专利名称：协同性生物分子-聚合物轭合物的制作方法
协同性生物分子-聚合物轭合物发明领域
本发明涉及新颖的协同性生物分子-聚合物轭合物，所述轭合物由永久-可断裂-链接聚合物或全部-可断裂-链接聚合物与生物活性分子的连接而产生，以协同性地增强被递送的生物分子的体内生物活性以及改善被递送的生物分子的药代动力学(PK)和药效动力学(PD)性质从而达到最佳的治疗效果。协同性生物分子-聚合物轭合物整合了大的和小的生物分子-聚合物轭合物在体内的药代动力学(PK)和药效动力学(PD)性质的优点。本发明还涉及新颖的协同性干扰素-α -聚合物(协同作用-干扰素-α -聚合物)轭合物，其是体内酶控制的、连续释放的和混合的干扰素协同作用体系，其增加生物活性并增强药理学性质，从而实现更大的干扰素- α相关的治疗。
发明背景
聚乙二醇(PEG)与生物活性分子的偶联，被称为“聚乙二醇化”(“Pegylation”)，用于递送生物活性分子，通常是蛋白质和小分子。该过程的至少一个优点是修改生物活性分子的药代动力学(PK)和药效动力学(ro)性质，并改善生物活性分子的治疗效果。聚乙二醇化增加蛋白质和小分子的大小和分子量，导致其在血浆中的半衰期的延迟。通常，聚乙二醇化可改变蛋白质和治疗分子的理化性质，导致母体蛋白质和治疗分子的生物活性下降。因此，期望优化PEG-蛋白质轭合物的PK和ro性质从而实现其最大的治疗效果。
在现有技术中已实现了将PEG与生物活性分子共价连接，包括直链和支链的PEG 聚合物。在绝大多数情况下，利用生物活性分子的氨基作为连接位点。Thompson等人的美国专利申请20030190304描述了聚乙二醇化试剂。Harris等人的美国专利7，030, 278 哈里斯等人描述了具有邻近的反应性基团的某些PEG衍生物。Martinez等人的美国专利5，643，575描述了某些非-抗原性支链聚合物轭合物。Huang等人的美国专利申请 20050033058描述了某些多臂PEG聚合物。Zalipsky的美国专利5，122，614公开了某些用于修饰多肽的活性碳酸酯。Gilbert等人的美国专利5，711，944描述了利用稳定(永久)的直链聚乙二醇进行轭合的干扰素聚合物轭合物。Milton等人的美国专利5，932，462描述了利用稳定的支链聚乙二醇进行轭合的干扰素聚合物轭合物。
分子质量低于50，000道尔顿的蛋白质药物通常在体内是短寿命物种，其具有约 5-20分钟的循环半衰期。蛋白质的清除经由几种机制，包括肾脏中的肾小球渗透、受体介导的内吞作用，和周边组织的降解，和在组织表面或通过血清蛋白酶的蛋白水解。再考虑到蛋白质药物无法口服吸收，延长治疗活性药物保持在循环中是临床上最重要的期望的特点。 然而，在低分子量肽和蛋白质药物的单一给药后很少能实现这种情况。实现本领域中描述的这种目的的至少一个策略是将这样的生物分子聚乙二醇化。然而，现有技术中聚乙二醇化方法的缺点是通过传统的永久支链或直链PEG化合物进行聚乙二醇化的蛋白质失去生物活性。这种生物活性的损失是由于连接至受关注的生物活性蛋白质的大的PEG聚合物所产生的空间位阻。例如，聚乙二醇化的干扰素，如`用于干扰素-α轭合的使用永久支链PEG 的派罗欣(Pegasys)或使用永久直链PEG的PEG-内含子(PEG-1ntron)分别只保留未修饰的干扰素a_2a和干扰素a _2b的抗病毒活性的7%和28%。对于许多治疗性蛋白质，生物活性的显著损失能导致很差的PK-ro谱，这往往限制了聚乙二醇化的治疗应用。PEG的数目和大小对蛋白质的生物活性、药代动力学和药效动力学性质具有显著影响。
在本领域中另一个悬而未决的问题是，通过允许聚合链接的受控降解循序延长短寿命蛋白质在体内的半衰期，是否会延长治疗性药物在体内的利用度，从而改善临床结果。 鉴于上述情况，期望有克服这些缺陷的生物分子-聚合物轭合物。本发明克服了现有技术中的这些缺点。
发明概述
本发明的至少一个方面提供了新颖的协同性生物分子-聚合物轭合物(Ia型、Ib 型、IIa型和IIb型)，其是经由可断裂-链接与支链或直链聚合物共价连接的生物分子。本申请中所用的协同性生物分子-聚合物轭合物是长效的、受控持续释放的和/或混合的协同体系，当在体内给药时，与相应的未轭合的生物分子相比，或者与经由不可断裂的链接与相同的聚合物轭合的生物分子相比，其增强生物分子的生物活性并改善生物分子的药理学性质。
本发明的至少一个方面涉及具有式I或II的协同性生物分子-聚合物轭合物
权利要求
1.协同性生物分子-聚合物轭合物，其包含下式(Pn----Ln----R----C) x——M 或[(P----L) n----R----C] x——M其中M是生物活性分子；其中X是与生物分子偶联的可断裂-链接聚合物的数目，且 x>l;其中η是n>2;其中P是聚合物或聚合物脂质；其中Pn是多个聚合的臂或片段，它们的类型和大小可以相同或不同；其中L是含有至少一个可断裂链接和至少一个永久链接的功能性链接部分；或Ln是全部可释放链接；其中R是连接聚合物和生物分子的不可断裂的间隔基；C是能够与生物分子连接的偶联基团。
2.权利要求1的协同性生物分子-聚合物轭合物，其中轭合的聚合物是永久-可断裂-链接支链聚合物(Ia型)。
3.权利要求1的协同性生物分子-聚合物轭合物,其中轭合的聚合物是全部-可断裂-链接支链聚合物(Ib型)。
4.权利要求1的协同性生物分子-聚合物轭合物，其中轭合的聚合物是永久-可断裂-链接直链聚合物(IIa型)。
5.权利要求1的协同性生物分子-聚合物轭合物,其中轭合的聚合物是全部-可断裂-链接直链聚合物(II b型)。
6.权利要求1的协同性生物分子-聚合物轭合物，其中所述永久链接选自由酰胺、氨基甲酸酯、碳酰胺、酰亚胺、胺、尿素、醚、氨基甲酸乙酯、硫化物、硫脲、硫代氨基甲酸酯、硫代碳酰胺和二硫代氨基甲酸酯组成的组；所述可释放的链接选自由羧酸酯、碳酸酯、磺酸酯、 磷酸酯，酰基咪唑并、氨基甲酸酯-咪唑并和二硫化物链接组成的组。
7.权利要求1的协同性生物分子-聚合物轭合物，其中所述可断裂链接是体内可断裂的、血浆可断裂的、可酶降解的、PH-诱导的可水解的、pH诱导的可自我断裂的、生理可断裂的、体内物质诱导的可断裂的、生化反应诱导的可断裂的或化学可断裂的。
8.权利要求7的协同性生物分子-聚合物轭合物，其中所述酶选自由酯酶、磷酸酶和硫酸酯酶组成的组。
9.权利要求1的协同性生物分子-聚合物轭合物，其中所述聚合的臂或片段Pn选自由聚(乙二醇)(PEG)、甲氧基聚乙二醇、烷基封端的聚(环氧乙烷)、聚(亚烷基氧化物)、 聚乙烯亚胺，聚(乙烯醇)、聚(丙二醇)、聚(氧乙基化甘油)、聚(氧乙基化葡萄糖)、聚 (氧乙基化多元醇)、聚(噁唑啉)、聚(氧乙基化山梨糖醇)、聚(丙烯酰吗啉)、聚(乙烯基吡咯烷酮)及其共聚物、三元共聚物和混合物组成的组。
10.权利要求1的协同性生物分子-聚合物轭合物，其中P是分子量为约50至约 40, 000的PEG聚合物。
11.权利要求10的协同性生物分子-聚合物轭合物，其中PEG聚合物的分子量为约 5000 至约 40，000。
12.权利要求1的协同性生物分子-聚合物轭合物，其中C是偶联部分，其选自由活性酯、混合酸酐、烷基醛、芳香族醛、马来酰亚胺、齒代乙酰基、羧酸、羟基、异氰酸酯、异硫氰酸酯、羰基、硫醇、二硫化物、氨基、羟基、酰肼和肼组成的组。
13.权利要求12的协同性生物分子-聚合物轭合物，其中所述活性酯选自由N-羟基琥珀酰亚胺酯、对硝基苯基酯、N-琥珀酰亚氨基碳酸酯、对-硝基苯基碳酸酯、酰基咪唑并或三氯苯基碳酸酯组成的组。
14.权利要求1的协同性生物分子-聚合物轭合物，其中R是氨基酸，其选自由赖氨酸、 丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、组氨酸、精氨酸、谷氨酸或天门冬氨酸组成的组；其中非 蛋白氨基酸选自由高半胱氨酸、高丝氨酸或鸟氨酸组成的组。
15.权利要求1的协同性生物分子-聚合物轭合物，其中所述n为2(n=2)且所述1型 协同性可断裂_支链聚合物轭合物包含下式
16.权利要求1的协同性生物分子_聚合物轭合物，其中所述n为2(n=2)且所述II 型协同性可断裂_直链聚合物轭合物包含下式(P2 ' L2 - P: - L: - R - C) x - M其中对于永久_可断裂_链接直链聚合物(Ila型)，U是永久链接且其中L2是可断裂 链接；其中对于全部-可断裂-链接直链聚合物(lib型)，U和L2均为可断裂链接。
17.权利要求1的协同性生物分子-聚合物轭合物，其中Pi和P2是甲氧基聚(乙二醇)；其中R是具有由下式表示的结构的与甲氧基聚乙二醇连接的赖氨酸
18.权利要求17的协同性生物分子-聚合物轭合物，其中游离氨基进一步与间隔基链 接，所述间隔基包含被活化的部分，其选自由N-羟基琥珀酰亚胺酯、对硝基苯基酯、N-琥 珀酰亚氨基碳酸酯、对硝基苯基碳酸酯、酰基咪唑并、醛、马来酰亚胺、卤代乙酰基、羧酸、羟 基、异氰酸酯、异硫氰酸酯、羰基、巯基、二硫化物、氨基、羟基、酰肼和肼组成的组。
19.用于制备永久_可断裂_链接聚合物、全部_可断裂_链接聚合物和非对称支链臂聚合物的合成方法，其包含经由使用mPEG-OH或mPEG衍生物的活化、偶联和酰基化操作在羧基上形成的可断裂链接，经由与mPEG亲电衍生物的酰基化、偶联和缩合在氨基上形成的永久链接，间隔基部分的插入和活化，以及用于合成可断裂-永久-混合链接的保护、脱保护操作。
20.权利要求17的协同性生物分子-聚合物轭合物，其中所述永久-可断裂链接支链 PEG衍生物包括Lys (a-1OK mPEG,氨基甲酸酯；20K mPEG酯)ε -琥珀酰亚氨基辛二酸酯， 化合物5。
21.权利要求17的协同性生物分子-聚合物轭合物，其中所述永久-可断裂链接支链 PEG衍生物包括Lys (α-1OK mPEG,酰胺；20K mPEG,酯)ε -琥珀酰亚氨基辛二酸酯，化合物6。
22.权利要求17的协同性生物分子-聚合物轭合物，其中所述永久-可断裂链接支链 PEG衍生物包括Lys ( ε-1OK mPEG,氨基甲酸酯；20K mPEG,酯)α -琥珀酰亚氨基辛二酸酯，化合物7。
23.权利要求17的协同性生物分子-聚合物轭合物，其中所述永久-可断裂链接支链 PEG衍生物是Lys ( ε -1OK mPEG,酰胺；20K mPEG,酯)α -琥珀酰亚氨基辛二酸酯，化合物 8。
24.权利要求17的协同性生物分子-聚合物轭合物，其中所述永久-可断裂链接支链 PEG衍生物是3-马来酰亚氨基丙酰基Lys (α-1OK mPEG，氨基甲酸酯)-20Κ mPEG酯，化合物9。
25.权利要求1的协同性生物分子-聚合物轭合物，其中所述轭合物能够是单一的组分或由多个组分组成的混合物；其中M是生物分子，其包括但不限于由蛋白质、糖蛋白、寡肽、多肽、酶、细胞因子、激素，抗体、单克隆抗体、抗体片段、单链抗体，核酸、DNA、RNA、RNA1、 SiRNA、寡核苷酸、低聚糖、多糖、激素、神经递质、碳水化合物、二糖、脂质、磷脂、糖脂、固醇、 核苷酸、细胞穿膜肽、药物和小分子组成的组。
26.权利要求1的协同性的生物分子-聚合物轭合物，其中M选自由细胞因子、阿尔法促红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、依那西普、干扰素、干扰素a _2a、干扰素 a-2b、干扰素alfacon-1、干扰素β _la、干扰素β _lb、干扰素Y _lb、白细胞介素、TNF-α、 胰岛素、尿激酶、链激酶、尿酸酶、超氧化物歧化酶、天门冬酰胺酶、精氨酸脱氨酶、葡糖脑苷脂酶、半乳糖苷酶、瑞替普酶、拉布立酶、艾杜糖醛酸酶、奥普瑞白介素、链道酶α、胶原酶、 阿尼普酶、半乳糖苷酶、阿加糖酶、生长因子、血红蛋白、凝血因子、凝血因子VI1、VIIa、VIII 和IX等组成的组。
27.权利要求1的协同性生物分子-聚合物轭合物，其中所述M是干扰素，其包括干扰素-α、干扰素_β、干扰素-Y、干扰素Y-1b的和干扰素-λ (干扰素拉姆达)。
28.权利要求1的协同性生物分子-聚合物轭合物，其中所述M是干扰素-α，其包括干扰素- a _2a、干扰素- a _2b、干扰素- α -1、干扰素alfacon-1和重组复合干扰素。
29.权利要求1的协同性生物分子-聚合物轭合物，其中所述M是干扰素-a-2b ;其中 R是具有如权利要求17中所描述的结构的赖氨酸；其中Pl和P2是mPEG而且每一个具有的分子量为约50至40，000 ;其中LI键是酰胺、氨基甲酸酯或胺链接且L2键是羧酸酯或碳酸酯链接。
30.权利要求1的协同性生物分子-聚合物轭合物，其中所述M是细胞因子；其中R是具有如权利要求17中所描述的结构的赖氨酸；其中Pl和P2是mPEG而且每一个具有的分子量为约50至40，000 ;其中L1键是酰胺、氨基甲酸酯或胺链接且L2键是羧酸酯或碳酸酯链接。
31.权利要求29或30中任一项的协同性生物分子-聚合物轭合物，其中所述赖氨酸具有选自由N-羟基琥珀酰亚胺酯、对硝基苯基酯、N-琥珀酰亚氨基碳酸酯、对硝基苯基碳酸酯和酰基咪唑并部分组成的组的被活化的部分。
32.权利要求29或30中任一项的协同性生物分子-聚合物轭合物，其中所述赖氨酸具有选自由用于特异性蛋白质N-末端轭合的烷基或芳香族醛组成的组的被活化的部分。
33.协同性干扰素α-30kPEG(10kmPEG氨基甲酸酯，20k mPEG酯)ε -辛二酸酯轭合物，其包含单一的成分，x=l。
34.权利要求33的协同性干扰素α-30kPEG(10kmPEG氨基甲酸酯，20k mPEG酯) ε -辛二酸酯轭合物，其中所述轭合物包含组成为X=1至2或X=1至3的混合物。
35.权利要求33或34中任一项的协同性干扰素α-30kPEG(10kmPEG氨基甲酸酯，20k mPEG酯)轭合物，其中所述干扰素α是干扰素α-2b。
36.权利要求1的协同性生物分子-聚合物轭合物，其是长效的、体内受控的持续释放的和混合的协同作用生物分子药物递送体系，提供增加的生物活性和增强的药理学性质， 以实现更大的治疗效果。
37.权利要求33的协同性生物分子-聚合物轭合物，其是长效的、体内酶控制的持续释放的和混合的干扰素_α协同作用体系，提供增加的干扰素活性和增强的药理学性质，以实现增加的、恒定的和持续的抗病毒活性。
38.权利要求1的协同性生物分子-聚合物轭合物，其中所述M是细胞因子或白细胞介素。
39.权利要求1的协同性生物分子-聚合物轭合物，其中所述M是凝血因子VII、VIIa、 VIII 或 IX。
40.一种治疗方法，包括向有需要的个体给予有效量的权利要求1的协同性生物分子-聚合物轭合物。
全文摘要
协同性生物分子-聚合物轭合物是长效的、体内受控的、持续释放的和混合的生物分子协同作用体系，其增加生物活性并增强药理学性质，以实现更大的治疗效果。
文档编号C07K17/00GK103068853SQ201180039895
公开日2013年4月24日 申请日期2011年8月19日 优先权日2010年8月19日
发明者李琦 申请人:Peg生物制药公司