大肠癌或食道癌的检测用标志物和检查方法

大肠癌或食道癌的检测用标志物和检查方法
【专利摘要】本发明涉及对受试体的侵袭性低、且检测灵敏度和正确性高的、选自大肠癌和食道癌中的癌的检测或检查方法，具体地，涉及包含体外测定来源于受试体的体液中的COTL1蛋白质，基于其量来评价受试体中罹患选自上述癌的癌的有无的步骤的癌的检查方法；以及包含能与该蛋白质特异性地结合的抗体或其片段的用于诊断选自大肠癌和食道癌中的癌的试剂盒。
【专利说明】大肠癌或食道癌的检测用标志物和检查方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及将COTLl蛋白质作为大肠癌或食道癌的检测用标志物，通过测定其在体液中的浓度来进行的大肠癌或食道癌的检查方法。
[0002]本发明还涉及包含能与用于检测大肠癌或食道癌的上述蛋白质结合的物质的大肠癌或食道癌的诊断用试剂盒。
【背景技术】
[0003]大肠癌是以脏器区分第2多的癌，全部癌患者中9.8%是大肠癌患者。2008年，世界上每10万人中有17.3人罹患大肠癌，8.2人死亡。在日本，大肠癌患者也是全脏器中第2多的癌，随着食生活的欧美化，罹患数倾向于增加。
[0004]食道癌在2008年世界上每10万人有7.0人，5.8人死亡。在世界的死亡原因中食道癌所占的比例逐年增加，2008年度，世界的全部癌死亡例的5.4%是由食道癌引起的死亡。
[0005]大肠癌和食道癌的治疗有内窥镜治疗、外科手术、化学疗法、放射线疗法等，综合考虑病期、肿瘤的大小和/或侵入深度、转移的程度等来施用。在为早期癌的情况下，可以通过内窥镜切除或者外科手术完全切除，复发率也非常低。在为晚期癌的情况下，向肺、肝脏、淋巴结和/ 或腹膜等发生难以切除的转移，另外还有时在切除的部位发生局部复发。在这样的时期，除了手术之外还要进行放射线疗法和/或化学疗法(抗癌剂治疗)。这样，大肠癌、食道癌均是在比较早期发现的情况下预后比较好，在初期癌的治疗中9成以上的患者完全治愈。但是，大的肿瘤和/或有转移的肿瘤的治疗成绩差，使人认识到早期发现的重要性。
[0006]然而，大肠癌和/或食道癌难以通过自觉症状早期发现。因为大肠癌、食道癌均在早期癌的阶段几乎无症状，很多情况下如果不是癌进展之后则不会出现明确的自觉症状。大肠癌的情况下，出现与排便有关的症状，食道癌的情况下，出现吞咽时的不适感等症状，但这些症状多被与其他病混同，另外症状表现是癌某种程度生长的结果，在由于自觉症状而就诊时发现的癌多已经发生转移，预后不良。
[0007]作为大肠癌、食道癌的检查法，在大肠癌的情况下有直肠指诊、便潜血检查等，食道癌有食道造影检查和内窥镜检查等。然而，这些方法有确定为癌需要花费时间、难以解释结果、假阳性率高这样的缺点。
[0008]因此，为了在筛选阶段检测大肠癌和/或食道癌，强烈要求发现灵敏度高的血中肿瘤标志物(tumor marker)并使用其进行检查。认为通过计测血中标志物的水平，可以进行比较的廉价且高通量的检查?诊断。到目前为止，作为大肠癌的标志物CEA(非专利文献I)、CA 19-9等被临床应用，关于食道癌SCC、CYFRA21-1 (非专利文献2)、CEA等也被临床应用)。
[0009]现有技术文献
[0010]非专利文献[0011 ]非专利文献 I:CarpeIan-HoImstrom Μ.等、1995年、British Journal of Cancer>第 71 卷、p868-872
[0012]非专利文献2:Quillien V.等、1998 年、Oncology Report、第 5 卷、pl561_1565
【发明内容】

[0013]发明要解决的课题
[0014]然而，现在临床应用的上述标志物缺乏癌的检测灵敏度。即使是在大肠癌中最常用的CEA也仅4成左右显示阳性。另外关于食道癌，也是即使被认为灵敏度最高的CYFRA21-1，其灵敏度也为4成左右。因此，这些肿瘤标志物的利用限于治疗后的经过观察这样的有限的目的，一般不进行以健康诊断的筛查为目的的测定。
[0015]本发明的课题是提供对大肠癌或食道癌的检测有用的新的肿瘤标志物、和使用了该肿瘤标志物的大肠癌或食道癌的检查方法。
[0016]用于解决课题的方法
[0017]为了解决上述课题，本
【发明者】们将在大肠癌患者的体液与健常体的体液中存在的蛋白质群进行了比较，另外将在食道癌患者的体液与健常体的体液中存在的蛋白质群进行了比较，作为在大肠癌或食道癌患者的体液中检测到的新肿瘤标志物，发现了 C0TL1蛋白质，从而完成了本发明。
[0018]“C0TL1”(肌动蛋白辅助蛋白样I, coactosin-likel)蛋白质是肌动蛋白细胞骨架结合性蛋白质，已报告在细胞内与5-脂氧合酶结合，被认为参与白三烯的生物合成(Provost P.等、2001 年、Journal of Biological Chemistry、第 276 卷、ρ.16520-16527)。另外，已报告该蛋白质伴随风湿的发病而其血中浓度升高(Eun-Heui J.等、2009年、Experimental and Molecular Medicine、第 41 卷、ρ.354-361)。并且，已知在膜腺癌组织中表达高(Nakatsura Τ.等、2001 年、Biochemical and Biophysical ResearchCommuni cat ion、第256卷、p.75-80)。然而,至今为止尚未知关于C0TL1蛋白质与大肠癌和食道癌的相关性的报告。
[0019]因此，本发明包含以下发明。
[0020](I)癌的检查方法，包含以下步骤:体外测定在来源于受试体的体液中存在的包含C0TL1蛋白质的癌检测用标志物的量，基于该量来评价受试体有无罹患选自大肠癌和食道癌中的癌。
[0021](2)根据⑴所述的方法，上述C0TL1蛋白质是包含序列号I所示的氨基酸序列、与该氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨基酸序列、或具有构成这些氨基酸序列的至少7?10个以上的连续氨基酸残基的序列部分的多肽。。
[0022](3)根据(I)或(2)所述的方法，在受试体的上述癌检测用标志物的量与健常体的该量相比统计学上有意义地多时，评价或确定为罹患了选自大肠癌和食道癌中的癌。
[0023](4)根据(3)所述的方法，上述统计学上有意义地多的量是健常体的2倍以上。
[0024](5)根据(I)?(4)的任一项所述的方法，上述测定使用能与上述癌检测用标志物特异性地结合的物质。
[0025](6)根据(5)所述的方法，上述能与癌检测用标志物特异性地结合的物质是抗C0TL1抗体和/或其抗体片段。[0026](7)根据(I)?(6)的任一项所述的方法，上述体液样品为血液或尿。
[0027](8)选自大肠癌和食道癌中的癌的诊断用试剂盒，包含抗COTLl抗体、其抗体片段、和/或它们的化学修饰衍生物。
[0028]本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请2011-186147号的说明书和/或附图所记载的内容。
[0029]通过本发明，可以以比现有的肿瘤标志物更高的灵敏度检测选自大肠癌和食道癌中的癌。例如，仅通过测定被怀疑罹患大肠癌或食道癌的患者的血液等体液样品中所含的COTLl蛋白质的浓度，就可以确定或评价是否是大肠癌或食道癌。
【专利附图】

【附图说明】
[0030]图1是通过蛋白质印迹法来测定健常人和大肠癌患者的血浆中的COTLl蛋白质而得的图。
[0031]图2是通过蛋白质印迹法来测定健常人和食道癌患者的血浆中的COTLl蛋白质而得的图。
【具体实施方式】
[0032]1.癌检测用标志物
[0033]本发明的第一方式涉及用于评价受试体是否罹患选自大肠癌和食道癌中的癌的癌检测用标志物。本发明是基于与健常相比COTLl蛋白质在大肠癌患者或食道癌患者的血液等体液中更多地存在的见解而做出的。如后述的本发明的第二方式中所说明的那样，根据受试体的血液等体液中存在的该蛋白质的量的多少，可以评价该受试体有无罹患大肠癌或食道癌。
[0034]在本发明中，“癌检测用标志物”是用于检测大肠癌或食道癌的生物学标志物，是指成为显示受试体罹患大肠癌或食道癌的指标的物质。本发明的癌检测用标志物是COTLl蛋白质。本说明书中称为COTLl蛋白质时，不仅是主要在脊椎动物种、优选为哺乳动物种中存在的全长COTLl蛋白质，也是对其突变体和/或它们的断片也使用的术语，在本说明书中，将它们总称为“C0TL1蛋白质”。
[0035]本发明的“C0TL1蛋白质”如上所述是指肌动蛋白细胞骨架结合性蛋白质。在本发明中，COTLl蛋白质例如为包含约142个氨基酸的约17kDa的来源于哺乳动物种的COTLl蛋白质，优选为来源于人的COTLl蛋白质(GenBank登录号NP_066972.1)，具体为包含序列号I所示的氨基酸序列的多肽。另外，COTLl蛋白质可以是在人中主要存在的全长COTLl蛋白质、来源于人的其突变体、和/或来源于人的它们的断片。这次，本
【发明者】们弄清楚了，COTLl蛋白质，与大肠或食道的正常细胞相比，统计学上有意义地由大肠癌细胞或食道癌细胞产生，进而另外，在大肠癌患者或食道癌患者中，比健常人更多的量漏出到体液中。
[0036]在本说明书中，上述COTLl蛋白质的“突变体”，是指在构成COTLl蛋白质、优选为序列号I所示的来源于人的COTLl蛋白质的氨基酸序列或其部分序列中，包含I个以上、优选为I个?几个氨基酸的缺失、置换、添加或插入的突变体，或者是指与该氨基酸序列或其部分序列显示约80%以上、约85%以上、优选为约90%以上、更优选为约95%以上、约97%以上、约98%以上、约99%以上的同一性百分数的突变体。在这里，“几个”是指约10、9、8、7、6、5、4、3或2个以下的整数。此外，“同一性百分数”可以使用利用BLAST和/或FASTA的蛋白质检索系统，在导入间隙或者不导入间隙的条件下确定(Karlin, S.等、1993年、Proceedingsof the National Academic Sciences U.S.A.、第 90 卷、p.5873-5877; Altschul, S.F.等、1990 年、Journal of Molecular Biology、第 215 卷、p.403-410; Pearson, W.R.等、1988 年、Proceedings of the National Academic Sciences U.S.A.、第 85 卷、p.2444-24488)。作为COTLl蛋白质的突变体的具体例，可列举基于受试体的种类(例如，在受试人的情况下为种族)和/或个体的多态性(含SNIPs)、剪接突变等。
[0037]在本说明书中，C0TL1蛋白质的“片段”是指下述多肽片段，所述多肽片段包含构成C0TL1蛋白质、优选为序列号I所示的来源于人的C0TL1蛋白质或其突变体的氨基酸的至少7?10个以上且少于总数、至少15个以上且少于总数、优选至少20个以上且少于总数、至少25个以上且少于总数、更优选至少35个以上且少于总数、至少40个以上且少于总数、至少50个以上且少于总数的连续氨基酸残基，且保持I个或几个表位。这样的片段可以与后述的本发明的抗体或其抗体片段免疫特异性地结合。这样的肽片段也包含在C0TL1蛋白质中的原因是，即使被片段化，只要能定量血液中的C0TL1蛋白质，就能实现本发明的目的，而且，血液中的上述C0TL1蛋白质(优选为序列号I所示的来源于人的C0TL1蛋白质或其突变体)的全长多肽，也可能被例如血液中存在的蛋白酶和/或肽酶等片段化而存在。
[0038]2.大肠癌或食道癌的检查方法
[0039]本发明的第二方式涉及体外检测或检查选自大肠癌和食道癌中的癌的方法。
[0040]本说明书中的“癌”这样的术语以包含恶性肿瘤和/或癌(Carcinoma)的意义使用。另外，癌可以是浸润性或非浸润性的任一种癌，或者原发灶或转移灶的任一种癌。
[0041]本发明是基于C0TL1蛋白质与健常人相比在大肠癌患者或食道癌患者的血液等体液中更多地存在这样的见解，测定在来源于受试体的体液中存在的本发明的癌检测用标志物的量，由其结果来评价受试体有无罹患大肠癌或食道癌的方法。
[0042]本发明的方法包括:(I)癌检测用标志物测定工序、和(2)罹患确定工序。以下，对于各个工序进行详细说明。
[0043]2-1.癌检测用标志物测定工序
[0044]“癌检测用标志物测定工序”是体外测定在来源于受试体的体液中存在的本发明的癌检测用标志物、即C0TL1蛋白质的量的工序。
[0045]在本说明书中，“受试体”是成为大肠癌或食道癌的罹患的检测对象的样本，对应于脊椎动物，优选为哺乳动物，特别优选为人。在本说明书中，在受试体是人的情况下，以后特别称为“受试人”。
[0046]在本说明书中，“体液”是被提供用于大肠癌或食道癌的检测的样品，是指生物学上的流体。体液只要是可能含有本发明的癌检测用标志物的生物学上的流体即可，不特别限定。包含例如，血液、尿、淋巴细胞培养上清、脑脊液、消化液(包含大肠液、食道腺分泌液、唾液)、汗、腹水、鼻粘液、泪、阴道分泌液、精液等。优选为血液或者尿。这里所说的“血液”包含全血、血浆和血清。全血不分静脉血、动脉血或脐带血。体液也可以是由同一个体获得的两种以上不同体液的组合。由于本发明的大肠癌或食道癌的检测方法通过侵袭性低的血液和/或尿也能够检测，所以作为简便的检测方法非常有用。
[0047]“来源于受试体的体液”是指已经从受试体采取的体液，本发明的方式并不包含采取体液的行为本身。来源于受试体的体液，可以在从受试体采取之后直接用于本发明的方法，也可以在采取后直接或实施适当的处理之后进行冷藏或冷冻，并在供给至本发明的方法之前恢复到室温再使用。作为冷藏或冷冻前的适当的处理，包括例如向全血中添加肝素等进行抗凝固处理后，或作为血浆或血清分离等。这些处理基于本领域公知的技术来进行即可。
[0048]在本说明书中，“本发明的癌检测用标志物的量”是指在来源于受试体的体液中存在的COTLl蛋白质的分量。该分量可以是绝对量或相对量的任一种。在绝对量的情况下，对应于在规定的体液量中所含的癌检测用标志物的质量或者体积。在相对量的情况下，是指通过相对于特定的测定值的来源于受试体的癌检测用标志物的测定值来表示的相对的值。可列举例如，浓度、荧光强度、吸光度等。
[0049]癌检测用标志物的量可以在体外使用公知的方法测定。可列举例如，使用能与上述蛋白质特异性地结合的物质进行测定的方法。
[0050]在本说明书中，“能特异性地结合”是指，某物质仅能够与本发明的目标癌检测用标志物即COTLl蛋白质实质地形成复合体。这里的“实质地”是指可以在对本发明的检查法无影响的程度的低水平有由非特异性结合产生的复合体的形成。
[0051]作为“能特异性地结合的物质”，可列举例如COTLl结合蛋白质等。更具体地说，例如，以COTLl蛋白质作为抗原，识别并结合该抗原的“抗COTLl抗体”;优选为识别并结合具有序列号I所示的氨基酸序列的多肽的抗体；或者以该多肽的突变体作为抗原，识别并结合该抗原的抗体、即识别并结合具有序列号I的氨基酸序列的突变型氨基酸序列的多肽的抗体和/或这些抗体的抗体片段。或者也可以是上述抗体或抗体片段的化学修饰衍生物。这里“化学修饰衍生物”包括以下任一者:在获得或保持与上述抗COTLl抗体或其片段的特异性结合的活性方面所需的功能上的修饰；或者在检测上述抗COTLl抗体或其片段方面所需的用于标记的修饰。
[0052]功能上的修饰可列举例如糖基化、去糖基化、PEG化。
[0053]标记上的修饰可列举利用例如荧光色素(FITC、罗丹明、德克萨斯红(Texas Red)、Cy3、Cy5)、荧光蛋白质(例如，PE、APC、GFP)、酶类(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶)、或者生物素、亲和素、链霉亲和素进行的标记。
[0054]抗体可以是多克隆抗体和单克隆抗体的任一者。为了能特异性地检测，优选为单克隆抗体。与COTLl蛋白质特异性地结合的抗COTLl多克隆抗体或抗COTLl单克隆抗体可以通过后述的方法制作。此外，抗人COTLl多克隆抗体已经由Protein Group公司等市售，也可利用该市售品。本发明的抗体的球蛋白类型只要具有上述特征即可，不特别限定，可以是IgG、IgM、IgA、IgE、IgD中任一种,优选为IgG和IgM0抗体片段包含例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv等，但不限于这些。还包含能通过遗传工程学技术产生的抗体片段和衍生物。这样的抗体包含例如合成抗体、重组抗体、多特异性抗体(含双特异性抗体)、单链抗体等。本发明的抗COTLl蛋白质抗体或其抗体片段是针对包含上述蛋白质的至少5个以上、优选为至少7?10个以上或至少8?10个以上的连续或不连续的氨基酸残基的I个或几个表位的抗体。特异性的多克隆抗体例如可以通过以下方法制作，所述方法包括在琼脂糖等载体上结合了 COTLl蛋白质(例如，蛋白质表面抗原(多)肽)的柱中通入免疫了该蛋白质的兔等的抗血清，再回收结合于柱载体上的IgG抗体的步骤。[0055](I)抗COTLl抗体的制作
[0056]以下具体说明本发明中使用的抗COTLl多克隆抗体和抗COTLl单克隆抗体的制作方法。
[0057](1-1)免疫原的调制
[0058]在本发明中制作抗体时，调制作为免疫原(抗原)的COTLl蛋白质。能够在本发明中作为免疫原使用的COTLl蛋白质，例如具有序列号I所示的氨基酸序列的人COTLl蛋白质或者其突变体或者其多肽片段，或者它们与其他肽(例如，信号肽、标记肽等)的融合多肽。作为免疫原的COTLl蛋白质，例如可以利用序列号I的氨基酸序列信息，通过本【技术领域】公知的方法、例如固相肽合成法等，来合成用作免疫原的COTLl蛋白质片段。在使用COTLl蛋白质片段作为免疫原的情况下，优选将其与KLH、BSA等载体蛋白质连接而使用。
[0059]此外，作为免疫原的COTLl蛋白质等也可以利用公知的DNA重组技术获得。编码COTLl蛋白质的cDNA可以通过cDNA克隆化法制作。从表达免疫原COTLl基因的上皮细胞等生物体组织中提取总RNA，将其使用寡聚dT纤维素柱处理，以所得的多聚A(+)RNA为模板，通过RT-PCR法制作cDNA文库，由该文库通过杂交筛选、表达筛选、抗体筛选等筛选来获得目标cDNA克隆。根据需要还可以通过PCR法将cDNA克隆进一步扩增。这样就可以得到与目标基因对应的cDNA。cDNA克隆化技术记载于例如Sambrook，J.和Russel, D.著、Molecular Cloning, A LABORATORY MANUAL (分子克隆实验指南)、Cold Spring HarborLaboratory Press,2001 年 I 月 15 日出版、第 I 卷 7.42 ?7.45、第 2 卷 8.9 ?8.17。
[0060]接下来，将通过上述方法等获得的cDNA克隆整合到表达载体中，再通过培养使用该载体进行了转化或转染的原核或真核宿主细胞，从而可以从该细胞获得目标的C0TL1蛋白质。此时，在从培养上清中获取目标的蛋白质等的情况下，可以通过在编码该多肽的DNA的5’末端侧翼化编码分泌信号序列的核苷酸序列，从而使成熟多肽分泌到细胞外。
[0061]作为表达载体，可列举来源于大肠菌的质粒(例如pET21a、pGEX4T、pC118、pC119、pC18、pC19等)、来源于枯草菌的质粒(例如pUBllO、pTP5等)、来源于酵母的质粒(例如YEpl3、YEp24、YCp50等)等，作为噬菌体DNA可列举λ -噬菌体Ugtl1、λ ZAP等)。并且，也可以使用牛痘病毒等动物病毒、杆状病毒等昆虫病毒载体。载体和表达系统可以从Novagen公司、宝酒造、第一化学药品、Qiagen公司、Stratagene公司、Promega公司、RocheDiagnositics 公司、Life technologies 公司、Genetics Institute 公司、GE Healthcare公司等购得。
[0062]为了向表达载体插入编码C0TL1蛋白质的DNA(例如，cDNA)，可采用:首先，将纯化后的DNA用适当的限制性酶切断，再插入到适当的限制性酶位点或者多克隆位点而与载体连接的方法等。载体除了含有编码该蛋白质的DNA之外，还可以含有调节元件，例如启动子、增强子、多腺苷酸化信号、核糖体结合位点、复制起始位点、终止子、选择标志物等。此外为了容易地纯化多肽可以在多肽的C末端或者N末端连接标记肽而制成融合多肽。代表性的标记肽可列举6?10个残基的组氨酸重复、FLAG、myc肽、GFP蛋白质等，但标记肽不限于这些，此外，关于DNA重组技术在Sambrook, J.和Russel, D.(上述)中记载。为了将DNA片段与载体片段连接，使用公知的DNA连接酶。
[0063]作为宿主细胞，可以使用细菌等原核细胞(例如大肠杆菌(Escherichiacoli)等大肠菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等枯草菌)、酵母(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、昆虫细胞(例如，Sf细胞)、哺乳动物细胞(例如，COS、CHO、BHK)等。向宿主细胞中导入重组载体的导入方法只要是向各个宿主导入DNA的方法即可，没有特别限定。向细菌导入该载体的方法，可列举例如，热激法、使用钙离子的方法、电穿孔法等。这些技术都是本领域公知的，在各种文献中记载。例如可参照Sambrook, J.&Russel, D.(上述)。此外，向动物细胞导入该载体的方法，优选使用例如脂质体转染法(PNAS (1989) Vol.86，6077,PNAS (1987) Vol.84，7413)、电穿孔转染法、磷酸钙法(Virology (1973) Vol.52，456-467)、使用脂质体的方法、DEAE-Dextran (DEAE-葡聚糖)法
坐寸ο
[0064]作为用于培养以大肠菌、酵母菌等微生物作为宿主获得的转化体的培养基，只要是含有微生物能够同化的碳源、氮源、无机盐类等、能有效地进行转化体的培养的培养基即可，可以使用天然培养基、合成培养基的任一种。培养通常在震荡培养或者通风搅拌培养等有氧条件下、在37°C进行6?24小时。培养过程中pH值保持在中性附近。pH值的调整使用无机或有机酸、碱溶液等进行。培养中可根据需要在培养基中添加氨苄青霉素和/或四环素等抗生素。在培养哺乳动物细胞等的转化体的情况下，也在适合各种细胞的培养基中培养后，回收培养上清或者细胞内所生产的蛋白质。此时培养基可以含有血清，也可以不含有血清，但更优选在无血清培养基中培养。在COTLl蛋白质等在菌体内或者细胞内的情况下，通过破碎菌体或细胞来提取蛋白质。此外在COTLl蛋白质在菌体外或者细胞外生产的情况下，直接使用培养液，或者通过离心分离等除去菌体或者细胞。
[0065]在不附加标记肽的情况下生产本发明的蛋白质的情况下，作为其纯化法可列举例如利用离子交换层析的方法。此外也可以是组合凝胶过滤层析和/或疏水性层析、等电点层析等的方法。另一方面，在该蛋白质上带有组氨酸重复、FLAG、myc、GFP这样的标记肽的情况下，可以采用利用一般使用的适合各种标记肽的亲和层析的方法。是否真正获得了 C0TL1蛋白质等，可以通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳等来确认。
[0066](1-2)抗体的制作
[0067]以这样获得的C0TL1蛋白质作为抗原，可以获得特异性地识别C0TL1蛋白质的抗体。
[0068]更具体地说，蛋白质、蛋白质片段、蛋白质突变体、融合蛋白质等，包含用于引起抗体形成的抗原决定簇或者表位，这些抗原决定簇或表位可以是直链结构(连续)，或可以是更高级结构(不连续)。此外，该抗原决定簇或表位可以通过在本【技术领域】公知的所有方法来鉴定。
[0069]通过本发明的C0TL1蛋白质可以诱导所有形态的抗体。只要分离出该蛋白质的全部或者一部分或者表位，就可以用常用的技术制造多克隆抗体和单克隆抗体的任一种。方法例如有 Kennet 等(主编)，Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension inBiological Analyses, Plenum Press, New York, 1980 中所列举的方法。
[0070](1-2-1)多克隆抗体的制作
[0071]为了制作多克隆抗体，首先将所得的C0TL1蛋白质在缓冲液中溶解调制免疫原。此外，根据需要，为了有效地进行免疫可以添加佐剂。作为佐剂的例子，可列举市售的弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FIA)等，可以将它们单独或者混合使用。
[0072]接下来，将上述调制的免疫原对哺乳动物例如大鼠、小鼠(例如近交系小鼠Balb/c)、兔等施与、免疫。免疫原的一次的施与量根据免疫动物的种类、施与途径等适宜确定，可以每I只动物约50?200 μ g。作为免疫原的施与方法，可列举例如，使用FIA或FCA的皮下注射、使用FIA的腹腔内注射、以及使用0.15mol/L的氯化钠的静脉注射等，但不限于此。此外，对免疫的间隔不特别限定，初次免疫之后，以几天到几周间隔、优选以I?4周间隔进行2?10次、优选为3?4次追加免疫。初次免疫后,通过ELISAGinzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,酶联免疫吸附测定)法等来反复测定免疫动物血清中的抗体效价，当抗体效价达到平高线(Plateau)时，向静脉内或者腹腔内注射免疫原，作为最终免疫。免疫之后，可以从血液中回收针对COTLl蛋白质的多克隆抗体。在需要单克隆抗体的情况下，制作后述的产生抗COTLl抗体的杂交瘤。
[0073](1-2-2)单克隆抗体的制作
[0074]根据本发明，可以制作生产特异性地识别COTLl蛋白质的抗COTLl单克隆抗体的杂交瘤。这种杂交瘤能够通过常用的技术产生并且鉴定。用于产生这种杂交瘤的方法之一，将动物用本发明的蛋白质免疫，从免疫后的动物采取产生抗体的细胞，并使该产生抗体的细胞与骨髓瘤(myeloma)细胞株融合，由此生产杂交瘤细胞，并且鉴定产生与COTLl蛋白质等结合的单克隆抗体的杂交瘤即可。
[0075]<从免疫动物回收产生抗体的细胞>
[0076]作为产生抗体的细胞，可列举脾细胞、淋巴结细胞、末梢血细胞等，优选脾细胞或局部淋巴结细胞。这些细胞使用从用COTLl蛋白质免疫过的动物中摘出或者采取的即可。对动物免疫的方法依据上述多克隆抗体制作的项。作为与产生抗体的细胞融合的骨髓瘤细胞株，可以使用小鼠等动物的一般可以购得的株化细胞。作为使用的细胞株，优选具有药剂选择性，并具有在未融合的状态下在HAT选择性培养基(含有次黄嘌呤、氨基喋呤、胸苷)中无法生存、只有在与产生抗体的细胞融合了的状态下才能生存的性质。此外，株化细胞优选来源于与免疫动物同种系的动物。作为骨髓瘤细胞株的具体例，有来源于BALB/c小鼠的次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)缺陷细胞株P3X63-Ag.8株(ATCCTIB9)、P3X63-Ag.8.Ul 株(JCRB9085)、P3/NSI/l_Ag4_l 株(JCRB0009)、P3x63Ag8.653 株(JCRB0028)或 Sp2/0-Agl4 株(JCRB0029)等。
[0077]<细胞融合>
[0078]细胞融合例如，在不含血清的DMEM、RPM1-1640培养基等动物细胞用培养基中，将产生抗体的细胞和骨髓瘤细胞株以约1:1?20:1的比例混合，在细胞融合促进剂的存在下进行融合反应。作为细胞融合促进剂，可以以约10?80%浓度使用平均分子量为1500?4000道尔顿(Da)的聚乙二醇等。另外根据情况不同，为提高融合效率也可以并用二甲基亚砜等辅助剂。还可以进一步使用利用了电刺激(例如电穿孔)的市售的细胞融合装置来使产生抗体的细胞和骨髓瘤细胞株融合(Nature, 1977，Vol.266，550-552)。
[0079]<杂交瘤的分选和克隆化>
[0080]从细胞融合处理后的细胞中分选出作为目标的产生抗COTLl抗体的杂交瘤。作为其方法，将细胞悬浮液用例如含胎牛血清的RPM1-1640培养基等进行适当的稀释后，在微量滴定板上以200万个/孔左右接种。向各孔内加入选择培养基，之后适当地更换选择培养基进行培养。培养温度为20?40°C，优选为约37°C。在骨髓瘤细胞为HGPRT缺陷株或者胸苷激酶缺陷株的情况下，可以通过使用含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷的选择性培养基(HAT培养基)仅选择性地培养具有产生抗体的能力的细胞与骨髓瘤细胞株的杂交瘤，使其增殖。其结果是，可以获得从使用选择培养基开始培养后约14天前后生长的细胞作为杂交瘤。
[0081]接下来，筛选在增殖的杂交瘤的培养上清中是否存在目标抗体。杂交瘤的筛选按照通常的方法即可，不特别限定。例如，采取作为杂交瘤生长的孔中所含的培养上清的一部分，通过酶免疫测定法(EIA=Enzyme Immuno Assay、和ELISA)、放射线免疫测定法(RIA:Radio Immuno Assay)等来进行。融合细胞的筛选通过有限稀释法等来进行，最终建立作为产生单克隆抗体的细胞的杂交瘤。本发明的杂交瘤如下所述，在利用RPM1-1640、DMEM等基本培养基的培养中是稳定的，并产生、分泌与来源于大肠癌或食道癌的COTLl蛋白质特异性地反应的单克隆抗体。
[0082]<抗体的回收>
[0083]单克隆抗体可以使用常用的技术回收。即，作为从建立好的杂交瘤中采取单克隆抗体的方法，可以采用通常的细胞培养法或者腹水形成法等。在细胞培养中，将杂交瘤在含10%胎牛血清的RPM1-1640培养基、MEM培养基或者无血清培养基等动物细胞培养基中，在常用的培养条件(例如37°C、5% CO2浓度)下培养2?10天，从其培养上清中获得抗体。在腹水形成法的情况下，可以将杂交瘤以约1000万个施与至与骨髓瘤细胞所来源的哺乳动物同种系的动物的腹腔内，使杂交瘤大量增殖。然后在I?2周之后采取腹水或者血清。
[0084]在上述抗体的采取方法中，如果需要纯化抗体，则可以适宜选择硫酸铵盐析法、离子交换层析法、亲和层析法、凝胶过滤层析法等公知的方法，或者通过上述方法的组合，从而获得被纯化的本发明的单克隆抗体。
[0085]本发明的单克隆抗体包含嵌合抗体，例如鼠科单克隆抗体的人化型。此外，根据本发明，还可提供上述抗体的抗原结合片段。作为可以使用常用的技术产生的抗原结合片段的例子，包含Fab及F(ab’)2、Fv等片段，但不限于这些。此外也可提供能通过遗传工程学技术产生的抗体片段和衍生物。本发明的抗体在体外和体内的任一种情况都可以在用于检测本发明的多肽或其(多)肽片段的存在的测定中使用。此外本发明的抗体也可以用于通过免疫亲和层析法来纯化蛋白质或者蛋白质片段。
[0086]为了实现测定中的特异性检测，优选使用单克隆抗体，但即使是多克隆抗体，也可以通过所谓吸收法获得特异抗体，所述吸收法包括使抗体与结合有纯化多肽的亲和柱结合的步骤。
[0087](2)使用抗COTLl抗体等的本发明的癌检测用标志物的体外测定
[0088]作为使用上述(I)所制作的抗COTLl抗体等来体外测定来源于受试人的体液中所存在的本发明的癌检测用标志物、即COTLl蛋白质的量的方法(免疫学测定法)，可列举例如，酶免疫测定法(ELISA、EIA)、荧光免疫测定法、放射免疫测定法(RIA)、发光免疫测定法、免疫比浊法、胶乳凝集反应、胶乳比浊法、红血球凝集反应、颗粒凝集反应或者蛋白质印迹法。
[0089]在将本发明的癌检测用标志物测定方法通过酶免疫测定法、荧光免疫测定法、放射免疫测定法或者发光免疫测定法等使用标记的免疫测定法来实施的情况下，优选将上述抗COTLl抗体等进行固定化，或者将样品中的成分固定化，从而进行这些免疫学反应。作为固相载体，可以使用由聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚乙烯基甲苯、聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、尼龙、聚甲基丙烯酸酯、胶乳、明胶、琼脂糖、纤维素、Sepharose (琼脂糖凝胶)、玻璃、金属、陶瓷或者磁性体等材质制成的珠、微板、试管、棒或者试验片等形状的不溶性载体。固定化可以如下进行:按照物理吸附法、化学结合法或它们的并用等公知的方法，使固相载体与上述抗COTLl抗体等或样品成分结合。
[0090]在本发明中，为了容易地检测上述抗COTLl抗体与体液中的来源于大肠癌细胞或食道癌细胞的本发明的癌检测用标志物的反应，可以通过标记上述抗COTLl抗体来直接检测该反应，或者通过使用标记二抗来间接检测该反应。在本发明的胃癌检测方法中，从灵敏度的方面考虑，优选利用后者的间接检测(例如夹心法等)。
[0091]作为标记物质，在酶免疫测定法的情况下，可以使用过氧化物酶(POD)、碱性磷酸酶、β -半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖氧化酶、乳酸脱氢酶、淀粉酶或者生物素-亲和素复合体等；在荧光免疫测定法的情况下，可以使用异硫氰酸荧光素、四甲基异硫氰酸罗丹明、取代异硫氰酸罗丹明、二氯三嗪基异硫氰酸酯、Alexa或AlexaFluoro等；而且在放射免疫测定法的情况下，可以使用氚、碘125或碘131等。此外发光免疫测定法可以使用NADH-、FMNH2-、萤光素酶系、鲁米诺-过氧化氢-POD系、吖啶酯系或者二氧杂环丁烷化合物系等。
[0092]关于标记物质与抗体的结合方法，在酶免疫测定法的情况下，可以使用戊二醛法、马来酰亚胺法、二硫化吡啶法或者高碘酸法等公知的方法；在放射免疫测定法的情况下，可以使用氯胺T法、鲍尔通-亨特(Bolton-Hunter)法等公知的方法。测定的操作法可以通过公知的方法(Current protocols in Protein Sciences, 1995年，John ffiley&Sons Inc.；Current protocols in Immunology, 2001 John ffiley&Sons Inc.)进行。
[0093]例如，在将上述抗COTLl抗体等直接标记的情况下，可以将体液中的成分固定化，使其与标记后的上述抗C0TL1抗体接触，形成本发明的癌检测用标志物(C0TL1蛋白质)-抗C0TL1抗体的复合体。然后清洗分离未结合的标记抗体，通过结合标记抗体量或未结合标记抗体量，可以测定体液中的癌检测用标志物(C0TL1蛋白质)的量。
[0094]此外，例如，在使用标记二抗的情况下，使本发明的抗体与样品反应(一次反应)，再与标记二抗反应(二次反应)。一次反应和二次反应可以以相反的顺序进行，也可以同时进行，或延迟时间进行。通过一次反应和二次反应，形成固定化了的本发明的癌检测用标志物-抗C0TL1抗体-标记二抗的复合体、或者固定化了的抗C0TL1抗体-本发明的癌检测用标志物-标记二抗的复合体。然后清洗分离未结合的标记二抗，通过结合标记二抗量或未结合标记二抗量，可以测定样品中的癌检测用标志物的质量。
[0095]具体地，在酶免疫测定法的情况下，使标记酶在其最适条件下与底物反应，通过光学方法等测定其反应生成物的量。在荧光免疫测定法的情况下，测定标记荧光物质产生的荧光强度；在放射免疫测定法的情况下，测定放射性物质标记产生的放射能量。在发光免疫测定法的情况下，测定发光反应系统产生的发光量。
[0096]在本发明的方法中，在对于将免疫比浊法、胶乳凝集反应、胶乳比浊法、红血球凝集反应或颗粒凝集反应等的免疫复合体凝集物的生成，通过利用光学方法测定其透射光或散射光、或目测测定的测定法来实施的情况下，作为溶剂可以使用磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、Tris缓冲液或者Good缓冲液等，还可以在反应系中进一步含有聚乙二醇等反应促进剂和/或非特异性反应抑制剂。[0097]显示本发明的检测法的优选实施方式的一例。首先将本发明的抗体作为一抗固定于不溶性载体。并优选将未吸附抗原的固相表面用与抗原无关的蛋白质(小牛血清、牛血清白蛋白、明胶等)进行封闭。接下来使固定化的一抗与受测样品接触。接着，使在与上述一抗不同的部位与本发明的癌检测用标志物反应的标记二抗接触，检测来自该标记的信号。这里使用的“在与一抗不同的部位与癌检测用标志物反应的二抗”只要是识别一抗与癌检测用标志物(C0TL1蛋白质)的结合部位以外的部位的抗体即可，不特别限制，无论免疫原的种类，可以是多克隆抗体、抗血清、单克隆抗体的任一种，还可以使用这些抗体的片段(如Fab、F(ab’)2、Fab、Fv、scFv等)。此外作为二抗还可以使用多种单克隆抗体。
[0098]此外，还可以与此相反，将本发明的抗体附加标记作为二抗，将在与本发明的抗体不同的部位与癌检测用标志物反应的抗体作为一抗固定于不溶性载体，使该固定化的一抗与受测样品接触，接着与作为二抗的带标记的本发明的抗体接触，检测来自上述标记的信号。
[0099]此外因为本发明的抗体如上所述与来源于大肠癌细胞或食道癌细胞的癌检测用标志物特异性地反应，所以可以作为癌的检测药使用。本发明的检测药含有本发明的抗体，因此可以使用本发明的检测药，通过检测从被怀疑罹患大肠癌或食道癌的个体中采取的样品中所含的来源于大肠癌细胞或食道癌细胞的癌检测用标志物，来检测或检查该个体中的大肠癌或食道癌、或有无罹患这些癌。
[0100]另外，本发明的检测药，虽然只要是用于进行免疫学测定的方法就在任一方法中都可以利用，但通过与本【技术领域】公知的免疫层析用试纸条等简便的方法组合使用，可以进一步简便且迅速地检测癌。免疫层析用试纸条例如由包含容易吸收样品的材料的样品接受部、含有本发明的检测药的试剂部、进行样品与检测药的反应生成物的移动的展开部、使展开的反应生产物显色的标记部、进行显色的反应生产物的展开的提示部等构成，可以制成与妊娠诊断药同样的形态。首先，在样品接收部加入样品后，样品接收部吸收样品而使样品到达试剂部。接着，在试剂部，样品中的来源于大肠癌细胞或食道癌细胞的癌检测用标志物与抗COTLl抗体的反应发生,反应生成的复合体移动通过展开部而到达标记部。在标记部，上述的反应复合体与标记二抗的反应发生，与该标记二抗的反应生成物展开抵达提示部，则显色被确认。上述免疫层析用试纸条因为完全不会带给使用者痛苦和/或由试剂使用产生的危险性，所以可以在家庭中的监测中使用，将其结果在各医疗机构水平上精查和/或治疗(外科切除等)，从而可以预防转移和/或复发。而且现在该试纸条可以通过例如日本特开平10-54830号公报所记载的那样的制造方法来廉价地大量生产。此外通过将本发明的检测药与已知的针对大肠癌或食道癌的肿瘤标志物的检测药组合使用，可以实现置信度高的诊断。
[0101]2-2.罹患确定工序
[0102]“罹患确定工序”是基于上述癌检测用标志物测定工序中测定的蛋白质的量来评价或确定大肠癌或食道癌的罹患的工序。基于测定的癌检测用标志物、即COTLl蛋白质的质量来确定大肠癌或食道癌癌的罹患。作为确定方法的一例，可列举例如，在受试体的癌检测用标志物的量和健常体的该量相比在统计学上有意义地多时，确定为罹患了大肠癌或食道癌的方法。
[0103]这里，“大肠癌”是指在大肠(盲肠、结肠、直肠)发生的恶性肿瘤。作为根据部位不同而区别的名称的盲肠癌、结肠癌、直肠癌包含在大肠癌中。大肠癌在病理学上分类为腺癌、内分泌细胞癌、腺鳞癌、鳞癌等，但不限于这些。
[0104]这里，“食道癌”是指在食道(从咽到胃的消化管部位)发生的恶性肿瘤。食道癌在病理学上分类为鳞癌、腺癌、粘表皮癌等，但不限于这些。
[0105]这里所指的“健常体”是指至少未罹患大肠癌和食道癌的个体，优选为健康的个体。并且健常体要和受试体为同一生物种。例如，在供检查的受试体为人(受试人)的情况下，健常体也必须为人(在本说明书中以下称为“健常人”)。健常体的身体条件优选与受试体相同或近似。身体条件例如，在人的情况下，对应于种族、性别、年龄、身高、体重等。
[0106]“统计学上有意义”，可列举例如，所得的值的危险率(有意义水准)小于5%(p< 0.05)、例如1%或者0.1%的情况。因此“统计学上有意义地多”是指在将从受试体和健常体分别获得的癌检测用标志物的量的差异进行统计学处理时，两者之间存在有意义的差异，并且受试体的上述蛋白质的量要高于健常体的该量。通常，关于体液中的癌检测用标志物的量，受试体多达健常体的2倍以上，优选为3倍以上、4倍以上、或5倍以上、更优选为10倍以上或20倍以上、进一步优选为50倍以上。如果量的差异为3倍以上，则可以说置信度高，统计学上也有意义地多。统计学的处理的检验方法只要适宜使用能够判断有意义性的有无的公知的检验方法即可，不特别限定。例如，可以使用学生t检验法、多重比较检验法。
[0107]健常体的体液中的癌检测用标志物的量，优选使用与在上述工序中已经说明的受试体的体液中的癌检测用标志物的量的测定方法同样的方法来测定。健常体的体液中的癌检测用标志物的量还可以在每逢测定受试体的体液中的癌检测用标志物的量时测定，但也可以利用事先测定好的癌检测用标志物的量。特别是如果事先测定好各种身体条件的健常体的癌检测用标志物的量，并将其数值输入电脑而数据库化，则通过在该电脑中输入受试体的身体条件，就可以马上利用具有与该受试体相比较最适合的身体条件的健常体的癌检测用标志物的量，因此是方便的。
[0108]受试体的体液中的癌检测用标志物的量与健常体的体液中的癌检测用标志物的量相比在统计学上有意义地多的情况下，判定该受试体罹患大肠癌或食道癌。对成为本发明的对象的大肠癌、食道癌的病期并没有特别的限制，遍及早期癌到晚期癌。
[0109]这样，根据本发明的大肠癌或食道癌检查方法，包括使用抗体免疫学测定体液样品中的癌检测用标志物的工序。通过本发明的方法，不仅可以判定或评价受试体是否罹患大肠癌或食道癌，还可以识别大肠癌患者与非大肠癌患者、或识别食道癌患者与非食道癌患者。
[0110]3.癌诊断用试剂盒
[0111]本发明的第三方式是癌诊断用试剂盒。
[0112]“癌诊断用试剂盒”为了检测癌罹患的有无、罹患的程度或改善的有无和/或改善的程度，另外根据情况为了筛选对癌的预防、改善或治疗有用的候选物质，优选为了癌诊断，而直接或间接地利用。
[0113]本发明的试剂盒，作为其构成物，包含能特异性识别并结合以下蛋白质的物质，所述蛋白质是在与选自大肠癌和食道癌中的癌的罹患有关的体液样品中、特别是血液、血清、血浆中表达变动的COTLl蛋白质，优选为具有序列号I所示的氨基酸序列或者其突变体序列的蛋白质。具体地说，包括例如抗COTLl蛋白质抗体或其抗体片段、或者它们的化学修饰衍生物。这些抗体可以与例如聚合物制、纤维素制等适宜材质的孔、板、条等任意形状的固相载体结合，另外，也可以制成例如上述的免疫层析用试纸条的形态。此外，还可以包含例如，标记二抗、以及为检测标记所需的底物、载体、清洗缓冲液、样品稀释液、酶底物、反应停止液、纯化的作为标准物质的COTLl蛋白质等、使用说明书等。
[0114]实施例
[0115]以下通过实施例来更具体地说明本发明。但本发明不受该实施例限制。
[0116]<参考例>
[0117](I)中空丝过滤器的制作
[0118]将膜表面具有截留分子量约5万的孔径的聚砜中空丝100根捆成束，在不使中空丝中空部堵塞的前提下将两末端用环氧树脂系封装剂固定在玻璃管上，制成微型模块。该微型模块(模块A)可用于除去血清或血浆中的高分子量蛋白质，其直径约7mm，长度约为17cm。同样地使用截留分子量约3千的孔径的膜制成用于浓缩低分子量蛋白质的微型模块(模块B)。微型模块在一端具有与中空丝内腔连接的入口，另一侧的端成为出口。中空丝微型模块的入口和出口通过硅管连接而形成封闭循环系流路。液体受蠕动泵的驱动而在该流路内循环。通过流路中途所具备的T字连接器，将3根模块A和I根模块B串联连接制成一个中空丝过滤器。另外，中空丝外套的玻璃管上具备排出从中空丝漏出的液体的端口。这样构成I个模块组。将该中空丝过滤器用蒸馏水清洗，填充PBS (含0.15mM NaCl的磷酸缓冲液，PH值7.4)水溶液。然后，分级原液的血清或血浆从该中空丝过滤器的流路入口被注入，分级、浓缩之后由流路出口被排出。注入该中空丝过滤器中的血清或血浆在每个模块A中与分子量约5万的分子 筛作用，分子量低于5万的低分子的成分被模块B浓缩、调制。
[0119]<实施例1 >
[0120](I)健常人和大肠癌患者血液的蛋白质鉴定
[0121]调制从获得了知情同意的大肠癌患者11名得到的血清的混合液、和从同年龄的健常人30名得到的血清的混合液。将各混合液通过孔径0.22 μ m的过滤器过滤除去杂质，调制成蛋白质浓度50mg/mL。将该血浆再用25mM碳酸氢铵溶液(pH值8.0)稀释成12.5mg/mL，使用参考例(I)所示的中空丝过滤器进行基于分子量的分级。将分级后的血清样品(总量1.8mL、最多含有250 μ g的蛋白质)冻结干燥之后，使用100 μ L的25mM碳酸氢铵溶液溶液(pH值8.0)再次溶解。对于该样品，用总蛋白质量的1/50量的胰蛋白酶，在37°C、2~3小时的条件下进行肽消化，使用脱盐柱(Waters公司)进行脱盐处理后，再使用离子交换柱(KYA今”)ο夕一 < )分级成8种级分。将各个级分使用反向柱(KYA今”)ο夕一文)进一步分级，对于溶出的肽，使用在线连接的质量分析仪Q-TOF Premier (Micromass公司)进行3次测定。将其测定数据通过作为分析软件的MASCOT ( 卜U 〃 ^ ^寸4工> ^社)进行分析，鉴定各个样品所含的蛋白质。将其结果在健常对照者与癌患者之间进行比较，在被鉴定的蛋白质中，作为在健常对照者(I号~3号)中3次测定均未检测到、在大肠癌患者(I号~3号)中3次测定全部检测到的蛋白质，发现了 COTLl蛋白质。将分析时算出的、关于COTLl蛋白质的存在置信度的得分记载于表1。
[0122]表1
【权利要求】
1.癌的检查方法，包含以下步骤:体外测定在来源于受试体的体液中存在的包含COTLl蛋白质的癌检测用标志物的量，基于该量来评价受试体有无罹患选自大肠癌和食道癌中的癌。
2.根据权利要求1所述的方法，上述COTLl蛋白质是包含序列号I所示的氨基酸序列、与该氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨基酸序列、或具有构成这些氨基酸序列的至少7?10个以上的连续氨基酸残基的序列部分的多肽。
3.根据权利要求1或2所述的方法，在受试体的上述癌检测用标志物的量与健常体的该量相比统计学上有意义地多时，评价或确定为罹患了选自大肠癌和食道癌中的癌。
4.根据权利要求3所述的方法，上述统计学上有意义地多的量是健常体的2倍以上。
5.根据权利要求1?4的任一项所述的方法，上述测定使用能与上述癌检测用标志物特异性地结合的物质。
6.根据权利要求5所述的方法，上述能与癌检测用标志物特异性地结合的物质是抗COTLl抗体和/或其抗体片段。
7.根据权利要求1?6的任一项所述的方法，上述体液样品为血液或尿。
8.选自大肠癌和食道癌中的癌的诊断用试剂盒，包含抗COTLl抗体、其抗体片段、和/或它们的化学修饰衍生物。
【文档编号】C07K16/18GK103765220SQ201280041642
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2012年8月28日 优先权日:2011年8月29日
【发明者】小林道元, 田中祥德, 高山爱子, 郑基晚, 坂井义治, 冈部宽 申请人:东丽株式会社, 国立大学法人京都大学