专利名称：一种莱克多巴胺单克隆抗体的制备方法
技术领域：
本发明涉及免疫化学技术领域，尤其涉及一种莱克多巴胺单克隆抗体的制备方法。
背景技术：
莱克多巴胺(RAC)为β2_受体激动剂，与其他兴奋剂类药物如克伦特罗、卡布特罗、沙丁胺醇等具有类似结构，对体内代谢的作用较强，能降低脂肪的生成和促进脂肪的分解，促进蛋白质合成并减少其降解；还能促进胰岛素的释放，使糖原分解增加，因此能利用合成脂肪的能量和成分来增加蛋白质的合成。近年来由于加大了打击非法使用克伦特罗的力度，使其同类药物RAC的非法添加日趋严重，尽管我国政府颁布了各种法令严禁将RAC等β 2_激动剂作为动物促生长剂使用，但是由于经济利益的驱使，违法滥用RAC等β2-激动剂的现象仍非常普遍，各类中毒事件时有发生。RAC长期使用后易在动物组织，特别是内脏中积聚残留，并通过食物链进入人体引起中毒症状，能使骨骼肌收缩增强，破坏快缩肌和慢缩肌纤维间的融合现象，引发肌肉震颤。其他中毒症状包括面色潮红、心动过速、心率失常、胸闷、腹痛、肌肉疼痛、四肢麻木、恶心、头痛和晕眩等。对患有高血压、青光眼、糖尿病、前列腺肥大等疾病的患者危害更大，严重的可能危及生命。RAC在牲畜体内吸收代谢较快，一般不易蓄积，体内RAC的含量很低，一般为ng级。目前RAC的检测技术主要有色谱技术和免疫分析技术等。色谱技术为经典技术，主要有高效液相色谱(HPLC)，高效液相色谱/荧光(HPLC/FLD)，液相色谱-质谱连用(LC-MS)，气相色谱-质谱连用(GC-MS)，高效毛细管电泳(HPCE)等方法。免疫分析技术主要有酶免疫技术、免疫生物传感器技术、金标免疫层析技术及新兴的生物芯片技术。色谱技术灵敏准确，但是样品处理繁琐费时，成本高，所需仪器设备昂贵，一次检测样品量少，检测时间长，而且需要有经过专门训练的专业人员来操作复杂的仪器设备，不易普及，仅作为少数实验室的确证方法。免疫分析技术具有敏感、特异且一次能检测大量样品、满足现场和快速检测的要求。已成为前期筛查的主要手段。由于作为半抗原的莱克多巴胺本身不能诱导机体产生抗体，必须将其与载体蛋白偶联获得人工合成的完全抗原才具有抗原性。而小分子抗原与载体蛋白的偶联效果及细胞融合后阳性克隆的筛选都直接影响着抗体的制备效果，是抗体制备的关键。目前，RAC与载体的连接方法主要有多元酸酐与混合酸酐联用法和1，4_ 丁二醇二缩水甘油醚法，这些方法改造位点均为莱克多巴胺的活性位点，在这些部位引入连接臂会影响到莱克多巴胺的电子分布和空间位阻，因此会不同程度造成免疫所得莱克多巴胺抗体特异性降低。为了建立莱克多巴胺酶免疫分析方法，需要制备特异性强、可大量生产的莱克多巴胺的单克隆抗体。但目前制备所得的莱克多巴胺的单克隆抗体特异性不强，也无法大量生产。因此，目前制备的莱克多巴胺的单克隆抗体存在假阳性、假阴性偏高，特异性不强，无法大量生产等问题。
发明内容
为解决现有技术存在的问题，本发明提供一种莱克多巴胺的单克隆抗体的制备方法，利用该方法生产的莱克多巴胺单克隆抗体灵敏度高、特异性强，可应用于莱克多巴胺的检测中，满足实际应用的需要。本发明的技术方案是提供一种莱克多巴胺的单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤A)制备完全抗原RAC-BSA和包被原RAC-OVA Ca)将莱克多巴胺，即RAC溶解在四氢呋喃水溶液中，先后加入苯甲氧羰琥珀酰亚胺和碳酸氢钠，搅拌12小时后用乙酸乙酯萃取，取有机相减压除去溶剂，过硅胶层析柱，收集中间产物A ; (b)将所述中间产物A溶解在二氯甲烷中，冷却至0°C，加入三乙胺和叔丁基二甲基氯硅烷，升至室温反应12h后加水，再用二氯甲烷萃取，取有机相减压除去溶剂，得到化合物B ; (c )将所述化合物B溶解在二氯甲烷中，冷却至- I (TC，先后加入三苯基膦、咪唑和N-溴代丁二酰亚胺，搅拌30min后加入饱和氯化铵溶液，再用二氯甲烷萃取，取有机相减压除去溶剂，得到化合物C ;(d)将6-羟基己烷甲酸甲酯溶解在N，N- 二甲基甲酰胺中，冷却至0°C，加入NaH，搅拌lOmin，得到混合液，将所述化合物C溶解在N，N-二甲基甲酰胺中，再加入到所述混合液中，搅拌IOh后减压除 去N，N-二甲基甲酰胺，用乙酸乙酯萃取，取有机相减压除去溶剂，得到化合物D ;(e)将所述化合物D溶解在甲醇水溶液中，冷却至0°C，加入LiOH,反应Ih后减压除去甲醇，用HCl调节PH至3，用乙酸乙酯萃取，取有机相减压除去溶剂，得到化合物E ; (f)将所述化合物E溶解在甲醇中，加入催化量的Pd/C，密闭反应体系，用氢气换气3次，反应Ih后过滤Pd/C，减压除去甲醇，得化合物F ；(g)将所述化合物F溶解在四氢呋喃，冷却至0°C，加入四丁基氟化铵，反应2h后减压除去四氢呋喃，过柱提纯产品，得到化合物G ； (h)将所述化合物G溶解在N，N- 二甲基甲酰胺中，冷却至0°C，加入三乙胺和牛血清白蛋白，即BSA，待BSA完全溶解后加入二环己基碳二亚胺，搅拌24h，减压除去N，N-二甲基甲酰胺，先后用水和乙醇洗涤，得到固体产物即为RAC-BSA ; (i)将所述化合物G溶解在N，N- 二甲基甲酰胺中，冷却至(TC，加入三乙胺和卵清蛋白，即OVAJt OVA完全溶解后加入二环己基碳二亚胺，搅拌24h，减压除去N，N-二甲基甲酰胺，先后用水和乙醇洗涤，得到固体产物即为RAC-OVA ;B)动物免疫采用Balb/c小鼠作为免疫动物，所述RAC-BSA与等体积弗氏完全佐剂乳化后作为第一次免疫原，所述RAC-BSA与等体积快速鼠单抗制备佐剂乳化后作为第二、三、四次免疫原，每次免疫剂量为25飞Oug/只小鼠，共免疫四次；C)冲击免疫所述免疫结束后1(Γ15天，用间接ELISA法测血清抗体效价，选取所述血清效价高的小鼠进行冲击免疫，所述冲击免疫的剂量为5(Tl00Ug/只；D)制备杂交瘤细胞所述冲击免疫结束后三天，取接受过冲击免疫的小鼠的脾细胞，以PEG4000作融合剂，将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞按数量比为5 :1进行细胞融合，选取阳性克隆进行亚克隆，得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；E)制备腹水并纯化莱克多巴胺单克隆抗体用灭菌石蜡致敏Balb/c小鼠，所述致敏结束7天后分别对每组小鼠腹腔注射所述杂交瘤细胞，7^10天后采集腹水，采用饱和硫酸铵法纯化腹水，再用DEAE弱阴离子交换树脂进一步纯化，得到纯化后的单克隆抗体，即莱克多巴胺单克隆抗体。步骤B)中RAC-BSA与等体积弗氏完全佐剂乳化后作为第一次免疫原，RAC-BSA与等体积快速鼠单抗制备佐剂乳化后作为第二、三、四次免疫原，使用佐剂变换的原因是如果完全用快速鼠单抗制备佐剂，会提高成本；完全用弗氏完全佐剂则需要较长的时间，而且抗原需求量大；两者在合适的时间结合使用既可以节约成本，又可以节省时间。步骤E)中采用饱和硫酸铵法纯化腹水，再用DEAE弱阴离子交换树脂进一步纯化，而不是采用传统的亲和层析方法，优点是可以减少对抗体活性的损害，并且可以提高抗体纯度。
作为本发明的进一步改进是步骤A)中所述制备完全抗原RAC-BSA和包被原RAC-OVA是采用醚化反应将莱克多巴胺苄醇基团的羟基连接上6-羟基己烷甲酸甲酯制备半抗原，再经过缩合反应制得莱克多巴胺与载体蛋白复合物；与目前常用的RAC与载体的连接方法多元酸酐与混合酸酐联用法和1，4_ 丁二醇二缩水甘油醚法相比，该方法不会改造莱克多巴胺的活性位点，不会影响到莱克多巴胺的电子分布和空间位阻，因此不会造成免疫所得莱克多巴胺抗体特异性降低。作为本发明的进一步改进是步骤B)中所述Balb/c小鼠为8 12周鼠龄的健康雄性Balb/c小鼠，选取该雄性青年小鼠的优点是小鼠免疫反应强烈，易于高效价高亲和力抗体的生成。作为本发明的进一步改进是步骤B)中所述第二、三、四次免疫的时间分别是所述第一次免疫后的第30、50、65天，免疫程序中时间的间隔有利于免疫效果的提高和高效价高亲和力抗体的生成。作为本发明的进一步改进是步骤C)中所述冲击免疫的免疫原是RAC-BSA，不加任何佐剂，易于闻效价闻未和力抗体的生成。作为本发明的进一步改进是步骤D)中所述PEG4000融合剂为预热至42°C的质量分数为50% PEG4000，在此条件下免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合效果较好。作为本发明的进一步改进是步骤E)中所述Balb/c小鼠为生育一次的雌性青年小鼠，优点是雌性小鼠腹膜弹性较好，尤其已育小鼠，产生腹水的量更多。与现有技术相比，本发明的有益效果是运用特殊免疫方式，抗体效价较高，相对缩减下游产品开发的成本；利用本发明提供的制备方法制得的莱克多巴胺单克隆抗体灵敏度高、特异性强，可应用于莱克多巴胺的检测中，假阳性、假阴性比率显著降低，满足实际应用的需要。
图I为制备完全抗原与包被原的相同中间产物G的合成路线示意 图2为RAC-BSA偶联物、RAC、BSA的紫外扫描光谱示意 图3为RAC-OVA偶联物、RAC, OVA的紫外扫描光谱示意 图4为间接ELISA测定抗体效价结果示意 图5为间接竞争ELISA测定IC50的回归曲线示意图。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。实施例一完全抗原与包被原的制备与检测。I、完全抗原的制备与检测。a.完全抗原的制备，包括如下步骤(1)将IOmol莱克多巴胺溶解在25mlTHF (四氢呋喃)和25ml纯水中，先后加入IOmolCbzOSU (苯甲氧羰琥珀酰亚胺)和20mol NaHCO3，搅拌12小时后用150ml乙酸乙酯萃取，取有机相用旋转蒸发仪减压除去溶剂，过硅胶层析柱，收集中间产物A ；
(2)将IOmol所述中间产物A溶解在50mlDCM (二氯甲烷)中，冷却至(TC，加入25mol三乙胺和20mol TBS-Cl (叔丁基二甲基氯硅烷)，升至室温反应12h，反应结束后加入IOOml水，再用200ml DCM萃取，取有机相用旋转蒸发仪减压除去溶剂，得到化合物B ;
(3)将IOmol所述化合物B溶解在50mlDCM中，冷却至_10°C，先后加入15mol三苯基膦、15mol咪唑和15mol NBS (N-溴代丁二酰亚胺)，搅拌30min后加入15ml饱和氯化铵溶液，再用IOOml DCM萃取，取有机相用旋转蒸发仪减压除去溶剂，得到化合物C ;
(4)将IOmol6-羟基己烷甲酸甲酯溶解在50ml DMF (N，N_ 二甲基甲酰胺)中，冷却至(TC，加入IOmol的NaH，搅拌lOmin，得到混合液，将IOmol所述化合物C溶解在5ml DMF中， 再加入到所述混合液中，搅拌10h，反应结束后减压除去DMF，用200ml EA (乙酸乙酯)萃取，取有机相用旋转蒸发仪减压除去溶剂，得到化合物D ；
(5)将IOmol所述化合物D溶解在20ml水和20ml甲醇中，冷却至(TC，加入15molLiOH,反应Ih后减压除去甲醇，用IN HCl调节pH至3，用200ml EA分三次萃取，取有机相用旋转蒸发仪减压除去溶剂，得到化合物E ;
(6)将IOmol所述化合物E溶解在50ml甲醇中，加入催化量的Pd/C，密闭反应体系，用氢气换气3次，反应Ih后过滤Pd/C，减压除去甲醇，得化合物F ；
(7)将IOmol所述化合物F溶解在50mlTHF中，冷却至(TC，加入12mol TBAF (四丁基氟化铵)，反应2h，反应结束后减压除去THF，过柱提纯产品，得到化合物G ；
(8)将IOmol所述化合物G溶解在DMF中冷却至0°C，加入IOmolEt3N (三乙胺)和O. 2mol BSA (牛血清白蛋白)，待BSA完全溶解后加入IOmol DCC (二环己基碳二亚胺)，搅拌24h,减压除去DMF，将剩余固体物质溶于水中，抽滤，收集滤液并加入体积分数为40%的乙醇，充分混匀后抽滤，用乙醇洗涤，收集固体并减压除去乙醇，得到固体产物即为RAC-BSA。步骤(I)- (7)的合成路线示意图如图I所示。b. RAC-BSA 的检测
采用紫外分光光度计进行全波长扫描，鉴定偶联物是否偶联成功称取RAC-BSA偶联物、RAC、BSA各lmg，分别溶于Iml PBS缓冲液中，以PBS为空白对照，对上述物质的溶液分别作光谱扫描，观测几种物质的光密度(OD值)，紫外扫描光谱图见图2。结果分析由图2可见，RAC和BSA的特征波长分别在291nm和276nm处，偶联物RAC-BSA在279nm处有一个吸收峰，由紫外特征吸收峰的偏移可知免疫抗原RAC-BSA偶联成功。2、包被原的制备与检测。a.包被原的制备
步骤同完全抗原的制备，只是步骤(8)中BSA (牛血清白蛋白)换为OVA (卵清蛋白)，得到 RAC-OVA。(3 ) RAC-OVA 的检测
采用紫外分光光度计进行全波长扫描，鉴定偶联物是否偶联成功称取RAC-OVA偶联物、RAC、OVA各lmg，分别溶于Iml PBS缓冲液中，以PBS为空白对照，对上述物质的溶液分别作光谱扫描，观测几种物质的光密度(OD值)，紫外扫描光谱图见图3。结果分析由图3可见，RAC和OVA的特征波长分别在291nm和280nm处，偶联物RAC-OVA在276nm处有一个吸收峰，由紫外特征吸收峰的偏移可知免疫抗原RAC-OVA偶联成功。实施例二小鼠免疫。取5只鼠龄在10周的Balb/c健康雄性小鼠，每只小鼠按下列程序免疫第O天取lmg/ml的RAC-BSA50y g加等体积弗氏完全佐剂乳化后在小鼠背部皮下多点注射，取lmg/ml的RAC-BSA25y g与等体积快速鼠单抗制备佐剂混匀后分别于第30天，第50天，第65天，同法注射免疫。一周后尾静脉血离心取血清用间接ELISA法测效价，选取血清效价高的小鼠于第80天进行冲击免疫,免疫原为RAC-BSA,免疫的剂量为50ug/只。间接ELISA检测抗血清效价方法的建立
(I)包被用O. 15M pH9. 6的NaHCO3包被缓冲液将所述包被原RAC-OVA稀释5000倍，100 μ I/孔加入酶标板，4°C过夜；次日取出，甩去孔内液体，PBST洗涤三次，拍干。(2)封闭每孔加120 μ I封闭液(含2%脱脂奶粉、1%0VA的PBS)，37°C封闭2h后，甩去孔内液体，PBST洗涤两次并拍干孔内液体。(3)加血清样品用稀释液将待检血清样品作1:10000——I =5120000梯度稀释， οομ I/孔加入酶标板，同时用阴性血清做阴性对照，稀释液做空白对照；37°C湿盒反应30min，甩去孔内液体，PBST洗涤五次，拍干。(4)加酶标二抗将羊抗鼠IgG酶标二抗用稀释液适当稀释，100 μ I/孔加入酶标板，37。。
湿盒反应30min，甩去孔内液体，PBST洗涤五次，拍干。(5)加底物每孔加入TMB底物溶液100μ 1，37°C湿盒显色15min。(6)反应终止每孔加入终止液(2M硫酸溶液)50 μ I0(7)测定选择450nm滤光片，用酶标仪测定、记录每孔的OD值。结果判定以样品血清孔的OD值在I. O左右，且P/N值在2. I以上的孔所对应的抗体稀释度为该抗血清的效价(P表示待检样品血清孔的吸光度值；N表示阴性对照血清孔的吸光度值)。实施例三细胞融合，杂交瘤细胞的筛选及克隆化培养。I、饲养细胞制备。
将一只未接受免疫的Balb/c小鼠拉颈脱臼处死，浸泡于75%酒精5分钟，在超净工作台内剪开腹部皮肤，暴露腹膜；酒精消毒后注入5ml RPMI1640培养液，晃动小鼠或反复抽吸几次后抽回注入离心管离心，弃上清，下层沉淀即为饲养细胞；用35ml完全培养液重悬上述饲养细胞，100 μ I/孔滴加到培养板，置培养箱培养。2、脾细胞制备。
取间接ELISA检测血清效价最高的免疫小鼠，眼眶采血后脱曰处死，在75%酒精中消毒后取脾脏，去除结缔组织，制备脾细胞悬液，转移到50ml离心管中，加RPMI1640培养液至30ml，离心弃上清，加RPMI1640培养液至30ml，计数，取I X IO8个细胞待用。3、骨髓瘤细胞制备。
取3瓶生长状态良好的(活细胞数>95%)骨髓瘤细胞，超净工作台中用弯头滴管将之完全吹下，转移到50ml离心管中，加RPMI1640培养液至30ml，离心弃上清，加RPMI1640培养液至30ml稀释，计数，取2 X IO7个细胞待用。4、细胞融合。按数量比脾细胞骨髓瘤细胞=5 :1，混合，1500rpm离心5分钟；弃上清，沉淀细胞块弹成糊状，置37°C水浴，在I分钟内加入Iml预热至42°C的质量分数为的50% PEG4000融合剂，并搅拌细胞，37°C水浴放置45s，2min内加入10mlRPMI1640培养液并搅拌细胞；IOOOrpm离心5min,弃上清。5、细胞培养。
轻轻将融合后的细胞弹匀，加入75ml HT培养液，将细胞重悬混匀，加到预先准备好的饲养细胞板中；37°C，CO2培养箱培养、观察；细胞融合后第一天开始，对细胞进行仔细观察并记录；次日添加HAT培养基100 μ I，培养4天；ΗΑΤ培养液换液一次，10天后换HT培养液 培养，依细胞数量及时做ELISA检测，后用RPMI1640完全培养液培养细胞。6、杂交瘤细胞的筛选。
融合后当杂交细胞集落生长到一定大小，培养液开始变黄，便可开始筛选抗体活性；在收集上清时，应在上次换液后4天进行，以便抗体积累；上清I :10稀释后用ELISA法进行杂交瘤细胞筛选。7、杂交瘤细胞的克隆化培养。
将阳性孔杂交细胞计数制成细胞悬液，把铺有饲养细胞的96孔板均分为4组，将细胞悬液按倍比法稀释成4组溶液，即每组每毫升含100、50、25、12. 5个细胞，以100 μ I/孔加板培养；约10天左右选择单克隆孔，检测抗体，如阳性者，再克隆，直至抗体阳性率100% ;此时选择抗体阳性强、细胞生长好的克隆，进行扩大培养，建系，保存。实施例四腹水制备及莱克多巴胺单克隆抗体的纯化。I、腹水制备。
选取生育一次的Balb/c雌性青年小鼠，每只注射500 μ I液体石蜡致敏；10天后收集杂交瘤细胞并用RPMI1640培养液或PBS缓冲液洗细胞两遍，取125万细胞注射于老鼠腹腔，一周后可见老鼠状态不活跃并且老鼠的腹腔肿大，此时可用无菌注射器于老鼠腹腔采集腹水，每隔一到两天采集一次，这样多次反复采集直到老鼠自然死亡；2000rpm离心去除上层脂肪和下层沉淀物，收集中层，取部分样品ELISA测效价，其余分装冻存备用。2、饱和硫酸铵法纯化腹水。
将腹水5ml与5ml PBS混合后，边搅拌边逐滴加入IOml饱和硫酸铵，继续温和搅拌IOmin后，4°C冰箱静置过夜；4°C，IOOOOrpm离心lOmin，弃上清；沉淀用PBS重溶至10ml，然后边轻轻搅拌边逐滴加入5ml饱和硫酸按溶液，4°C冰箱静置过夜；4°C，IOOOOrpm离心lOmin，弃上清；最后获得的沉淀用少量生理盐水溶解后，放入透析袋中于4°C进行透析，以置换缓冲液。3、DEAE弱阴离子交换树脂进一步纯化。
装柱，O. 02M pH8. OPB平衡后将透析后抗体上样，平衡缓冲液继续平衡至穿透峰回落至基线，换用盐溶液滴度洗脱并收集各组分；经过DEAE纯化后的抗体纯度达到95%以上。实施例五莱克多巴胺单克隆抗体的鉴定。I、间接ELISA测定抗体效价。
O. 15M pH9. 6的碳酸盐包被缓冲液(0.22 μ m过滤)将抗原稀释至所需浓度，50-100ng/孔包被；PBST洗涤2次，拍干，加入200 μ I封闭液；将待测样品稀释成系列梯度浓度(I: 10000，1:20000，1:40000，1:80000…1:5120000)按 100 μ I/孔加入包被板孔中，同时设立阴性(小鼠阴性血清)和空白对照(PBS溶液)，370C反应2h ；PBST洗涤2次，加入适当稀释的酶标二抗10(^1/孔，371反应111，PBST洗涤3次，PBS洗涤I次，加显色液100 μ I/孔，37°C恒温培养箱放置20min ;加入2M硫酸溶液50 μ I终止反应；可于白色背景上，直接用肉眼观察结果反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“ + 号表示；也可测OD值在酶标仪上，于450nm以空白对照孔调零后测各孔OD值，若OD值大于1.0即为阳性。结果分析由图4 (单抗效价测定)可知，该单抗的效价为1:320000。2、间接竞争ELISA测定IC50。
分别包被100ng、50ng、25ng、12. 5ng、6. 25ng浓度的抗原样品；每个梯度包被2列；封闭；倒出孔内溶液，PBST洗涤2次，封闭；每一行按标准加入50 μ I标准品溶液和相应的OD 值在I. O时的抗体稀释溶液；同时设定不加孔为第一行；标准品抗原的浓度依次为O. IngO. 3ng O. 9ng 2. 7ng 8. Ing 24. 3ng最后一行设为空白行；37°C反应2小时加入PBST洗涤2次，PBS洗涤I次，拍干；加入酶标抗体，37 V反应Ih后PBST洗涤3次，PBS洗涤I次，拍干；加显色液100 μ I/孔，37°C恒温培养箱放置20min ;加入2M硫酸溶液50 μ I ;在酶标仪上，于450nm以空白对照孔调零后测各孔OD值；按以下公式计算抑制率
抑制率(％) = [ (B — B。)/B0] X 100% ；
抑制率为50%时的Rac质量浓度即为该单抗的IC50值；
结果如表一所不
表一
权利要求
1.一种莱克多巴胺单克隆抗体的制备方法，其特征在于包括如下步骤 A)制备完全抗原RAC-BSA和包被原RAC-OVA (a)将莱克多巴胺，即RAC溶解在四氢呋喃水溶液中，先后加入苯甲氧羰琥珀酰亚胺和碳酸氢钠，搅拌12小时后用乙酸乙酯萃取，取有机相减压除去溶剂，过硅胶层析柱，收集中间产物A ;(b)将所述中间产物A溶解在二氯甲烷中，冷却至0°C，加入三乙胺和叔丁基二甲基氯硅烷，升至室温反应12h后加水，再用二氯甲烷萃取，取有机相减压除去溶剂，得到化合物B ; (c)将所述化合物B溶解在二氯甲烷中，冷却至-10°C，先后加入三苯基膦、咪唑和N-溴代丁二酰亚胺，搅拌30min后加入饱和氯化铵溶液，再用二氯甲烷萃取，取有机相减压除去溶剂，得到化合物C ;(d)将6-羟基己烷甲酸甲酯溶解在N，N- 二甲基甲酰胺中，冷却至0°C，加入NaH，搅拌lOmin，得到混合液，将所述化合物C溶解在N，N- 二甲基甲酰胺中，再加入到所述混合液中，搅拌IOh后减压除去N，N-二甲基甲酰胺，用乙酸乙酯萃取，取有机相减压除去溶剂，得到化合物D ;(e)将所述化合物D溶解在甲醇水溶液中，冷却至0°C，加入LiOH，反应Ih后减压除去甲醇，用HCl调节pH至3，用乙酸乙酯萃取，取有机相减压除去溶剂，得到化合物E ; (f )将所述化合物E溶解在甲醇中，加入催化量的Pd/C，密闭反应体系，用氢气换气3次，反应Ih后过滤Pd/C，减压除去甲醇，得化合物F ；(g)将所述化合物F溶解在四氢呋喃中，冷却至0°C，加入四丁基氟化铵，反应2h后减压除去四氢呋喃，过柱提纯产品，得到化合物G ； (h)将所述化合物G溶解在N，N- 二甲基甲酰胺中，冷却至O °C，加入三乙胺和牛血清白蛋白，即BSA，待BSA完全溶解后加入二环己基碳二亚胺，搅拌24h，减压除去N，N-二甲基甲酰胺，先后用水和乙醇洗涤，得到固体产物即为RAC-BSA ；(i)将所述化合物G溶解在N，N- 二甲基甲酰胺中，冷却至O °C，加入三乙胺和卵清蛋白，即OVAJt OVA完全溶解后加入二环己基碳二亚胺，搅拌24h，减压除去N，N- 二甲基甲酰胺，先后用水和乙醇洗漆，得到固体产物即为RAC-OVA ； B)动物免疫采用Balb/c小鼠作为免疫动物，所述RAC-BSA与等体积弗氏完全佐剂乳化后作为第一次免疫原，所述RAC-BSA与等体积快速鼠单抗制备佐剂乳化后作为第二、三、四次免疫原，每次免疫剂量为25飞Oug/只小鼠，共免疫四次； C)冲击免疫所述第四次免疫结束后1(Γ15天，用间接ELISA法测血清抗体效价，选取所述血清效价高的小鼠进行冲击免疫，所述冲击免疫的剂量为5(Tl00Ug/只； D)制备杂交瘤细胞所述冲击免疫结束后三天，取接受过冲击免疫的小鼠的脾细胞，以PEG4000作融合剂，将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞按数量比为5 1进行细胞融合，选取阳性克隆进行亚克隆，得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株； E)制备腹水并纯化莱克多巴胺单克隆抗体用灭菌石蜡致敏Balb/c小鼠，所述致敏结束7天后分别对每组小鼠腹腔注射所述杂交瘤细胞，7 10天后采集腹水，采用饱和硫酸铵法纯化腹水，再用DEAE弱阴离子交换树脂进一步纯化，得到纯化后的单克隆抗体，即莱克多巴胺单克隆抗体。
2.根据权利要求I所述的一种莱克多巴胺单克隆抗体的制备方法，其特征在于步骤A)中所述制备完全抗原RAC-BSA和包被原RAC-OVA是采用醚化反应将莱克多巴胺苄醇基团的羟基连接上6-羟基己烷甲酸甲酯制备半抗原，再经过缩合反应制得莱克多巴胺与载体蛋白复合物。
3.根据权利要求I所述的一种莱克多巴胺单克隆抗体的制备方法，其特征在于步骤B)中所述Balb/c小鼠为8 12周鼠龄的健康雄性Balb/c小鼠。
4.根据权利要求I所述的一种莱克多巴胺单克隆抗体的制备方法，其特征在于步骤B)中所述第二、三、四次免疫的时间分别是所述第一次免疫后的第30、50、65天。
5.根据权利要求I所述的一种莱克多巴胺单克隆抗体的制备方法，其特征在于步骤C)中所述冲击免疫的免疫原是RAC-BSA。
6.根据权利要求I所述的一种莱克多巴胺单克隆抗体的制备方法，其特征在于步骤D)中所述PEG4000融合剂为预热至42°C的质量分数为50%PEG4000。
7.根据权利要求I所述的一种莱克多巴胺单克隆抗体的制备方法，其特征在于步骤E)中所述Balb/c小鼠为生育一次的雌性青年小鼠。
全文摘要
本发明提供一种莱克多巴胺单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤A)制备完全抗原RAC-BSA和包被原RAC-OVA；B)动物免疫；C)冲击免疫；D)制备杂交瘤细胞；E)制备腹水并纯化莱克多巴胺单克隆抗体。利用本发明提供的制备方法制得的莱克多巴胺单克隆抗体灵敏度高、特异性强，可应用于莱克多巴胺的检测中，假阳性、假阴性比率显著降低，满足实际应用的需要。
文档编号C07K16/44GK102924601SQ201210424258
公开日2013年2月13日 申请日期2012年10月31日 优先权日2012年10月31日
发明者李攀, 任琪, 谢桂华, 谈宇清 申请人:深圳市宝凯仑科技有限公司