水化合物的相对量增加至少5个百分点、更优选地增加至少7个百分点、至少10个百分点、至少15个百分点、至少20个百分点、至少25个百分点、至少30个百分点、至少35个百分点、至少40个百分点、至少45个百分点，或至少50个百分点。组合物中连接于存在于Fab部分中的至少一个糖基化位点并包含至少一个游离半乳糖单元，优选地包含至少两个游离半乳糖单元的碳水化合物的相对量为组合物中连接于存在于Fab部分中的至少一个糖基化位点的所有碳水化合物中包含至少 一个游离半乳糖单元，优选地包含至少两个游离半乳糖单元的碳水化合物的百分比。例如，增加至少10个百分点指代这样的实施方式，其中组合物中连接于存在于Fab部分中的至少一个糖基化位点并包含至少一个游离半乳糖单元，优选地包含至少两个游离半乳糖单元的碳水化合物的百分比值在步骤(b3)中增加了 10，即，步骤(b3)之前相对量为X%，步骤(b3)之后相对量为(X+10)%。连接于存在于Fab部分中的至少一个糖基化位点的碳水化合物中游离半乳糖单元的量的增加还包括增加组合物中连接于存在于所述抗体或其片段或衍生物的Fab部分中的至少一个糖基化位点并已经包含至少一个游离半乳糖单元的碳水化合物中游离半乳糖单元的数量。具体而言，根据本发明的方法的步骤(b3)的游离半乳糖单元的量的增加指代组合物中连接于存在于所述抗体或其片段或衍生物的Fab部分中的至少一个糖基化位点的碳水化合物中每条碳水化合物链的游离半乳糖单元的平均量的增加。优选地，所述每条碳水化合物链的游离半乳糖单元的平均量增加了至少0.01、更优选地增加了至少0.05、至少0.1、至少0.15、至少0.2、至少0.3或最优选地增加了至少0.5。在优选的实施方式中，增加游离半乳糖单元的量以使组合物中连接于存在于所述抗体或其片段或衍生物的Fab部分中的至少一个糖基化位点的碳水化合物中每条碳水化合物链的游离半乳糖单元的平均量为至少0.5、优选地至少0.6、至少0.7、至少0.8、至少0.9、至少1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9或至少1.95。在增加抗体的循环半衰期之前可能已经在Fab部分中存在一个或多个糖基化位点，或已经根据本发明作为方法的一部分将一个或多个这些糖基化位点引入抗体的Fab部分。因此，增加连接于存在于所述抗体或其片段或衍生物的Fab部分中的至少一个糖基化位点的碳水化合物中游离半乳糖单元的量的步骤在特定实施方式中包括将一个或多个糖基化位点引入Fab部分的步骤。这些新引入的糖基化位点在糖基化时优选地携带碳水化合物，其中组合物中至少50%、更优选地至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或最优选地至少98%的所述碳水化合物包含至少一个游离半乳糖单元、优选地包含至少两个游离半乳糖单元。将糖基化位点向抗体或其片段或衍生物的Fab部分的引入在下文有更详细的描述。唾液酸的量的减少和/或游离半乳糖单元的量的增加可通过任何已知方式实现，包括在具有低的或没有唾液酸化活性的细胞或细胞系中表达所述抗体或其片段或衍生物。具有低的或没有唾液酸化度的细胞系可例如通过选择细胞系中合适的单克隆、通过遗传改造细胞系例如向细胞系的基因组中引入一个或多个突变、或通过针对一种或多种参与细胞系中唾液酸化途径的基因的敲除或降低或RNA干扰而获得。参与唾液酸化途径的合适的基因例如编码负责将唾液酸残基转移至碳水化合物链的唾液酸基转移酶、控制唾液酸残基或其前体转运到细胞中的相关区段或细胞器的转运子或参与唾液酸合成的酶。具体的实例为唾液酸基转移酶如α 2，6-和α 2，3_唾液酸基转移酶、转运子如CMP-唾液酸转运子、表异构酶如UDP-N-乙酰葡萄糖胺-2-表异构酶、激酶如N-乙酰甘露糖胺激酶和N-乙酰葡萄糖胺激酶、N-乙酰神经氨酸-9-Ρ-合成酶、N-乙酰神经氨酸-9-Ρ-磷酸酶和CMP-N-乙酰神经氨酸合成酶。进一步地，可在表达过程中使用产生低唾液酸化度的培养条件。备选地或另外地，可使用体外去唾·液酸化，特别是使用唾液酸酶进行酶催去唾液酸化，或使用合适的化学反应物进行化学去唾液酸化。用于提供具有特异调整的唾液酸含量，尤其是低含量的唾液酸的糖蛋白的合适细胞系及方法在例如W02005/080585中有描述。除了在连接于所述抗体或其片段或衍生物的Fab部分中的一个或多个糖基化位点的碳水化合物中降低唾液酸含量和/或增加游离半乳糖单元含量之外，还可通过向抗体或其片段或衍生物的Fab部分中引入一个或多个糖基化位点而降低抗体或其片段或衍生物的循环半衰期。通过引入所述(多个)糖基化位点，可增加抗体或其片段或衍生物中具有低度唾液酸化的碳水化合物的存在量。这些新引入的糖基化位点在糖基化时优选地携带碳水化合物，其中组合物中所述碳水化合物中低于50%、更优选地低于40%、低于30%、低于20%、低于15%、低于10%、低于7%或最优选地低于5%包含一个或多个唾液酸残基。同样地，这些新合成的糖基化位点在糖基化时优选地携带碳水化合物，其中组合物中所述碳水化合物中至少50%、更优选地至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或最优选地至少98%包含至少一个游离半乳糖单元、优选地包含至少两个游离半乳糖单元。上文描述了如何达到相应的低的唾液酸化量。优选地，向所述抗体或器片段或衍生物的Fab部分中引入至少一个、更优选地至少两个或至少三个糖基化位点。在特定实施方式中，引入了一个、两个或三个糖基化位点。所述(多个)糖基化位点可通过任何本领域已知方式引入。糖基化位点的引入优选地是通过遗传改造编码所述抗体或其片段或衍生物的核酸完成的。具体而言，糖基化位点是通过改变编码所述抗体或其片段或衍生物的核酸序列引入的。优选地，突变抗体的一个或多个密码子以使编码的氨基酸形成糖基化位点。糖基化位点的引入可通过添加一个或多个其他密码子而产生一个或多个添加的氨基酸完成，通过置换一个或多个核苷酸产生一个或多个氨基酸的置换而完成，及/或通过删除一个或多个密码子以产生一个或多个氨基酸的删除而完成。具体而言，将所述(多个)糖基化位点引入抗体或其片段或衍生物的重链可变区或轻链可变区，优选地为重链可变区。更优选地将所述糖基化位点引入可变区的骨架区中。然而，还可将糖基化位点引入Fab部分的恒定区，尤其是重链恒定区I。在将一个或多个糖基化位点引入抗体或其片段或衍生物的Fab部分时，所述抗体或其片段或衍生物优选地在其Fab部分起始并不含有糖基化位点。然而，在特定实施方式中，抗体或其片段或衍生物在其Fab部分已经含有一个或多个糖基化位点，通过根据本发明的方法引入一个或多个另外的糖基化位点。新引入的(多个)糖基化位点优选地携带碳水化合物，其中组合物中低于50%、更优选地低于40%、低于30%、低于20%、低于15%、低于10%、低于7%或最优选地低于5%的所述碳水化合物包含一个或多个唾液酸残基。具体而言，组合物中连接于存在于所述抗体或其片段或衍生物的Fab部分中的所有糖基化位点的碳水化合物中低于50%、优选地低于40%、低于30%、低于20%、低于15%、低于10%、低于7%或最优选地低于5%优选地包含一个或多个唾液酸残基。同样地，这些新引入的(多个)糖基化位点在糖基化时优选地携带碳水化合物，其中组合物中至少50%、优选地至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或最优选地至少98%的所述碳水化合物包含至少一个游离半乳糖单元、优选地包含至少两个游离半乳糖单元。具体而言，组合物中连接于存在于所述抗体或其片段或衍生物的Fab部分中的所有糖基化位点的碳水化合物中至少50%、更优选地至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或最优选地至少98%包含至少一个游离半乳糖单元、优选地包含至少两个游离半乳糖单元。上文对如何达到相应低量的唾液酸化进行了描述。Fab糖基化位点

存在于抗体或其片段或衍生物的Fab部分或向抗体或其片段或衍生物的Fab部分中引入或从其中移除的一个或多个糖基化位点为N-糖基化位点和/或O-糖基化位点，优选地为N-糖基化位点，更优选地为具有氨基酸序列Asn Xaa Ser/Thr的N-糖基化位点，其中Xaa为任何氨基酸，优选地，除了 Pro以外。它们可位于抗体或其片段或衍生物的Fab部分中任何位置。然而，它们优选地位于重链可变区或轻链可变区，更优选地位于重链可变区。具体而言，它们可位于骨架区，和/或重链和/或轻链可变区的CDR中，优选地位于骨架区。然而，所述一个或多个糖基化位点还可位于Fab部分的恒定区，特别是重链恒定区I中。Fab部分中糖基化位点的引入和移除可通过改变Fab部分的氨基酸序列而实现，特别是通过添加、置换和/或删除一个或多个氨基酸残基。优选地，这可通过遗传改造编码抗体或其片段或衍生物的氨基酸的核酸而完成，尤其是通过对所述核酸序列进行诱变。合适的用于移除或引入糖基化位点的方法在上文有描述。优选地，在其中抗体或其片段或衍生物包含两个或更多个重链可变区的实施方式中，存在于重链可变区的糖基化位点也存在于所述抗体或其片段或衍生物的所有重链可变区中。优选地，在其中抗体或其片段或衍生物包含两个或更多个重链恒定区尤其是两个或更多个CHl区域的实施方式中，存在于重链恒定区I的糖基化位点也存在于所述抗体或其片段或衍生物的所有重链恒定区I中。优选地，在其中抗体或其片段或衍生物包含两个或更多个轻链可变区的实施方式中，存在于轻链可变区的糖基化位点也存在于所述抗体或其片段或衍生物的所有轻链可变区中。优选地，在其中抗体或其片段或衍生物包含两个或更多个轻链恒定区的实施方式中，存在于轻链恒定区的糖基化位点也存在于所述抗体或其片段或衍生物的所有轻链恒定区中。分离自人血清的抗体中有近似30%在Fab部分内有糖基化位点。对于抗-EGFR抗体，尤其是西妥昔单抗，这些抗体Fab部分的一个糖基化位点优选地位于重链可变区的骨架区3中，更优选地位于根据Kabat编号85号位氨基酸。对于抗-Mucl抗体，尤其是Pankomab,这些抗体Fab部分的一个糖基化位点优选地位于重链可变区的⑶R2中，更优选地位于根据Kabat编号54号位氨基酸。如果在抗体或其片段或衍生物的Fab部分中存在至少一个糖基化位点，则组合物中至少一个抗体或其片段或衍生物在Fab部分是糖基化的。优选地，组合物中的抗体或其片段或衍生物中有至少25%、更优选地至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%或最优选地大约100%在Fab部分是糖基化的。进一步地，组合物中的抗体或其片段或衍生物中有至少25%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%或最优选地大约100%在Fab部分有如本文所描述的特异糖基化位点，优选地在Fab部分的所有糖基化位点是糖基化的。例如在例如纯化过程之后或过程中通过富集方法还可获得更高度的相应糖基化的抗体。在优选的实施方式中，在抗体或其片段或衍生物的Fab部分中引入或移除一个或多个糖基化位点并不抑制所述抗体或其片段或衍生物的抗原结合和/或抗原特异性。优选地，在Fab部分中引入或移除一个或多个糖基化位点并不显著减少抗原结合和/或抗原特异性。同样地，增加或降低连接于抗体或其片段或衍生物的Fab部分中的一个或多个糖基化位点的碳水化合物中的唾液酸的量优选地不抑制抗原结合和/或抗原特异性，优选地不显著减少抗原结合和/或抗原特异性。具体而言，在进行根据本发明的方法后，具有增加或降低的循环半衰期的抗体或其片段或衍生物对其特异抗原的结合亲和力为其循环半衰期得到控制前的抗体或其片段或衍生物的结合亲和力的至少0.5%、至少1%、至少5%、至少10%、优选地至少25%、至少50%、至少60%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%。然而，为避免增加或降低连接于抗体或其片段或衍生物的Fab部分中的特定糖基化位点的碳水化合物中的唾液酸负向影响抗原结合或抗原特异性或有负向影响的风险，可将所述糖基化位点从抗体移除及/或将一个或多个其他糖基化位点在不会或较少程度上影响抗原结合和/或抗原特异性的位置引入Fab部分。然后可根据需要增加或降低连接于新引入的(多个)糖基化位点的碳水化合物的唾液酸含量以控制循环半衰期。优选地，所述新引入的(多个)糖基化位点位于可变区的骨架区，或更优选地位于Fab的恒定区如重链恒定区I和/或轻链恒定区。抗体或其片段或衍生物根据本发明的方法中使用抗体可为任何抗体，包括天然发生的抗体、多克隆或单克隆抗体、工程抗体、嵌合抗体或人源化抗体。其可为人、小鼠、大鼠、山羊、灵长类或骆驼抗体。优选地，抗体为人、嵌合或人源化抗体。其可为任何抗体类型，包括IgG、IgE、IgA、IgD和IgM抗体以及任何亚型包括IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。优选地，抗体为IgG抗体，更优选地为IgGl或IgG2抗体，最优选地为IgGl抗体。例如，抗体可选自抗-EGFR抗体如西妥昔单抗、抗-TF抗体如Karomab、抗-Mucl抗体如Pankomab、抗-HE R2抗体如曲妥单抗、抗-CD20抗体如利妥昔单抗、抗_Αβ抗体如solanezumab、抗-⑶52抗体如阿仑单抗(Alemtuzumab),及其嵌合抗体或人源化形式。优选的抗-EGFR抗体在W096/40210(具体描述了人源化和嵌合形式的抗体225)及US4, 943，533 (描述了小鼠抗体225)中有所描述，并/或包含一个或多个选自以下的⑶R:具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDRHl、具有SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的CDRH2、具有SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的CDRH3、具有SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的CDRLl、具有SEQ IDNO:5的氨基酸序列的⑶RL2、具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的⑶RL3。具体而言，抗体可以为嵌合或人源化的抗-EGFR抗体，其包含⑴包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDRHl、具有SEQID NO: 2的氨基酸序列的⑶RH2、具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的⑶RH3的重链可变区；(ii)可选地，包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDRLl、具有SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的⑶RL2、具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的⑶RL3的轻链可变区；(iii)存在于Fab部分中在根据Kabat编号重链可变区85号位氨基酸处的糖基化位点；以及(iv)可选地，存在于Fe部分在重链恒定区2的297号位氨基酸处的糖基化位点。所述抗体优选地能够与西妥昔单抗和/或抗体225结合相同的抗原，尤其是结合于相同表位。优选的抗-Mucl抗体在专利申请W004/065423和EP09009942.5中有描述，其并入本文作为参考，并/或包含一个或多个选自以下的CDR:具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDRHl、具有SEQ ID N0:8的氨基酸序列的CDRH2、具有SEQ ID N0:9的氨基酸序列的CDRH3、具有SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的CDRLl、具有SEQ ID NO: 11的氨基酸序列的CDRL2、具有SEQ ID NO: 12的氨基酸序列的⑶RL3。具体而言，抗体可以为嵌合或人源化的抗-TA-Mucl抗体，其包含⑴包含具有SEQ ID NO: 7的氨基酸序列的CDRHl、具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的⑶RH2、具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的⑶RH3的重链可变区；(ii)可选地，包含具有SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的CDRLl、具有SEQ ID N0:11的氨基酸序列的⑶RL2、具有SEQ ID NO: 12的氨基酸序列的⑶RL3的轻链可变区；(iii)存在于Fab部分中在根据Kabat编号重链可变区54号位氨基酸处的糖基化位点；以及(iv)可选地，存在于Fe部分在重链恒定区2的297号位氨基酸处的糖基化位点。所述抗体优选地能够与Pankomab结合相同的抗原,尤其是结合于相同表位。具体而言，所述嵌合或人源化抗-TA-Mucl-抗体能够特异性结合于包含氨基酸序列H)TR(SEQID NO: 13)的表位，更优选地为包含H)TRP(SEQ ID NO: 14)的表位。对此表位的结合是依赖于糖基化的，其中具体而言如果相应地有碳水化合物部分连接于序列I3DTR或PDTRP的苏氨酸残基时则结合增加。优选地，如果该表位在苏氨酸残基处由碳水化合物部分糖基化时结合增加，所述碳水化合物部分选自:N-乙酰半乳糖胺(Τη)、唾液酸基α2-6Ν-乙酰半乳糖胺(sTn)、半乳糖β 1-3Ν-乙酰半乳糖胺(TF)及半乳糖β 1_3(唾液酸基α 2-6) N-乙酰半乳糖胺(sTF)，优选地为Tn或TF。优选地，碳水化合物部分通过α-O-糖苷键结合于苏氨酸残基。在一些实施方式中，结合对糖基化的依赖性是由当糖基化时所述表位采用的特异表位造成的，尤其是由上文提到的特异性碳水化合物部分。在其中结合的亲和力取决于表位构象的情况下，抗体不必结合于碳水化合物部分，可仅仅结合于表位的肽部分。优选地，表位包含在粘蛋白Mucl的细胞外串联重复内。具体而言，根据本发明的抗体能够结合于一种肿瘤相关粘蛋白表位，特别是肿瘤相关Mucl表位如表位TA-Mucl (见Karsten, U.等人(2004) Glycobiologyl4, 681_692and Danielczyk, A.等人(2006) Cancer Tmmunol.1mmunother.55, 1337-1347)。肿瘤相关粘蛋白I表位TA-Mucl优选地指代Mucl的表位,其存在于肿瘤细胞而不存在于正常细胞上且/或仅能在存在于肿瘤细胞而不是存在于正常细胞上时由宿主循环系统中抗体接近。优选的抗-⑶52抗体包含一个或多个选自以下的⑶R:具有SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的CDRH1、具有SEQ ID NO: 16的氨基酸序列的CDRH2、具有SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的CDRH3、具有SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的CDRLl、具有SEQ ID NO: 19的氨基酸序列的⑶RL2、具有SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的⑶RL3。具体而言，抗体可以为抗-⑶52抗体，其包含⑴包含具有SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的CDRHl、具有SEQ ID NO: 16的氨基酸序列的⑶RH2、具有SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的⑶RH3的重链可变区；(ii)可选地，包含具有SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的CDRLl、具有SEQ ID NO: 19的氨基酸序列的⑶RL2、具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的⑶RL3的轻链可变区；(iii)存在于Fab部分中在根据Kabat编号重链可变区60号位氨基酸处的糖基化位点；以及(iv)可选地，存在于Fe部分在重链恒定区2的297号位氨基酸处的糖基化位点。所述抗体优选地能够与阿伦单抗结合相同的抗原，尤其是结合于相同表位。优选的抗-Aβ抗体包含一个或多个选自以下的⑶R:具有SEQ ID Ν0:21的氨基酸序列的CDRHl、具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDRH2、具有SEQ ID Ν0:23的氨基酸序列的CDRH3、具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDRLl、具有SEQ ID Ν0:25的氨基酸序列的⑶RL2、具有SEQ ID NO: 26的氨基酸序列的⑶RL3。具体而言，抗体可以为抗_Αβ抗体，其包含(i)包含具有SEQ ID NO: 21的氨基酸序列的CDRHl、具有SEQ ID NO: 22的氨基酸序列的⑶RH2、具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的⑶RH3的重链可变区；(ii)可选地，包含具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDRLl、具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的⑶RL2、具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的⑶RL3的轻链可变区；(iii)存在于Fab部分中在根据Kabat编号重链可变区55号位氨基酸处的糖基化位点；以及(iv)可选地，存在于Fe部分在重链恒定区2的297号位氨基酸处的糖基化位点。所述抗体优选地能够与Solanezumab结合相同的抗原,尤其是结合于相同表位。除了 Fab部分中的一个或多个糖基化位点外，抗体还可在Fe部分中包含一个或多个糖基化位点。优选的，其包含Fe部分的天然发生糖基化位点。例如，其包含CH2区域中的糖基化位点，具体而言在IgG抗体的情况下为Asn297处。在这些实施方式中，优选地组合物中至少一个抗体或其片段或衍生物在Fe部分糖基化。优选地，组合物中抗体或其片段或衍生物中有至少25%、更优选地至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%，最优选地大约100%在Fe部分糖基化。抗体的片段或衍生物优选地包含至少抗体的重链可变区。优选地，其进一步包含抗体的重链恒定区1，和/或抗体的轻链可变区和/或抗体的轻链恒定区。在一个优选的实施方式中，抗体的片段或衍生物包含抗体的整个Fab部分。具体而言，抗体的片段或衍生物选自:(i)Fab片段，其是由重链和轻链各自可变区及第一恒定结构域构成的单价片段；(ii)F(ab)2片段，其是包含由铰链区的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，其由重链的可变区及第一恒定结构域CHl构成；(iv)Fv片段，其由抗体单臂上的重链和轻链可变区的构成；(V) scFv片段,其是由单一多肽链构成的Fv片段；(vi) (Fv)2片段，其由两个Fv片段共价相连而构成；(Vii)重链可变结构域；以及(viii)多价抗体，其由以如下方式共价相连的重链可变区和轻链可变区构成:重链和轻链可变区的结合只能在分子间而不能在分子内发生。所述片段或衍生物优选地能够与抗体结合于相同抗原，优选地结合于相同表位。糖基化形式

在优选的实施方式中，循环半衰期受到根据本发明的方法控制并包含于根据本发明的抗体组合物中的抗体或其片段或衍生物具有为所述抗体或其片段或衍生物提供特定所需特性的其他糖基化特征。这些抗体或其片段或衍生物上的碳水化合物优选地为复合型碳水化合物。具体而言，连接于抗体或其片段或衍生物的Fab部分和/或Fe部分的碳水化合物中优选地有至少50%、更优选地至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%最优选地大约100%具有图21B中所示的核心结构，其中黑色方块代表N-乙酰葡萄糖胺残基(GlcNAc)而灰色圆圈代表甘露糖残基(Man)。更优选地，具有所述核心结构的碳水化合物为复合型碳水化合物如双天线复合型碳水化合物，其具有图21C中所示的核心结构，其中黑色方块代表N-乙酰葡萄糖胺残基(GlcNAc)、灰色圆圈代表甘露糖残基(Man)、白色圆圈代表半乳糖残基(Gal)、灰色菱形代表唾液酸残基(SA)、黑色三角代表果糖残基(Fuc)而灰色方块代表平分型N-乙酰葡萄糖胺残基(bisGlcNAc);其中碳水化合物的分支中的GlcNAc、Gal和SA、bisGlcNAc以及Fuc仅仅是可选地存在于碳水化合物结构中的，也可能不存在。具体而言，这些可选的残基以本文描述的量存在。具体而言，抗体组合物中连接于所述抗体或其片段或衍生物的碳水化合物中有至少50%携带至少一个半乳糖残基。更优选地，组合物中所述碳水化合物中有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%或至少80%携带至少一个半乳糖残基。在优选的实施方式中，抗体组合物中连接于所述抗体或其片段或衍生物的Fab部分的碳水化合物中有至少70%携带至少一个半乳糖残基。更优选地，组合物中所述碳水化合物中有至少至少75%、至少80%、至少85%或至少90%携带至少一个半乳糖残基。所述半乳糖残基优选地为末端半乳糖残基，具体而言连接于N-乙酰葡萄糖胺残基，后者特别是位于碳水化合物链的一个或多个分支的末端并可选地进一步携带一个唾液酸残基。术语“末端的”在这一点上仅指代半乳糖残基在碳水化合物链中的位置，具体而言指的是其在碳水化合物某个分支上的位置。这并不意味着该半乳糖残基必须是碳水化合物链的非还原性末端的最后一个单糖单元。具体而言，末端半乳糖单元可进一步携带一个唾液酸残基。
在优选的实施方式中，抗体或其片段或衍生物具有人的或类似人的糖基化形式。具体地，连接于抗体或其片段或衍生物的碳水化合物优选地不包含具有Gal α (1- 3)GalP (I— 4)GlcNAc结构的Galili表位。优选地，它们不包含Gal a (1- 3)Gal结构。连接于抗体或其片段或衍生物的碳水化合物还优选地不包含N-羟乙酰神经氨酸(NeuGc)残基。进一步地，在组合物中连接于抗体或其片段或衍生物的碳水化合物中唾液酸优选地有至少25%是通过2，6-连接偶联的。更优选地，组合物中连接于抗体或其片段或衍生物的碳水化合物中唾液酸优选地有至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%或至少68%是通过2，6-连接偶联的。通过使用类似于天然人糖基化的糖基化形式，减少了施用抗体或其片段或衍生物引起的不利副作用。具体而言，应当避免碳水化合物结构如Galili表位、NeuCg或高量的2，3-连接唾液酸，因为其可能引发患者免疫系统产生免疫应答。例如，使用具有类似人糖基化形式的嵌合的或优选地人源化抗体可避免人抗-小鼠抗体(HAMA)应答。尤其已知的是Galili表位引起大量严重的超敏反应。具体而言，表达于小鼠SP2/0细胞的嵌合抗-EGFR抗体西妥昔单抗(Erbitux)包含的碳水化合物携带有Galili表位及NeuGc,因此在人类患者中诱导了针对所述抗体的免疫反应。由根据本发明的方法获得的抗体，特别是根据本发明的方法获得的EGFR抗体如嵌合或人源化西妥昔单抗抗体或具有与西妥昔单抗相同表位的抗体(其可包含在根据本发明的抗体组合物中)不包含这些不利的碳水化合物结构。进一步地，在根据本发明的组合物中，连接于抗体或其片段或衍生物的碳水化合物优选地有至少10%、更优选地至少15%、至少20%、至少23%、至少25%、至少27%、至少29%或至少30%携带平分型N-乙酰葡萄糖胺(bisGlcNAc)残基。具体而言，组合物中连接于抗体或其片段或衍生物的Fab部分的碳水化合物优选地有至少50%、更优选地至少55%、至少60%、至少65%或甚至70%携带bisGlcNAc。在特定实 施方式中，根据本发明的组合物中连接于抗体或其片段或衍生物的Fab部分的碳水化合物中不超过50%、优选地不超过40%、不超过30%、不超过25%、不超过20%、不超过15%、不超过13%或不超过10%携带果糖残基。在进一步的实施方式中，根据本发明的组合物中连接于抗体或其片段或衍生物的Fab部分的碳水化合物优选地有至少1%、更优选地至少2%、至少5%、至少7%、至少8%、至少9%或至少10%携带果糖残基。增强的生物学活性在本发明的优选的实施方式中，具有增加的循环半衰期的抗体此外还具有增强的生物学活性。在此方面的抗体的生物学活性包括例如ADCC和⑶C。增强的生物学活性主要是通过优化的糖基化形式达到的，尤其是在抗体Fe部分优化的糖基化形式。例如，IgG型抗体的ADCC活性由抗体通过其Fe部分与Fe Y -受体特别是Fe YRIIIa的结合介导。Fe Y RIIIa表达于天然杀伤(NK)细胞及巨噬细胞上，在受抗体激活时诱导细胞因子以及细胞毒性颗粒的释放，导致抗体包围的靶标细胞的凋亡。抗体对Fe Y -受体的结合亲和力受到连接于抗体Fe部分的糖基化位点的碳水化合物的影响。因此，优化抗体Fe部分的糖基化形式会产生更强的Fe YRIIIa结合并因此产生增强的ADCC活性。除了抗体的循环半衰期外，其治疗效力在很多情况下也取决于针对抗体所结合的靶标细胞的细胞毒性效应的诱导。因此，增加抗体的ADCC活性也增加了其的治疗价值。例如，使用ADCC活性得到优化的抗体时，施用于患者相同量的抗体会实现高得多的治疗益处。进一步地，为达到相同的治疗效应，只需要施用量低得多的所述抗体。如本文所讨论的，抗体的循环半衰期的增加也产生增强的治疗效应。因此，增加的循环半衰期和增加的生物学活性这两种特征的组合提供了高度优势的治疗抗体。然而，这两种特性优选地都是通过控制抗体的糖基化形式而优化的。具体而言，在抗体Fab部分的唾液酸度的增加会增加其循环半衰期而在抗体Fe部分的果糖化度的降低增加其ADCC活性。进一步地，在Fe部分的高唾液酸化度可干扰ADCC活性。本发明的一项成果在于将这两种特征在一个抗体组合物中组合并因此提供在Fab部分的糖基化形式优化达到高循环半衰期且在Fe部分的糖基化形式优化达到高生物学活性的抗体。已经发现尤其是连接于IgG抗体Fe部分的碳水化合物中减少的果糖量、增加的平分型GlcNAc的量和/或减少的唾液酸的量会增加抗体对Fe yRIIIa的亲和力及/或其ADCC活性。因此，在优选的实施方式中，根据本发明的抗体组合物中的抗体或其片段或衍生物在连接于抗体或其片段或衍生物的Fe部分的碳水化合物中有低的果糖量。备选地或除了此低的果糖量之外，抗体或其片段或衍生物在连接于Fe部分的碳水化合物中优选地具有高的平分型GlcNAc的量和/或低的唾液酸量。在抗体的Fe部分的这种糖基化形式产生增加的抗体ADCC活性。在优选的实施方式中，根据本发明的抗体组合物中连接于抗体或其片段或衍生物的Fe部分的碳水化合物中优选地至少50%、更优选地至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少93%、至少95%或至少97%不携带果糖残基。在抗体Fe部分的糖基化中低的果糖含量对该抗体的高抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC)十分重要。尤其在IgG抗体的情况下，在Fe糖基化中高的果糖量减少抗体对Fe Y -受体的亲和力，特别是对由天然杀伤细胞和巨噬细胞表达并介导ADCC的Fe Y RIIIa的亲和力。进一步地，连接于IgG抗体的Fe部分的糖基化位 点的碳水化合物中低的果糖量也减少了抗体对人Fe Y RIIIa的不同多态性变体(FcyRIIIa-158F和FcyRIIIa-158V)的结合亲和力中的差异。因此，在连接于Fe部分的碳水化合物中具有低的果糖量，尤其是具有如上文描述的果糖量的IgG抗体可用于以一定的量治疗患者，当以该量施用相同的在Fe部分有高果糖含量的抗体时不引起治疗作用。进一步地，使用这些低果糖抗体时，可以相同量的抗体治疗具有不同的Fe Y RIIIa多态性变体的患者如纯合Fe Y RIIIa-158F患者、纯合Fe Y RIIIa-158V患者和杂合Fe Y RIIIa-158F/V患者，产生类似对所施用的相同量的抗体的应答。具体而言，在其Fe部分具有高果糖含量的抗体对Fe YRIIIa-158F的结合具有尤其降低的亲和力。因此，使用所述低果糖抗体扩大了抗体治疗的患者覆盖率。这一点在其中使用了根据本发明的相应抗体组合物的实施例中也有表明。进一步地，根据本发明的组合物中连接于抗体或其片段或衍生物的Fe部分的碳水化合物中优选地至少5%、更优选地至少7%、至少10%、至少12%、至少15%、至少18%、至少20%或至少22%携带bisGlcNAc。在抗体，尤其是IgG抗体的Fe部分较高量的bisGlcNAc可使该抗体产生增加的ADCC。进一步地，根据本发明的组合物中连接于抗体或其片段或衍生物的Fe部分的碳水化合物中优选地至少60%、更优选地至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少93%、至少95%或至少97%不携带唾液酸残基。进一步地，根据本发明的组合物中连接于抗体或其片段或衍生物的Fe部分的碳水化合物中优选地至少75%、更优选地至少80%、至少85%、至少90%、至少93%、至少95%或至少97%不携带两个或更多个唾液酸残基。在抗体的Fe部分较高的唾液酸化度对与Fe受体特别是Fe Y RIIIa的结合有负面影响，因此也影响抗体的ADCC。用于生产这些抗体组合物的细胞和细胞系优选地能够提供在Fab部分具有高唾液酸化度并在Fe部分具有低唾液酸化度的抗体。合适的细胞系的实例为细胞系GT-5s及由其来源或与其同源的细胞或细胞系。抗体组合物在第二方面，本发明提供了抗体组合物，其包含抗体或其功能片段或衍生物，特征在于所述抗体或器片段或组合物包含在其Fab部分中的至少一个糖基化位点，特征还在于组合物中连接于抗体或其片段或衍生物的Fab部分的碳水化合物中至少65%携带至少一个末端唾液酸残基且/或连接于抗体或其片段或衍生物的Fab部分的碳水化合物中低于35%携带至少两个游离半乳糖单元。所述抗体组合物优选的特征，特别是优选的糖基化形式在上文有所描述并符合下文的糖基化形式。优选地，根据本发明的抗体组合物中抗体或其片段或衍生物中至少75%、更优选地至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%且最优选地大约100%识别、结合于且/或特异于相同抗原，优选地为相同表位。所述抗体组合物可由根据本发明的控制抗体或其片段或衍生物的循环半衰期的方法获得，或确实是通过该方法获得的，其中连接于一个或多个所述抗体或其片段或衍生物Fab部分存在的糖基化位点的碳水化合物中唾液酸的量得到增加。

具体而言，根据本发明的抗体组合物中的抗体或其片段或衍生物优选地在根据本发明的用于控制循环半衰期的方法上具有上文描述的一项或多项特征。具体而言，相应组合物中包含的与根据本发明的用于控制循环半衰期的方法相关而描述的所述抗体或其片段或衍生物的这些特征，特别是糖基化形式、Fab糖基化位点的特征以及糖基化形式的特征，如上文描述的，还可应用于根据本发明的抗体组合物中的抗体或其片段或衍生物。在优选的实施方式中，组合物中连接于抗体或其片段或衍生物的Fab部分的碳水化合物中有至少68%、至少70%、至少75%或至少80%携带至少一个末端唾液酸残基。具体而言，组合物中连接于存在于抗体或其片段或衍生物的Fab部分中的至少一个糖基化位点的碳水化合物中每条碳水化合物链的唾液酸平均量为至少0.65、优选地至少0.7、至少0.75、至少0.8、至少0.9、至少1.0、至少1.05或至少1.1。进一步地,组合物中连接于抗体或其片段或衍生物的Fab部分的碳水化合物中优选地低于30%、低于25%、低于20%、低于15%、低于10%、低于7%或低于5%携带两个或更多游离半乳糖单元。具体而言，组合物中连接于存在于抗体或其片段或衍生物的Fab部分中的至少一个糖基化位点的碳水化合物中每条碳水化合物链的游离半乳糖单元平均量低于1.2、更优选地低于1.1、低于1.0、低于0.9、低于0.85、低于0.8、低于0.75或低于0.7。优选地，组合物中至少一种抗体或其片段或衍生物在Fab部分糖基化。更优选地，组合物中抗体或其片段或衍生物中至少25%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%或至少90%在Fab部分糖基化。进一步地，组合物中抗体或其片段或衍生物中优选地至少25%、更优选地至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%或最优选地至少90%如本文描述的在Fab部分的特异糖基化位点，优选地在Fab部分存在的所有糖基化位点处有糖基化。还可例如在纯化过程中或之后就相应糖基化形式富集抗体或其片段或衍生物。优选地，抗体组合物中的抗体或其片段或衍生物进一步在其Fe部分包含至少一个糖基化位点。所述糖基化位点优选地是由碳水化合物糖基化的，其中组合物中携带果糖残基的碳水化合物的量优选地低于50%、更优选地低于40%、低于30%、低于25%、低于20%、低于15%、更优选地低于10%且最优选地低于5%。进一步地，组合物中连接于Fe部分并携带一个或多个唾液酸残基的碳水化合物的量优选地低于50%、更优选地低于40%、低于30%、低于25%、低于20%、低于15%、低于10%，最优选地低于7%或低于5%。组合物中的抗体或其片段或衍生物优选地具有下表列出的糖基化形式:
权利要求
1.用于控制抗体或其功能片段或衍生物的循环半衰期的方法，其包括步骤 (a)对于增加循环半衰期(al)在包含抗体或其功能片段或衍生物的组合物中增加连接于存在于所述抗体或其片段或衍生物的Fab部分中的至少一个糖基化位点的碳水化合物中的唾液酸的量；及/或(a2)移除存在于抗体或其片段或衍生物的Fab部分中的一个或多个糖基化位点；及/或(a3)在包含抗体或其功能片段或衍生物的组合物中降低连接于存在于所述抗体或其片段或衍生物的Fab部分中的至少一个糖基化位点的碳水化合物中的游离半乳糖单元的 量;或 (b)对于降低循环半衰期(bl)在包含抗体或其功能片段或衍生物的组合物中降低连接于存在于所述抗体或其片段或衍生物的Fab部分中的至少一个糖基化位点的碳水化合物中的唾液酸的量；及/或(b2)向抗体或其片段或衍生物的Fab部分中引入一个或多个糖基化位点；和/或(b3)在包含抗体或其功能片段或衍生物的组合物中增加连接于存在于所述抗体或其片段或衍生物的Fab部分中的至少一个糖基化位点的碳水化合物中的游离半乳糖单元的量。
2.根据权利要求1的方法，其中步骤(al)包含一项或多项以下特征: (i)增加唾液酸的量以使组合物中连接于存在于Fab部分中的至少一个糖基化位点的碳水化合物中至少50%包含至少一个唾液酸残基； ( )增加唾液酸的量以使组合物中连接于存在于Fab部分中的至少一个糖基化位点的碳水化合物中每条碳水化合物链的唾液酸残基的平均量为至少0.8 ； (iii)增加连接于存在于Fab部分中的至少一个糖基化位点的碳水化合物中唾液酸的量而组合物中连接于存在于所述抗体或其片段或衍生物的Fe部分中的至少一个糖基化位点的碳水化合物中低于20%、优选地低于10%包含至少一个唾液酸，以及 (iv)增加唾液酸的量的步骤,包括在细胞或细胞系具有高的唾液酸化活性的条件下，于所述细胞或细胞系中表达所述抗体或其片段或衍生物。
3.根据权利要求1或2的方法，其中步骤(a2)包含一项或多项以下特征: (i)通过改变编码所述抗体或其片段或衍生物的核酸序列而移除所述一个或多个糖基化位点； ( )要移除的至少一个糖基化位点存在于所述抗体或其片段或衍生物的重链可变区或轻链可变区，优选地在重链可变区中，更优选地为在其骨架区中； (iii)移除存在于所述抗体或其片段或衍生物的Fab部分中的所有糖基化位点； (iv)所述一个或多个糖基化位点的移除不会显著减少或消除所述抗体或其片段或衍生物的抗原结合和/或抗原特异性；以及 (v)抗原结合亲和力降低不超过20%、优选地不超过15%、不超过10%或不超过5%。
4.根据权利要求1-3中任何一项的方法，其中步骤(a3)包含一项或多项以下特征: (i)降低游离半乳糖单元的量以使组合物中连接于存在于Fab部分中的至少一个糖基化位点的碳水化合物中低于50%包含至少两个游离半乳糖单元；以及 ( )降低游离半乳糖单元的量的步骤，包括在细胞或细胞系具有高的唾液酸化活性的条件下，于所述细胞或细胞系中表达所述抗体或其片段或衍生物。
5.根据权利要求1的方法，其中步骤(bl)包含一项或多项以下特征: (i)降低唾液酸的量以使组合物中连接于存在于Fab部分中的至少一个糖基化位点的碳水化合物中低于50%包含至少一个唾液酸残基； ( )降低唾液酸的量以使组合物中连接于存在于Fab部分中的至少一个糖基化位点的碳水化合物中的每条碳水化合物的唾液酸残基的平均量为低于0.8 ;以及 (iii)降低唾液酸的量的步骤，包括在细胞或细胞系具有低的或无唾液酸化活性的条件下，于所述细胞或细胞系中表达所述抗体或其片段或衍生物。
6.根据权利要求1或5的方法，其中步骤(b2)包含一项或多项以下特征: (i)向所述抗体或其片段或衍生物的Fab部分中引入恰好一个、至少两个或至少三个糖基化位点； ( )所述一个或多个糖基化位点是通过改变编码所述抗体或其片段或衍生物的核酸序列而引入； (iii)向所述抗体或其片段或衍生物的重链可变区或轻链可变区中引入至少一个糖基化位点，优选地向重链可变区中引入，更优选地是在其骨架区中； (iv)向重链恒定区I或轻链恒定区中引入至少一个糖基化位点； (v)所述抗体或其片段或衍生物在引入一个或多个糖基化位点前在其Fab部分不含糖基化位点； (vi)向Fab部分中引入的至少一个糖基化位点具有序列AsnXaaSer/Thr,其中Xaa为任何的氨基酸，优选地除了 Pro以外； (vii)所述一个或多个引入的糖基化位点和/或连接于所述糖基化位点的碳水化合物不会显著减少或消除所述抗体或其片段或衍生物的抗原结合和/或抗原特异性；以及 (viii)在包含所述抗体或其片段或衍生物的组合物中连接于一个或多个引入的糖基化位点的碳水化合物中低于50%包含至少一个唾液酸残基。
7.根据权利要求1、5和6中任何一项的方法，其中步骤(b3)包含一项或多项以下特征: (i)增加游离半乳糖单元的量以使组合物中连接于存在于Fab部分中的至少一个糖基化位点的碳水化合物中至少50%包含至少两个游离半乳糖单元；以及 ( )增加唾液酸的量的步骤，包括在细胞或细胞系具有低的或无唾液酸化活性的条件下，于所述细胞或细胞系中表达所述抗体或其片段或衍生物。
8.根据权利要求1-7中任何一项的方法，其中存在于所述抗体或其片段或衍生物的Fab部分中的至少一个糖基化位点存在于重链可变区或轻链可变区中，优选地在重链可变区中，更优选地是在可变区的骨架区中。
9.根据权利要求1-8中任何一项的方法，其中包含所述抗体或其片段或衍生物的组合物中，所述抗体或其片段或衍生物中至少50%在Fab部分糖基化。
10.根据权利要求1-9中任何一项的方法，其中所述抗体或其片段或衍生物包含在Fe部分中的至少一个糖基化位点，优选地在CH2区域中，最优选地是在氨基酸Asn297处。
11.根据权利要求10的方法，其中所述抗体或其片段或衍生物具有一项或多项以下特征:(i)在包含所述抗体或其片段或衍生物的组合物中，所述抗体或其片段或衍生物中至少50%在Fe部分糖基化； (ii)在包含所述抗体或其片段或衍生物的组合物中，连接于Fe部分的碳水化合物中至少80%、优选地至少90%不携带果糖残基； (iii)在包含所述抗体或其片段或衍生物的组合物中，连接于Fe部分的碳水化合物中至少80%、优选地至少90%不携带唾液酸残基；以及 (iv)在包含所述抗体或其片段或衍生物的组合物中，连接于Fe部分的碳水化合物中至少5%携帯平分型N-こ酰葡萄糖胺残基。
12.根据权利要求1-11中任何ー项的方法，其中所述抗体或其片段或衍生物具有ー项或多项以下特征: (i)在包含所述抗体或其片段或衍生物的组合物中，连接于所述抗体或其片段或衍生物的碳水化合物中至少70%携帯至少ー个半乳糖残基； (ii)所述抗体或其片段或衍生物具有人的糖基化形式； (iii)连接于所述抗体或其片段或衍生物的碳水化合物不包含具有结构Gala (1-3)Gal 3 (I — 4)GlcNAc 的 Galili 表位; (iv)连接于所述抗体或其片段或衍生物的碳水化合物不包含N-羟こ酰神经氨酸(NeuGc)残基; (v)在包含所述抗体或其片段或 衍生物的组合物中，连接于所述抗体或其片段或衍生物的碳水化合物中的唾液酸有至少40%是通过2，6-连接偶联的； (vi)在包含所述抗体或其片段或衍生物的组合物中，连接于所述抗体或其片段或衍生物的碳水化合物中至少23%携带平分型N-こ酰葡萄糖胺(bisGlcNAc)残基； (vii)所述抗体为IgG、IgE、IgA、IgD或IgM抗体,优选地为IgGl或IgG2抗体,更优选地为IgGl抗体； (viii)所述抗体为人、小鼠、大鼠、山羊、灵长类或骆驼抗体；以及 (ix)所述抗体为工程改造的抗体、单克隆抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
13.根据权利要求1-12中任何ー项的方法，其中抗体的片段或衍生物具有ー项或多项以下特征: (i)其包含至少抗体的重链可变区，可选地其进ー步包含抗体的重链恒定区1，和/或抗体的轻链可变区，和/或抗体的轻链恒定区； (ii)其选自由以下构成的一組:(a)Fab片段，其为由每条重链和轻链的可变区和第一恒定结构域构成的单价片段； (b)F (ab)2片段，其为包含由铰链区ニ硫桥相连的两个Fab片段的双价片段； (c)Fd片段，其由重链的可变区及第ー恒定结构域CHl构成； (d)Fv片段，其由抗体单臂的重链和轻链可变区构成； (e)scFv片段,其由单ー多肽链构成的Fe片段； (f)(Fv)2片段,其由两个共价连接在一起的Fv片段构成； (g)重链可变结构域；及 (h)多价抗体，其由以如下方式共价连接在一起的重链可变区和轻链可变区构成:重链和轻链可变区的结合只能在分子间而不能在分子内发生；以及(iii)其能够与所述抗体结合于相同抗原，优选地结合于相同表位。
14.根据权利要求1-13中任何一项的方法，其中组合物中连接于所述抗体或其片段或衍生物的Fab部分的碳水化合物中至少50%、优选地至少60%、更优选地至少70%携带bisGlcNAco
15.根据权利要求1-14中任何一项的方法，其中抗体为嵌合或人源化抗-EGFR抗体，其包含 ⑴包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDRHl、具有SEQID N0:2的氨基酸序列的CDRH2、具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDRH3的重链可变区； ( )可选地，包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDRLl、具有SEQ ID N0:5的氨基酸序列的⑶RL2、具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的⑶RL3的轻链可变区； (iii)存在于Fab部分中在根据Kabat编号重链可变区85号位氨基酸处的糖基化位点；以及 (iv)存在于Fe部分在重链恒定区2的297号位氨基酸处的糖基化位点。
16.根据权利要求1-14中任何一项的方法，其中抗体为嵌合或人源化抗-TA-Mucl抗体，其包含 (i)包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDRHl、具有SEQID NO:8的氨基酸序列的CDRH2、具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDRH3的重链可变区； ( )可选地，包含具有SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的CDRLl、具有SEQ ID N0:11的氨基酸序列的⑶RL2、具有SEQ ID NO: 12的氨基酸序列的⑶RL3的轻链可变区； (iii)存在于Fab部分中在根据Kabat编号重链可变区54号位氨基酸处的糖基化位点；以及 (iv)存在于Fe部分在重链恒定区2的297号位氨基酸处的糖基化位点。
17.包含抗体或其片段或衍生物的抗体组合物，特征为所述抗体或其片段或衍生物包含在其Fab部分中的至少一个糖基化位点，且特征还在于组合物中连接于所述抗体或其片段或衍生物的Fab部分的碳水化合物中至少65%携带至少一个末端唾液酸残基及/或连接于所述抗体或其片段或衍生物的Fab部分的碳水化合物中低于35%携带至少两个游离半乳糖单元。
18.根据权利要求17的抗体组合物，其中所述抗体或其片段或衍生物具有如权利要求2、4和8-16中限定的一项或多项特征。
19.根据权利要求17或18的抗体组合物，其中所述抗体或其片段或衍生物具有一项或多项以下特征: (i)组合物中所述抗体或其片段或衍生物中至少50%在Fab部分糖基化； ( )组合物中连接于Fab部分的碳水化合物中至少70%、优选地至少75%携带至少一个末端唾液酸残基； (iii)其包含在Fe部分中的至少一个糖基化位点，优选地在CH2区域中，更优选地是在氨基酸Asn 297处； (iv)组合物中所述抗体或其片段或衍生物中至少50%在Fe部分糖基化； (V)组合物中连接于Fe部分的碳水化合物中至少80%不携带果糖残基； (vi)组合物中连接于Fe部分的碳水化合物中至少70%、优选地至少80%不携带唾液酸残基; (vii)组合物中连接于Fe部分的碳水化合物中至少5%携带平分型N-乙酰化葡萄糖胺残基； (viii)组合物中连接于所述抗体或其片段或衍生物的碳水化合物中至少70%携带至少一个半乳糖残基； (ix)其具有人的糖基化形式； (x)连接于所述抗体或其片段或衍生物的碳水化合物不包含具有结构Galα (1- 3)Gal β (I — 4)GlcNAc 的 Galili 表位; (xi)连接于所述抗体或其片段或衍生物的碳水化合物不包含N-羟乙酰神经氨酸(NeuGc)残基; (xii)组合物中连接于所述抗体或其片段或衍生物的碳水化合物中的唾液酸有至少40%是通过2，6-连接偶联的； (xiii)组合物中连接于所述抗体或其片段或衍生物的碳水化合物中至少23%携带平分型N-乙酰葡萄糖胺(bisGlcNAc)残基； (xiv)组合物中连接于所述抗体或其片段或衍生物的Fab部分的碳水化合物中至少50%、优选地至少60%、更优选地至少70%携带bisGlcNAc; (xiv)所述抗体为IgG、IgE 、IgA、IgD或IgM抗体,优选地为IgGl或IgG2抗体,更优选地为IgGl抗体; (xv)所述抗体为人、小鼠、大鼠、山羊、灵长类或骆驼抗体； (xvi)所述抗体为工程改造的抗体、单克隆抗体、嵌合抗体或人源化抗体； (xvii)抗体的片段或衍生物包含至少抗体的重链可变区以及Fab部分中的糖基化位占.(xviii)所述片段或衍生物选自由以下构成的一组: (a)Fab片段，其是由每条重链和轻链的可变区和第一恒定结构域构成的单价片段； (b)F (ab)2片段，其是包含由铰链区二硫桥相连的两个Fab片段的双价片段； (c)Fd片段，其由重链的可变区及第一恒定结构域CHl构成； (d)Fv片段，其由抗体单臂的重链和轻链可变区构成； (e)scFv片段，其是由单一多肽链构成的Fe片段； (f)(Fv)2片段,其由两个共价连接在一起的Fv片段构成； (g)重链可变结构域；及 (h)多价抗体，其由以如下方式共价连接在一起的重链可变区和轻链可变区构成:重链和轻链可变区的结合只能在分子间而不能在分子内发生； (xix)所述片段或衍生物能够与所述抗体结合于相同抗原，优选地结合于相同表位；以及 (XX)所述抗体选自抗-EGFR抗体如西妥昔单抗、抗-TF抗体如Karomab、抗-Mucl抗体如Pankomab、抗-HER2抗体如曲妥单抗、抗-CD20抗体如利妥昔单抗。
20.包含嵌合或人源化抗-EGFR抗体的抗体组合物，其中嵌合或人源化抗-EGFR抗体包含的重链可变区包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的⑶RHl、具有SEQ ID N0:2的氨基酸序列的⑶RH2、具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的⑶RH3;包含的轻链可变区包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDRLl、具有SEQ ID N0:5的氨基酸序列的CDRL2、具有SEQ IDNO:6的氨基酸序列的⑶RL3，特征为 (i)所述抗体在根据Kabat编号重链可变区的85号位氨基酸处包含存在于Fab部分中的糖基化位点，其中组合物中连接于所述存在于Fab部分中的所述糖基化位点的碳水化合物中有至少65%携带至少一个末端唾液酸残基且/或连接于所述存在于Fab部分中的所护糖基化位点的碳水化合物中低于35%携带至少两个游离半乳糖单元，或( )所述抗体不包含在Fab部分中的糖基化位点。
21.根据权利要求20的抗体组合物，其中抗体具有所有以下特征 (i)所述抗体包含存在于Fe部分中的糖基化位点； ( )组合物中连接于 Fe部分的碳水化合物中至少80%不携带果糖残基； (iii)组合物中连接于Fe部分的碳水化合物中至少70%、优选地至少80%不携带唾液酸残基； (iv)组合物中连接于Fe部分的碳水化合物中至少10%携带平分型N-乙酰葡萄糖胺残基; (v)组合物中连接于抗体的碳水化合物中至少70%携带至少一个半乳糖残基； (vi)连接于抗体的碳水化合物不包含具有结构Galα (I — 3) Gal β (I — 4) GlcNAc的Galili表位；以及 (vii)连接于抗体的碳水化合物不包含N-羟乙酰神经氨酸(NeuGc)残基； (viii)可选地，组合物中连接于所述抗体或其片段或衍生物的Fab部分的碳水化合物中优选地至少50%、优选地至少60%、更优选地至少70%携带bisGlcNAc。
22.包含嵌合或人源化抗-MucI抗体的抗体组合物，其中嵌合或人源化抗-Muc I抗体包含的重链可变区包含具有SEQ ID NO: 7的氨基酸序列的⑶RHl、具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的⑶RH2、具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的⑶RH3;包含的轻链可变区包含具有SEQID NO: 10的氨基酸序列的CDRLl、具有SEQ ID NO: 11的氨基酸序列的CDRL2、具有SEQ IDNO: 12的氨基酸序列的CDRL3，特征为所述抗体在根据Kabat编号重链可变区的54号位氨基酸处包含存在于Fab部分中的糖基化位点，其中组合物中连接于所述存在于Fab部分中的所述糖基化位点的碳水化合物中有至少65%携带至少一个末端唾液酸残基且/或连接于所述存在于Fab部分中的所述糖基化位点的碳水化合物中低于35%携带至少两个游离半乳糖单元。
23.根据权利要求22的抗体组合物，其中抗体具有所有以下特征 (i)所述抗体包含存在于Fe部分中的糖基化位点； ( )可选地，组合物中连接于Fe部分的碳水化合物中至少80%不携带果糖残基； (iii)组合物中连接于Fe部分的碳水化合物中至少80%不携带唾液酸残基； (iv)组合物中连接于Fe部分的碳水化合物中至少5%携带平分型N-乙酰葡萄糖胺残基; (v)组合物中连接于抗体的碳水化合物中至少70%携带至少一个半乳糖残基； (vi)连接于抗体的碳水化合物不包含具有结构Galα (I — 3) Gal β (I — 4) GlcNAc的Galili表位；以及 (vii)连接于抗体的碳水化合物不包含N-羟乙酰神经氨酸(NeuGc)残基。
24.根据权利要求17-23中任何一项的抗体组合物用于医疗的用途，优选地为用于癌症的治疗。
25.根据权利要求17-24中任何一项的抗体组合物，其为药用组合物。
26.根据权利要求20-23中任何一项的抗体组合物，用于在具有至少一个编码Fe Y RIII a-158F的等位基因的患者中治疗癌症。
27.根据权利要求20或21的抗体组合物，用于在Erbitux治疗失败后治疗癌症。
28.根据权利要求20或21的抗体组合物，用于治疗癌症，其中肿瘤细胞在EGFR信号转导通路中包含至少一个激活突变。
29.根据权利要求28的抗体组合物，其中激活突变产生组成型活化的K-Ras突变体、组成型活化的PI3激酶突变体或Raf激酶的过表达。
30.用于生产包含具有所需的循环半衰期的抗体或其功能片段或衍生物的抗体组合物的方法，其包括将所述抗体或其功能片段或衍生物在宿主细胞中表达的步骤，其中根据权利要求I的用于控制所述抗体或其片段或衍生物的半衰期的方法是使用所述方法的步骤(al)、步骤(a3)、步骤(bl)或步骤(b3)进行的，且/或该宿主细胞表达通过根据权利要求1的方法使用步骤(a2)或(b2)获得的抗体或其功能片段或衍生物。
31.根据权利要求30的方法，其中进行或已经进行了根据权利要求2-16中任何一项的方法。
32.根据权利要求30或31的方法，其中抗体组合物具有权利要求2-25中一项或多项中限定的一项或多项特征。
33.抗体或其功能片段或衍生物，其中所述抗体或其片段或衍生物中至少一个CDR的氨基酸序列来源于包含存在于Fe部分中的至少一个糖基化位点的参考抗体，且其中所述抗体或其片段或衍生物不包含在Fab部分中的糖基化位点，其中所述抗体或其片段或衍生物比参考抗体具有更高的循环半衰期。
34.根据权利要求33的抗体或其功能片段或衍生物，其具有一项或多项以下特征: (i)其与参考抗体结合相同的表位； ( )所述抗体或其片段或衍生物的重链可变区的所有三个CDR的氨基酸序列都来源于参考抗体； (iii)所述抗体或其片段或衍生物的轻链可变区的所有三个CDR的氨基酸序列都来源于参考抗体； (iv)所述抗体或其片段或衍生物的重链可变区的整段氨基酸序列和/或轻链可变区的整段氨基酸序列都来源于参考抗体； (v)所述抗体或其功能片段或衍生物的抗原结合亲和力类似于或高于参考抗体的抗原结合未和力； (vi)所述抗体或其功能片段或衍生物的循环半衰期比参考抗体的循环半衰期高出至少5%、优选地高出至少10%、至少15%、至少20%或至少25%; (vii)抗原结合亲和力降低不超过20%、优选地不超过15%、不超过10%或不超过5%; (viii)参考抗体选自抗-EGFR抗体如西妥昔单抗或与西妥昔单抗结合于相同表位的抗体、抗-Mucl抗体如Pankomab或与Pankomab结合于相同表位的抗体、抗_Αβ抗体如solanezumab以及抗-CD52抗体如阿仑单抗或与阿伦单抗结合于相同表位的抗体；以及(ix)参考抗体的Fab部分中的糖基化位点为N-糖基化位点，其优选地具有氨基酸序列Asn Xaa Ser/Thr,其中Xaa为任何氨基酸,优选地除了 Pro以外。
35.根据权利要求33或34的抗体或其功能片段或衍生物，其中参考抗体为抗-EGFR抗体，其包含 (i)包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDRHl、具有SEQID N0:2的氨基酸序列的CDRH2、具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDRH3的重链可变区； ( )可选地，包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDRLl、具有SEQ ID N0:5的氨基酸序列的⑶RL2、具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的⑶RL3的轻链可变区； (iii)存在于Fab部分中在根据Kabat编号重链可变区85号位氨基酸处的糖基化位点；以及 (iv)可选地，存在于F e部分在重链恒定区2的297号位氨基酸处的糖基化位点；或 其中参考抗体为抗-TA-Mucl抗体，其包含 (i)包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDRHl、具有SEQID NO:8的氨基酸序列的CDRH2、具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDRH3的重链可变区； ( )可选地，包含具有SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的CDRLl、具有SEQ ID N0:11的氨基酸序列的⑶RL2、具有SEQ ID NO: 12的氨基酸序列的⑶RL3的轻链可变区； (iii)存在于Fab部分中在根据Kabat编号重链可变区54号位氨基酸处的糖基化位点；以及 (iv)可选地，存在于Fe部分在重链恒定区2的297号位氨基酸处的糖基化位点；或 其中参考抗体为抗-CD52抗体，其包含 (i)包含具有SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的CDRHl、具有SEQID NO: 16的氨基酸序列的⑶RH2、具有SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的⑶RH3的重链可变区； ( )可选地，包含具有SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的CDRLl、具有SEQ ID N0:19的氨基酸序列的⑶RL2、具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的⑶RL3的轻链可变区； (iii)可选地，存在于Fab部分中在根据Kabat编号重链可变区60号位氨基酸处的糖基化位点；以及 (iv)可选地，存在于Fe部分在重链恒定区2的297号位氨基酸处的糖基化位点；或 其中嵌合抗体为抗-A β抗体，其包含 ⑴包含具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDRHl、具有SEQID Ν0:22的氨基酸序列的⑶RH2、具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的⑶RH3的重链可变区； ( )可选地，包含具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDRLl、具有SEQ ID N0:25的氨基酸序列的⑶RL2、具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的⑶RL3的轻链可变区； (iii)可选地，存在于Fab部分中在根据Kabat编号重链可变区55号位氨基酸处的糖基化位点；以及 (iv)可选地，存在于Fe部分在重链恒定区2的297号位氨基酸处的糖基化位点。
36.根据权利要求33-35中任何一项的抗体或其功能片段或衍生物，其中 (i)参考抗体Fab部分中的糖基化位点在重链或轻链可变区中，且 ( )所述抗体或其功能片段或衍生物的重链或轻链可变区的氨基酸序列与参考抗体的对应氨基酸序列差异为至少一个氨基酸，以移除重链或轻链可变区中的糖基化位点。
37.用于生产编码具有增加的循环半衰期的抗体或其功能片段或衍生物的核酸的方法，其包括步骤: (a)提供编码具有Fab部分中的糖基化位点的抗体或其功能片段或衍生物的核酸；以及 (b)向所述核酸中引入突变以移除所编码的抗体或其功能片段或衍生物的Fab部分中的糖基化位点。
38.可由根据权利要求37的方法获得的核酸。
39.用于生产具有增加的循环半衰期的抗体或其功能片段或衍生物的方法，其包括步骤: (a)提供编码具有Fab部分中的糖基化位点的抗体或其功能片段或衍生物的核酸； (b)向所述核酸中引入突变以移除所编码的抗体或其功能片段或衍生物的Fab部分中的糖基化位点。
(C)表达步骤(b)中获得的核酸以生产不具有Fab部分中的糖基化位点并比具有Fab部分中的糖基化位点的抗体或其功能片段或衍生物有更高循环半衰期的抗体或其功能片段或衍生物。
40.可由根据权利要求39的方法获得的抗体或其功能片段或衍生物。
41.抗体组合物，其包 含如权利要求33-36中一项或多项所限定的抗体或其功能片段或衍生物。
42.根据权利要求41的组合物，其中组合物中的抗体或其功能片段或衍生物具有如权利要求11和/或12所限定的在Fe部分中的糖基化形式。
全文摘要
本发明涉及用于通过调整连接于抗体Fab部分的碳水化合物中唾液酸的量而控制抗体半衰期的方法。进一步地，本发明提供了具有增加的循环半衰期的抗体。
文档编号C07K16/28GK103119064SQ201180039635
公开日2013年5月22日 申请日期2011年8月10日 优先权日2010年8月10日
发明者S·戈莱茨, A·丹尼尔奇克, L·施特克尔 申请人:葛莱高托普有限公司