通过与TaqMan探针组合的多重PCR从单一抗体产生细胞中获得Fab片段的方法
【专利摘要】本文报道了用于从单细胞中扩增和定量编码同源IgG重链和轻链的核酸（人IgG同种型）的多重单管实时逆转录酶基因特异性聚合酶链反应的方法。
【专利说明】通过与TaqMan探针组合的多重PCR从单一抗体产生细胞中获得Fab片段的方法
[0001]在本文中报道了通过组合多重聚合酶链式反应(PCR)和TaqMan探针，从单一抗体产生细胞中获得抗体的方法，以允许PCR产物的快速筛选。通过体外翻译，可以获得各个抗体的Fab片段，并且可以测定Fab片段的结合性质。
[0002]发明背景
[0003]随着杂交瘤技术的建立(Cole,S.P.C.，等人，Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy, Alan R.Liss, p.77 (1985)； 和 Boerner, P.，等人，J.1mmunol.147 (1991) 86-95)，单克隆免疫球蛋白已经在科学研究、人类保健和诊断学中发挥着关键的作用。因此，单克隆(特别是治疗性)免疫球蛋白的产生是一个进行了大量研究的领域。在这方面，其中杂交瘤技术和曬菌体展示技术(Hoogenboom, H.R.和Winter, G.，J.Mol.Biol.227(1992)381-388 ；Marks, J.D.，等人，J.Mol.Biol.222 (1991) 581-597)是用于单克隆免疫球蛋白产生的两种最常见技术。在杂交瘤技术中，稳定克隆的获得是需要克服的障碍，因此，减少抗体的多样性，使得仅有限数量的B细胞可以成功地融合、增殖，以及随后的被表征。相似地，基于噬菌体或酵母展示的组合文库方法的缺点是免疫球蛋白重链和轻链的随机配对。原始重链和轻链对的分离以及非同源配对(non cognate pairing),需要筛选大量免疫球蛋白产生细胞以鉴定高亲和力的重链和轻链对。此外，此类非同源对可能显示出与人抗原的不想要的交叉反应。最后，由于固有的选择偏倚，通过选择和筛选组合文库鉴定的靶特异性免疫球蛋白的遗传多样性通常是受限制的。
[0004]可以根据本领域已知的方法从免疫球蛋白产生细胞中产生免疫球蛋白。此类方法是例如杂交瘤技术。不同的方法是基于免疫球蛋白的核酸序列的鉴定。通常，所述方法足以鉴定可变区或者甚至仅CDR区或者仅CDR3区的序列。例如，mRNA分离自免疫球蛋白产生细胞库，并用于构建编码免疫球蛋白的CDR区的cDNA文库。然后，将cDNA文库转染到合适的宿主细胞，例如NSO或CHO中，并用于筛选特异性免疫球蛋白产生。
[0005]W02008/104184报道了用于克隆同源抗体(cognate antibody)的方法。Tiller 等人(Tiller,T.，等人，J.1mmunol.Meth.329 (2007) 112-124)报道了来自单个人B细胞的单克隆抗体的有效产生。Braeuninger等人(Braeuninger, A.,等人，Blood93 (1999) 2679-2687)报道了来自T细胞富集的B细胞淋巴瘤的单个B细胞分子的分析。Rohatgi 等 A (Rohatgi, S.,等人，J.1mmunol.Meth.339 (2008) 205-219)报道了嵌套式(RT-) PCR引物的系统设计和测试。在W002/13862中，报道了改变B细胞介导的病理的方法和组合物。Haurum等人(Mei jer, P.J.和Haurum, J.S., J.Mol.Biol.358(2006)764-772)报道了一步 RT 多重重叠延伸 PCR (one-step RT-multiplexoverlap extension PCR)。Stollar等人和Junghans等人通过单细胞PCR反应报道了序列分析(Wang, X.Stollar, B.D., J.1mmunol.Meth.244 (2000) 217-225 ；Coronella, J.A.和 Junghans, R.P., Nucl.Acids Res.28 (2000) E85)。Jiang, X.和 Nakano, H.,等人(Biotechnol.Prog.22(2006)979-988)报道了用于体外转录和翻译的线性表达元件的构建。[0006]发明概述
[0007]已经发现，通过组合在反转录和基因特异性聚合酶链反应中所需的引物，以及在多重单管实时聚合酶链反应中实时定量所需的探针，可以改进(例如变得更快和更强)通常使用的用于获得编码同源(cognate) VH和VL的核酸的多步骤方法。
[0008]在一个方面，在本文中报道了用于多重单管实时逆转录酶基因特异性聚合酶链反应的方法，所述聚合酶链反应用于从单个B细胞或成浆细胞或浆细胞中扩增和定量编码同源IgG重链和轻链的核酸(人IgG同种型)，所述方法包括以下步骤:
[0009]-用第一和第二5’-引物以及第一和第二 3’-引物以及第一和第二 TaqMan探针，在一个步骤中进行反转录和聚合酶链反应。
[0010]在一个实施方案中，第一 5’ -引物与编码重链前导肽或第一重链构架区的核酸序列互补。在一个实施方案中，第二 5’ -引物与编码轻链前导肽或第一轻链构架区的核酸序列互补。在一个实施方案中，第一 3’ -引物与编码重链CHl结构域的C-端氨基酸残基的核酸序列互补。在一个实施方案中，第二 3’ -引物与编码轻链恒定域的C-端氨基酸残基的核酸序列互补。在一个实施方案中，第一 TaqMan探针与编码重链CHl结构域的N-端氨基酸残基的核酸互补。在一个实施方案中，第二 TaqMan探针与编码轻链恒定域的N-端氨基酸残基的核酸互补。
[0011]在一个方面，本文中还报道了获得单克隆抗体的方法，其包括体外翻译编码人免疫球蛋白G片段的核酸，其中使用如本文中所报道的用于扩增和定量编码同源IgG重链和轻链的核酸的多重单管实时逆转录酶基因特异性聚合酶链反应方法，通过特异性扩增获自产生单一免疫球蛋白的人B细胞、成浆细胞或浆细胞或者包含人免疫球蛋白基因座的动物的B细胞的mRNA的cDNA片段来获得核酸。
[0012]在一个实施方案中，随后将Fab PCR产物转录成mRNA并使用大肠杆菌裂解物进行体外翻译。`
[0013]使用如本文中所报道的方法，有可能根据B细胞产生的免疫球蛋白的抗原结合特征，表征所提供的许多B细胞。因此，不会发生免疫球蛋白多样性的丢失。由于分析的B细胞是体外成熟步骤之后获得的成熟B细胞，所以所述B细胞产生的免疫球蛋白不太可能显示出与其他抗原的交叉反应。
[0014]在另外的实施方案中，如本文中所报道的方法的特征在于，引物提供了用于5’_引物的编码翻译起始密码子ATG的突出端和/或用于3’-引物的编码翻译终止密码子TTA的突出端。在另外的实施方案中，如本文中所报道的方法的特征在于包括其他步骤:
[0015]-提供单细胞并获得该细胞的mRNA。
[0016]如本文中所报道的另一方面是用于产生免疫球蛋白Fab片段的方法，其包括以下步骤:
[0017]-提供单一免疫球蛋白产生细胞，
[0018]-使用如本文中所报道的用于扩增和定量编码同源IgG重链和轻链的核酸的多重单管实时逆转录酶基因特异性聚合酶链反应，从细胞中获得编码免疫球蛋白轻链和重链可变域，任选地还编码轻链恒定域的一部分和重链ChI结构域的一部分的核酸，
[0019]-产生包含所获得的核酸的线性表达基质，
[0020]-体外翻译核酸从而产生免疫球蛋白Fab片段。[0021]本文中所报道的另一方面是用于产生免疫球蛋白的方法，其包括以下步骤:
[0022]-提供单一免疫球蛋白产生细胞，
[0023]-使用用于扩增和定量如本文中所报道的编码同源IgG重链和轻链的核酸的多重单管实时逆转录酶基因特异性聚合酶链反应，从细胞中获得编码免疫球蛋白轻链和重链可变域的核酸，
[0024]-将前述步骤中获得的每一核酸与编码各个免疫球蛋白轻链或重链恒定域的非编码C-端恒定域氨基酸残基的核酸有效连接，
[0025]-用在前述步骤中获得的核酸转染真核或原核细胞，
[0026]-培养经转染的细胞，在一个实施方案中，在适合于表达免疫球蛋白的条件下培养经转染的细胞，
[0027]-从细胞或者培养基中回收免疫球蛋白，从而产生免疫球蛋白。
[0028]在如本文中所报道的全部方法的一个实施方案中，免疫球蛋白是免疫球蛋白G类(IgG)。
[0029]在如本文中所报道的全部方法的一个实施方案中，每一引物彼此相互独立地选自SEQ ID NO:05,SEQ ID NO:06,SEQ ID NO:07,SEQ ID NO:08,SEQ ID NO:09,SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12。
[0030]在如本文中所报道的全部方法的一个实施方案中，用彼此相互独立的一对引物进行聚合酶链反应，所述引物选自SEQ ID NO:05, SEQ ID NO:06、SEQ ID NO:07、SEQ IDNO:08, SEQ ID NO:09,SE`Q ID NO:10,SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12。
[0031]发明详述
[0032]在一个方面，本文报道了用于多重单管实时逆转录酶基因特异性聚合酶链反应的方法，所述聚合酶链反应用于扩增和定量来自单个B细胞或成浆细胞或浆细胞的编码同源IgG重链和轻链的核酸(人IgG同种型)。
[0033]-使用第一和第二5’ -引物以及第一和第二 3’ -引物以及第一和第二 TaqMan探针，在一个步骤中进行反转录和聚合酶链反应。
[0034]已经发现，通过组合在反转录和基因特异性聚合酶链反应中所需的引物，以及在多重单管实时聚合酶链反应中实时定量所需的探针，可以改进(例如变得更快和更强)通常使用的用于获得编码同源VH和VL的核酸的多步骤方法。
[0035]尤其可以将该方法用作为改进目前所使用的具有某些缺点的两步方法的其他可能方法。例如，由于有可能诱导引物-引物-二聚体形成和/或诱导非特异性结合，所以为了增加灵敏性而使用高引物浓度是不合适的，或者增加扩增循环的数目可以导致非特异性序列的扩增。
[0036]通过使用用人pan B细胞标记，⑶19包被的磁性微珠(参见例如，Bertrand, F.E.,III,等人，Blood90 (1997) 736-744)，可以从外周血中分离B细胞。在有限稀释方法的情况下，可以将单细胞置于96孔微量滴定板的孔中。可以提取这些细胞的mRNA。
[0037]在如本文中所报道的方法中，在单管聚合酶链反应中，将多重聚合酶链反应用于同时扩增编码重链和轻链可变域的核酸。与在分离的反应中扩增重链可变域和轻链可变域相反，当前方法提供了增加的灵敏性和增加量的扩增序列。在聚合酶链反应中使用基因特异性引物增强了该方法的特异性和准确性。[0038]对于所需的灵敏性和准确性，更复杂的基因结构(在人IgG的情况下)需要引物设计、放置以及聚合酶链反应的不同策略。
[0039]因此，本文报道了可以在不连接和连接扩增的重链编码区和轻链编码区的情况下实施多重实时逆转录酶聚合酶链反应。对于所获得的核酸的体外翻译，有益的是编码结构域包含适合于形成链间二硫键的半胱氨酸残基。
[0040]例如，在Ausubel, F.M.，ed.，Current Protocol s in MolecularBiology, Volumes I toIII (1997), Wiley and Sons ；Sambrook, J.,等人,MolecularCloning:A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989) ；Morrison, S.L.,等 A , Proc.Natl.Acad.Sc1.USA81 (1984) 6851-6855 ；US5, 202, 238和US5, 204, 244.中报道了本领域技术人员已知的用于实施当前发明的方法和技术。
[0041]术语“免疫球蛋白”表示基本上由免疫球蛋白基因编码的一种或多种多肽组成的蛋白质。公认的免疫球蛋白基因包括不同的恒定区基因以及无数的免疫球蛋白可变区基因。免疫球蛋白可以以多种形式存在，所述形式包括例如，Fv、Fab和F(ab)2以及单链(scFv)或双抗体。免疫球蛋白一般包含两个所称作的轻链多肽(轻链)和两个所称作的重链多肽(重链)。每一重链和轻链多肽含有可变域(可变区)(通常为多肽链的氨基端部分)，其包含能与结合配偶体(通常为抗原)相互作用的结合区。每一重链和轻链多肽包含恒定区(通常为羧基端部分)。重链的恒定区介导抗体与以下细胞的结合:i)携带Fe Y受体(Fe YR)的细胞，例如吞噬细胞或者ii)携带新生Fe受体(FcRn)(也已知为Brambell受体)的细胞。重链的恒定区还介导与一些因子的结合，包括经典补体系统的因子如成分(Clq)。免疫球蛋白的轻链或重链的可变域依次包含不同区段，即四个构架区(FR)和三个超变区(⑶R)。
[0042]术语“嵌合免疫球蛋白”表示包含来自第一非人种属的可变域即结合区和来自第二不同来源或物种的恒定区的至少一部分的免疫球蛋白，优选地单克隆免疫球蛋白。嵌合免疫球蛋白通常通过重组DNA技术制备。在一个实施方案中，嵌合免疫球蛋白包含小鼠、大鼠、仓鼠、兔或绵羊可变域和人恒定区。在一个实施方案中，人重链恒定区是人IgG恒定区。在另一个实施方案中，人轻链恒定域是K轻链恒定域或λ轻链恒定域。
[0043]免疫球蛋白的“Fe部分”不直接参与结合抗原，但显示出多种效应子功能。取决于重链的恒定区的氨基酸序列，将免疫球蛋白划分为以下类别:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。将这些类别的一些进一步划分为亚类，即将IgG划分为IgGl、IgG2、IgG3和IgG4或者将IgA划分为IgAl和IgA2。根据免疫球蛋白所属的免疫球蛋白类别，将免疫球蛋白的重链恒定区分别称为a (IgA)、δ (IgD)、ε (IgE), Y (IgG)和μ (IgM)。在一个实施方案中，免疫球蛋白属于IgG类。“免疫球蛋白的Fe部分”是本领域技术人员熟知的术语，并且基于木瓜蛋白酶切割免疫球蛋白而定义。在一个实施方案中，免疫球蛋白含有的Fe部分是人Fe部分或者来源于人类来源的Fe部分。在另外的实施方案中，Fe部分是亚类IgG4或IgGl的人免疫球蛋白的Fe部分或者是亚类IgGl、IgG2或IgG3的人免疫球蛋白的Fe部分，其以这样的方式修饰，以使不能检测到如下所定义的Fe Y受体(例如FcYRIIIa)结合和/或Clq结合。在一个实施方案中，Fe部分是人Fe部分，在另一个实施方案中，是人IgG4或IgGl亚类Fe部分或来自人IgGl亚类的突变的Fe部分。在另外的实施方案中，Fe部分来自具有突变L234A和L235A的人IgGl亚类。尽管IgG4显示出降低的Fe Y受体(例如Fcy RIIIa)结合，但其他IgG亚类的免疫球蛋白显示出强烈的结合。然而，如果改变Pro238、Asp265、Asp270、Asn297 (丢失 Fe 糖)、Pro329、Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434 或 / 和 His435，那么也提供了降低的 Fe y受体结合(Shields, R.L.，等人，J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604 ；Lund, J.，等人，FASEBJ.9(1995) 115-119;Morgan, A.，et al.，Immunol.86(1995)319-324 ；EP0307434)o 在一个实施方案中，提及Fe Y受体结合，免疫球蛋白是具有L234、L235和/或D265、和/或含有PVA236突变的IgG4或IgGl亚类或者IgGl或IgG2亚类。在另一个实施方案中，突变是S228P、L234A、L235A、L235E 和 / 或 PVA236 (PVA236 意为来自 IgGl 的氨基酸位置 233 至236氨基酸序列ELLG (以单字母氨基酸密码给出)或者IgG4的EFLG被PVA替换)。在另外的实施方案中，突变是IgG4的S228P和IgGl的L234A和L235A。在一个实施方案中，重链恒定区具有这样的氨基酸序列:SEQ ID N0:0USEQ ID NO:02、具有突变L234A和L235A的SEQ ID N0:01或具有突变S228P的SEQ ID NO: 02，而轻链恒定区具有SEQ ID NO: 03或SEQID NO:04的氨基酸序列。
[0044]如本文中所用，术语“人免疫球蛋白”表示这样的免疫球蛋白，其具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区(域)并与这些种系序列具有高度的序列相似性或同一性。抗体的恒定区是人IgGl或IgG4型的恒定区或其变体。此类区域可以是异型的，并且由例如 Johnson, G.和 Wu, Τ.Τ.，Nucleic Acids Res.28 (2000) 214-218，及其中所参考的数据库所述。
[0045]如本文中所用，术语“重组免疫球蛋白”表示通过重组方法制备、表达或产生的免疫球蛋白。该术语包括从宿主细胞，例如大肠杆菌、NS0、BHK或CHO细胞分离的免疫球蛋白。在一个实施方案中，根据本发明的“重组人免疫球蛋白”具有重排形式的可变区和恒定区。重组人免疫球蛋白已经进行了体内体细胞高变。因此,重组人免疫球蛋白的VH和VL区的氨基酸序列是归属于定义的人种系VH和VL序列的序列，但不能天然地存在于体内人抗体种系的所有组成成分中。
[0046]术语“单克隆免疫球蛋白”表示获自基本上同质的免疫球蛋白的群体的免疫球蛋白，即除以少量存在的天然发生的突变外，各个免疫球蛋白群是相同的。单克隆免疫球蛋白是针对单个抗原位点高度特异的。此外，与`多克隆免疫球蛋白制备物(其包括针对不同抗原位点(决定簇或表位)的不同免疫球蛋白)相反，每一单克隆免疫球蛋白针对单一抗原位点。除单克隆免疫球蛋白的特异性之外，它们的有利之处在可以通过其他免疫球蛋白无污染的合成。修饰语“单克隆”表示获自基本上同质的免疫球蛋白群体的免疫球蛋白的特征，并且并不应解释为需要通过任意特定的方法产生免疫球蛋白。
[0047]如本文中所用，术语“可变域”(轻链(')的可变域、重链(Vh)的可变域)表示直接参与靶抗原的结合的免疫球蛋白的一对轻链和重链的各个结构域。可变域通常是轻链和重链的N-端结构域。轻链和重链的可变域具有相同的一般结构，即它们拥有“免疫球蛋白构架”，并且每一结构域包含通过三个“高变区”(或者“互补决定区，⑶R”)连接的四个“构架区”(FR)，其序列是相当保守的。在本申请内，术语“互补决定区(⑶R)”或“高变区”(HVR)是可互换使用的，并表示主要参与抗原结合的抗体的氨基酸残基。“构架”区(FR)是那些除高变区以外的可变域的区域。因此，免疫球蛋白的轻链和重链可变域从N-端至C-端包含区域FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。根据Kabat，E.A.，等人，Sequences of Proteinsof Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes ofHealth, Bethesda, MD (1991)的标准定义，确定Q)R和FR氨基酸残基。
[0048]如本申请中所用，术语“氨基酸”表示羧基a_氨基酸的组群，其可以由核酸直接编码或者编码为前体形式。各个氨基酸通过由三个核苷酸(所称作的密码子或碱基-三联体)组成的核酸编码。每一氨基酸通过至少一个密码子编码。将通过不同密码子编码的同一氨基酸称为“遗传密码的简并性”。如本申请中所用，术语“氨基酸”表示天然存在的羧基a-氨基酸，并且包括丙氨酸(三字母密码:ala,单字母密码:A)、精氨酸(arg, R)、天冬酰胺(asn,N)、天冬氨酸(asp, D)、半胱氨酸(cys, C)、谷氨酰胺(gin, Q)、谷氨酸(glu,E)、甘氨酸(gly,G)、组氨酸(his，H)、异亮氨酸(ile，I)、亮氨酸(leu，L)、赖氨酸(lys，K)、甲硫氨酸(met，Μ)、苯丙氨酸(phe, F)、脯氨酸(pro, P)、丝氨酸(ser, S)、苏氨酸(thr, T)、色氨酸(trp, W)、酪氨酸(tyr, Y)和纟颜氨酸(val, V)。
[0049]在本申请内，“核酸”或“核酸序列”是可以互换使用的术语，指由各个核苷酸(也称为碱基)‘a’、‘c’、‘g’和‘t’(或者在RNA中为‘u’)组成的聚合分子，即指DNA、RNA或其修饰物。多核苷酸分子可以是天然存在的多核苷酸分子或者合成的多核苷酸分子或者一个或多个天然存在的多核苷酸分子与一个或多个合成的多核苷酸分子的组合。该定义还包括这样的天然存在的多核苷酸分子，其中改变(例如通过诱变)、缺失或添加一个或多个核苷酸。核酸可以是分离的或者是整合到另一核酸中的，例如整合到表达盒、质粒或宿主细胞的染色体中。核酸的特征在于其核酸序列由各个核苷酸组成。
[0050]对于本领域技术人员而言，将例如多肽的氨基酸序列转变成编码该氨基酸序列的相应核酸序列的步骤和方法是熟知的。因此，核酸的特征在于其核酸序列由各个核苷酸组成，并且同样地所述核酸编码多肽的氨基酸序列。
[0051]使用如本文中所报道的包含单管实时逆转录酶基因特异性聚合酶链反应(PCR)的方法，可以从单细胞获得编码单克隆免疫球蛋白的核酸。此外，使用如本文中所报道的PCR方法和体外翻译的组合，可以`从单细胞获得编码单克隆免疫球蛋白的核酸，并且可以以足以表征免疫球蛋白的结合性质的量至少以Fab片段的形式提供编码的免疫球蛋白。为了扩增获自单细胞的非常少量的mRNA，PCR (聚合酶链反应)必须非常灵敏。
[0052]因此，基于从单细胞中扩增编码IgG同种型免疫球蛋白的同源IgG HC (免疫球蛋白G重链)和IgG LC (免疫球蛋白G轻链)的核酸以及随后体外翻译所获得的扩增核酸，可以提供Fab片段或完整的免疫球蛋白。使用该方法，提供了获得通过单细胞产生的免疫球蛋白的有关信息的高灵敏度的方法。所述信息甚至可以从单细胞的微量mRNA中获得。根据本发明的方法允许用生物化学方法表征由单细胞表达的免疫球蛋白的结合特征。因此，与杂交瘤技术相比，使用该方法，可以实现更高的多样性的表征。此外，由于可以例如从抗原接触后的成熟B细胞中获得同源免疫球蛋白链，所以可以选择性地获得编码高特异性以及正确装配的免疫球蛋白的核酸。
[0053]如本文中所报道，用于从单细胞中获得编码免疫球蛋白Fab片段的核酸的方法包括用于从单个B细胞中扩增编码同源IgG HC和IgG LC (人IgG同种型)的核酸的单管实时多重半嵌套式PCR。因此，可以使用大肠杆菌细胞裂解物体外翻译Fab片段。可以使用ELISA和蛋白质印迹方法确认表达。
[0054]总之，如本文中所报道的方法包括以下一般步骤[0055]i)用人⑶19包被的磁性微珠从外周血中分离B细胞，
[0056]ii)通过例如有限稀释或FACS沉积单细胞，
[0057]iii)提取各个B细胞的mRNA，
[0058]iv)获得由各个B细胞产生的编码免疫球蛋白的至少可变域(VH和VL)的一个或多个核酸，
[0059]V)体外翻译RNA模版，和，
[0060]vi)任选地，表征免疫球蛋白或免疫球蛋白片段的结合性质。
[0061]如本文中报道的基于PCR的方法是高度灵敏的，并且导致扩增的编码免疫球蛋白的重链和轻链或其片段的核酸的高度回收。在体外翻译用如本文中所报道的基于PCR的方法获得的核酸后，还提供了表达功能性和稳定的Fab片段的方法。
[0062]可以互换使用的术语“聚合酶链反应”和“PCR”表示用于特异性扩增核酸例如DNA或RNA的区域的方法。该方法已经由K.Mullis (参见例如Winkler, Μ.Ε.,等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA79 (1982) 2181-2185)研发。区域可以是单个基因、基因的一部分、编码或者非编码序列。大多数PCR方法通常扩增数百个碱基对(bp)的DNA片段，尽管一些技术允许扩增多达40千个碱基对(kb)大小的片段。基本的PCR设置需要几种组分和试剂。这些组分包括含待扩增区域的核酸模版、与待扩增区域的5’ -和3’ -末端互补的两种引物、聚合酶，例如Taq聚合酶或者另一热稳定性聚合酶、聚合酶从中合成新链的脱氧核苷三磷酸(dNTP)、为聚合酶的最佳 活性和稳定性提供合适的化学环境的缓冲液、二价阳离子，通常为Mg2+，以及最后，单价阳离子如钾离子。
[0063]可以互换使用的术语“多重聚合酶链反应”或“多重PCR”表示在单个PCR反应/混合物中使用多个独特的引物的聚合酶链反应，以产生对不同DNA序列特异的不同大小的扩增子。通过一次靶向多个基因，可以从单个测试运行中获得其他信息，否则需要几倍的试剂和更多的时间运行才能获得该信息。必须优化每一引物集的退火温度，以在单个反应内正确地运行。此外，当通过凝胶电泳目测时，扩增子大小应当足够不同，以形成不同的条带。
[0064]在人类基因组中，含有免疫球蛋白编码基因的染色体基因座位于染色体2、14和22 (参见图1)。人免疫球蛋白G重链基因座可以见于染色体14 (14q32.2)上，所述基因座中的染色体方向:端粒-5’ -末端-Vh-D-Jh-Ch_3’ -末端-着丝粒。如下表1中所述，对染色体上的VHg段进行分类。
[0065]表1.根据 Matsuda, F.，等人，J.Exp.Med.188 (1998) 2151-2162 和 Tomlinson, 1.Μ.,等人，V Base sequence directoryl999,将 VH_ 基因分组成 Vh 家族。
[0066]
【权利要求】
1.用于从单细胞扩增和定量编码同源IgG重链和轻链的核酸的方法，其包括以下步骤: -使用第一和第二 5’-引物以及第一和第二 3’-引物以及第一和第二 TaqMan探针，在一个步骤中进行反转录和聚合酶链反应。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于 a)第一5’ -引物与编码重链前导肽或第一重链构架区的核酸序列互补，和/或 b)第二5’ -引物与编码轻链前导肽或第一轻链构架区的核酸序列互补，和/或c)第一3’ -引物与编码重链CHl结构域的C-端氨基酸残基的核酸序列互补，和/或 d)第二3’ -引物与编码轻链恒定域的C-端氨基酸残基的核酸序列互补，和/或 e)第一TaqMan探针与编码重链CHl结构域的N-端氨基酸残基的核酸互补，和/或 f)第二TaqMan探针与编码轻链恒定域的N-端氨基酸残基的核酸互补。
3.用于获得单克隆抗体的方法，其包括以下步骤 -体外翻译编码免疫球蛋白片段的核酸，其中所述核酸通过使用根据权利要求1或2中任一项的方法，特异性扩 增获自单一免疫球蛋白产生细胞的mRNA的cDNA片段获得。
4.根据权利要求3的方法，其进一步包括以下步骤 -随后将PCR产物转录成mRNA，并使用大肠杆菌细胞裂解物体外翻译所述mRNA。
5.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述引物提供了用于5’-引物的编码翻译起始密码子ATG的突出端和/或用于3’ -引物的编码翻译终止密码子TTA的突出端。
6.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于包括另外的步骤: -提供单细胞并获得该细胞的mRNA。
7.用于产生免疫球蛋白Fab-片段的方法，其包括以下步骤: -提供单一免疫球蛋白产生细胞， -使用用于扩增和定量根据权利要求1或2中任一项中的编码同源IgG重链和轻链的核酸的多重单管实时逆转录酶基因特异性聚合酶链反应，从所述细胞中获得编码免疫球蛋白轻链和重链可变域，任选地还编码轻链恒定域的一部分和重链ChI结构域的一部分的核酸， -产生包含获得的核酸的线性表达基质， -体外翻译所述核酸，从而产生所述免疫球蛋白Fab片段。
8.用于产生免疫球蛋白的方法，其包括以下步骤: -提供单一免疫球蛋白产生细胞， -使用用于扩增和定量根据权利要求1或2中任一项的编码同源IgG重链和轻链的核酸的多重单管实时逆转录酶基因特异性聚合酶链反应，从所述细胞获得编码免疫球蛋白轻链和重链可变域的核酸， -将前述步骤中获得的每一所述核酸与编码所述各个免疫球蛋白轻链或重链恒定域的非编码C-端恒定域氨基酸残基的核酸有效连接， -用前述步骤中获得的所述核酸转染真核细胞或原核细胞， -培养经转染的细胞，在一个实施方案中，在适合于表达所述免疫球蛋白的条件下培养所述转染的细胞，-从所述细胞或者培养基中回收所述免疫球蛋白，从而产生免疫球蛋白。
9.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述免疫球蛋白是G类免疫球蛋白(IgG)。
10.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述单细胞是单个B细胞或者单个成衆细胞或者单个衆细胞。
11.SEQ ID N0:05或06或07或08或09或10的核酸。
12.试剂盒，其包含SEQID N0:05、06、07、08、09和10的核酸。
【文档编号】C07K16/00GK103814047SQ201280045381
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2012年9月20日 优先权日:2011年9月21日
【发明者】H-W·克雷尔, A·利夫克, V·利夫克, K·马丁, C·韦尔克 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司