专利名称：丁二磺酸腺苷蛋氨酸的制备方法
技术领域：
本发明涉及丁二磺酸腺苷蛋氨酸的制备方法。
背景技术：
某些微生物可以在细胞内积累丁二磺酸腺苷蛋氨酸，通过这些微生物，特别是在培养基中加入一定量的前体物质L-蛋氨酸，菌体的合成能力大大加强。当前，通过微生物发酵进而提取丁二磺酸腺苷蛋氨酸，仍是工业化生产的主要途径，但目前工艺发酵周期长，步骤繁琐。
发明内容
本发明的目的在于提供一种丁二磺酸腺苷蛋氨酸的制备方法。根据本发明的一个方面，提供丁二磺酸腺苷蛋氨酸的制备方法对菌株酿酒酵母依次进行活化、种子培养、发酵和精制后得丁二磺酸腺苷蛋氨酸成品。在一些实施方式中，包括以下步骤(I)、将菌株酿酒酵母接入平板培养基中，培养温度26 30°C，6 8天后，再将单菌落移至斜面培养基中，培养温度26 30°C，时间6 8天,得斜面孢子。(2)、用无菌的接种环挖取0. 5 Icm2步骤(I)所得的斜面孢子至一级种子培养基中，培养温度为26 30°C，培养时间为20 30h ;再将一级种子接种至下一级种子培养基中，培养温度26 30°C，培养时间为20 30h，每一级种子的接种量为I 20% ；(3)、将步骤(2)所得的最后一级种子接入发酵培养基中，接种量为10 30%，培养温度26 30°C，罐压0 0. 05MPa，风量为1:1 1:2(V: V)，发酵过程中pH控制在3. 5
6.0，发酵开始后即补入葡萄糖水，葡萄糖水的浓度为200 400g/L，控制总糖在0. 3
3.0g/100ml，发酵24h后再补充三磷酸腺苷和L-蛋氨酸，三磷酸腺苷的补入重量为发酵培养基量的0. 5 2. 5%，L-蛋氨酸的补入重量为发酵培养基量的0. 5 I. 5%，发酵48 72h后得到腺苷蛋氨酸发酵液；(4)、在步骤(3)所得的腺苷蛋氨酸发酵液中添加防腐剂和助滤剂对酵母细胞进行破壁，破壁后的发酵液通过板框进行过滤，得腺苷蛋氨酸清液；(5)、将步骤(4)所得到的腺苷蛋氨酸清液通过超滤膜，得腺苷蛋氨酸超滤液，再将腺苷蛋氨酸超滤液通过纳滤膜进行浓缩，得腺苷蛋氨酸纳滤液；(6)、将步骤(5)所得到的腺苷蛋氨酸纳滤液用工业色谱进行分离，流动相采用有机溶剂作为洗脱体系，将纯化分离得到的收集液减压浓缩得腺苷蛋氨酸浓缩液；再在腺苷蛋氨酸浓缩液中加入丁二磺酸后进行喷雾干燥或冷冻干燥，得到丁二磺酸腺苷蛋氨酸成品。在一些实施方式中，步骤(I)中的平板培养基配方和斜面培养基配方均为2. 0%重量份的葡萄糖、0. 5%重量份的酵母膏、0. 1%重量份的氯化钠、2. 0%重量份的琼脂，余量为蒸馏水。在一些实施方式中，步骤(2)中的种子培养基配方为2.0%重量份的葡萄糖，1.0%重量份的蛋白胨，0. 2%重量份的酵母粉，0. 4%重量份的磷酸氢二钾，余量为饮用水。在一些实施方式中，步骤(3)中的发酵培养基的配方为2. 0%重量份的葡萄糖，
I.5%重量份的酵母粉，0. 4%重量份的磷酸氢二钾，2. 0%重量份的硫酸铵，余量为饮用水。
在一些实施方式中，步骤(4)中的防腐剂为苯甲酸及其盐类、山梨酸及其盐类或尼泊金酯类，每100升腺苷蛋氨酸发酵液中添加的防腐剂重量为0. 05 lKg，助滤剂为珍珠岩,每100升腺苷蛋氨酸发酵液中添加的助滤剂重量为0. 5 5Kg。在一些实施方式中，步骤(5)中超滤膜的截留分子量为5000 20000，选自聚砜、聚醚砜、聚氯乙烯、聚砜酰胺、磺化聚砜或交聚乙烯醇，纳滤膜的截留分子量为100 1000，选自醋酸纤维素、磺化聚砜、磺化聚醚砜或聚乙烯醇。在一些实施方式中，步骤(6)中的工业色谱柱为反相色谱柱，色谱柱填料为> 3um的十八烷基硅烷键合硅胶，洗脱流动相为有机溶剂如乙腈、甲醇或异丙醇与水的混合液，比如含5 15%甲醇的水混合液，含5 30%乙腈的水混合液，含有5 30%异丙醇的水混合液，恒流泵流速> 50ml/min，采用紫外检测器检测相关物质，吸收波长设定范围在240 280nm。在一些实施方式中，步骤(6)中的腺苷蛋氨酸与丁二磺酸质量比为I :0. 8 I. 2。在一些实施方式中，步骤(6)中干燥方法为喷雾干燥法或冷冻干燥法，喷雾干燥法中喷塔温度60 80°C，流速大于0. lL/h，喷雾干燥时间5 7h，冷冻干燥法中预冻温度(-35°C,，真空度为I 10pa，加热温度在5°C 40°C，冷冻干燥时间30 40h。在一些实施方式中，步骤(6)中减压浓缩温度彡60°C，真空度彡-0. 08Mpa。在一些实施方式中，酿酒酵母为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ATCCl1909。斜面培养基是通过以下方法制成的先将琼脂称好后放入搪瓷杯中，加入适量蒸馏水煮沸使其溶化。再将其他成分称好后放入小烧杯中，加少量水搅拌使其溶解后，倒入搪瓷杯中混匀，最后定容至所需体积，用2N盐酸调pH至7. 0，分装到20 X 200的试管中，装样量为15 30ml。塞上棉塞，消毒。消毒后搁成斜面，冷却后即可用于斜面制备。将本发明制得的丁二磺酸腺苷蛋氨酸成品采用高效液相色谱法测定，色谱条件如下色谱柱为C18柱,洗脱液为甲酸铵水溶液，流速为I. Oml/min,检测波长为260nm,注入体积为20uI,色谱柱温度为常温。本发明具有以下优点和效果通过对菌株酿酒酵母依次进行种子培养、发酵和精制后得丁二磺酸腺苷蛋氨酸成品，发酵周期短，分离效果好，产品纯度高。
具体实施例方式实施例一I、制备斜面先称取20g琼脂放入搪瓷杯中，加入适量蒸馏水煮沸使其溶化。再称取20g葡萄糖、5g酵母膏和Ig氯化钠放入小烧杯中，加少量水搅拌使其溶解后，倒入搪瓷杯中混匀，最后定容1L，用211101/1盐酸调？11至7.0，装入20\200的试管中，装样量为20ml。塞上棉塞，搁成斜面，冷却后即得斜面培养基。2、制备斜面孢子将菌株Saccharomyces cerevisiae ATCC11909接入平板培养基中，培养温度26°C，6天后，再将单菌落移至步骤I所得的斜面培养基中，培养温度26°C，时间6天，得斜面孢子，平板培养基配方为2. 0%重量份的葡萄糖、0. 5%重量份的酵母膏、0. 1%重量份的氯化钠、2. 0%重量份的琼脂，余量为蒸馏水。3、一级种子用无菌的接种环挖取0. 5cm2步骤2所得的斜面孢子至装有80ml —级种子培养基的500ml摇瓶中，再将摇瓶放入北京安必升科技发展有限公司生产的型号为Y45H摇床内，摇床转数220n，培养温度26°C，时间20h，一级种子培养基的配方为2. 0%重量份的葡萄糖，I. 0%重量份的蛋白胨，0. 2%重量份的酵母粉，0. 4%重量份的磷酸氢二钾，余量为饮用水，得一级种子。4、二级种子将步骤3所得的一级种子以10%的接种量接入装有8L 二级种子培养基的15L种子罐中，培养温度26°C，时间20h，二级种子培养基的配方为2. 0%重量份的葡萄糖，I. 0%重量份的蛋白胨，0. 2%重量份的酵母粉，0. 4%重量份的磷酸氢二钾，余量为饮用水，得二级种子。5、发酵培养将步骤4所得的二级种子以10%的接种量接入装有80L发酵培养基中的200L发酵罐中，培养温度26°C，罐压0. 05MPa,风量为1:1(V: V)，发酵过程中pH控制在
4.5 6. 0,发酵Imin开后即补入葡萄糖水,葡萄糖水的浓度为250g/L,控制总糖在0. 3 3. 0g/100ml，发酵24h后再补充三磷酸腺苷和L-蛋氨酸，三磷酸腺苷的补入重量为发酵培养基重量的0. 8%，L-蛋氨酸的补入重量为发酵培养基重量的0. 8%。发酵64h后得到腺苷蛋氨酸发酵液。发酵培养基的配方为2. 0%重量份的葡萄糖，I. 5%重量份的酵母粉，0. 4%重量份的磷酸氢二钾，2. 0%重量份的硫酸铵,余量为饮用水。6、取步骤5所得的腺苷蛋氨酸发酵液100L，在发酵液中加入防腐剂苯甲酸钠100g，助滤剂珍珠岩500g，搅拌2小时进行破壁；破壁后的发酵液通过昆山市昆工环保机械有限公司生产的型号为Y5/450-25板框式压滤机过滤，得到腺苷蛋氨酸清液120L，腺苷蛋氨酸浓度2. 5mg/ml。在其它的实施例中防腐剂还可以采用苯甲酸、山梨酸及其盐类或尼泊
金酯类。7、将步骤6得到的腺苷蛋氨酸清液通过超滤膜过滤，过截留分子量20000的超滤膜，超滤膜材质为聚砜，收集滤液，结束后用去离子水水洗，得腺苷蛋氨酸超滤液体积150L，腺苷蛋氨酸浓度2. 0mg/mlo8、将步骤7得到的腺苷蛋氨酸超滤液，通过截留分子量200的纳滤膜，纳滤膜材质为磺化聚砜，得腺苷蛋氨酸纳滤液体积2. 1L，腺苷蛋氨酸浓度136mg/ml。9、取步骤8所得的腺苷蛋氨酸纳滤液0. 5L，加入等体积的甲醇溶液，混合溶液进样上反向色谱柱，色谱柱填料采用10 y m的十八烷基硅烷键合硅胶，使用乙腈水=10 90作为流动相进行洗脱，流速为150ml/min，收集腺苷蛋氨酸洗脱液。10、将步骤9中所得的腺苷蛋氨酸洗脱液真空浓缩，浓缩温度50°C，浓缩真空度-0. 08Mpa，得浓度为251mg/ml的腺苷蛋氨酸浓缩液。11、在步骤10收集到的腺苷蛋氨酸浓缩液中加入丁二磺酸，腺苷蛋氨酸解析液与丁二磺酸质量比为1:0. 8 ;再对该混合物冷冻干燥，预冻温度为-40°C，真空度为5pa，加热温度在40°C，干燥时间30h，得到丁二磺酸腺苷蛋氨酸成品412. Og。12、将步骤11制得的丁二磺酸腺苷蛋氨酸成品采用高效液相色谱法测定，色谱条件如下色谱柱为C18柱，洗脱液为甲酸铵水溶液，流速为I. Oml/min,检测波长为260nm，注入体积为20ul，色谱柱温度为常温。样品纯度为99. 71% (见表一)。表一 丁二磺酸腺苷蛋氨酸样品HPLC测定结果
权利要求
1.丁二磺酸腺苷蛋氨酸的制备方法，其中，对菌株酿酒酵母依次进行种子培养、发酵和精制后得丁二磺酸腺苷蛋氨酸成品。
2.根据权利要求I所述的丁二磺酸腺苷蛋氨酸的制备方法，其中，所述种子培养步骤包括 (1)、将菌株酿酒酵母接入平板培养基中，培养温度26 30°C，6 8天后，再落移至斜面培养基中，培养温度26 30°C，时间6 8天，得斜面孢子； (2)、用无菌的接种环挖取0.5 Icm2步骤(I)所得的斜面孢子至一级种子培养基中，在26 30°C温度下培养20 30小时；再将一级种子接种至下一级种子培养基中，在26 30°C温度下培养20 30小时，每一级种子的接种量为I 20% ； 所述发酵步骤包括 (3)、将步骤(2)所得的最后一级种子接入发酵培养基中，接种量为10 30%，培养温 度26 30°C，罐压0 0. 05MPa，风量为体积比1:1 1: 2，发酵过程中pH控制在3. 5 6. 0，发酵开始后即补入葡萄糖水，葡萄糖水的浓度为200 400g/L，控制总糖在0. 3 3. 0g/100ml，发酵24小时后再补充三磷酸腺苷和L-蛋氨酸，三磷酸腺苷的补入量为发酵培养基重量的0. 5 2. 5%, L-蛋氨酸的补入量为发酵培养基重量的0. 5 I. 5%,发酵48 72h后得腺苷蛋氨酸发酵液； (4)、在步骤(3)所得的腺苷蛋氨酸发酵液中添加防腐剂和助滤剂对酵母细胞进行破壁，破壁后的发酵液通过板框进行过滤，得到腺苷蛋氨酸清液； 所述精制步骤包括 (5)、将步骤(4)所得到的腺苷蛋氨酸清液通过超滤膜，得腺苷蛋氨酸超滤液，再将腺苷蛋氨酸超滤液通过纳滤膜进行浓缩，得腺苷蛋氨酸纳滤液； (6)、将步骤(5)所得到的腺苷蛋氨酸纳滤液用工业色谱进行分离，流动相采用有机溶剂作为洗脱体系，将纯化分离得到的收集液减压浓缩得腺苷蛋氨酸浓缩液；再在腺苷蛋氨酸浓缩液中加入丁二磺酸后进行喷雾干燥或冷冻干燥，得到丁二磺酸腺苷蛋氨酸成品。
3.根据权利要求2所述的丁二磺酸腺苷蛋氨酸的制备方法，其中，步骤(2)中所述的种子培养基配方为2. 0%重量份的葡萄糖，I. 0%重量份的蛋白胨，0. 2%重量份的酵母粉，0. 4%重量份的磷酸氢二钾，余量为饮用水。
4.根据权利要求2所述的丁二磺酸腺苷蛋氨酸的制备方法，其中，步骤(3)中所述的发酵培养基的配方为2. 0%重量份的葡萄糖，I. 5%重量份的酵母粉，0. 4%重量份的磷酸氢二钾,2. 0%重量份的硫酸铵,余量为饮用水。
5.根据权利要求2所述的丁二磺酸腺苷蛋氨酸的制备方法，其中，步骤(4)中所述的防腐剂为苯甲酸及其盐类、山梨酸及其盐类或尼泊金酯类，每100升腺苷蛋氨酸发酵液中添加的防腐剂重量为0. 05 lKg，助滤剂为珍珠岩，每100升腺苷蛋氨酸发酵液中添加的助滤剂重量为0. 5 5Kg。
6.根据权利要求2所述的丁二磺酸腺苷蛋氨酸的制备方法，其中，步骤(5)中所述的超滤膜的截留分子量为5000 20000，选自聚砜、聚醚砜、聚氯乙烯、聚砜酰胺、磺化聚砜或聚乙烯醇，所述纳滤膜的截留分子量为100 1000，选自醋酸纤维素、磺化聚砜、磺化聚醚砜或聚乙烯醇。
7.根据权利要求2所述的丁二磺酸腺苷蛋氨酸的制备方法，其中，步骤(6)中所述的工业色谱柱为反相色谱柱，色谱柱填料为> 3um的十八烷基硅烷键合硅胶，洗脱流动相有机溶剂为乙腈、甲醇、异丙醇，流速彡50ml/min。
8.根据权利要求2所述的丁二磺酸腺苷蛋氨酸的制备方法，其中，步骤(6)中所述腺苷蛋氨酸浓缩液与丁二磺酸质量比为I :0. 8 I. 2，所述喷雾干燥法中喷塔温度60 80°C，流速大于0. lL/h，喷雾干燥时间为5 7h，所述冷冻干燥法中预冻温度< _35°C，真空度为I 10pa，加热温度在5°C 40°C，干燥时间为30-40h。
9.根据权利要求2所述的丁二磺酸腺苷蛋氨酸的制备方法，其中，步骤(I)中所述的平板培养基配方和斜面培养基配方均为2. 0%重量份的葡萄糖、0. 5%重量份的酵母膏、0. 1%重量份的氯化钠、2. 0%重量份的琼脂，余量为蒸馏水。
10.根据权利要求I或2所述的丁二磺酸腺苷蛋氨酸的制备方法，其中，所述酿酒酵母为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) ATCC 11909。
全文摘要
本发明公开了一种丁二磺酸腺苷蛋氨酸的制备方法，对菌株酿酒酵母依次进行种子培养、发酵和精制后得丁二磺酸腺苷蛋氨酸成品。本发明优点在于发酵周期短，分离效果好，产品纯度高。
文档编号C07H1/06GK102747123SQ20121026977
公开日2012年10月24日 申请日期2012年7月31日 优先权日2012年7月31日
发明者付静, 史佳栋, 张莹, 徐建国, 朱培硕 申请人:无锡福祈制药有限公司