使靶细胞可逆染色的方法
【专利摘要】本发明涉及使靶细胞可逆染色的方法。本发明还涉及分离靶细胞或由存在至少一个共同特异性受体分子定义的靶细胞群的方法。本发明还提供了可用于实施本发明所述方法的试剂盒。
【专利说明】使靶细胞可逆染色的方法
[0001]相关专利申请的交叉引用
[0002]本专利申请要求于2011年7月18日向美国专利和商标局提交的美国临时专利申请 61/508，943 的“Method of Reversibly Staining a Target Cell”的优先权的权益,该申请以引用的方式全文并入本文。
发明领域
[0003]本发明涉及使靶细胞可逆染色的方法。本发明还涉及分离由存在至少一种共同特异性受体分子定义的靶细胞或靶细胞群的方法。本发明还提供了可用于实施本发明的方法的试剂盒。
_4] 发明背景
[0005]细胞疗法对许多疾病的治疗是高效的已经得到证明。例如，原发性免疫缺陷可以通过造血干细胞移植(HSCT)治愈，某些白血病可以通过异体HSCT和供者淋巴细胞输注(DLI)的组合得到完全缓解(Kolb, H.J.等，Donor leukocyte transfusions fortreatment of recurrent chronic myelogenous leukemia in marrow transplantpatients.Blood76 (12)，2462-2465 (1990))。在一些临床环境中，病毒特异性T细胞的过继转移对重建免疫功能低下患者对抗由巨细胞病毒(CMV)造成的威胁生命的并发症(Riddell，S.R.等,Restoration of viral immunity in immunodeficient humansby the adoptive transfer of T cell clones.Science257 (5067)，238-241 (1992))或由Epstein-Barr-病毒(EBV)介导的淋巴组织增生性疾病(Rooney，C.M.等，Use of gene-modified virus-specific T lymphocytes to controlEpstein-Barr-virus-related lymphoproliferation.Lancet345(8941), 9-13(1995))非常有效。同样，无论是源自自身肿`瘤浸润性淋巴细胞还是培养或体外设计的肿瘤抗原定向T细胞都是对改进疗法有前景的候选项。
[0006]无论这些有趣的临床观察结果如何，细胞疗法更广泛转移到临床应用仍然需要等待。这主要是由于这样的事实，用于产生免疫治疗的细胞制备物的多数程序是非常费时、费力并且昂贵的。此外，已知的用于调节临床疗效的细胞群通常需要被富集到很高的纯度，因为“不需要的”细胞的污染可能会介导有害的且有时危及生命的副作用(如移植物抗宿主病(GvHD)是由异种反应性T细胞在同种异基因干细胞移植和/或DLI治疗中介导的)。已有研究表明，极少量过继转移T细胞可以促进有益的临床疗效，同样的规则也适用于细胞群介导的负面影响。因此，提供适用于治疗的定义明确的高纯度细胞制备物成为使这些有前景的疗法更有效和可预测并且降低潜在副作用风险的关键。
[0007]目前表面标记物介导的临床细胞纯化的方法通常依赖于单一的参数(如，⑶34，MHC多聚体)。但是，对于多数细胞群一无论直接是源自离体的还是在体外细胞培养后的一不同表面标记物的组合是必须的，以便从其它细胞中真正将这些细胞分隔出来。例如，天然存在的调节性T细胞(Treg)代表一类有前景的细胞亚群，其能预防基于同种异基因HSCT4 的急性 GvHD 或自身免疫疾病的发展(Riley, J.L.，June, C.H.，&Blazar, B.R.，HumanT regulatory cell therapy: take a billion or so and call me in the morning.1mmunity30(5)，656-665 (2009)，Randolph, D.A.&Fathman，C.G.，Cd4+Cd25+regulatory T cellsand their therapeutic potential.Annu Rev Med57，381-402 (2006))。
[0008]除了由大量细胞共有的CD4的表达，其它的标记物如其组成型表达的高亲和性IL-2受体a链(⑶25)需要进一步减少异质性。然而，⑶25也表达于很大部分的非调节性细胞上，所述细胞包括最近活化的效应细胞和记忆T细胞。因此，已建议使用组合的染色模式，如CD4、CD25、CD 127和CD45RA的组合(Miyara，M.等，Functionaldelineation and differentiation dynamics of human CD4+T cells expressing theFoxP3transcription factor.1mmunity30(6), 899-911 (2009), Hoffmann, P.等，Onlythe CD45RA+subpopulation of CD4+CD25high T cells gives rise to homogeneousregulatory T-cell lines upon in vitro expansion.Bloodl08(13)，4260-4267(2006))来更精确地鉴定此与临床相关的T细胞亚群。
[0009]目前所有可用的基于临床标记物的细胞分离技术采用顺磁性珠子，所述珠子将标记的细胞群保留在磁场内。由此，使用直接标记的靶细胞群的积极富集策略得到最高纯度。但是，经由几种不同标记物的组合的纯化仍然很难达到，尽管分离具有最高纯度的不同细胞群是必需的。另外，阳性筛选后，标记和珠子通常保留在细胞产物中，潜在地操纵分离的细胞群或负面地影响其功能/生活力如通过受体阻滞。特别是在临床细胞分选中，保留的细胞标记会导致细胞产品在患者中的重大适用性调节障碍。为了规避阳性筛选的问题，许多临床细胞处理程序已经变为耗竭设置。不幸的是，靶细胞的纯度往往很低并且耗竭法常需要不同抗体的复杂混合物， 这就使得其生产和应用费力且价格昂贵。
[0010]因此，仍然需要提供一种用于细胞纯化或分离的方法，该方法例如在细胞分选后允许从纯化的细胞群中释放且完全除去受体结合的所有组分和染色剂。
[0011]发明概沭
[0012]本发明一方面提供一种使用可检测标记使靶细胞可逆染色的方法，所述靶细胞包含在其表面上的受体分子，所述方法包括:
[0013]使包含所述靶细胞的细胞混合物与下述物质接触:
[0014](i)受体结合试剂，所述受体结合试剂包含至少一个(任意)结合位点B，其中结合位点B特异性结合至所述受体分子，其中所述受体结合试剂经由结合位点B和所述受体分子之间的结合的解离速率常数(Ktjff)的值为约0.5 X IO-W1或更大，所述受体结合试剂进一步包含至少一个结合配偶体C，其中所述结合配偶体C能够(可逆)连接到多聚化试剂的结合位点Z,
[0015](ii)多聚化试剂，所述多聚化试剂包含用于受体结合试剂的结合配偶体C的可逆结合的至少两个结合位点Z，其中受体结合试剂(i)和多聚化试剂(ii)形成结合至所述靶细胞的(多个)多价结合复合物，每个多价结合复合物包含结合至一个所述多聚化试剂的至少两个所述受体结合试剂，所述多价结合复合物相对于所述受体结合试剂提供增加的亲合力；和
[0016](iii)结合至所述多价结合复合物的所述可检测标记，
[0017]其中所述靶细胞通过所述多价结合复合物与所述靶细胞的结合染色，并且基于所述受体结合试剂的所述结合配偶体C与所述多聚化试剂的所述结合位点Z之间的结合的破裂，所述靶细胞的染色是可逆的。
[0018]本发明的第二个方面提供此染色法用于分离由存在(至少一种共同特异性)受体分子定义的靶细胞群的用途。
[0019]本发明另一方面提供用于使用可检测标记使靶细胞可逆染色(分离)的试剂盒，所述靶细胞包含在其表面的受体分子。此试剂盒包括:
[0020](i)至少一种受体结合试剂，所述至少一种受体结合试剂包含特异性结合至所述受体分子的(任意)结合位点B，其中所述受体结合试剂经由结合位点B和所述受体结合分子之间的结合的解离速率常数(Ktjff)的值为约0.5X IO-W1或更大，并且所述受体结合试剂进一步包含至少一个结合配偶体C，其中所述结合配偶体C能够被多聚化试剂的结合位点Z (可逆)结合，
[0021](ii)至少一种多聚化试剂，所述至少一种多聚化试剂包含用于受体结合试剂的所述结合配偶体C的至少两个结合位点Z，其中结合配偶体C与所述多聚化试剂的结合位点Z能够形成可逆键合，
[0022](iii)可检测标记，所述可检测标记结合至或能够结合至受体结合试剂⑴和/或多聚化试剂(ii)。
[0023]本发明的再一方面提供一种特异性结合至受体分子的受体结合试剂在使靶细胞可逆染色的方法中的用途，所述受体结合试剂包含至少一个结合位点B，其中所述结合位点B特异性结合至所述受体分子，其中所述受体结合试剂经由结合位点B和所述受体分子之间的结合的解离速率常数(Ktjff)的值为约0.SXlO-4Sec-1或更大。
[0024]本发明的又一个方面提供一种使用可检测标记使靶细胞可逆染色的方法，所述靶细胞包含在其表面的(至少一种)受体分子，所述方法包括:
[0025]使包含所述靶细胞的细胞混合物与下述物质的接触:
[0026](i)至少两种受体结合试剂，每种受体结合试剂包含至少一个结合位点B，其中每种受体结合试剂的结合位点B特异性结合至所述受体分子，其中每种所述受体结合试剂经由结合位点B和所述受体分子之间的结合的解离速率常数(Ktjff)的值为约0.5X lOAec—1或更大，每种所述受体结合试剂进一步包含至少一个结合配偶体C，其中每种受体结合试剂的结合配偶体C能够(可逆)结合至多聚化试剂的结合位点Z，
[0027](ii)多聚化试剂，所述多聚化试剂包含用于每种受体结合试剂的结合配偶体C的可逆结合的至少一个结合位点Z,
[0028]其中所述至少两种受体结合试剂⑴和多聚化试剂(ii)形成结合至所述靶细胞的(多个)多价结合复合物，每个多价结合复合物包含结合至一个所述多聚化试剂的每种受体结合试剂中的至少一个，所述多价结合复合物相对于每种所述受体结合试剂提供增加的亲合力；和 [0029](iii)结合至所述多价结合复合物的所述可检测标记，
[0030]其中所述靶细胞通过所述多价结合复合物与所述靶细胞的结合染色，并且其中基于每种所述受体结合试剂的所述结合配偶体C与所述多聚化试剂的所述结合位点Z之间的结合的分裂，所述靶细胞的染色是可逆的。
[0031]本发明另一方面提供用于使用可检测标记使靶细胞可逆染色(或分离)的试剂盒，所述靶细胞包含在其表面上的受体分子，所述试剂盒包括:[0032](i)至少两种受体结合试剂，所述至少两种受体结合试剂包含特异性结合至所述受体分子的结合位点B，其中每种所述受体结合试剂经由结合位点B和所述受体结合分子之间的结合的解离速率常数(Ktjff)的值为约0.5X Kr4sec-1或更大，并且每种所述受体结合试剂进一步包含至少一个结合配偶体C，其中每种受体结合试剂的结合配偶体C能够被多聚化试剂的结合位点Z (可逆)结合，
[0033](ii)至少一种多聚化试剂，所述至少一种多聚化试剂包含用于每种受体结合试剂的所述结合配偶体C的的至少一个结合位点Z，其中每种结合试剂的结合配偶体C与所述多聚化试剂的所述结合位点Z能够形成可逆键合，
[0034](iii)可检测标记，所述可检测标记结合至或能够结合至受体结合试剂(i)和/或多聚化试剂(ii)。
[0035]附图简沭
[0036]将非限制性实施例与附图结合考虑并参照发明详述将会更好的理解本发明，其中:
[0037]图1示出使用Fab片段作为(至少一个)受体结合试剂(就Fab片段而言且也通常在本发明的一个实施例中，受体结合试剂可含有用于受体分子的单个结合位点)的可逆染色法的原理。图1a示出Fab片段用作受体结合试剂的说明性示例，其中链霉亲和素结合肽即
为受体结合试剂的结合配偶体C。在这一实施例中，链霉亲和素结合肽融合或缀合到Fab片段从而形成受体结合试剂。在图1a所示实例中，多聚化试剂是链霉亲和素突变蛋白(“5'//邙-Tacthl?” )，其包含用于所述至少一个结合配偶体C的至少两个结合位点Z。在图1a所不实例中，多聚化试剂带有灭光标记如操红蛋白。在图1b的实例中，再次一起示出了 Fab片段和缀合到作为标记的磁珠上的多聚化试剂。采用链霉亲和素突变蛋白与Fab片段之间经由链霉亲和素结合肽的多价结合复合物形成的可逆染色法在本文中也称作“Fab-多聚体染色”。图1c示出这种可逆Fab-多聚体染色法的示意图概况。在这一实例中，从存在于血液样品中的细胞混合物中染色/分离靶细胞。用于结合至存在于靶细胞上的细胞受体、Ktjff速率为约0.5 X KT4SecT1或更大的Fab片段通过Str印-tag?/5yr<?/?-Tactin?复合物形成可逆多聚化。靶细胞被多价结合复合物(通过如图1c步骤a)中所示使细胞与多聚化试剂和受体结合试剂接触)染色并可选地与缺乏同源性细胞表面受体分子的其它细胞分离，例如，利用荧光活化细胞分选术(图1c步骤b)中标记为商标“FACS?”)。用与
S'mp-tag?.肽竞争的&/r/?-Tactin?i配体D-生物素后续处理分离染色的靶细胞导致Fab片段从多聚化试剂上移位，由此导致多聚化试剂复合物)的从靶细胞中释放(如图1c步骤c)所示)。保留的Fab片段，未复合，由于其高Ktjff速率
将在合理的时间窗(自发地)解离，并且可以通过洗涤完全从靶细胞表面移除(如图1c步骤d)所示)。洗涤可以在这样一个体积下进行，所述体积在每个洗涤步骤期间将Fab片段稀释至至少等于Fab片段与同源细胞表面受体分子之间的结合的亲和性解离常数(Kd)的浓度。图1d示出与图1c类似的染色过程，其中多聚化试剂缀合到磁珠上并且其中染色/分离步骤包括经由其上结合染色细胞的磁柱将染色细胞从未染色细胞中分离。
[0038]图2示出Fab多聚体可逆染色所需的结合特性。图2示出用不同抗-⑶4Fab突变体染色的抗-⑶4Fab多聚体的FACS分析，所述不同抗-⑶4Fab突变体对于Fab片段与作为受体分子的CD4的结合具有增加的Ktjff-速率(Fab片段的结合动力学的总结列于表I)。外周血单核细胞(PBMC )用融合至两个顺序排列的5y/rp-tag?,序列(市售商品名为“One-STrEP-tag”;结合配偶体C)的抗_CD4Fab片段(受体结合试剂)染色并用藻红蛋白标记的 Strep- Tactin? (Strep-Tactin PE ；IBA GmbH, G6ttingen，德国；包含用于结合配偶
体C的至少2个结合位点Z的多聚化试剂)多聚化，然后在用D-生物素处理之前(第二列)或之后(第三列)进行分析。然后在仅用Str印-Tactin PE (未结合Fab片段)(第四列)移除Fab-单体的洗涤步骤后，检测靶细胞表面上保留的Fab-单体(即用作受体结合试剂的Fab片段)。在上述细胞可逆染色后再次进行Fab多聚体的染色(第五列)，来控制生物素移除的完成，否则该生物素将会妨碍如第四列所示的保留Fab-单体仅用Strep-Tactin PE (未结合Fab片段)的染色，从而导致错误的实验结论。或者，细胞用单体Fab片段培养、洗涤并在用Str印-Tactin PE? (第一，即最左边的列)染色后进行分析。示出了活的⑶3+T细胞。点图中的数字表示门内细胞的百分比。
[0039]图3示出图2的FACS分析的备选方案，即Fab多聚体染色可逆性的蛋白质印迹分析。CD4Fab多聚体利用列于表1并进一步如图2具体说明的不同抗_CD4Fab_突变体和5^-c^-Tactin? PE (IBA GmbH, G6ttingen,德国)生成。PBMC 与不同 CD4Fab 多聚体一起
孵育，且每个样品中的一致的细胞染色用流式细胞仪检测(与浅色直方图对比，实线代表未染色细胞)。然后，细胞用D-生物素处理并随后洗涤。最后，经洗涤的细胞裂解，并用高特异性的抗'抗体(StrepMAB-Classic Horse Radish Peroxidase (HRP)缀合物；
IBA GmbH, Gdttingen，德国)分析溶解(S)和未溶解(I)级分的保留Fab-单体。为了控制
一致量的不溶细胞物质的应用，同时用来自兔的针对P -肌动蛋白的第一抗体(Santa CruzBiotechnology Inc., Santa Cruz, USA)和缀合到HRP的针对兔Ig (免疫球蛋白)的第二抗体(Sigma, St.Louis, USA)来检测P -肌动蛋白。
[0040]发明详沭
[0041]本发明提供一种使在细胞表面具有受体分子的靶细胞或靶细胞群可逆染色的方法。对照于描述于美国专利7，776，562或国际专利申请W002/054065的方法，本发明是基于这样的发现，在该方法中，受体结合试剂与靶细胞表面上的受体分子的低亲和性结合并不是可逆性必须的。相反，本发明已经发现不考虑结合强度，意味着无论受体结合试剂和受体分子之间结合的解离常数(Kd)是否具有低亲和性，例如在Kd为约10_3到10_7M的范围内，或是否具有高亲和性，例如在Kd为约10_7到IO-kiM的范围内，靶细胞都能被可逆染色，只要受体结合试剂经由结合位点B与受体分子的结合的解离发生得足够快。以Ktjff速率(也称为受体结合试剂(经由结合位点B)与受体分子之间的结合的解离速率常数)表示，Ktjff速率为约0.5X10_4sec_1或更大，约IXKr4SecT1或更大，约SXKr4SecT1或更大，约
`3X KT4SecT1或更大，约4X KT4SecT1或更大，约5X KT4SecT1或更大，约I X KT3SecT1或更大，约 1.5 X KT3SecT1 或更大，约 2 X KT3SecT1 或更大，约 3 X KT3SecT1 或更大，约 4X KT3SecT1 或更大，约SXKr3SecT1或更大，约IXKr2SecT1或更大，或约5X Kr1SecT1或更大。本文关于Koff速率、km速率或Kd时所用术语“约”是指包含±0.1%、±0.2%、±0.3%、±0.4%、±0.5%、±0.7%、±0.9%、土 1.0%、土 1.2%、土 1.4%、土 1.6%、土 1.8%、±2.0%、±2.2%、±2.4%、±2.6%、±2.8%、±3.0%、±3.5%、±4.0.%、±4.5%、±5.0%、±6.0%、±7.0%、±8.0%、±9.0%、± 10.0%、± 15.0% 或 ±20.0% 的误差容限。
[0042]在本文中，值得注意的是受体结合试剂L与其受体P (例如细胞表面受体分子)之间复合物(C)的形成可以描述为著名的两状态过程
[0043]
【权利要求】
1.一种使用可检测标记使靶细胞可逆染色的方法，所述靶细胞包含在其表面上的受体分子，所述方法包括: 使包含所述靶细胞的细胞混合物与下述接触: (i)受体结合试剂，所述受体结合试剂包含至少一个结合位点B,其中所述结合位点B特异性结合至所述受体分子，其中所述受体结合试剂经由所述结合位点B和所述受体分子之间的结合的解离速率常数的值为大约0.5X IO-W1或更大，所述受体结合试剂进一步包含至少一个结合配偶体C，其中所述结合配偶体C能够可逆结合至多聚化试剂的结合位点Z ； (ii)多聚化试剂，所述多聚化试剂包含用于所述受体结合试剂的结合配偶体C的可逆结合的至少两个结合位点Z， 其中所述受体结合试剂(i)和所述多聚化试剂(ii)形成结合至所述靶细胞的多价结合复合物，每个多价结合复合物包含结合至到一个所述多聚化试剂的至少两个所述受体结合试剂，所述多价结合复合物相对于所述受体结合试剂提供增加的亲合力；和 (iii)所述可检测标记，所述可检测标记结合至或能够结合至所述多价结合复合物， 其中所述靶细胞通过所述多价结合复合物与所述靶细胞的结合染色，并且其中经所述受体结合试剂的所述结合配偶体C与所述多聚化试剂的所述结合位点Z之间的结合的破裂，所述靶细胞的染色是可逆的。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述结合位点Z与所述配偶体C的可逆结合的解离常数(Kd)在10_2M到10_13M的范围内。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述受体分子结合试剂与所述受体分子之间的结合的解离速率常数(Iw)的值为约IXKr4SecT1或更大，约2X KT4SecT1或更大，约3X KT4SecT1或更大，约4X KT4SecT1或更大，约5X KT4SecT1或更大，约I X KT3SecT1或更大，约 1.5 X KT3SecT1 或更大，约 2 X KT3SecT1 或更大，约 3 X KT3SecT1 或更大，约 4X KT3SecT1 或更大，约5X10_3sec_1或更大，或约IXKr2SecT1或更大。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述受体结合试剂与所述受体分子之间的结合的解离常数(Kd)在10_2M到KTkiM的范围内。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述受体结合试剂与所述受体分子之间的结合的解离常数(Kd)在下述范围内:约10_3M至约KTkiM,或约10_3M至约10_9M，或约10_3M至约I(T8M,或约KT3M至约I(T7M,或约KT7M至约I(T10M,或约KT7M至约1(T9M。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其进一步包括从存在于所述细胞混合物中的非靶细胞分离所述染色的细胞。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其进一步包括通过破裂所述受体结合试剂的所述结合配偶体C与所述多聚化试剂的所述结合位点Z之间的结合从所述靶细胞中移除所述染色。
8.根据权利要求6至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述多聚化试剂的移除导致所述受体结合试剂从所述染色的细胞的解离。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其特征在于， (a)所述结合配偶体C包含生物素，所述多聚化试剂包含可逆结合至生物素的链霉亲和素类似物或抗生物素蛋白类似物；(b)所述结合配偶体C包含可逆结合至链霉亲和素或抗生物素蛋白的生物素类似物，所述多聚化试剂包含可逆结合至所述生物素类似物的链霉亲和素、抗生物素蛋白、链霉亲和素类似物、或抗生物素蛋白类似物，或 (c)所述结合配偶体C包含链霉亲和素或抗生物素蛋白结合肽，所述多聚化试剂包含可逆结合至所述链霉亲和素或抗生物素蛋白结合肽的链霉亲和素、抗生物素蛋白、链霉亲和素类似物、或抗生物素蛋白类似物。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述结合配偶体C包含链霉亲和素-结合肽Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys,所述多聚化试剂包含链霉亲和素类似物Val44-Thr45-Ala46-Arg47 或链霉亲和素类似物 Ile44-Gly45-Ala46-Arg'
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其特征在于，所述结合配偶体C与所述多聚化试剂的所述结合位点Z之间的结合在二价阳离子存在下进行。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述结合配偶体C包含钙调蛋白结合肽，所述多聚化试剂包含钙调蛋白，或 其特征在于，所述结合配偶体C包含FLAG肽，所述多聚化试剂包含能结合所述FLAG肽的抗体，或 其特征在于，所述第一结合C包含寡聚组氨酸标签，所述多聚化试剂包含结合所述寡聚组氨酸标签的抗体。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其特征在于，所述结合配偶体C与所述多聚化试剂的所述结合位点Z之间的结合通过金属离子螯合破裂。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述金属螯合通过添加EDTA或EGTA完成。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其特征在于，所述多聚化试剂是链霉亲和素或抗生物素蛋白或者链霉亲和素或抗生物素蛋白的任意类似物的低聚物或聚合物。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述低聚物或聚合物通过多糖交联。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其特征在于，所述结合配偶体C包含抗原，所述多聚化试剂包含针对所述抗原的抗体。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述抗原是表位标签。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述表位标签选自Myc-标签(序列:EQKLISEEDL )、HA-标签(序列:YPYDVPDYA)、VSV-G-标签(序列:YTDIEMNRLGK)、HSV_ 标签(序列:QPELAPEDPED)、V5-标签(序列:GKPIPNPLLGLDST)和谷胱甘肽-S-转移酶。
20.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述抗原包含蛋白质。
21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述蛋白质选自麦芽糖结合蛋白(MBP)、几丁质结合蛋白(CBP)或硫氧还蛋白。
22.根据前述权利要 求中任一项所述的方法，其特征在于，特异性结合至所述受体分子的所述受体结合试剂选自抗体、二价抗体片段、单价抗体片段、具有抗体样结合特性的蛋白质性结合分子和MHC分子。
23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述二价抗体片段是(Fab)/-片段或二价单链Fv片段。
24.根据权利要求23所述的方法，其特征在于，所述单价抗体片段选自Fab片段、Fv片段和单链Fv片段(scFv)。
25.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述具有抗体样结合特性的蛋白质性结合分子选自适配体、基于脂质运载蛋白家族的多肽的突变蛋白、重组蛋白、基于锚蛋白支架的蛋白、基于结晶支架的蛋白、纤连蛋白、和高亲和性多聚体。
26.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述接触在温度<15°C下进行。
27.根据权利要求26所述的方法，其特征在于，所述接触在温度<4°C下进行。
28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述靶细胞是哺乳动物细胞。
29.根据权利要求28所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞是淋巴细胞或干细胞。
30.根据权利要求29所述的方法，其特征在于，所述淋巴细胞是T细胞、T辅助细胞、B细胞或自然杀伤细胞。
31.根据权利要求30所述的方法，其特征在于，所述T细胞选自CMV-特异性CD8+T淋巴细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞和调节性T细胞。
32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述可检测标记是荧光染料或磁性标记。
33.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，靶细胞通过一组至少两种不同受体分子的方式顺序染色和分离，其中采用至少两种不同受体结合试剂，每种受体结合试剂包含特异性结合至所述至少两种不同受体分子的组中的预选受体分子的结合位点B。
34.根据权利要求33所述的方法，其特征在于，结合至所述至少两种不同受体分子的组的第二或任何其它受体分子的受体结合试剂进一步包含能够被多聚化试剂的结合位点Z结合的至少一个结合配偶体C。
35.根据权利要求34所述的方法，其特征在于，所述受体结合试剂经由所述结合位点B与所述第二或任何其它受体分子特异性结合之间的结合的解离速率常数(I^ff)的值为约0.5X 10 4sec 1 或更大。
36.根据权利要求34或35所述的方法，其特征在于，所述第二或任何其它受体分子与特异性结合所述第二或任何其它受体分子的所述受体结合试剂之间的结合的解离常数(Kd)在10_2至KT7M的范围内。
37.根据权利要求1至36中任一项所述的方法在由存在至少一种共同特异性受体定义的细胞群的分离中的用途。
38.根据权利要求37所述的用途，其特征在于，所述由存在共同特异性受体定义的细胞群是淋巴细胞群或干细胞群。
39.根据权利要求3 8所述的用途，其特征在于，所述淋巴细胞群是抗原特异性T细胞群、T辅助细胞群、B细胞群或自然杀伤细胞群。
40.根据权利要求39所述的方法，其特征在于，所述T细胞选自CMV特异性CD8+T淋巴细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞和调节性T细胞。
41.根据权利要求38所述的用途，其用于所述淋巴细胞群或所述干细胞群的功能状态的测定。
42.根据权利要求38所述的用途，其用于淋巴细胞群的纯化以用于体外扩增。
43.根据权利要求38所述的用途，其用于干细胞群的纯化，所述干细胞群用于再生治疗。
44.根据权利要求43所述的用途，其特征在于，所述干细胞群是CD34+特异性群或Nanog+ 群。
45.根据权利要求38所述的用途，其特征在于，所述经纯化的细胞群为用于调节免疫应答的⑶4+T辅助细胞。
46.根据权利要求38所述的用途，其用于淋巴细胞群的纯化，所述淋巴细胞群用于过继转移、癌症治疗、细菌感染治疗、病毒感染治疗或免疫疗法。
47.根据权利要求46所述的用途，其特征在于，所述经纯化的细胞群是对相关抗原特异性的CD8+T细胞，对白血病相关抗原特异性的CD8+T细胞，对黑色素瘤相关抗原特异性的⑶8+T细胞，对病毒抗原特异性的CD8+T细胞。
48.根据权利要求47所述的用途，其特征在于，所述对病毒抗原特异性的CD8+T细胞为巨细胞病毒(CMV)磷蛋白65-特异性⑶8+T细胞或EB病毒-EBNA抗原-特异性⑶8+T细胞。
49.根据权利要求46所述的用途，其特征在于，所述经纯化的细胞群是用于自身免疫疾病、I型糖尿病、肠炎、过敏治疗的Treg细胞。
50.根据权利要求49所述的用途，其特征在于，所述自身免疫疾病是移植物抗宿主病(GvHD)或移植物排斥反应。
51.根据权利要求49或50所述的用途，其特征在于，所述Treg细胞群是CD4+CD25+.CD45RA+Treg 细胞。
52.根据权利要求46所述的用途，其特征在于，所述经纯化的细胞群是CD62L+CD8+特异性中央记忆T细胞。
53.一种用于使用可检测标记使靶细胞可逆染色的试剂盒，所述靶细胞包含在其表面上的受体分子，所述试剂盒包含: (i)至少一种受体结合试剂，所述至少一种受体结合试剂包含特异性结合至所述受体分子的结合位点B，其中所述受体结合试剂经由所述结合位点B和所述受体结合分子之间的结合的解离速率常数的值为约0.5X IO-W1或更大，并且所述受体结合试剂进一步包含至少一个结合配偶体C，其中所述结合配偶体能够被多聚化试剂的结合位点Z可逆结合； (ii)至少一种多聚化试剂，所述至少一种多聚化试剂包含用于所述受体结合试剂的所述结合配偶体C的至少两个结合位点Z，其中所述结合配偶体C与所述多聚化试剂的所述结合位点Z能够形成可逆键合； (iii)可检测标记，所述可检测标记结合至或能够结合至所述受体结合试剂(i)和/或所述多聚化试剂(ii)。
54.根据权利要求53所述的试剂盒，其特征在于，所述结合配偶体C与所述结合位点Z之间的结合的解离常数(Kd)在10_2至10_13M的范围内。
55.特异性结合至受体分子的受体结合试剂在根据权利要求1-35中任一项所述的使靶细胞可逆染色的方法中的用途，所述受体结合试剂包含至少一个结合位点B，其中所述结合位点B特异性结合至所述受体分子，其中所述受体结合试剂经由所述结合位点B与所述受体分子之间的结合的解离速率常数(Iw)的值为约0.5X IO-W1或更大。
56.根据权利要求55所述的用途，其特征在于，所述受体结合试剂选自抗体、二价抗体片段、单价抗体片段、具有抗体样结合性质的蛋白质性结合分子和MHC分子。
57.根据权利要求56所述的用途，其特征在于，所述二价抗体片段是(Fab)/-片段、二价单链Fv片段或双特异抗体。
58.根据权利要求57所述的方法，其特征在于，所述单价抗体片段选自Fab片段、Fv片段、和单链Fv片段(scFv)。
59.根据权利要求58所述的方法，其特征在于，所述具有抗体样结合性质的蛋白质性结合分子选自适配体、基于脂质运载蛋白家族的多肽的突变蛋白、重组蛋白、基于锚蛋白支架的蛋白、基于结晶支架的蛋白、纤连蛋白、和高亲和性多聚体。
60.一种使用可检测标记使靶细胞可逆染色的方法，所述靶细胞包含在其表面上的受体分子，所述方法包括: 使包含所述靶细胞的细胞物与下述接触: (i)至少两种受体结合试剂，每种所述受体结合试剂包含至少一个结合位点B，其中每种受体结合试剂的所述结合位点B特异性结合至所述受体分子，其中每种所述受体结合试剂经由所述结合位点B和所述受体分子之间的结合的解离速率常数(I^ff)的值为约0.5 X IO-W1或更大，每种所 述受体结合试剂进一步包含至少一个结合配偶体C，其中每种受体结合试剂的结合配偶体C能够可逆结合至多聚化试剂的结合位点Z ； (ii)多聚化试剂，所述多聚化试剂包含用于每种所述受体结合试剂的结合配偶体C的可逆结合的至少一个结合位点Z, 其中所述至少两种受体结合试剂(i)和所述多聚化试剂(ii)形成结合至所述靶细胞的多价结合复合物，每个多价结合复合物包含结合至一个所述多聚化试剂的每种受体结合试剂中的至少一种，所述多价结合复合物相对于每种所述受体结合试剂提供增强的亲合力；和 (iii)所述可检测标记，所述可检测标记结合至或能够结合至所述多价结合复合物， 其中所述靶细胞通过所述多价结合复合物与所述靶细胞的结合染色，并且其中经每种所述受体结合试剂的所述结合配偶体C与所述多聚化试剂的所述结合位点Z之间的结合的破裂，所述靶细胞的染色是可逆的。
61.根据权利要求60所述的方法，其特征在于，所述结合位点Z与每种受体结合试剂的所述配偶体C之间的结合的解离常数(Kd)在Kr2至IO-3M的范围内。
62.一种用于使用可检测标记使靶细胞可逆染色的试剂盒，所述靶细胞包含在其表面上的受体分子，所述试剂盒包含: (i)至少两种受体结合试剂，所述至少两种受体结合试剂包含特异性结合至所述受体分子的结合位点B，其中每种所述受体结合试剂经由所述结合位点B和所述受体结合分子之间的结合的解离速率常数的值为约0.5X IO-W1或更大，并且每种所述受体结合试剂进一步包含至少一个结合配偶体C，其中每种所述受体结合试剂的结合配偶体能够被多聚化试剂的结合位点Z结合， (ii)至少一种多聚化试剂，所述至少一种多聚化试剂包含用于每种所述受体结合试剂的所述结合配偶体C的至少一个结合位点Z，其中每种结合试剂的结合配偶体C与所述多聚化试剂的所述结合位点Z能够形成可逆键合， (iii)可检测标记，所述可检测标记结合至或能够结合至所述受体结合试剂(i)和/或所述多聚化试剂(ii)。
63.根据权利要求62所述的试剂盒，其特征在于，所述结合位点Z与每种受体结合试剂的所述配偶体C之间的结合的解`离常数(Kd)在Kr2至KT3M的范围内。
【文档编号】C07K14/36GK103797028SQ201280045377
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2012年7月17日 优先权日:2011年7月18日
【发明者】托马斯·施密特, 克里斯蒂安·施滕贝尔, 迪尔克·H·布施, 洛塔尔·格尔梅罗特 申请人:Iba 股份有限公司