一种广谱β-内酰胺酶荧光底物及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种可供检测个体中细菌耐药性的荧光检测方法中所用的广谱β-内酰胺酶荧光底物，其结构如下所示：实验结果表明，本发明提供的荧光底物C-2可准确的定性检测出不同样品中的抗头孢菌素的细菌，可用于临床或其他检测领域制备相应的诊断试剂或诊断试剂盒，具有广泛的应用空间和实用价值。
【专利说明】一种广谱β_内酰胺酶荧光底物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及药物合成领域，具体地说是涉及一种可用于检测广谱β内酰胺抗生素治疗的细菌耐药性的荧光底物及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]自从人类在上世纪20年代首次发现以青霉素为代表的β_内酰胺类抗生素以来，它们已经成为治疗细菌感染的一线药物，挽救了无数人的生命。同其它类别的抗生素相比，β -内酰胺类抗生素具有疗效高，毒性低的特性。但是，细菌也在不断的进化各种抗药机制。目前，抗药性细菌感染已经成为全球性的问题。特别是在中国，印度，已经其他一些国家，由于存在着滥用抗生素的现象，出现超级抗药性细菌，从而导致无药可治的可能性是不容忽视的。
[0003]细菌对抗β -内酰胺类抗生素的最主要机制是通过β -内酰胺酶实现的。它们可以有效的分解内酰胺类抗生素。为抵消这些酶的作用，在临床上可以采取了两种方法。第一，共同使用β_内酰胺类药物和β_内酰胺酶抑制剂。一些处方药利用这一策略，包括(氨苄青霉素+舒巴克坦)和(阿莫西林+克拉维酸钾)。第二是开发不被普通β_内酰胺酶降解的药物，比如许多第三和第四代的广谱头孢菌素。然而，抗生素的发展和抗药性细菌的出现是一个矛和盾的关系。目前，许多在临床上检测到的细菌已经具有了分解第三和第四代的头孢菌素的能力。这主要是由广谱内酰胺酶所造成的。
[0004]由于细菌耐药性的发展与误用/滥用抗生素是紧密相关的，为延长广谱抗生素的有效使用期，在临床上治疗细菌感染应该尽可能的做到对症下药，避免使用无必要的广谱抗生素。为了实现这一目标，快速，灵敏，和准确诊断细菌菌株对各种内酰胺类药物的药敏程度是必须的步骤。
[0005]在西方发达国家，抗生素的使用受到严格控制。但在中国，印度，以及发展中国家，抗生素被大大滥用和误用，其后果是抗药性细菌的不断出现。2009年在印度出现的新德里金属内酰胺酶，NDM-1，是一个典型的例子。这个蛋白质酶可以水解目前所有的β-内酰胺类抗生素。换句话说，含有NDM-1的细菌可以抵御任何β-内酰胺类抗生素。同时，由于全球的交通便利，在一地得到的抗药性细菌可以很容易的传播到世界各地，从而造成大规模的微生物感染。
[0006]为尽可能的延缓抗药性细菌的出现和延长现有抗生素的使用寿命，防止抗生素的滥用和误用是一个有力的手段。这要求在临床治疗细菌感染过程中，能够尽快确定细菌对不同抗生素的抗药和敏感程度，以防止过分使用，或者无效使用抗生素。另外，在治疗败血症病人时，由于及早使用正确的抗生素和病人的生存率直接挂钩，这也需要尽快确定细菌对不同抗生素的抗药和敏感程度。
[0007]β -内酰胺类抗生素被广泛应用在临床和畜牧业中用来治疗细菌感染。特别是第三四代头孢菌素是一线抗生素药物。但是，广谱内酰胺酶的出现使得三四代头孢菌素不再是治疗细菌感染的万能妙药。在临床上迫切需要一种快速的能够确定细菌是否对三四代头孢菌素具有抗药性的分析方法。利用β-内酰胺酶的荧光底物来检测β-内酰胺酶的存在是一个普遍的分析方法。事实上，目前许多现有的荧光β-内酰胺酶的底物可以做到高灵敏度和实时的对β-内酰胺酶进行检测。然而，所以这些分子都不具有选择性，即不可能区分普通和广谱β-内酰胺酶。
[0008]由于含有普通内酰胺酶的细菌对第三四代广谱头孢菌素敏感，而含有广谱β_内酰胺酶的细菌对第三四代广谱头孢菌素具有抗药性。我们希望能够有一种快捷的方法来区分这两类细菌，从而可以尽快确定临床细菌感染是否可以用第三四代广谱头孢菌素来治疗。
[0009]目前，国内外用来检测细菌抗药性的方法可以分成3大类。
[0010]第一类是基于传统的微生物培养技术，又可以分为液体培养基和固态培养基的方法。液体培养基方法可以准确测定一种抗生素的最低抑菌浓度。但是，当待测抗生素品种较多时，此方法工作量大，所以已经逐渐被固态培养基方法所取代。固态培养基方法又可以分为若干类，主要有纸片扩散法，E-test，等等。比如，在纸片扩散中，不同的抗生素药片被放置在固态培养基表面。当细菌在培养基表面生长时，如果对某种抗生素敏感，这在此药片周围形成一个清晰的环状无菌带。其大小受细菌对抗生素的敏感程度所决定。如果细菌对此抗生素有抗药性，这不会形成此无菌带。这类基于微生物培养技术的方法目前是细菌抗药性检测的主流方法。但是，由于细菌生长需要时间，此类方法至少需要48-72小时。对于生长缓慢的细菌，比如结核分支杆菌，需要的时间更长，因此对于需要尽快知道细菌抗药性的情况，例如败血症病人的治疗， 这类方法无法及时提供选择抗生素的必要信息。
[0011]第二类方法是基于聚合酶链反应的基因方法。病人样品可以用针对β -内酰胺酶基因的特定探针进行基因扩增，然后来检测得到抗药性的基因变异。此类方法快速，灵敏。但是，由于此类方法不是功能性测定，所以只能用来检测已知的耐药机制，而不能确定以往未知的全新抗药机理。
[0012]第三类方法是直接测定β -内酰胺酶的降解β -内酰胺类抗生素的功能。目前有多种内酰胺酶的荧光底物可以选择。这类底物本身没有荧光，但是，当它们被内酰胺酶分解后，会有荧光产品出现。通过观测荧光强度变化，可以确定内酰胺酶的存在。但是，现有内酰胺酶底物无法区分普通和广谱内酰胺酶。所以并不能够起到指导抗生素选择的作用。
[0013]概括而言，虽然目前的相关技术在它们的适用领域中有无可取代的位置，但在特定的应用中，特别是在处理治疗败血症病人的过程中，它们也有着种种局限。所以，一种可以快速区分普通和广谱β_内酰胺酶的检验方法是迫切需要的。在国内外尚无同类产品。类似产品有日本Kanto Chemical公司生产的Cica-β-test试剂。Cica-β-test试剂也可以用来检测细菌是否对三四代头孢菌素具有抗药性。但是，由于Cica-β -test试剂检测依赖于颜色变化(阳性样品的颜色从黄色变到红色)，灵敏度至少要比本产品的荧光检测法低一个数量级。另外一个类似产品是美国Life Technologies公司生产的GeneBLAze试剂。GeneBLAze试剂也是基于荧光检测，但是，此试剂只能用来无差别的检测所有的β-内酰胺酶的存在，而不能特异性的检测能够降解三四代头孢菌的广谱内酰胺酶。此外，GeneBLAze试剂只是一个研究用产品，用来进行一些真核细胞的光学显像实验，而不是在临床上用于检测细菌抗药性。
【发明内容】
[0014]早期的青霉素以及一二代的头孢菌素能够被普通β -内酰胺酶所分解，所以含有普通内酰胺酶的细菌对它们具有抗药性。但是，在只有普通内酰胺酶存在的情况下，第三和第四代头孢菌素是稳定的。这主要是因为第三和第四代头孢菌素的内酰胺环上有一个特殊的取代基，对普通β -内酰胺酶有巨大的位阻作用，所以普通β -内酰胺酶不能有效的分解三四代头孢菌素。换句话说，只含有普通内酰胺酶的细菌对三四代头孢菌素敏感。然而，广谱内酰胺酶，包括金属内酰胺酶以及由普通内酰胺酶突变而来的超广谱β内酰胺酶，不受此取代基的影响，因而可以有效的降解三四代头孢菌素。
[0015]以往的β -内酰胺酶的荧光底物不具有在三四代头孢菌素上的特殊取代基，所以它们可以同时被普通和广谱β -内酰胺酶所分解。因此它们可以检测所有的β -内酰胺酶，但是无法区分这两类的内酰胺酶。
[0016]解决上述技术问题可通过设计并合成一种全新的内酰胺酶的荧光底物，此底物的化学结构包含了在三四代头孢菌素上的特殊取代基。所以，它对普通内酰胺酶稳定，但是可以被广谱内酰胺酶所降解，从而得到可以观察到的荧光信号变化。因此，在临床上使用时，可以特定检测到含有广谱内酰胺酶的抗药性细菌。
[0017]根据此想法和思路，发明人通过反复的实验研究与分析和理论探索，已成功得到预期的研究结果和应用产品细菌耐药性荧光检测试剂盒。
[0018]本发明的目的之一是提供一种新的广谱β -内酰胺酶荧光底物，其具体结构式如下所示的化合物或所述化合物的对映体、消旋体或非对映异构体:
[0019]
【权利要求】
1.一种广谱β-内酰胺酶荧光底物，其特征在于:所述广谱β-内酰胺酶荧光底物的具体结构式如下所示的化合物或所述化合物的对映体、消旋体或非对映异构体:
2.一种制备权利要求1所述广谱β_内酰胺酶荧光底物的方法，其特征在于，包括如下具体步骤A~Ε、Β~E、C~E或D~Ε,具体化学反应式如下所示:
3.根据权利要求2所述的制备广谱β-内酰胺酶荧光底物的方法，其特征在于:步骤A操作为:以头孢噻肟钠为原料在酸性条件下溶解，加入二苯基重氮甲烷，调节pH值到9后，萃取提取；洗涤有机层，干燥，除去溶剂；经硅胶柱分离纯化，收集组分除去溶剂后得到化合物I ; 步骤B操作为:将2-(1Η-苯并三唑-1-基)-1，1,3, 3-四甲基咪唑六氟磷酸盐、1-羟基-苯并三唑、二异丙基乙胺、加入化合物I和三苯甲基甘氨酸混合溶解，搅拌，反应完成后，将反应液提取，洗涤有机层浓缩后，经硅胶柱分离纯化，收集组分除去溶剂后得到化合物2 ; 步骤C操作为:三异丙基硅烷和三氟乙酸加入到含有化合物2的二氯甲烷溶液中，搅拌，除去溶剂后洗涤，然后溶解在乙腈和磷酸钠缓冲液中，加入从新鲜桔皮中提取的乙酰酯酶后，混合物搅拌，除去乙酰酯酶，滤液浓缩，调PH值至3.5左右，缓慢加入Ph2CN2和乙腈，搅拌，调整pH值至8.9，用乙酸乙酯提取两次，有机层加入三苯甲基甘氨酸的羟基琥珀酼亚胺脂，并用高效液相色谱法来监测反应进程，反应完成后，混合物用盐水洗涤三次后，浓缩除去溶剂后重新溶解于二氯甲烷中，继续加入4-硝基苯基氯和吡啶，搅拌，反应结束后，经硅胶柱分离纯化，收集组分除去溶剂后得到化合物3 ； 步骤D操作为:化合物4溶解于含有二异丙基乙胺的二甲基甲酰胺中，然后加入化合物3，混合物在0° C下搅拌用胶柱纯化分离洗脱，得到化合物5 ； 步骤E操作为:三异丙基硅烷和三氟乙酸加入到含化合物4的正己烷中，搅拌，除去溶剂，用二氯甲烷洗涤3次后重新溶解在二甲基亚砜中，然后加入化合物6和二异丙基乙胺，搅拌，反应结束后，通过制备高效液相色谱纯化，用岛津高效液相色谱法在540nm波长检测，收集组分得到化合物7，即所述的β -内酰胺酶荧光底物。
4.根据权利要求3所述的制备广谱β-内酰胺酶荧光底物的方法，其特征在于，所述步骤A具体反应为:以头孢噻肟钠为原料加入I毫摩尔的盐酸和甲苯磺酸溶解在乙腈和水溶液中，加入二苯基重氮甲烷，在0° C下混合搅拌直到特征的紫色消失；在混合物中加入氢氧化钠溶液调节PH值到9后，用乙酸乙酯萃取提取；有机层先后用水和饱和盐水洗涤，干燥，在用旋转蒸发仪除去溶剂；富集物用30%正己烷-乙酸乙酯在50克的硅胶柱上进行分离纯化，收集组分干燥。
5.根据权利要求3所述的制备广谱β-内酰胺酶荧光底物的方法，其特征在于，所述步骤B具体反应为:在乙腈溶液中添加2-(1!1-苯并三唑-1-基)-1，1,3, 3-四甲基咪唑六氟磷酸盐，1-羟基-苯并三唑和二异丙基乙胺，然后在-20° C下加入化合物I和三苯甲基甘氨酸，混合物在-20° C下搅拌，然后自然升温到0° C，并继续反应，反应完成后，将反应液倒入含冰水和2Μ HCl的混合液中，用100毫升的二氯甲烷提取，有机层用饱和盐水洗两次，干燥，然后旋转蒸发浓缩得到淡黄色固体，所述淡黄色固体经硅胶柱以15%乙酸乙酯-正己烷洗脱纯化，收集组分用干燥。
6.根据权利要求3所述的制备广谱β-内酰胺酶荧光底物的方法，其特征在于，所述步骤C具体反应为:三异丙基硅烷和三氟乙酸在-20° C分别加入到含有化合物2的二氯甲烷溶液中，混合物在0° C下搅拌，除去溶剂后以干燥乙醚洗涤三次，然后溶解在乙腈和磷酸钠缓冲液(pH值=6.5)中，继续加入从新鲜桔皮中提取的乙酰酯酶后，混合物搅拌过夜，加入丙酮沉淀乙酰酯酶，得到的黄色滤液浓缩，用稀盐酸(0.8摩尔/升)酸化至pH值3.5左右，缓慢加入Ph2CN2和乙腈，搅拌0.5小时后，溶液调整pH值至8.9，用乙酸乙酯提取两次，有机层加入三苯甲基甘氨酸的羟基琥珀酼亚胺脂，并用高效液相色谱法来监测反应进程，反应完成后，混合物用盐水洗涤三次后，浓缩除去溶剂；黄色油状产物被重新溶解于二氯甲烷中，继续加入4-硝基苯基氯和吡啶，混合物在-20° C下搅拌，反应结束后，将产物加载到硅胶柱上用25%丙酮一正己烷洗脱纯化，收集组分旋干燥。
7.根据权利要求3所述的制备广谱β-内酰胺酶荧光底物的方法，其特征在于，所述步骤D具体反应为:化合物4溶解在含有二异丙基乙胺的二甲基甲酰胺中，然后加入化合物3，混合物在0° C下搅拌用胶柱纯化，并用25%丙酮一正己烷洗脱后收集。
8.根据权利要求3所述的制备广谱β-内酰胺酶荧光底物的方法，其特征在于，所述步骤E具体反应为:三异丙基硅烷和三氟乙酸加入到含化合物4的正己烷中，搅拌，除去溶剂，用二氯甲烷洗涤3次后重新溶解在二甲基亚砜中，然后加入化合物6和二异丙基乙胺，在0° C下搅拌，反应结束后，通过制备高效液相色谱纯化，用岛津高效液相色谱法在540nm波长检测，收集组分冷冻干燥。
9.一种权利要求1所述的广谱β -内酰胺酶荧光底物的应用，其特征在于:所述是广谱β_内酰胺酶荧光底物用于制备检测个体耐药性的诊断检测试剂或诊断检测试剂盒。
10.根据权利要求8所述的广谱β-内酰胺酶荧光底物的应用，其特征在于:所述的诊断检测试剂或诊断检测试剂盒`于检测β_内酰胺类抗生素的个体耐药性。
【文档编号】C07K5/062GK103509083SQ201210219507
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2012年6月28日 优先权日:2012年6月28日
【发明者】王郁生 申请人:王郁生