专利名称：多酚类物质的精制方法及根据该方法提取的多酚成分应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种或多种功能性多酚类物质的精制提纯方法，以及根据该精制方法提取得到的功能性多酚成分的应用。
背景技术：
多酚类物质在抗菌、抗病毒、抗氧化、消除活性氧、降低胆固醇、消臭、改善肠道、抗厌食、抗动脉硬化、抗癌、抗过敏、抑制黑色素生成等领域，具有非常广泛的生理作用，在食品、食品素材、食品添加剂、饲料添加剂、化妆品素材、医药等领域的原料和配料中也广泛地被使用。现在，能被工业化利用的主要是儿茶素类，类黄酮类，查尔酮类，单宁类等为代表的功能性多酚类物质，但是也只是由原料直接提取的初级产物。因此，现在大部分被使用的功能性多酚类物质，是由多酚的衍生物或多酚类的聚合物等成分混在一起的组成物。通过最近的研究发现，有较大范围分子量分布的多酚类物质，根据分子量大小的差异在生物体内的活性效果也是有很大差异的。例如通常被认为非常有用的原花青素中，分子量的大的聚合物(譬如10个以上单元的聚合体)由于很难被吸收，其效果要比2 3个聚合体单元的效果要低。但是从稳定性方面考虑，有时候分子量较大的聚合物要比2 3个单元的聚合体要高的多。
为了得到功能性更高和更有效的活性多酚类成分，一般都是必须用逆相系的色谱分离法，导致成本很高，很难被工业化利用。利用聚苯乙烯或是苯乙烯二乙烯基苯类的吸附树脂，得到原花青素的制造方法(特开昭63 - 162685号)及多酚的制造方法(特平6 — 300578号)等被相继公开。但是，这些技术不是用来单独分离不同种类的原花色素和多酚类物质的，而是如何把不同种类的原花青素和多酚类物质一起提取的技术。另外，上述原花青素的制造方法是针对聚苯乙烯吸附树脂为前提，根据不同的乙醇浓度进行测试，使原花青素的提取率和纯度都有所提高。但是如何按照聚合度不同进行分离和如何按照各花青素的种类进行分离，以及把原花青素同有关其他多酚类的混合组分中分离出来的精制方法一点都没有在上诉专利中提及。因此，根据以上的现状，研究开发一种能精制分离得到功能性和活性效果更强的目的多酚类物质，以及开发效率更高，更经济的制造方法得到更高纯度含量的功能性多酚物质的方法，具有非常迫切的现实意义。
在葡萄和蔓越橘(俗称小红莓)中含有作为儿茶素聚合物的原花青素类(花青素 B2、花青素A型等)和高分子型花青素(7个以上单元的聚合体)等花色素苷物质，之外还有糖类、有机酸、蛋白质等成分。另外红花的花瓣中黄颜色色素的成分主要是红花黄色素A和红花黄色素B，其中显示红色的成分主要是红花素(红花甙)及其衍生物组成的。现在工业上被利用的红花黄色素，基本上是由这些原料成分组成的混合物，其中也包括功能性多酚类成分的。最近，各个成分的功能性变得更加明朗化，产业界也提出了对特定功能性多酚的不同需求。譬如很多客户希望能得到功能性效果较高的花青素A型的高纯度产品，以及高纯度含量的红花黄色素A或高纯度含量的红花黄色B，就是其中的一个例子。可是，从现有工业化的生产的成本考虑，目前市场上还没有合适的产品。发明内容
本发明提供一种或多种功能性多酚类物质的高效分离精制方法，更具体的说，是把植物中含有的茶多酚类、类黄酮类、查尔酮类、单宁类等功能性多酚，与蛋白质、脂肪、多糖类、无机物、有机物等其他成分进行精致分离，获取高纯度特定多酚产品或高纯度功能性单体产品的加工精制方法，以克服现有技术存在的各种缺陷。
本发明是通过如下的技术方案实现的
I)将包含目的多酚的提取液，用展开溶剂调整为I 50被％的调制液；
2)用极性吸附树脂作为色谱柱固定相，将步骤I)中的调制液通过上述色谱柱，采用色谱柱分离法分离，并通过高效液相色谱法分离各组分；该极性吸附树脂具有分子筛分尚作用;
3)将经初步得到的含有高含量目的多酚的组分，用孔径不相同的2种分离膜进行进一步分离精制，得到高纯度目的多酚。
所述分离精制步骤通过如下方法实现
将含有高含量目的多酚的组分(2)通过精制液桶(6)流入大孔径分离膜(4)，透过液(H)流入循环桶(7)，精制液则回到精制液桶(6)继续循环；循环桶(7)中的透过液(H)流入小孔径分离膜(5)，精制液(I)流入精制液桶(6)，分离液则回到循环桶(7)继续循环；上述双循环系统不断往复循环2 10小时，最后在精制液桶(6)或桶(7)中得到高纯度目的多酚。
所述色谱柱分离法是在在溶析出口上设置UV/vis分光光度计，通过高效液相色谱法确定目的多酚组分；
所述极性吸附树脂为苯乙烯类树脂，选择孔径大于目的多酚分子量的吸附树脂；
根据功能性目的多酚的物理化学的性质来考虑选择合适的合成树脂吸着量，树脂的吸着量以树脂质量的10-40倍为好。
展开溶剂可以是水、碱、酸、乙醇类、酯类、酮类或其混合液，最好是根据提取液和需要溶析出来的目的多酚类的特性，调制出最适合的溶析液的配比。为了分离精制得到目的多酚类群，提取溶剂和展开溶剂的极性可以根据多酚的类物质的特性进行选择。
分离膜的选择遵循如下原则根据含有高含量功能性目的多酚的组分中，目的多酚和其他多酚类物质的分子量和/或极性差异，当目的多酚类物质的分子量小于6000时， 大孔径分离膜必须选择分子量大于6000的膜，而小孔径分离膜最好选择分子量小于500的膜。
本发明尤其公开一种A型花青素的分离精制方法，包括如下步骤
A)将包含A型花青素的小红莓提取液添加质量浓度为50_97被％的乙醇调配成 15 45wt%浓度的调制液；
B)取步骤A)中的调制液，导入含极性吸附树脂的树脂塔(3)，用展开溶剂流入树脂塔(3)进行分离精制；
C)溶析液按顺序分离成5 7个组分，用高效液相色谱法进行分析，取含有高含量目的多酚的组分(2);
D)含有高含量目的多酚的组分(2)通过精制液桶(6)流入大孔径分离膜(4)，透过液(H)流入循环桶(7)，精制液则回到精制液桶(6)继续循环；循环桶(7)中的透过液(H)再流入小孔径分离膜(5)，精制液(I)流入精制液桶(6)，分离液则回到循环桶(7)继续循环； 上述双循环系统不断往复循环2 3小时，最后在精制液桶(6)中得到纯度为90 98wt% 的A型花青素。
所述极性吸附树脂为苯乙烯类树脂，选择孔径大于目的多酚分子量的树脂；例如钻石离子 HP20、HP20SS、HP21、SP206、SP70、SP700、SP207、CHP3C、CHP5C、CHP20P、SP850、 SP825L (以上全都是三菱化成工业公司制造)，AMBERLITE XAD-I, XAD-2, XAD-4, XAD-2000 (以上全都是日本ORGANO公司制造)
所述展开溶剂可以是水、碱、酸、乙醇类、酯类、酮类或其混合液，优选柠檬酸和乙醇混合液；
步骤B)中调制液的流速为2 20毫升/分；
大孔径分离膜(4)优选分子量3000-6000的膜，小孔径分离膜(5)优选分子量 300-1000 的膜；
上述分离膜可选择例如SEP-3013、SEP-3023、SEP-3053 (以上为旭化成股份有限公司)、字符C-02-HR、字符C-40-HR (以上为日本KURARAY公司制)、UP00、UP010、UP020 (以上是NADIR制)、Cefilt-UF (日本碍子股份有限公司)等；
步骤D)中的分离精制步骤最好是在流速I 20升/分，压力O. 2 O. 5MPa，温度 15 35°C的条件下进行。
本发明从含有多酚和包含其他成分的提取液中，用有分子筛分离作用和疏水性的吸着树脂作为色谱柱固定相，分离得到功能性目的多酚类物质。具体的做法是，作为合成吸着树脂，用苯乙烯类的合成吸着树脂进行了尝试分离。其得到结果，如图I所示，我们把有分子筛作用的和有疏水性的吸着树脂作为固定相，在特定的溶析条件下，进行色谱柱分离后，按照以下次序得到各种多酚组分，依次得到有分子量大极性高的组分，分子量大但极性低的组分，分子量小但极性高的组分，分子量小但极性低的组分。
但是如果用上述合成吸着树脂处理方法和分离膜进行单独分开处理的话，目的多酚的纯度并没有很大程度的提高。这说明，本发明方法将合成吸着树脂处理方法和分离膜处理进行组合处理的方法产生了显著的效果。
作为本发明使用的含多种功能性多酚成分的原料，譬如葡萄、蔓越橘(俗称小红莓)、苹果等功能性多酚类物质含量高的果实、叶、根还有它们的榨汁液、植物的提取物等都可以使用。在本发明中，作为特定的生理活性的目的多酚化合物的分离，作为可以精制分离的多酚类群，包括由来自苯酚酸类和酯构成的苯酚酸类群，还有多酚和有机酸的酯构成的多酚群，儿茶酸类及儿茶酸类的聚合物(η ( 6)(别名花青素)构成的多酚群，查尔酮和其糖甙以及或由类黄酮和其糖甙构成的多酚群，单宁类群等。
所述疏水性吸着树脂的选择非常重要，必须考虑被选择功能性目的多酚的极性及分子量和合成吸着树脂的疏水性(难溶于水)的强度和孔径的大小。就是说，功能性目的多酚的分子量要比所选择的合成吸着树脂的孔径要小，而且必须选择有一定疏水性的树脂。
图I是本发明用吸着树脂处理得出的各多酚成分的溶析倾向示意图。
图2是本发明精制方法的流程示意图。
图3是本发明实施例I与对比样的光照射抗氧化效果对比图。
图4是本发明实施例2与对比样的光照射后色素残存率结果图。
具体实施方式
下面结合附图给出本发明较佳实施例，以详细说明本发明的技术方案。
如图2所示，本发明的分离精制过程如下
将包含目的多酚的提取液，用展开溶剂调整为I 50被％的调制液；将调制液倒入树脂塔(3 )之后，桶(I)中的展开溶剂流入含疏水性吸着树脂的树脂塔(3 )进行色谱柱法分离，并将含有高浓度目的多酚的组分放入桶(2)中回收。然后再将含有高含量功能性目的多酚的组分(2)移送到精制液桶(6)，通过精制液桶(6)流入大孔径分离膜(4)，透过液(H) 流入循环桶(7)，精制液则回到精制液桶(6)继续循环；循环桶(7)中的透过液(H)流入小孔径分离膜(5)，精制液(I)流入精制液桶(6)，分离液则回到循环桶(7)继续循环；上述双循环系统不断往复循环2 10小时，最后在精制液桶(6)中得到高纯度功能性目的多酚。
实施例I
以下以A型花青素的分离精制为例，以详细说明本发明的技术方案。
在小红莓中富含的A型花青素，是由聚合型单宁，或非水分解类单宁、即以黄烷-3，4-二醇为构成单元，通过聚合而生成的高分子化合物。一般来说，自然界中存在的都是以3-30个单元为主的聚合物(即聚合度η为3-30)，但是具有功能性效果的一般都是3_5 个单元为主的小分子聚合物居多。众所周知，花青素A型有抑制透明质酸酶活性效果、抗过敏和抗炎症作用，还有防止因细菌而引起的尿路感染症等效果。本专利的方法就是，从小红莓提取液中，简单高效的获取高纯度的精制A型花青素的成分。
I、小红莓的调制液
小红莓提取步骤，往新鲜小红莓I重量里加含O. 2% -O. 8 %柠檬酸的5-10重量的水，温度在50-90°C范围内，搅拌2-5小时。小红莓调制液就是上述抽提液体进行过滤，然后添加50-97 %乙醇使之成为15-45 %浓度，备后使用。根据HPLC分析结果如图3所示，可以知道小红莓调制液中至少存在7种不同的花青素成分。本发明专利的目的就是把这里面的特定的功能性最强的目的成分(HPLC谱图中标注的成分NO. 7)进行简单的分离和精致。
2、处理合成吸着树脂
使用的装置是用直径50mmX长50cm的玻璃柱，充填苯乙烯系合成树脂SP_700(三菱化成公司制)树脂700ml，用含有O. 2% -O. 8%柠檬酸的含水乙醇(浓度为20-50%)溶液作为展开溶剂。把200毫升小红莓调制液以流速2-20毫升/分的速度，室温下导入以上柱子。然后用上述展开溶剂进行分离精制。按先后溶出顺序，每300ml为一组分，分离得到7 个组分。对这些组分进行HPLC分析，组分4的花青素含量最多，组分4中所含的各成分的比例如图3所不,成分3、成分6、成分7的所含百分比分别是12%、32%、46%(参照表I)。
表I组分4中所含各成分的百分比含量
权利要求
1.一种多酚类物质的分离精制方法，其特征在于，包括如下步骤1)将包含目的多酚的提取液，用展开溶剂调整为I 50被％的调制液；2)用极性吸附树脂作为色谱柱固定相，将步骤I)中的调制液通过上述色谱柱，采用色谱柱分离法分离，并通过高效液相色谱法分离各组分；3)将经初步得到的含有高含量目的多酚的组分，用孔径不相同的2种分离膜进行进一步分离精制，得到高纯度目的多酚。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤3)所述分离精制步骤包括将含有高含量目的多酚的组分(2)通过精制液桶(6)流入大孔径分离膜(4)，透过液(H)流入循环桶(7)，精制液则回到精制液桶(6)继续循环；循环桶(7)中的透过液(H)流入小孔径分离膜(5)，精制液(I)流入精制液桶(6)，分离液则回到循环桶(7)继续循环；上述双循环系统不断往复循环2 10小 时，最后在精制液桶(6)或桶(7)中得到高纯度目的多酚。
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述极性吸附树脂为苯乙烯类树脂，选择孔径大于目的多酚分子量的吸附树脂。
4.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述展开溶剂选自水、碱、酸、乙醇类、酯类、 酮类或其混合液，当目的多酚类物质的分子量小于6000时，大孔径分离膜必须选择分子量大于6000的膜,而小孔径分离膜最好选择分子量小于500的膜。
5.如权利要求I 4任一项所述的方法，其特征在于，所述多酚为茶多酚类、类黄酮类、 查尔酮类或单宁类功能性多酚。
6.一种A型花青素的分离精制方法，其特征在于，包括如下步骤A)将包含A型花青素的小红莓提取液添加质量浓度为50-97wt%的乙醇调配成15 45wt%浓度的调制液；B)取步骤A)中的调制液，导入含极性吸附树脂的树脂塔(3)，用展开溶剂流入树脂塔(3)进行分离精制；C)溶析液按顺序分离成5 7个组分，用高效液相色谱法进行分析，取含有高含量目的多酚的组分(2);D)含有高含量目的多酚的组分(2)通过精制液桶(6)流入大孔径分离膜(4)，透过液(H)流入循环桶(7)，精制液则回到精制液桶(6)继续循环；循环桶(7)中的透过液(H)再流入小孔径分离膜(5)，精制液(I)流入精制液桶(6)，分离液则回到循环桶(7)继续循环；上述双循环系统不断往复循环2 3小时，最后在精制液桶(6)中得到纯度为90 98wt% 的A型花青素。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述极性吸附树脂为苯乙烯类树脂，选择孔径大于目的多酚分子量的吸附树脂；所述展开溶剂为柠檬酸和乙醇混合液。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，大孔径分离膜(4)为分子量3000-6000的膜，小孔径分离膜(5)为分子量300-1000的膜。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤B)中调制液的流速为2 20毫升/分， 步骤D)中的分离精制步骤是在流速I 20升/分，压力O. 2 O. 5MPa，温度15 35°C的条件下进行的。
10.根据权利要求6 9任一项方法得到的A型花青素的应用，其特征在于，可在食品、 化妆品、医药品或医药中间体、保健品领域中添加作为色素稳定剂或着色剂使用。
全文摘要
本发明提供一种多酚类物质的分离精制方法，包括如下步骤将包含目的多酚的提取液，用展开溶剂调整为1～50wt％的调制液；用极性吸附树脂作为色谱柱固定相，将步骤1)中的调制液通过上述色谱柱，采用色谱柱分离法分离，并通过高效液相色谱法分离各组分；将经初步得到的含有高含量目的多酚的组分，用孔径不相同的两种分离膜进行进一步分离精制，得到高纯度目的多酚。本发明可从植物提取液中精制分离特定的多酚类物质，方法简单可靠，纯度高。
文档编号C07D311/62GK102942432SQ20121030346
公开日2013年2月27日 申请日期2012年8月23日 优先权日2012年8月23日
发明者钟旭东, 市龙太 申请人:食味添(上海)科技贸易有限公司