具有促进抗原清除的FcRn结合结构域的治疗性抗原结合分子的制作方法
【专利摘要】本发明提供：在中性pH下对新生儿Fc受体(FcRn)的亲和力提高的修饰的FcRn结合结构域；包含所述FcRn结合结构域的抗原结合分子，其具有低免疫原性、高稳定性并且仅形成少数聚集体；在中性或酸性pH下具有提高的FcRn结合活性而在中性pH下对预存抗药抗体的结合活性又不提高的修饰抗原结合分子；抗原结合分子用于改进抗原结合分子介导的细胞对抗原的摄入的用途；抗原结合分子用于降低血浆特定抗原浓度的用途；修饰的FcRn结合结构域用于增加单个抗原结合分子在其降解前可结合的抗原的总数的用途；修饰的FcRn结合结构域用于改进抗原结合分子的药代动力学的用途；用于降低对预存抗药抗体的结合活性的方法；和用于产生所述抗原结合分子的方法。
【专利说明】具有促进抗原清除的FcRn结合结构域的治疗性抗原结合分子
【技术领域】
[0001]本发明涉及:在中性pH下对新生儿Fe受体(FcRn)的亲和力提高的修饰的FcRn结合结构域；包含所述FcRn结合结构域的抗原结合分子，其具有低免疫原性、高稳定性并且仅形成少数聚集体；在中性或酸性PH下FcRn结合活性提高而在中性pH下对预存抗药抗体的结合活性又不提高的修饰抗原结合分子；所述抗原结合分子用于改进抗原结合分子介导的细胞对抗原的摄入的用途；所述抗原结合分子用于降低血浆特定抗原浓度的用途；所述修饰的FcRn结合结构域用于增加单个抗原结合分子在其降解前可结合的抗原的总数的用途；所述修饰的FcRn结合结构域用于改进抗原结合分子的药代动力学的用途；用于降低对预存抗药抗体的结合活性的方法；和用于产生所述抗原结合分子的方法。
【背景技术】
[0002]由于其在血浆中的高稳定性和很少副作用，越来越多的抗体被用作药物。靶向可溶性抗原的常规抗体在注射后结合患者血浆中的抗原，然后以抗体-抗原复合物的形式稳定地持续存在直到降解。虽然典型的抗体一般具有长的半衰期(1-3周)，但是抗原具有少于一天的相对短的半衰期。与抗体的复合物中的抗原因此比仅抗原具有显著较长的半衰期。因此，在注射常规抗体后抗原浓度往往增加。已报告了靶向各种可溶性抗原的抗体的这种情况，例如IL_6(J Immunotoxicol.2005, 3, 131-9.(NPLl)) ；β淀粉状蛋白(MAbs.20109-10 月;2 (5):576-88(NPL2)) ；MCP-1 (ARTHRITIS&RHEUMATISM2006, 54, 2387-92 (NPL3)) ；hepcidin(AAPS J.2010，12(4):646-57.(NPL4))和 sIL-6 受体(Blood.2008 年11月15日；112 (10):3959-64.(NPL5))。报告描述了在给予抗体时血浆总抗原浓度从基线增加至约10-1000倍(取决于抗原)。
[0003]由于不需要血浆总抗原浓度的这种增加，因此开发了通过治疗性抗体消除抗原的策略。这些策略之一是使用针对IgG的新生儿Fe受体(FcRn)的结合亲和力提高的pH依赖性抗原结合抗体来快速处理抗原(参见例如PCT申请号PCT/JP2011/001888 (PTLl))。FcRn是存在于许多细胞的膜中的蛋白质。在中性pH下对FcRn的结合活性提高的抗体可结合细胞表面上的FcRn,籍此抗体与受体一起以小囊泡内化进入细胞。由于小囊泡内部的pH逐渐降低，因此抗原由于其在酸性PH下的低亲和力而自pH依赖性抗原结合抗体中解离。解离的抗原然后被降解，同时FcRn和结合的抗体在降解前再循环返回细胞表面。因此，在中性pH下对FcRn的结合活性提高的pH依赖性抗原结合抗体可用来从血浆中消除抗原并降低其血浆浓度。
[0004]之前的研究也已表明提高在酸性pH下对FcRn的结合亲和力的Fe工程改造还可改进内体再循环效率和抗 体的药代动力学。例如，M252Y/S254T/T256E (YTE)变体(J Biol Chem, 2006，281:23514-23524.(NPL6))、M428L/N434S (LS)变体(NatBiotechnol, 201028:157-159.(NPL7))、T250Q/M428L(J Immunol.2006, 176(I):346-56.(NPL8))和 N434H 变体(Clinical Pharmacology&Therapeutics(201I)89(2):283-290.(NPL9))显示相对于天然IgGl半衰期改进。
[0005]然而，这类取代还具有改变抗体性质的风险，所述性质对治疗性抗体的研发是重要的，例如抗体的稳定性、免疫原性、聚集行为和对预存抗体(例如类风湿因子)的结合亲和力。因此提供不仅仅提高抗体清除而且还满足开发治疗性抗原结合分子的标准的修饰FcRn结合结构域是本发明的主要目的。这些可开发性标准特别是高稳定性、低免疫原性、低聚集体百分比和低的对预存抗药抗体(ADA)的结合亲和力。
[0006]下面显示与本发明有关的现有技术文件。本说明书中引用的所有文件均通过引用结合到本文中。
[0007]引用列表
[0008]专利文献
[0009][PTL1] PCT/JP2011/00188 (W0/2011/122011)，ANTIGEN-BINDING MOLECULES THATPROMOTE ANTIGEN CLEARANCE(促进抗原清除的抗原结合分子)
[0010]非专利文献
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[0017][NPL7]Nat Biotechnol, 201028:157-159
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[0019][NPL9]Clinical Pharmacology&Therapeutics(2011)89(2):283-290
[0020]发明概述
[0021]技术问题
[0022]鉴于上述情况构思出本发明。本发明的一个目的是提供在中性pH下对FcRn的亲和力提高的修饰的FcRn结合结构域；包含所述FcRn结合结构域的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子具有低免疫原性、高稳定性并且只形成少数聚集体；在中性或酸性PH下FcRn结合活性提高而在中性PH下对预存抗药抗体的结合活性又不提高的修饰抗原结合分子；所述抗原结合分子用于改进抗原结合分子介导的细胞对抗原的摄入的用途；所述抗原结合分子用于降低血浆特定抗原浓度的用途；所述修饰的FcRn结合结构域用于增加单个抗原结合分子在其降解前可结合的抗原的总数的用途；所述修饰的FcRn结合结构域用于改进抗原结合分子的药代动力学的用途；和用于产生所述抗原结合分子的方法。
[0023]解决问题的方案
[0024]本发明人对以下进行了专心致志的研究:在中性pH下对FcRn的亲和力提高的修饰的FcRn结合结构域和具有低免疫原性、高稳定性并且只形成少数聚集体的包含所述FcRn结合结构域的抗原结合分子。结果，本发明人发现在FcRn结合结构域特定位置上的取代提高在中性PH下对FcRn的亲和力而又不显著提高免疫原性、不显著降低稳定性和/或不显著提高高分子量物类的比率。
[0025]此外，本发明人对以下进行了专心致志的研究:在中性pH或酸性pH下对FcRn的亲和力提高但是又不显著提高对预存抗药抗体的结合活性的修饰的FcRn结合结构域和包含这类FcRn结合结构域的抗原结合分子。结果，本发明人发现在FcRn结合结构域特定位置上的取代降低在中性PH下对预存抗药抗体的亲和力而又不显著降低FcRn结合活性。
[0026]具体地讲，本发明涉及:
[0027][I]包含修饰的FcRn结合结构域的抗原结合分子，其中所述修饰的FcRn结合结构域在选自以下的一个或多个位置上包含氨基酸取代:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434 和 EU436，其中数字表明按照EU编号的取代的位置。
[0028][2] [I]的抗原结合分子，其中FcRn结合结构域具有
[0029]a)在EU252和EU434位上的氨基酸的氨基酸取代；和
[0030]b)在选自以下一个或多个位置上的氨基酸取代:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU256、EU258、EU286、EU387、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434和 EU436。
[0031][3] [I]或[2]的抗原结合分子，其中所述修饰的FcRn结合结构域包含:
[0032]EU238位上的天冬氨酸，
[0033]EU250位上的缬氨酸，
[0034]EU252位上的酪氨酸，[0035]EU254位上的苏氨酸，
[0036]EU255位上的亮氨酸，
[0037]EU256位上的谷氨酸，
[0038]EU258位上的天冬氨酸或异亮氨酸，
[0039]EU286位上的谷氨酸，
[0040]EU307位上的谷氨酰胺，
[0041]EU308位上的脯氨酸，
[0042]EU309位上的谷氨酸，
[0043]EU311位上的丙氨酸或组氨酸，
[0044]EU315位上的天冬氨酸，
[0045]EU428位上的异亮氨酸，
[0046]EU433位上的丙氨酸、赖氨酸、脯氨酸、精氨酸或丝氨酸，
[0047]EU434位上的酪 氨酸或色氨酸，和/或
[0048]EU436位上的异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸或苯丙氨酸。
[0049][4] [2]的抗原结合分子，其中FcRn结合结构域包含在选自以下一个或多个位置组合上的氨基酸的氨基酸取代:
[0050]a)EU252、EU434 和 EU436 ；
[0051 ]b)EU252、EU307、EU311 和 EU434 ；
[0052]c)EU252、EU315 和 EU434 ；
[0053]d) EU252、EU308 和 EU434 ；
[0054]e)EU238、EU252 和 EU434 ；
[0055]f)EU252、EU434、EU307、EU311 和 EU436 ;和
[0056]g) EU252、EU387 和 EU434。
[0057][5] [4]的抗原结合分子，其中FcRn结合结构域包含:
[0058]a)EU252位上的酪氨酸、EU315位上的天冬氨酸和EU434位上的酪氨酸；或
[0059]b)EU252位上的酪氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的异亮氨酸；或
[0060]c)EU252位上的酪氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的亮氨酸；或
[0061]d)EU252位上的酪氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的缬氨酸；或
[0062]e)EU252位上的酪氨酸、EU254位上的苏氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的异亮氨酸。
[0063][6] [2]的抗原结合分子，其中FcRn结合结构域在3个或更多个位置上包含氨基酸取代，其中所述3个或更多个位置是选自以下的组合之一:
[0064]a)EU252/EU434/EU307/EU311/EU286 ；
[0065]b)EU252/EU434/EU307/EU311/EU286/EU254 ；
[0066]c)EU252/EU434/EU307/EU311/EU436 ；
[0067]d)EU252/EU434/EU307/EU311/EU436/EU254 ；
[0068]e)EU252/EU434/EU307/EU311/EU436/EU250 ；
[0069]f)EU252/EU434/EU308/EU250 ；
[0070]g)EU252/EU434/EU308/EU250/EU436 ;和[0071 ] h)EU252/EU434/EU308/EU250/EU307/EU311。
[0072][7] [6]的抗原结合分子，其中FcRn结合结构域包含:
[0073]a)EU252位上的酪氨酸、EU286位上的谷氨酸、EU307位上的谷氨酰胺、EU311位上的丙氨酸和EU434位上的酪氨酸；或
[0074]b)EU252位上的酪氨酸、EU254位上的苏氨酸、EU286位上的谷氨酸、EU307位上的谷氨酰胺、EU311位上的丙氨酸和EU434位上的酪氨酸；或
[0075]c)EU252位上的酪氨酸、EU307位上的谷氨酰胺、EU311位上的丙氨酸、EU434位上的酪氨酸和436位上的异亮氨酸；或
[0076]d)EU252位上的酪氨酸、EU254位上的苏氨酸、EU286位上的谷氨酸、EU307位上的谷氨酰胺、EU311位上的丙氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的异亮氨酸；或
[0077]e)EU250位上的缬氨酸、EU252位上的酪氨酸、EU254位上的苏氨酸、EU308位上的脯氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的缬氨酸；或
[0078]f)EU250位上的缬氨酸、EU252位上的酪氨酸、EU307位上的谷氨酰胺、EU311位上的丙氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的缬氨酸；或
[0079]g) EU252位上的酪氨酸、EU307位上的谷氨酰胺、EU311位上的丙氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的缬氨酸；或
[0080]h)EU250位上 的缬氨酸、EU252位上的酪氨酸、EU308位上的脯氨酸和EU434上的酪氨酸；或
[0081]i)EU250位上的缬氨酸、EU252位上的酪氨酸、EU307位上的谷氨酰胺、EU308位上的脯氨酸、EU311位上的丙氨酸和EU434的酪氨酸。
[0082][8] [2]的抗原结合分子，其中FcRn结合结构域在3个或更多个位置上包含氨基酸取代，其中所述3个或更多个位置是选自以下的组合之一:
[0083]a) EU252 和 EU434 和 EU307 和 EU311 和 EU436 和 EU286 ；
[0084]b) EU252 和 EU434 和 EU307 和 EU311 和 EU436 和 EU250 和 EU308 ；
[0085]c) EU252 和 EU434 和 EU307 和 EU311 和 EU436 和 EU250 和 EU286 和 EU308 ；
[0086]d) EU252 和 EU434 和 EU307 和 EU311 和 EU436 和 EU250 和 EU286 和 EU308 和 EU428。
[0087][9] [8]的抗原结合分子，其中FcRn结合结构域包含:
[0088]a)EU252位上的酪氨酸、EU286位上的谷氨酸、EU307位上的谷氨酰胺、EU311位上的丙氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的缬氨酸；或
[0089]b)EU250位上的缬氨酸、EU252位上的酪氨酸、EU307位上的谷氨酰胺、EU308位上的脯氨酸、EU311位上的丙氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的缬氨酸；或
[0090]c)EU250位上的缬氨酸、EU252位上的酪氨酸、EU286位上的谷氨酸、EU307位上的谷氨酰胺、EU308位上的脯氨酸、EU311位上的丙氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的缬氨酸；或
[0091]d)EU250位上的缬氨酸、EU252位上的酪氨酸、EU286位上的谷氨酸、EU307位上的谷氨酰胺、EU308位上的脯氨酸、EU311位上的丙氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的缬氨酸。
[0092][10] [2]的抗原结合分子，其中FcRn结合结构域在3个或更多个位置上包含氨基酸取代，其中所述3个或更多个位置是选自以下的组合之一:[0093]a) EU434 和 EU307 和 EU311 ;
[0094]b) EU434 和 EU307 和 EU309 和 EU311 ;或
[0095]c) EU434 和 EU250 和 EU252 和 EU436。
[0096][11] [10]的抗原结合分子，其中FcRn结合结构域包含:
[0097]a)EU307位上的谷氨酰胺、EU311位上的组氨酸和EU434位上的酪氨酸；或
[0098]b)EU307位上的谷氨酰胺、EU309位上的谷氨酸、EU311位上的丙氨酸和EU434位上的酪氨酸；或
[0099]c)EU307位上的谷氨酰胺、EU309位上的谷氨酸、EU311位上的组氨酸和EU434位上的酪氨酸；或
[0100]d)EU250位上的缬氨酸、EU252位上的酪氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的缬氨酸。
[0101][12][1]-[11]中任一个的抗原结合分子，其中高分子量物类的比率小于2%。
[0102][13] [1]-[12 ]中任一个的抗原结合分子，其中抗原结合分子包含具有以下的抗原结合结构域:
[0103]a)在pH5.5-6.5下比在pH7_8下对抗原的结合活性低或
[0104]b)对抗原的“钙浓度依赖性结合”活性。
[0105][14] [1]-[5]中任一个的抗原结合分子,其中所述结合分子在pH7下对FcRn的结合活性为50-150nM, Tm高于63.(TC，Epibase评分小于250。
[0106][15] [1]-[3]和[6]_[7]中任一个的抗原结合分子，其中所述结合分子在pH7下对FcRn的结合活性为15-50nM，Tm高于60°C，Epibase评分小于500。
[0107][16] [1]-[3]和[8]_[9]中任一个的抗原结合分子，其中在pH7下所述结合分子对FcRn的结合活性强于15nM，Tm高于57.5°C, Epibase评分小于500。
[0108][17] [1]-[3]中任一个的抗原结合分子，其中FcRn结合结构域包含以下氨基酸取代:
[0109]a)在EU238、EU255和/或EU258位上的氨基酸取代，和
[0110]b)在3个或更多个位置上的氨基酸取代，其中所述3个或更多个位置是表4-7提供的组合之一。
[0111][18] [1]-[17]中任一个的抗原结合分子，其中
[0112]a)在FcRn结合结构域的EU257位上，氨基酸不是选自以下的氨基酸:丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和苏氨酸，和/或
[0113]b)在FcRn结合结构域的EU252位上，氨基酸不是色氨酸。
[0114][19][1]-[18]中任一个的抗原结合分子，其中抗原结合分子具有与包含完整FcRn结合结构域的对照抗体的结合亲和力相比不显著提高的对预存抗药抗体的结合活性。
[0115][20] [19]的抗原结合分子，其中FcRn结合结构域还在选自以下的一个或多个位置上包含氨基酸取代:EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438 和 EU440。
[0116][21] [20]的抗原结合分子，其中FcRn结合结构域包含一个或多个选自以下的氨基酸取代:
[0117]EU387位上的精氨酸，
[0118]EU422位上的谷氨酸、精氨酸或丝氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、苏氨酸或谷氨酰胺；[0119]EU424位上的谷氨酸或精氨酸、赖氨酸或天冬酰胺；
[0120]EU426位上的天冬氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸或酪氨酸；
[0121]EU433位上的天冬氨酸；
[0122]EU436位上的苏氨酸；
[0123]EU438位上的谷氨酸、精氨酸、丝氨酸或赖氨酸；和
[0124]EU440位上的谷氨酸、天冬氨酸或谷氨酰胺。
[0125][22] [1]-[21]中任一个的抗原结合分子，其中所述修饰的FcRn结合结构域包含3个或更多个取代，其中所述3个或更多个取代是表12-13提供的组合之一。
[0126][23] [1]-[22]中任一个的抗原结合分子，其中所述修饰的FcRn结合结构域包含3个或更多个取代，其中所述3个或更多个取代是表14-15提供的组合之一。
[0127][24] [20]-[23]中任一个的抗原结合分子，其中FcRn结合结构域包含:
[0128]a)EU252位上的酪氨酸、EU387位上的精氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的缬氨酸；或
[0129]b)EU252位上的酪氨酸、EU422位上的谷氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的缬氨酸；或 [0130]c)EU252位上的酪氨酸、EU422位上的精氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的缬氨酸；或
[0131]d)EU252位上的酪氨酸、EU422位上的丝氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的缬氨酸；或
[0132]e)EU252位上的酪氨酸、EU424位上的谷氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的缬氨酸；或
[0133]f)EU252位上的酪氨酸、EU424位上的精氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的缬氨酸；或
[0134]g) EU252位上的酪氨酸、EU434位上的酪氨酸、EU436位上的缬氨酸和EU438位上的谷氨酸；或
[0135]h) EU252位上的酪氨酸、EU434位上的酪氨酸、EU436位上的缬氨酸和EU438位上的精氨酸；或
[0136]i)EU252位上的酪氨酸、EU434位上的酪氨酸、EU436位上的缬氨酸和EU438位上的丝氨酸；或
[0137]j)EU252位上的酪氨酸、EU434位上的酪氨酸、EU436位上的缬氨酸和EU440位上的谷氨酸。
[0138][25] [1]-[24]中任一个的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子是抗体。
[0139][26] [1]-[25]中任一个的抗原结合分子用于改进抗原结合分子介导的细胞对抗原的摄入的用途。
[0140][27] [1]-[25]中任一个的抗原结合分子用于降低血浆特定抗原浓度的用途，其中所述抗原结合分子包含可结合所述抗原的抗原结合结构域。
[0141][28] 一种用于改进抗原结合分子的药代动力学的方法，所述方法包括在选自以下的一个或多个位置上将氨基酸取代引入所述抗原结合分子的FcRn结合结构域中的步骤:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434 和 EU436。
[0142][29] 一种用于延迟消除受试者中的抗原结合分子的方法，所述方法包括在选自以下的一个或多个位置上将氨基酸取代引入所述抗原结合分子的FcRn结合结构域中的步骤:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434 和 EU436。
[0143][30] 一种延长抗原结合分子的血浆滞留时间的方法，所述方法包括在选自以下的一个或多个位置上将氨基酸取代引入所述抗原结合分子的FcRn结合结构域中的步骤:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434 和 EU436。
[0144][31] 一种用于提高抗原结合分子的血浆抗原消除速率的方法，所述方法包括在选自以下的一个或多个位置上将氨基酸取代引入所述抗原结合分子的FcRn结合结构域中的步骤:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434 和 EU436。
[0145][32] 一种用于提高抗原结合分子消除血浆抗原的能力的方法，所述方法包括在选自以下的一个或多个位置上将氨基酸取代引入所述抗原结合分子的FcRn结合结构域中的步骤:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434 和 EU436。 [0146][33] [28]-[32]中任一个的方法，其中将另外的氨基酸取代在EU256位上引入FcRn结合结构域中。
[0147][34] [28]-[33]中任一个的方法，其中所述方法还包括在选自以下的一个或多个位置上将氨基酸取代引入FcRn结合结构域中的步骤:EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438 和 EU440。
[0148][35] 一种用于产生[1]_[25]中任一个的抗原结合分子的方法，所述方法包括以下步骤:
[0149](a)选择亲本FcRn结合结构域并且通过在选自以下的一个或多个位置上引入氨基酸取代来改变所述亲本 FcRn:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434 和 EU436 ；
[0150](b)选择抗原结合分子的抗原结合结构域并且改变抗原结合结构域中的至少一个氨基酸以得到PH依赖性抗原结合结构域或钙离子依赖性抗原结合结构域；
[0151](c)获得编码其中将(a)和(b)中制备的人FcRn结合结构域和抗原结合结构域连接的抗原结合分子的基因，和
[0152](d)使用(C)中制备的基因产生抗原结合分子。
[0153][36] [35]的方法，其中在步骤a)中将另外的氨基酸取代在EU256位上引入FcRn结合结构域中。
[0154][37] [35]-[36]中任一个的方法,其中所述方法还包括在选自以下的一个或多个位置上将氨基酸取代引入FcRn结合结构域中的步骤:EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438 和 EU440。
[0155][38] 一种包含修饰的FcRn结合结构域的抗原结合分子,其中所述修饰的FcRn结合结构域在选自以下的一个或多个位置上包含氨基酸取代:EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438和EU440，其中与包含完整FcRn结合结构域的抗原结合分子的结合亲和力相比所述抗原结合分子对预存抗药抗体(ADA)的结合亲和力在中性pH下不显著提高。
[0156][39] [38]的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子另外在中性或酸性pH范围内对FcRn的结合亲和力提高。
[0157][40] [38]或[39]的抗原结合分子，其中取代一个或多个选自EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438 和 EU440 的位置的氨基酸选自
[0158]a) EU387位上的精氨酸；
[0159]b)EU422位上的谷氨酸、精氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、苏氨酸或谷氨酰胺；
[0160]c)EU424位上的谷氨酸、精氨酸、赖氨酸或天冬酰胺；
[0161]d)EU426位上的天冬氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸或酪氨酸；
[0162]e) EU433位上的天冬氨酸
[0163]f)EU436位上的苏氨酸
[0164]g)EU438位上的谷氨酸、精氨酸、丝氨酸或赖氨酸；和
[0165]h)EU440位上的谷氨酸、天冬氨酸或谷氨酰胺。
[0166][41] [38]-[40]中任一个的抗原结合分子，其中所述修饰的FcRn结合结构域包含表10提供的一个或多个位置或组合之一的氨基酸取代。
[0167][42] [38]-[40]中任一个的抗原结合分子，其中所述修饰的FcRn结合结构域包含表11提供的氨基酸取代或取代组合的任一个。
[0168][43] [39]-[42]中任一个的抗原结合分子，其中所述修饰的FcRn结合结构域还包含选自以下的FcRn结合结构域的一个或多个位置上的氨基酸取代:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU256、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU434 和EU436，其中所述取代使得FcRn结合活性在中性pH或酸性pH范围内增加。
[0169][44] [39]-[43]中任一个的抗原结合分子，其中所述修饰的FcRn结合结构域在以下的FcRn结合结构域位置上包含氨基酸取代:
[0170]i) a) EU438/EU440 或 b) EU424 ;和
[0171]ii)a) EU434, b) EU252/EU254/EU256 ；c) EU428/EU434 ;或 d) EU250/EU428。
[0172][45] [44]的抗原结合分子，其中所述修饰的FcRn结合结构域包含以下氨基酸取代:
[0173]i) a) EU438R/EU440E 或 b) EU424N ;和
[0174]ii)a)M434H ；b)M252Y/S254T/T256E ；c)M428L/N434S ；或 d)T250Q 和 M428L(EU 编号)。
[0175][46] [45]的抗原结合分子，其中所述修饰的FcRn结合结构域包含3个或更多个氨基酸取代，其中所述3个或更多个取代是表13和15中提供的组合之一。
[0176][47] [39]-[42]中任一个的抗原结合分子，其中所述修饰的FcRn结合结构域包含以下位置的取代:
[0177]a)在选自 EU387、EU422、EU424、EU438、EU440、EU433 的一个或多个位置上或其中两个位置是选自EU422/EU424和EU438/EU440的组合之一的两个或更多个位置；和
[0178]b)其中两个位置是表9提供的组合之一的两个或更多个位置。
[0179][48] [47]的抗原结合分子，其中所述修饰的FcRn结合结构域包含3个或更多个氨基酸取代，其中所述3个或更多个氨基酸取代是表12或14提供的组合之一。
[0180][49] [39]-[48]中任一个的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包含pH依赖性抗原结合结构域或钙离子依赖性抗原结合结构域。
[0181][50] 一种用于降低包含FcRn结合结构域的抗原结合分子对预存ADA的结合活性的方法,所述FcRn结合结构域在中性或酸性pH下对FcRn的结合活性提高且在中性pH下对预存ADA的结合活性提高，所述方法包括以下步骤:
[0182]a)提供具有在中性或酸性pH下对FcRn的结合活性提高且在中性pH下对预存ADA的结合活性提高的FcRn结合结构域的抗原结合分子；和
[0183]b)在选自 EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438 和 EU440 的一个或多个位置上取代FcRn结合结构域中的氨基酸，得到具有修饰的FcRn结合结构域的抗原结合分子。
[0184][51] [50]的方法，其中步骤b)包括在3个或更多个位置上取代氨基酸，其中所述3个或更多个位置为表10提供的组合之一。
[0185][52] [50]的方法，其中步骤b)包括将3个或更多个氨基酸取代引入FcRn结合结构域中，其中所述3个或更多个氨基酸取代为表11提供的组合之一。
[0186][53] 一种用于增加单个抗原结合分子可结合的抗原总数而与亲本抗体相比又不显著提高在中性PH 下对预存ADA的结合活性的方法，所述方法包括以下步骤:
[0187]a)提供包含亲本FcRn结合结构域的抗原结合分子，
[0188]b)通过在选自以下的一个或多个位置上取代亲本FcRn结合结构域的氨基酸序列中的氨基酸来改变步骤a)的亲本FcRn结合结构域:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU256、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434 和 EU436 ;和
[0189]c)通过在选自以下的一个或多个位置上取代亲本FcRn结合结构域的氨基酸序列中的氨基酸来改变步骤b)的修饰的FcRn结合结构域:EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438 和 EU440。
[0190][54] 一种用于促进以抗原结合的形式摄入细胞中的不含抗原的抗原结合分子在胞外释放而与亲本抗体相比又不显著提高所述抗原结合分子在中性PH下对预存ADA的结合活性的方法，所述方法包括以下步骤:
[0191]a)提供包含亲本FcRn结合结构域的抗原结合分子，
[0192]b)通过在选自以下的一个或多个位置上取代亲本FcRn结合结构域的氨基酸序列中的氨基酸来改变亲本FcRn结合结构域:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU256、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434 和 EU436 和 EU428 ；和
[0193]c)通过在选自以下的一个或多个位置上取代亲本FcRn结合结构域的氨基酸序列中的氨基酸来改变步骤b)的修饰的FcRn结合结构域:EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438 和 EU440。
[0194][55] 一种用于提高抗原结合分子消除血浆抗原的能力而与亲本抗体相比又不显著提高在中性PH下对预存ADA的结合活性的方法，所述方法包括以下步骤:
[0195]a)提供包含亲本FcRn结合结构域的抗原结合分子，
[0196]b)通过在选自以下的一个或多个位置上取代亲本FcRn结合结构域的氨基酸序列中的氨基酸来改变亲本FcRn结合结构域:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU256、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434 和 EU436 和 EU428 ；和
[0197]c)通过在选自以下的一个或多个位置上取代亲本FcRn结合结构域的氨基酸序列中的氨基酸来改变步骤b)的修饰的FcRn结合结构域:EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438 和 EU440。
[0198][56] 一种用于改进抗原结合分子的药代动力学而与亲本抗体相比又不显著提高在中性pH下对预存ADA的结合活性的方法，所述方法包括以下步骤:
[0199]a)提供包含亲本FcRn结合结构域的抗原结合分子，
[0200]b)通过在选自以下的一个或多个位置上取代亲本FcRn结合结构域的氨基酸序列中的氨基酸来改变亲本FcRn结合结构域:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU256、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434 和 EU436 ;和
[0201]c)通过在选自以下的一个或多个位置上取代亲本FcRn结合结构域的氨基酸序列中的氨基酸来改变步骤b)的修饰的FcRn结合结构域:EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438 和 EU440。
[0202][57] 一种用于降低血浆总抗原浓度或血浆游离抗原浓度而与亲本抗体相比又不显著提高在中性PH下对预存ADA的结合活性的方法，所述方法包括以下步骤:
[0203]a)提供包含亲本FcRn结合结构域的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包含可结合所述抗原的抗原结合结构域，
[0204]b)通过在选自以下的一个或多个位置上取代亲本FcRn结合结构域的氨基酸序列中的氨基酸来改变亲本FcRn结合结构域:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU256、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434 和 EU436 ;和
[0205]c)通过在选自以下的一个或多个位置上取代亲本FcRn结合结构域的氨基酸序列中的氨基酸来改变步骤b)的修饰的FcRn结合结构域:EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438 和 EU440。
[0206][58] 一种用于产生包含在中性或酸性pH下对FcRn的结合活性提高且在中性pH下对预存ADA的结合活性降低的FcRn结合结构域的抗原结合分子的方法，所述方法包括以下步骤:
[0207](a)提供在中性或酸性pH范围内对FcRn的结合活性提高且在中性pH范围内对预存ADA的结合活性提高的FcRn结合结构域，
[0208](b)在选自以下的一个或多个位置上取代氨基酸:EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438 和 EU440，
[0209](C)选择抗原结合分子的抗原结合结构域并且改变抗原结合结构域中的至少一个氨基酸以得到PH依赖性抗原结合结构域，或选择钙离子依赖性抗原结合结构域；
[0210](d)获得编码其中将(a)和(b)中制备的人FcRn结合结构域和抗原结合结构域连接的抗原结合分子的基因，和
[0211] (e)使用(C)中制备的基因产生抗原结合分子，其中与具有完整FcRn结合结构域的亲本抗原结合结构域相比，所产生的所述抗原结合分子在中性或酸性PH下对FcRn的结合活性提高且在中性PH下对内源ADA的结合活性降低。[0212][59] [58]的方法，其中在中性或酸性pH范围内对FcRn和预存ADA的结合活性提高且在中性PH范围内对预存ADA的结合活性提高的FcRn结合结构域在选自以下的一个或多个位置上包含氨基酸取代:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU256、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434 和 EU436。
[0213][60] [53]-[57]中任一个的方法，其中在步骤a)中引入的氨基酸取代位于3个或更多个位置，其中所述3个或更多个位置是表4-7提供的组合之一。
[0214][61] [53]-[60]中任一个的方法，其中在步骤b)中引入的氨基酸取代位于3个或更多个位置，其中所述3个或更多个位置为表10提供的组合之一。
[0215]附图简述
[0216][图1A]图1A显示现有技术的抗体(“常规抗体”)与具有增强的FcRn的pH依赖性抗原结合抗体相比从血浆中消除抗原的示意图，所述两种抗体在中性PH下均结合可溶性抗原。常规抗体与血浆中的抗原结合，并且被细胞非特异性地摄入酸性内体。在内体的酸性条件下，常规抗体结合小囊泡内的FcRn，并转运回到细胞表面，抗体在此再次释放。在整个内化和再循环过程期间抗原与抗原结合结构域结合。在中性PH下FcRn结合提高的pH依赖性抗原结合抗体与细胞表面上的FcRn结合，并快速内化到细胞内，因而以比常规抗体高的频率内化到细胞内。在内体的酸性条件下，抗原从修饰抗体上解离,并转运至溶酶体，在此被蛋白水解性降解。仍与FcRn结合的抗体再循环返回细胞表面。在此，再循环的游离抗体可再次与另一抗原结合。通过重复FcRn介导的摄取、抗原解离和降解及抗体再循环的这个循环，在中性pH下与FcRn的结合亲和力提高的这种pH依赖性抗原结合抗体可比常规抗体递送显著较多量的抗原至溶酶体，因此与常规抗体相比，可更显著地降低血浆总抗原浓度。
[0217][图1B]图1B显示内体中可溶性抗原从具有pH依赖性抗原结合结构域的IgG抗体中解离的图示。这导致抗原消除增加，并允许抗体与血浆中的另一抗原结合。
[0218][图2]图2显示包含Fe变体的抗体的hFcRn结合亲和力(x轴)和y轴上的Tm的示图(Fe变体F1-F599:空心正方形；Fc变体F600-F1052:实心正方形)。
[0219][图3]图3显示包含Fe变体的抗体的hFcRn结合亲和力(x轴)和高分子量(HMW)部分(以％表示)(y轴)的示图(Fe变体F1-F599:空心正方形，Fe变体F600-F1050:实心正方形)。
[0220][图4]图4显示包含Fe变体的抗体的hFcRn结合亲和力(x轴)和免疫原性评分(Epibase评分)的示图(Fe变体F1-F599:空心正方形，Fe变体F600-F1052:实心正方形)。
[0221][图5]图5显示包含其hFcRn结合亲和力强于15nM的Fe变体的抗体的hFcRn结合亲和力(X轴)和熔解温度Tm(y轴)的示图(其Kd小于或等于15nM的F1-F599的Fe变体:空心正方形，其Kd小于或等于15nM的F600-F1052的Fe变体(第I组):实心正方形)。
[0222][图6]图6显示包含其hFcRn结合亲和力强于15nM的Fe变体的抗体的hFcRn结合亲和力(X轴)和HMW(以％表示)(y轴)的示图(其Kd小于或等于15nM的F1-F599的Fe变体:空心正方形；其Kd小于或等于15nM的F600-F1052的Fe变体(第I组):实心正方形)。[0223][图7]图7显示包含其hFcRn结合亲和力强于15nM的Fe变体的抗体的hFcRn结合亲和力和免疫原性评分的示图(其Kd小于或等于15nM的F1-F599的Fe变体:空心正方形；其Kd小于或等于15nM的F600-F1052的Fe变体(第I组):实心正方形)。
[0224][图8]图8显示包含其hFcRn结合亲和力介于15nM和50nM之间的Fe变体的抗体的hFcRn结合亲和力和Tm的示图(其Kd= 15_50nM的F1-F599的Fe变体，空心正方形；其Kd = 15-50nM的F600-F1052的Fe变体(第2组):实心正方形)
[0225][图9]图9显示包含其hFcRn结合亲和力介于15nM和50nM之间的Fe变体的抗体的hFcRn结合亲和力和HMW(% )的示图(其Kd = 15_50nM的F1-F599的Fe变体，空心正方形；其Kd = 15-50nM的F600-F1052的Fe变体(第2组):实心正方形)。
[0226][图10]图10显示包含其hFcRn结合亲和力介于15nM和50nM之间的Fe变体的抗体的hFcRn结合亲和力和免疫原性评分的示图(其Kd = 15-50nM的F1-F599的Fe变体，空心正方形；其Kd = 15-50nM的F600-F1052的Fe变体(第2组):实心正方形)。
[0227][图11]图11显示包含其hFcRn结合亲和力介于50nM和150nM之间的Fe变体的抗体的hFcRn结合亲和力和Tm的示图(其Kd = 50_150nM的F1-F599的Fe变体，空心正方形；其Kd = 50-150nM的F600-F1052的Fe变体(第3组):实心正方形)。
[0228][图12]图12显示包含其hFcRn结合亲和力介于50nM和150nM的Fe变体的抗体的hFcRn结合亲和力和HMW (% )的示图(其Kd = 50_150nM的F1-F599的Fe变体，空心正方形；其Kd = 50-150nM之间的F600-F1052的Fe变体(第3组):实心正方形)。
[0229][图13]图13显示包 含其hFcRn结合亲和力介于50nM和150nM之间的Fe变体的抗体的hFcRn结合亲和力和免疫原性评分的示图(其Kd = 50-150nM的F1-F599的Fe变体:空心正方形；其Kd = 50-150nM的F600-F1052的Fe变体(第3组):实心正方形)。
[0230][图14]图14显示包含其hFcRn结合亲和力介于150nM和700nM之间的Fe变体的抗体的hFcRn结合亲和力和Tm的示图(其Kd = 150_700nM的F1-F599的Fe变体，空心正方形；其Kd = 150-700nM的Fe变体F600-F1052 (第4组):实心正方形)。
[0231][图15]图15显示包含其hFcRn结合亲和力介于150nM和700nM之间的Fe变体的抗体的hFcRn结合亲和力和HMW(% )的示图(其Kd = 150_700nM的F1-F599的Fe变体:空心正方形；其Kd = 150-700nM的F600-F1052的Fe变体(第4组):实心正方形)。
[0232][图16]图16显示包含其hFcRn结合亲和力介于150nM和700nM之间的Fe变体的抗体的hFcRn结合亲和力和免疫原性评分的示图(其Kd = 150-700nM的F1-F599的Fe变体:空心正方形；其Kd = 150-700nM的F600-F1052的Fe变体(第4组):实心正方形)。
[0233][图17]图 17 显示在注射 Fv4-1gGl、Fv4-F652、Fv4-F890 和 Fv4-F946 后的人 FcRn转基因小鼠中和在对照小鼠(无抗体注射)中随时间推移的血浆抗原(hsIL-6R)浓度的示图。
[0234][图18]图 18 显示在注射 Fv4-1gGl、Fv4-F652、Fv4-F890 和 Fv4-F946 后在人 FcRn转基因小鼠中随时间推移的血浆抗体浓度的示图。
[0235][图19]图19显示在对照(无抗体注射)和在注射Fv4-1gGl、Fv4-Fll和Fv4-F652后的人FcRn转基因小鼠中随时间推移的血浆抗原(hsIL-6R)浓度的示图。
[0236][图20]图20显示在注射Fv4-1gGl、Fv4-Fll和Fv4_F652后在人FcRn转基因小鼠中随时间推移的血浆抗体浓度的示图。[0237][图21]图21显示来自30名RA患者的血清针对人源化抗IL_6受体抗体Fv4-1gGl (图21-1)、其YTE变体(图21_2)和LS变体(图21_3)的电化学发光(ECL)反应的示图。
[0238][图22]图22显示来自15名RA患者的血清针对人源化抗IL_6受体抗体Fv4-1gGl (图 22-1)、Fv4-N434H(图 22-2)、Fv4_Fll (图 22-3)、Fv4_F68 (图 22-4),Fv4-890 (图22-5)和Fv4_F947 (图22-6)的电化学发光(ECL)反应的示图。
[0239][图23]图23显示图22所示的来自15名RA患者的血清针对Fv4-1gGl、Fv4_Fll、Fv4-F68、Fv4-F890和Fv4_F947的ECL反应的平均值(图23_1)、几何平均值(图23_2)和中位值(图23-3)。
[0240][图24]图24显示来自15名RA患者的血清针对人源化抗IL_6受体抗体Fv4-1gGl (图 24-1)和变体 Fv4_F890、Fv4_F1058、Fv4_F1059、Fv4_F1060、Fv4_F1061、Fv4-F1062、Fv4-F1063、Fv4_F1064、Fv4_F1065、Fv4_F1066、Fv4_F1067、Fv4_F1068、Fv4-F1069、Fv4-F1070、Fv4_F1071、Fv4_F1072 和 Fv4_F1073(图 24-2 至图 24-18)的电化学发光(ECL)反应的示图。
[0241][图25]图25显示图24所示的来自15名RA患者的血清针对Fv4_IgGl、变体 Fv4-F890、Fv4-F1058、Fv4_F1059、Fv4_F1060、Fv4_F1061、Fv4_F1062、Fv4_F1063、Fv4-F1064、Fv4-F1065、Fv4_F1066、Fv4_F1067、Fv4_F1068、Fv4_F1069、Fv4_F1070、Fv4-F1071、Fv4-F1072和Fv4-F1073的ECL反应的平均值(图25-1)、几何平均值(图25-2)和中位值(图25-3)。
[0242][图26]图26显示来自15名RA患者的血清针对变体Fv4_F1104、Fv4_F1105和Fv4-F1106的电化学发光(ECL)反应的示图。
[0243][图27]图27显示来自15名RA患者的血清针对变体Fv4_F1107、Fv4_F1108、Fv4-F1109、Fv4-F1110、Fv4_Fllll、Fv4_F1112、Fv4_F1113 和 Fv4_F1114(图 27—1 至图27-8)的电化学发光(ECL)反应的示图。
[0244][图28]图28显示来自15名RA患者的血清针对变体Fv4_F1230(图28-1)、Fv4-F1231(图28-2)、Fv4-F1232(图28-3)的电化学发光(ECL)反应的示图。
[0245][图29]图29显示来自15名RA患者的血清针对变体Fv4_F947、Fv4_F1119、Fv4-F1120、Fv4-F1121、Fv4-F1122、Fv4-F1123 和 Fv4-F1124 的电化学发光(ECL)反应的示图。
[0246][图30]图30-1至图30_4显示来自15名RA患者的血清针对变体Fv4_F939、Fv4-F1291、Fv4-F1268和Fv4_F1269的电化学发光(ECL)反应的示图。图30-5至图30-9显示来自30名RA患者的血清针对变体Fv4-F1243、Fv4_F1245、Fv4_F1321、Fv4_F1340和Fv4-F1323的电化学发光(ECL)反应的示图。
[0247][图31]图31显示来自15名RA患者的血清针对变体Fv4_F890(图31-1)和Fv4-F1115( = F890+S424N,图31-2)的电化学发光(ECL)反应的示图。
[0248][图32]图32显示来自15或30名RA患者的血清针对变体Fv4_YTE(图32-1)、Fv4-F1166( = YTE+Q438R/S440E,图 32-2), Fv4_F1167( = YTE+S424N,图 32-3),Fv4-LS (图 32-4)、Fv4-Fl 170 ( = LS+Q438R/S440E,图 32-5)、Fv4_Fl 171 (LS+S424N，图32-6)、Fv4-N434H(图 32-7)、Fv4_Fl 172 ( = N434H+Q438R/S440E,图 32-8)、Fv4_Fl 173 (=N434H+S424N，图32-9)的电化学发光(ECL)反应的示图。
[0249][图33]图33显示来自30名RA患者的血清针对变体Fv4_LS、Fv4_F1380(图
33-2)、Fv4-F1384(图 33-3)、Fv4_F1385 (图 33-4)、Fv4_F1386 (LS+S426Y，图 33-5),Fv4-F1388(图 33-6)和 Fv4_F1389 (LS+Y436T，图 33-7)的电化学发光(ECL)反应的示图。
[0250][图34]图34显示来自30名RA患者的血清针对变体F939的电化学发光(ECL)反应的示图。
[0251][图35]图35显示来自30名RA患者的血清针对变体F1378的电化学发光(ECL)反应的示图。
[0252][图36]图36显示来自30名RA患者的血清针对变体F1379的电化学发光(ECL)反应的示图。
[0253][图37]图37显示来自30名RA患者的血清针对变体F1262的电化学发光(ECL)反应的示图
[0254][图38]图38显示来自 30名RA患者的血清针对变体Fl138的电化学发光(ECL)反应的示图
[0255][图39]图39显示来自30名RA患者的血清针对变体F1344的电化学发光(ECL)反应的示图
[0256][图40]图40显示来自30名RA患者的血清针对变体F1349的电化学发光(ECL)反应的示图
[0257][图41]图41显示来自30名RA患者的血清针对变体F1350的电化学发光(ECL)反应的示图
[0258][图42]图42显示来自30名RA患者的血清针对变体F1351的电化学发光(ECL)反应的示图
[0259][图43]图43显示来自30名RA患者的血清针对变体F1261的电化学发光(ECL)反应的示图
[0260][图44]图44显示来自30名RA患者的血清针对变体F1263的电化学发光(ECL)反应的示图
[0261][图45]图45显示来自30名RA患者的血清针对变体F1305的电化学发光(ECL)反应的示图
[0262][图46]图46显示来自30名RA患者的血清针对变体F1306的电化学发光(ECL)反应的示图
[0263][图47]图47显示来自30名RA患者的血清针对变体F1268的电化学发光(ECL)反应的示图
[0264][图48]图48显示来自30名RA患者的血清针对变体F1269的电化学发光(ECL)反应的示图
[0265][图49]图49显示来自30名RA患者的血清针对变体F1413的电化学发光(ECL)反应的示图
[0266][图50]图50显示来自30名RA患者的血清针对变体F1416的电化学发光(ECL)反应的示图
[0267][图51]图51显示来自30名RA患者的血清针对变体F1419的电化学发光(ECL)反应的示图
[0268][图52]图52显示来自30名RA患者的血清针对变体F1420的电化学发光(ECL)反应的示图
[0269][图53]图53显示来自30名RA患者的血清针对变体F1370的电化学发光(ECL)反应的示图
[0270][图54]图54显示来自30名RA患者的血清针对变体F1371的电化学发光(ECL)反应的示图
[0271][图55]图55显示来自30名RA患者的血清针对变体F1599的电化学发光(ECL)反应的示图
[0272][图56]图56显示来自30名RA患者的血清针对变体F1600的电化学发光(ECL)反应的示图
[0273][图57]图57显示来自30名RA患者的血清针对变体F1566的电化学发光(ECL)反应的示图
[0274][图58]图58显示来自30名RA患者的血清针对变体F1448的电化学发光(ECL)反应的示图
[0275][图59]图59 显示来自30名RA患者的血清针对变体F1601的电化学发光(ECL)反应的示图
[0276][图60]图60显示来自30名RA患者的血清针对变体F1602的电化学发光(ECL)反应的示图
[0277][图61]图61显示来自30名RA患者的血清针对变体F1603的电化学发光(ECL)反应的示图
[0278][图62]图62显示来自30名RA患者的血清针对变体F1531的电化学发光(ECL)反应的示图
[0279][图63]图63显示来自30名RA患者的血清针对变体F1604的电化学发光(ECL)反应的示图
[0280][图64]图64显示来自30名RA患者的血清针对变体F1605的电化学发光(ECL)反应的示图
[0281][图65]图65显示来自30名RA患者的血清针对变体F1586的电化学发光(ECL)反应的示图
[0282][图66]图66显示来自30名RA患者的血清针对变体F1592的电化学发光(ECL)反应的示图
[0283][图67]图67显示来自30名RA患者的血清针对变体F1610的电化学发光(ECL)反应的示图
[0284][图68]图68显示来自30名RA患者的血清针对变体F1611的电化学发光(ECL)反应的示图
[0285][图69]图69显示来自30名RA患者的血清针对变体F1612的电化学发光(ECL)反应的示图
[0286][图70]图70显示来自30名RA患者的血清针对变体F1613的电化学发光(ECL)反应的示图[0287][图71]图71显示来自30名RA患者的血清针对变体F1614的电化学发光(ECL)反应的示图
[0288][图72]图72显示来自30名RA患者的血清针对变体F1615的电化学发光(ECL)反应的示图
[0289][图73]图73显示来自30名RA患者的血清针对变体F1567的电化学发光(ECL)反应的示图
[0290][图74]图74显示来自30名RA患者的血清针对变体F1572的电化学发光(ECL)反应的示图
[0291][图75]图75显示来自30名RA患者的血清针对变体F1576的电化学发光(ECL)反应的示图
[0292][图76]图76显示来自30名RA患者的血清针对变体F1578的电化学发光(ECL)反应的示图
[0293][图77]图77显示来自30名RA患者的血清针对变体F1579的电化学发光(ECL)反应的示图
[0294][图78]图78显示来自30名RA患者的血清针对变体F1641的电化学发光(ECL)反应的示图
[0295][图79]图79显 示来自30名RA患者的血清针对变体F1642的电化学发光(ECL)反应的示图
[0296][图80]图80显示来自30名RA患者的血清针对变体F1643的电化学发光(ECL)反应的示图
[0297][图81]图81显示来自30名RA患者的血清针对变体F1644的电化学发光(ECL)反应的示图
[0298][图82]图82显示来自30名RA患者的血清针对变体F1645的电化学发光(ECL)反应的示图
[0299][图83]图83显示来自30名RA患者的血清针对变体F1646的电化学发光(ECL)反应的示图
[0300][图84]图84显示来自30名RA患者的血清针对变体F1647的电化学发光(ECL)反应的示图
[0301][图85]图85显示来自30名RA患者的血清针对变体F1648的电化学发光(ECL)反应的示图
[0302][图86]图86显示来自30名RA患者的血清针对变体F1649的电化学发光(ECL)反应的示图
[0303][图87]图87显示来自30名RA患者的血清针对变体F1650的电化学发光(ECL)反应的示图
[0304][图88]图88显示来自30名RA患者的血清针对变体F1651的电化学发光(ECL)反应的示图
[0305][图89]图89显示来自30名RA患者的血清针对变体F1652的电化学发光(ECL)反应的示图
[0306][图90]图90显示来自30名RA患者的血清针对变体F1653的电化学发光(ECL)反应的示图
[0307][图91]图91显示来自30名RA患者的血清针对变体F1654的电化学发光(ECL)反应的示图
[0308][图92]图92显示来自30名RA患者的血清针对变体F1655的电化学发光(ECL)反应的示图
[0309][图93]图93显示来自30名RA患者的血清针对变体F1329的电化学发光(ECL)反应的示图
[0310][图94]图94显示来自30名RA患者的血清针对变体F1331的电化学发光(ECL)反应的示图
[0311][图95]图95显示来自30名RA患者的血清针对变体F1718的电化学发光(ECL)反应的示图
[0312][图96]图96显示来自30名RA患者的血清针对变体F1719的电化学发光(ECL)反应的示图
[0313][图97]图97显示来自30名RA患者的血清针对变体F1720的电化学发光(ECL)反应的示图
[0314][图98]图98显示来自30名RA患者的血清针对变体F1721的电化学发光(ECL)反应的示图
[0315][图99]图99显示来自30名RA患者的血清针对变体F1671的电化学发光(ECL)反应的示图
[0316][图100]图100显示来自30名RA患者的血清针对变体F1670的电化学发光(ECL)反应的示图
[0317][图101]图101显示来自30名RA患者的血清针对变体F1711的电化学发光(ECL)反应的示图
[0318][图102]图102显示来自30名RA患者的血清针对变体F1712的电化学发光(ECL)反应的示图
[0319][图103]图103显示来自30名RA患者的血清针对变体F1713的电化学发光(ECL)反应的示图
[0320][图104]图104显示来自30名RA患者的血清针对变体F1722的电化学发光(ECL)反应的示图
[0321][图105]图105显示来自30名RA患者的血清针对变体F1723的电化学发光(ECL)反应的示图
[0322][图106]图106显示来自30名RA患者的血清针对变体F1724的电化学发光(ECL)反应的示图
[0323][图107]图107显示来自30名RA患者的血清针对变体F1725的电化学发光(ECL)反应的示图
[0324][图108]图108显示来自30名RA患者的血清针对变体F1675的电化学发光(ECL)反应的示图
[0325] [图109]图109显示来自30名RA患者的血清针对变体F1714的电化学发光(ECL)反应的示图[0326][图110]图110显示来自30名RA患者的血清针对变体F1715的电化学发光(ECL)反应的示图
[0327][图111]图111显示来自30名RA患者的血清针对变体F1716的电化学发光(ECL)反应的示图
[0328][图112]图112显示来自30名RA患者的血清针对变体F1717的电化学发光(ECL)反应的示图
[0329][图113]图113显示来自30名RA患者的血清针对变体F1683的电化学发光(ECL)反应的示图
[0330][图114]图114显示来自30名RA患者的血清针对变体F1756的电化学发光(ECL)反应的示图
[0331][图115]图115显示来自30名RA患者的血清针对变体F1757的电化学发光(ECL)反应的示图
[0332][图116]图116显示来自30名RA患者的血清针对变体F1758的电化学发光(ECL)反应的示图
[0333][图117]图117显示来自30名RA患者的血清针对变体F1759的电化学发光(ECL)反应的示图
[0334][图118]图118显 示来自30名RA患者的血清针对变体F1681的电化学发光(ECL)反应的示图
[0335][图119]图119显示来自30名RA患者的血清针对变体F1749的电化学发光(ECL)反应的示图
[0336][图120]图120显示来自30名RA患者的血清针对变体F1750的电化学发光(ECL)反应的示图
[0337][图121]图121显示来自30名RA患者的血清针对变体F1751的电化学发光(ECL)反应的示图
[0338][图122]图122显示来自30名RA患者的血清针对变体F1760的电化学发光(ECL)反应的示图
[0339][图123]图123显示来自30名RA患者的血清针对变体F1761的电化学发光(ECL)反应的示图
[0340][图124]图124显示来自30名RA患者的血清针对变体F1762的电化学发光(ECL)反应的示图
[0341][图125]图125显示来自30名RA患者的血清针对变体F1763的电化学发光(ECL)反应的示图
[0342][图126]图126显示来自30名RA患者的血清针对变体F1752的电化学发光(ECL)反应的示图
[0343][图127]图127显示来自30名RA患者的血清针对变体F1753的电化学发光(ECL)反应的示图
[0344][图128]图128显示来自30名RA患者的血清针对变体F1754的电化学发光(ECL)反应的示图
[0345][图129]图129显示来自30名RA患者的血清针对变体F1755的电化学发光(ECL)反应的示图
[0346][图130]图130显示来自30名RA患者的血清针对变体F1685的电化学发光(ECL)反应的示图
[0347][图131]图 131 显示在注射 Fv4_IgGl、Fv4_F1243 和 Fv4_F1245 后在人 FcRn 转基因小鼠中随时间推移的血浆抗体浓度的示图。
[0348][图132]图 132 显示在注射 Fv4-1gGl、Fv4-F1243 和 Fv4-F1245 后的人 FcRn 转基因小鼠中和在对照小鼠(无抗体注射)中随时间推移的血浆抗原(hsIL-6R)浓度的示图。
[0349][图133]图133显示在注射Fv4_IgGl、Fv4_F1389后在人FcRn转基因小鼠中随时间推移的血浆抗体浓度的示图。
[0350][图134]图134显示SPR分析的传感图。在不同条件(pH、Ca浓度)下，对抗hlgA抗体的hlgA结合进行了分析。
[0351][图135]图135显示在注射GA2-F760和GA2-F1331后在人FcRn转基因小鼠中随时间推移的血浆抗体浓度的示图。
[0352][图136]图136显示在注射GA2-F760和GA2-F1331后在人FcRn转基因小鼠中随时间推移的血浆hlgA浓度的示图。
[0353][图137]图137显示在注射278-F760和278-F1331后在人FcRn转基因小鼠中随时间推移的血浆抗体浓度的示图。
[0354][图138]图138显示在注射278-F760和278-F1331后在人FcRn转基因小鼠中随时间推移的血浆hIgE(Asp6)浓度的示图。
[0355]实施方案的描述
[0356]发明详述
[0357]在描述本发明的材料与方法之前，应了解这些描述只是说明性的，并无意是限制性的。还应了解本发明不限于本文描述的特定的大小、形状、尺寸、材料、方法、方案等，因为这些可按照例行实验和/或优化改变。本说明书中所用术语只用于描述具体形式或实施方案的目的，并无意限制仅受随附权利要求书限制的本发明的范围。除非另有说明，否则本文所用全部技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。在有冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。
[0358]本说明书中提及的各出版物、专利或专利申请的公开内容通过引用以其整体明确结合到本文中。然而，本文无一内容应被解释为承认本发明无资格通过先前发明先于这类公开内容。
[0359]本文所用措词“一个”、“一种”和“所述”意指“至少一个”，除非另有明确说明。
[0360]描述于W0/2011/122011的研究表明在pH7.4下与FcRn的结合提高的抗原结合分子(例如抗IL6受体抗体)能够从血浆消除抗原，并降低血浆总抗原浓度。因此，可通过pH依赖性抗原结合(在PH7.4下与血浆中的抗原结合，在pH6.0下在酸性内体内解离抗原)或通过离子化钙浓度依 赖性抗原结合(在高离子化钙浓度下与血浆内的抗原结合，在低离子化钙浓度下在内体内解离抗原)改进抗原消除的效率(参见图1B)。图1A中显示了通过与常规抗体相比在中性pH下与FcRn的结合亲和力改进的pH依赖性抗原结合抗体从血衆中消除抗原的机制。
[0361 ] 本发明提供FcRn结合结构域中的新的氨基酸取代，其提高抗原结合分子在酸性和中性pH范围内的FcRn结合活性，其中在中性pH范围内的FcRn结合活性强于完整IgG或包含完整FcRn结合结构域的抗原结合分子的FcRn结合活性(例如强于3200nM)。修饰的抗原结合分子在给予后可降低血浆总抗原浓度超过包含除完整人IgGFcRn结合结构域以外相同抗原结合结构域的对照抗原结合分子。
[0362]Fe受体是免疫细胞(例如天然杀伤细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和肥大细胞)表面上的蛋白质。它们与抗体的Fe (可结晶片段)区结合，所述Fe区与被感染细胞或侵入性病原体连接，并通过抗体介导的吞噬作用或依赖抗体的细胞介导毒性，刺激吞噬细胞或细胞毒性细胞消灭微生物或感染细胞。
[0363]有几种不同类型的Fe受体，根据它们识别的抗体的类型对其分类。本文的术语“FcRn”是指结合IgG的新生儿Fe受体，在构上与MHCI类蛋白类似，在人中由FCGRT基因编码。
[0364]本文所用术语“FcRn结合结构域”是指直接或间接与FcRn结合的蛋白质结构域。优选FcRn为哺乳动物FcRn，更优选为人FcRn。与FcRn直接结合的FcRn结合结构域是抗体Fe区。同时，能够与具有人FcRn结合活性的多肽(例如白蛋白或IgG)结合的区域，可通过白蛋白、IgG等与人FcRn间接结合。因此,这类人FcRn结合区可以是与具有人FcRn结合活性的多肽结合的区域。
[0365]本文所用术语“Fe区”或“抗原结合分子的Fe区”是指与FcRn、优选与哺乳动物FcRn、更优选与人FcRn直接结合的FcRn结合结构域。具体地讲,Fe区是抗体的Fe区。优选Fe区是哺乳动物Fe区，更优选是人Fe区。具体地讲，本发明的Fe区是包含人免疫球蛋白的第2和第3恒定结构域(CH2和CH3)，更优选包含铰链、CH2和CH3的Fe区。优选免疫球蛋白是IgG。优选F e区是人IgGl的Fe区。
[0366]本发明提供具有修饰的FcRn结合结构域的抗原结合分子，其中与具有完整FcRn结合结构域的抗原结合分子相比，所述抗原结合分子在中性PH范围内的FcRn结合活性提闻。
[0367]具体地讲，本发明提供具有修饰的FcRn结合结构域的抗原结合分子，所述修饰的FcRn结合结构域在选自以下的一个或多个位置上在FcRn结合结构域中具有氨基酸取代:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434和EU436。本发明的抗原结合分子还可在另外的位置上包含取代。例如，除上述提及的一个或多个位置上的取代以外，抗原结合分子可包含EU256位上的取代。优选EU256位上的氨基酸被谷氨酸取代。
[0368]术语“结合亲和力”或“结合活性”是指两种物质间非共价相互作用的强度，通过两种物质所形成的复合物的解离常数(KD)测量，除非另有明确定义。对特定靶分子(例如FcRn)，结合蛋白(或“配体”)可具有例如小于lO'lO'lO—7或KT8M的KD。在第一 pH范围内结合靶的数值KD小于在第二 pH范围内结合靶的数值KD可表明相对于在第二 pH范围内配体与靶的结合，在第一 pH范围内结合配体与靶的结合亲和力较高。结合亲和力的差异可为至少1.5、2、3、4、5、10、15、20、50、70、80、100、500或1000倍。结合亲和力可通过各种方法测定，包括表面等离子体共振、平衡透析、平衡结合、凝胶过滤、ELISA或光谱法(例如采用荧光测定法)。
[0369]在某一 pH范围内FcRn结合结构域对FcRn的结合亲和力提高相当于与针对完整FcRn结合结构域所测量的FcRn结合亲和力相比，所测量的FcRn结合亲和力提高。KD (完整)的结合亲和力/KD(变体)的结合亲和力的差异为至少1.5、2、3、4、5、10、15、20、50、70、80、100、500或1000倍。FcRn结合结构域对FcRn的结合亲和力的提高可在酸性或中性pH范围内。
[0370]术语“包含完整FcRn结合结构域的抗原结合分子”是指包含未修饰的FcRn结合结构域的抗原结合分子。本文所用术语“完整IgGFcRn结合结构域”是指人IgG的未修饰的FcRn结合结构域。具体地讲,FcRn结合结构域是完整人IgG的FcRn结合结构域。优选完整FcRn结合结构域是完整Fe区。术语“包含完整Fe区的抗体”是指包含未修饰的Fe区的抗体。未修饰的Fe区来源于其中的抗体优选为IgG。更优选其为人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4，还更优选为人IgGl。在本发明的特别优选的实施方案中，包含完整Fe区的抗体是包含未修饰的Fe区的抗体。包含完整Fe区的抗体可以是完整人IgG。
[0371]本文所用术语“完整IgG”是指未修饰的IgG，并且不限于IgG的特定类别。这意味着人IgGl、IgG2、IgG3、IgG4或其同种异型变体可用作“完整人IgG”，只要它可在酸性pH范围内与人FcRn结合。优选“完整IgG”是人IgGl。优选完整IgG是包含野生型Fe区的IgG0 [0372]在本发明的情况下，在中性pH范围内抗原结合分子提高的FcRn结合活性优选强于KD3.2微摩尔。优选在中性pH范围内提高的FcRn结合活性强于700纳摩尔，更优选强于500纳摩尔，最优选强于150纳摩尔。
[0373]在酸性pH范围内提高的本发明抗原结合分子的FcRn结合活性一般是完整IgG的FcRn结合活性约2倍-约100倍范围的FcRn结合活性。优选在酸性pH范围内提高的抗原结合分子的FcRn结合活性为完整IgG的FcRn结合活性的至少10倍。更优选在酸性pH范围内提高的本发明抗原结合分子的FcRn结合活性是完整IgG的FcRn结合活性的至少20倍。
[0374]本文所用术语“中性pH范围”和“中性pH”通常是指ρΗ6.7-ρΗΙΟ.0，优选ρΗ7.0-ρΗ8.0 内的任何 pH 值，其实例包括 ρΗ7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9和8.0。特别优选的酸性pH值为pH7.4，其接近体内血浆(血液)pH。
[0375]本文所用术语“酸性pH范围”和“酸性pH”通常是指pH4.0_pH6.5，优选ρΗ5.5-ρΗ6.5 内的任何 pH 值，其实例包括 ρΗ5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4和6.5。特别优选的酸性pH值的范围为ρΗ5.8-ρΗ6.0，其接近体内早期内体的pH。
[0376]有关本申请的氨基酸位置例如“EU387”或“位置387”，除非另有说明，否则按照称为 EU 编号系统(Kabat, E.A.，T.T.Wu, H.M.Perry, K.S.Gottesman, C.Foeler.1991.Sequences of Proteins of Immunological Interest.N0.91-3242U.S.Public HealthServices, National Institutes of Health, Bethesda)的方案编号，并且是指FcRn 结合结构域中，特别是Fe区中的位置。以类似方式，取代用例如“EU387R”或“EU440E”表示，其中在“EU”之后给出的数字表明按照EU编号的取代的位置，数字后的字母是以一字母代码给出的取代的氨基酸。取代也可写为(氨基酸I)-位置_(氨基酸2)，其中第一氨基酸是被取代的氨基酸，第二氨基酸是在规定位置上的取代氨基酸。
[0377]本文所用术语“取代”和“氨基酸的取代”是指氨基酸序列中的氨基酸被另一个氨基酸置换，其中后者不同于被置换的氨基酸。用于置换氨基酸的方法为本领域技术人员所熟知，包括但不限于编码氨基酸序列的核苷酸序列的突变。
[0378]更具体地讲，FcRn结合结构域中氨基酸的取代是指关于亲本FcRn结合结构域的氨基酸序列的氨基酸置换。本发明的FcRn结合结构域还包括已具有所需取代的修饰的FcRn结合结构域。
[0379]亲本FcRn结合结构域是具有以下位置的氨基酸和在中性pH下对FcRn无亲和力或亲和力低(弱于3200nM)的FcRn结合结构域:EU238位上的脯氨酸、EU250位上的苏氨酸、EU252位上的甲硫氨酸、EU254位上的丝氨酸、EU255位上的精氨酸、EU256位上的苏氨酸、EU258位上的谷氨酸、EU286位上的天冬酰胺、EU307位上的苏氨酸、EU308位上的缬氨酸、EU309位上的亮氨酸、EU311位上的谷氨酰胺、EU315位上的天冬酰胺、EU387位上脯氨酸、EU422位上的缬氨酸、EU424位上的丝氨酸、EU426位上的丝氨酸、EU428位上的甲硫氨酸、EU433位上的组氨酸、EU434位上的天冬酰胺、EU436位上的酪氨酸、EU438位上的谷氨酰胺和EU440位上的丝氨酸。亲本FcRn结合结构域可包含其它位置的取代，但优选亲本FcRn结合结构域是未修饰的。优选亲本FcRn结合结构域是Fe区(亲本Fe区)。优选亲本Fe区来源于哺乳动物抗体；更优选亲本Fe区是人抗体的Fe区。人抗体的Fe区在本文称为人Fe区。
[0380]亲本Fe区优选为完整Fe区，更优选人完整Fe区。优选亲本Fe区为IgG的Fe区，更优选为人IgG的Fe区。甚至更优选亲本Fe区为包含野生型铰链、野生型CH2和野生型CH3结构域的人Fe区。在本发明的情况下，术语亲本抗体是指包含亲本Fe区的抗体。
[0381]亲本抗原结合分子包括但不限于受体蛋白(膜结合受体和可溶性受体)、识别膜抗原(例如细胞表面标志物)的抗体和识别可溶性抗原(例如细胞因子)的抗体。 [0382]本文所用术语“亲本抗原结合分子”是指具有亲本FcRn结合结构域的抗原结合分子。“亲本抗原结合分子”的来源不受限制，可获自非人动物或人的任何生物。优选生物选自小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠(gerbil)、猫、兔、狗、山羊、绵羊、牛、马、骆驼和非人灵长类动物。在另一个实施方案中，“亲本抗原结合分子”也可获自食蟹猴(cynomologus monkey) >狨猴、猕猴、黑猩猩或人。亲本IgG可以是天然存在的IgG或天然存在的IgG的变体或工程改造形式。亲本IgG可指多肽本身、包含亲本IgG的组合物或编码亲本IgG的氨基酸序列。要注意，“亲本IgG”包括下文概述的已知市售的重组产生的IgG。优选“亲本IgG”获自人IgGl,但不限于IgG的具体亚类。这意味着人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4可适当地用作“亲本IgG”。类似地，上述任何生物的IgG的任何亚类可优选用作“亲本IgG”。天然存在的IgG的变体或工程改造形式的实例描述于Curr Opin Biotechnol.2009年12月；20(6):685-91 ；Curr Opin Immunol.2008 年 8 月；20(4):460-70 ；Protein Eng Des Sel.2010 年 4 月；
23(4): 195-202 ;TO2009/086320、W02008/092117、W02007/041635 和 W02006/105338,但不限于这些。
[0383]本发明的FcRn结合结构域或Fe区可在两个或更多个位置包含取代，这在本文称为取代的“组合”。例如由组合“EU424/EU434/EU436”限定的Fe区是包含在EU424、EU434和EU436位上的取代的Fe区。
[0384]取代氨基酸(亲本FcRn结合结构域中的氨基酸被该氨基酸取代)可以是任何氨基酸，除非文中明确说明，包括但不限于:丙氨酸(Ala,A)、精氨酸(arg,R)、天冬酰胺(asn,N)、天冬氨酸(asp,D)、半胱氨酸(cys,C)、谷氨酸(glu,E)、谷氨酰胺(gln,Q)、甘氨酸(gly,G)、组氨酸(his，H)、异亮氨酸(ile，I)、亮氨酸(leu，L)、赖氨酸(lys，K)、甲硫氨酸(met，Μ)、苯丙氨酸(phe, F)、脯氨酸(pro, P)、丝氨酸(ser, S)、苏氨酸(thr, T)、色氨酸(trp,W)、酪氨酸(tyr, Y)和缬氨酸(val, V)。优选 EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438和EU440位中的任一个处的取代氨基酸选自:丙氨酸(Ala，A)、精氨酸(arg，R)、谷氨酸(glu, E)、谷氨酰胺(gin, Q)、天冬氨酸(asp, D)、丝氨酸(ser, S)、苏氨酸(thr, T)、酪氨酸(tyr, Y)和赖氨酸(lys, K)。
[0385]本发明的一个优选的实施方案中，本发明的抗原结合分子具有修饰的FcRn结合结构域，所述修饰的FcRn结合结构域包含在以下位置上用不同于被取代氨基酸的氨基酸的氨基酸取代:
[0386]a)在 EU252 和 EU434 位上，和
[0387]b)在选自以下的一个或多个位置上:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU256、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434 和 EU436。
[0388]取代氨基酸可以是任何氨基酸，除非文中明确说明。EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434 和 EU436 位上的优选的取代氨基酸见表1。
[0389][表 I]
[0390]优选的取代氨基酸
【权利要求】
1.一种包含修饰的FcRn结合结构域的抗原结合分子，其中所述修饰的FcRn结合结构域在选自以下的一个或多个位置上包含氨基酸取代:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434 和 EU436，其中数字表明按照EU编号的取代的位置。
2.权利要求1的抗原结合分子，其中所述FcRn结合结构域具有 a)在EU252和EU434位上的氨基酸的氨基酸取代；和 b)在选自以下的一个或多个位置上的氨基酸取代:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU256、EU258、EU286、EU387、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434和 EU436。
3.权利要求1或2的抗原结合分子，其中所述修饰的FcRn结合结构域包含: EU238位上的天冬氨酸， EU250位上的缬氨酸， EU252位上的酪氨酸， EU254位上的苏氨酸， EU255位上的亮氨酸， EU256位上的谷氨酸， EU258位上的天冬氨酸或异亮氨酸， EU286位上的谷氨酸， EU307位上的谷氨酰胺， EU308位上的脯氨酸， EU309位上的谷氨酸， EU311位上的丙氨酸或组氨酸， EU315位上的天冬氨酸， EU428位上的异亮氨酸， EU433位上的丙氨酸、赖氨酸、脯氨酸、精氨酸或丝氨酸， EU434位上的酪氨酸或色氨酸，和/或 EU436位上的异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸或苯丙氨酸。
4.权利要求2的抗原结合分子，其中所述FcRn结合结构域包含在选自以下的一个或多个位置组合上的氨基酸的氨基酸取代:
a)EU252、EU434 和 EU436 ;
b)EU252、EU307、EU311和 EU434 ;
c)EU252、EU315 和 EU434 ;
d)EU252、EU308 和 EU434;
e)EU238、EU252 和 EU434 ;
f)EU252、EU434、EU307、EU311 和 EU436 ;和
g)EU252、EU387 和 EU434。
5.权利要求4的抗原结合分子，其中所述FcRn结合结构域包含: a)EU252位上的酪氨酸、EU315位上的天冬氨酸和EU434位上的酪氨酸；或 b)EU252位上的酪氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的异亮氨酸；或c)EU252位上的酪氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的亮氨酸；或 d)EU252位上的酪氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的缬氨酸；或e)EU252位上的酪氨酸、EU254位上的苏氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的异亮氨酸。
6.权利要求2的抗原结合分子，其中所述FcRn结合结构域在3个或更多个位置上包含氨基酸取代，其中所述3个或更多个位置是选自以下的组合之一:
a)EU252 / EU434 / EU307 / EU311 / EU286 ；
b)EU252 / EU434 / EU307 / EU311 / EU286 / EU254 ；
c)EU252 / EU434 / EU307 / EU311 / EU436 ；
d)EU252 / EU434 / EU307 / EU311 / EU436 / EU254 ；
e)EU252 / EU434 / EU307 / EU311 / EU436 / EU250 ；
f)EU252 / EU434 / EU308 / EU250 ；
g)EU252 / EU434 / EU308 / EU250 / EU436 ;和
h)EU252 / EU434 / EU308 / EU250 / EU307 / EU311。
7.权利要求6的抗原结合分子，其中所述FcRn结合结构域包含: a)EU252位上的酪氨酸、EU286位上的谷氨酸、EU307位上的谷氨酰胺、EU311位上的丙氨酸和EU434位上的酪氨酸；或 b)EU252位上的酪氨酸、EU254位上的苏氨酸、EU286位上的谷氨酸、EU307位上的谷氨酰胺、EU311位上的丙氨酸和EU434位上的酪氨酸；或 c)EU252位上的酪氨酸、EU307位上的谷氨酰胺、EU311位上的丙氨酸、EU434位上的酪氨酸和436位上的异亮氨酸；或 d)EU252位上的酪氨酸、EU254位上的苏氨酸、EU286位上的谷氨酸、EU307位上的谷氨酰胺、EU311位上的丙氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的异亮氨酸；或 e)EU250位上的缬氨酸、EU252位上的酪氨酸、EU254位上的苏氨酸、EU308位上的脯氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的缬氨酸；或 f)EU250位上的缬氨酸、EU252位上的酪氨酸、EU307位上的谷氨酰胺、EU311位上的丙氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的缬氨酸；或 g)EU252位上的酪氨酸、EU307位上的谷氨酰胺、EU311位上的丙氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的缬氨酸；或 h)EU250位上的缬氨酸、EU252位上的酪氨酸、EU308位上的脯氨酸和EU434位上的酪氨酸；或 i)EU250位上的缬氨酸、EU252位上的酪氨酸、EU307位上的谷氨酰胺、EU308位上的脯氨酸、EU311位上的丙氨酸和EU434的酪氨酸。
8.权利要求2的抗原结合分子，其中所述FcRn结合结构域在3个或更多个位置上包含氨基酸取代，其中所述3个或更多个位置是选自以下的组合之一:
a)EU252 和 EU434 和 EU307 和 EU311 和 EU436 和 EU286 ；
b)EU252 和 EU434 和 EU307 和 EU311 和 EU436 和 EU250 和 EU308 ；
c)EU252 和 EU434 和 EU307 和 EU311 和 EU436 和 EU250 和 EU286 和 EU308 ；d)EU252 和 EU434 和 EU307 和 EU311 和 EU436 和 EU250 和 EU286 和 EU308 和 EU428。
9.权利要求8的抗原结合分子，其中所述FcRn结合结构域包含: a) EU252位上的酪氨酸、EU286位上的谷氨酸、EU307位上的谷氨酰胺、EU311位上的丙氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的缬氨酸；或 b)EU250位上的缬氨酸、EU252位上的酪氨酸、EU307位上的谷氨酰胺、EU308位上的脯氨酸、EU311位上的丙氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的缬氨酸；或 c)EU250位上的缬氨酸、EU252位上的酪氨酸、EU286位上的谷氨酸、EU307位上的谷氨酰胺、EU308位上的脯氨酸、EU311位上的丙氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的缬氨酸；或 d)EU250位上的缬氨酸、EU252位上的酪氨酸、EU286位上的谷氨酸、EU307位上的谷氨酰胺、EU308位上的脯氨酸、EU311位上的丙氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的缬氨酸。
10.权利要求2的抗原结合分子，其中所述FcRn结合结构域在3个或更多个位置上包含氨基酸取代，其中所述3个或更多个位置是选自以下的组合之一:
a)EU434 和 EU307 和 EU311 ;
b)EU434 和 EU307 和 EU309 和 EU311 ;或
c)EU434 和 EU250 和 EU252 和 EU436。
11.权利要求10的抗原结合分子，其中所述FcRn结合结构域包含: a)EU307位上的谷氨酰胺、EU311位上的组氨酸和EU434位上的酪氨酸；或 b)EU307位上的谷氨酰胺、EU309位上的谷氨酸、EU311位上的丙氨酸和EU434位上的酪氨酸；或 c)EU307位上的谷氨酰胺、EU309位上的谷氨酸、EU311位上的组氨酸和EU434位上的酪氨酸；或 d)EU250位上的缬氨酸；EU252位上的酪氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的缬氨酸。
12.权利要求1-11中任一项的抗原结合分子，其中高分子量物类的比率小于2%。
13.权利要求1-12中任一项的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包含抗原结合结构域，其具有: a)在pH5.5-6.5下比在pH 7-8下对抗原的结合活性低，或 b)对抗原的“钙浓度依赖性结合”活性。
14.权利要求1-5中任一项的抗原结合分子,其中所述结合分子在pH7下对FcRn的结合活性为50-150nM，Tm高于63.0°C，Epibase评分小于250。
15.权利要求1-3和权利要求6-7中任一项的抗原结合分子，其中所述结合分子在pH7下对FcRn的结合活性为15-50nM，Tm高于60°C，Epibase评分小于500。
16.权利要求1-3和权利要求8-9中任一项的抗原结合分子，其中所述结合分子在pH7下对FcRn的结合活性强于15nM，Tm高于57.5°C, Epibase评分小于500。
17.权利要求1-3中任一项的抗原结合分子，其中所述FcRn结合结构域包含以下氨基酸取代: a)在EU238、EU255和/或EU258位上的氨基酸取代，和 b)在3个或更多个位置上的氨基酸取代，其中所述3个或更多个位置是表4-7提供的组合之一。
18.权利要求1-17中任一项的抗原结合分子，其中 a)在FcRn结合结构域的EU257位上，氨基酸不是选自以下的氨基酸:丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和苏氨酸，和/或 b)在FcRn结合结构域的EU252位上，氨基酸不是色氨酸。
19.权利要求1-18中任一项的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子具有与包含完整FcRn结合结构域的对照抗体的结合亲和力相比不显著提高的对预存抗药抗体的结合活性。
20.权利要求19的抗原结合分子，其中所述FcRn结合结构域还在选自以下的一个或多个位置上包含氨基酸取代:EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438 和 EU440。
21.权利要求20的抗原结合分子，其中所述FcRn结合结构域包含一个或多个选自以下的氨基酸取代: EU387位上的精氨酸； EU422位上的谷氨酸、精氨酸、或丝氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、苏氨酸或谷氨酰胺； EU424位上的谷氨酸或精氨酸、赖氨酸或天冬酰胺； EU426位上的天冬氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸或酪氨酸； EU433位上的天冬氨酸； EU436位上的苏氨酸； EU438位上的谷氨酸、精氨酸、丝氨酸或赖氨酸；和 EU440位上的谷氨酸、天冬氨酸或谷氨酰胺。
22.权利要求1-21中任一项的抗原结合分子，其中所述修饰的FcRn结合结构域包含3个或更多个取代，其中所述3个或更多个取代是表12-13提供的组合之一。
23.权利要求1-22中任一项的抗原结合分子，其中所述修饰的FcRn结合结构域包含3个或更多个取代，其中所述3个或更多个取代是表14-15提供的组合之一。
24.权利要求20-23中任一项的抗原结合分子，其中所述FcRn结合结构域包含: a)EU252位上的酪氨酸、EU387位上的精氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的缬氨酸；或 b)EU252位上的酪氨酸、EU422位上的谷氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的缬氨酸；或 c)EU252位上的酪氨酸、EU422位上的精氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的缬氨酸；或 d)EU252位上的酪氨酸、EU422位上的丝氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的缬氨酸；或 e)EU252位上的酪氨酸、EU424位上的谷氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的缬氨酸；或 f)EU252位上的酪氨酸、EU424位上的精氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的缬氨酸；或 g)EU252位上的酪氨酸、EU434位上的酪氨酸、EU436位上的缬氨酸和EU438位上的谷氨酸；或h)EU252位上的酪氨酸、EU434位上的酪氨酸、EU436位上的缬氨酸和EU438位上的精氨酸；或 i)EU252位上的酪氨酸、EU434位上的酪氨酸、EU436位上的缬氨酸和EU438位上的丝氨酸；或 j) EU252位上的酪氨酸、EU434位上的酪氨酸、EU436位上的缬氨酸和EU440位上的谷氨酸。
25.权利要求1-24中任一项的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子是抗体。
26.权利要求1-25中任一项的抗原结合分子用于改进抗原结合分子介导的细胞对抗原的摄入的用途。
27.权利要求1-25中任一项的抗原结合分子用于降低血浆特定抗原浓度的用途，其中所述抗原结合分子包含可结合所述抗原的抗原结合结构域。
28.一种用于改进抗原结合分子的药代动力学方法，所述方法包括在选自以下的一个或多个位置上将氨基酸取代引入所述抗原结合分子的FcRn结合结构域中的步骤:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434 和 EU436。
29.一种用于延迟消除受试者中的抗原结合分子的方法，所述方法包括在选自以下的一个或多个位置上将氨基酸取代引入所述抗原结合分子的FcRn结合结构域中的步骤:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434 和 EU436。
30.一种延长抗原结合分子的血浆滞留时间的方法，所述方法包括在选自以下的一个或多个位置上将氨基酸取代引入所述抗原结合分子的FcRn结合结构域中的步骤:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434 和 EU436。
31.一种用于提高抗原结合分子的血浆抗原消除速率的方法，所述方法包括在选自以下的一个或多个位置上将氨基酸取代引入所述抗原结合分子的FcRn结合结构域中的步骤:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434 和 EU436。
32.一种用于提高抗原结合分子消除血浆抗原的能力的方法，所述方法包括在选自以下的一个或多个位置上将氨基酸取代引入所述抗原结合分子的FcRn结合结构域中的步骤:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434 和 EU436。
33.权利要求28-32中任一项的方法，其中将另外的氨基酸取代在EU256位上引入FcRn结合结构域中。
34.权利要求28-33中任一项的方法,其中所述方法还包括在选自以下的一个或多个位置上将氨基酸取代引入FcRn结合结构域中的步骤:EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438 和 EU440。
35.一种用于产生权利要求1-25中任一项的抗原结合分子的方法，所述方法包括以下步骤: (a)选择亲本FcRn结合结构域并且通过在选自以下的一个或多个位置上引入氨基酸取代来改变所述亲本 FcRn:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434 和 EU436 ； (b)选择抗原结合分子的抗原结合结构域并且改变抗原结合结构域中的至少一个氨基酸以得到PH依赖性抗原结合结构域或钙离子依赖性抗原结合结构域； (c)获得编码其中将(a)和(b)中制备的人FcRn结合结构域和抗原结合结构域连接的抗原结合分子的基因，和 (d)使用(C)中制备的基因产生抗原结合分子。
36.权利要求35的方法，其中在步骤a)中将另外的氨基酸取代在EU256位上引入FcRn结合结构域中。
37.权利要求35-36中任一项的方法，其中所述方法还包括在FcRn结合结构域中在选自以下的一个或多个位置上引入氨基酸取代的步骤:EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438 和 EU440。
38.一种包含修饰的FcRn结合结构域的抗原结合分子，其中所述修饰的FcRn结合结构域在选自以下的一个或多个位置上包含氨基酸取代:EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438和EU440，其中与包含完整FcRn结合结构域的抗原结合分子的结合亲和力相t匕，所述抗原结合分子在中性PH下对预存抗药抗体(ADA)的结合亲和力不显著提高。
39.权利要求38的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子另外在中性或酸性pH范围内对FcRn的结合亲和力提高。
40.权利要求38或39的抗原结合分子，其中取代一个或多个选自EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438 和 EU440 的位置的氨基酸选自 a)EU387位上的精氨酸； b)EU422位上的谷氨酸、精氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、苏氨酸、或谷氨酰胺； c)EU424位上的谷氨酸、精氨酸、赖氨酸或天冬酰胺； d)EU426位上的天冬氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸或酪氨酸； e)EU433位上的天冬氨酸 f)EU436位上的苏氨酸 g)EU438位上的谷氨酸、精氨酸、丝氨酸或赖氨酸；和 h)EU440位上的谷氨酸、天冬氨酸或谷氨酰胺。
41.权利要求38-40中任一项的抗原结合分子，其中所述修饰的FcRn结合结构域包含表10提供的一个或多个位置或组合之一的氨基酸取代。
42.权利要求38-40中任一项的抗原结合分子，其中所述修饰的FcRn结合结构域包含表11提供的氨基酸取代或取代组合的任一个。
43.权利要求39-42中任一项的抗原结合分子，其中所述修饰的FcRn结合结构域还包含选自以下的FcRn结合结构域的一个或多个位置上的氨基酸取代:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU256、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU434 和EU436，其中所述取代使得FcRn结合活性在中性pH或酸性pH范围内增加。
44.权利要求39-43中任一项的抗原结合分子，其中所述修饰的FcRn结合结构域在以下的FcRn结合结构域位置上包含氨基酸取代:
i)a) EU438 / EU440 或b) EU424 ;和ii)a) EU434, b) EU252/EU254/EU256 ；c) EU428/EU434 ;或 d) EU250/EU428。
45.权利要求44的抗原结合分子，其中所述修饰的FcRn结合结构域包含以下氨基酸取代:
i)a) EU438R/EU440E 或 b) EU424N ;和
ii)a) M434H ；b) M252Y/S254T/T256E ；c) M428L/N434S ;或d) T250Q和M428L (EU编号)。
46.权利要求45的抗原结合分子，其中所述修饰的FcRn结合结构域包含3个或更多个氨基酸取代，其中所述3个或更多个取代是表13和15中提供的组合之一。
47.权利要求39-42中任一项的抗原结合分子，其中所述修饰的FcRn结合结构域包含以下位置的取代: a)在选自EU387、EU422、EU424、EU438、EU440、EU433的一个或多个位置上或其中两个位置是选自EU422/EU424和EU438/EU440的组合之一的两个或更多个位置；和 b)其中两个位置是表9提供的组合之一的两个或更多个位置。
48.权利要求47的抗原结合分子，其中所述修饰的FcRn结合结构域包含3个或更多个氨基酸取代，其中所述3个或更多个氨基酸取代是表12或14提供的组合之一。
49.权利要求39-48中任一项的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包含pH依赖性抗原结合结构域或钙离子依赖性抗原结合结构域。
50.一种用于降低包含FcRn结合结构域的抗原结合分子对预存ADA的结合活性的方法,所述FcRn结合结构域在中性或酸性pH下对FcRn的结合活性提高且在中性pH下对预存ADA的结合活性提高，所述方法包括以下步骤: a)提供具有在中性或酸性pH下对FcRn的结合活性提高且在中性pH下对预存ADA的结合活性提高的FcRn结合结构域的抗原结合分子；和 b)在选自EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438 和 EU440 的一个或多个位置上取代FcRn结合结构域中的氨基酸，得到具有修饰的FcRn结合结构域的抗原结合分子。
51.权利要求50的方法，其中步骤b)包括在3个或更多个位置上取代氨基酸，其中所述3个或更多个位置为表10提供的组合之一。
52.权利要求50的方法，其中步骤b)包括将3个或更多个氨基酸取代引入FcRn结合结构域中，其中所述3个或更多个氨基酸取代为表11提供的组合之一。
53.一种用于增加单个抗原结合分子可结合的抗原总数而与亲本抗体相比又不显著提高在中性PH下对预存ADA的结合活性的方法，所述方法包括以下步骤: a)提供包含亲本FcRn结合结构域的抗原结合分子， b)通过在选自以下的一个或多个位置上取代亲本FcRn结合结构域的氨基酸序列中的氨基酸来改变步骤a)的亲本FcRn结合结构域:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU256、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434 和 EU436 ;和 c)通过在选自以下的一个或多个位置上取代亲本FcRn结合结构域的氨基酸序列中的氨基酸来改变步骤b)的修饰的FcRn结合结构域:EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438 和 EU440。
54.一种用于促进以抗原结合的形式摄入细胞中的不含抗原的抗原结合分子在胞外释放而与亲本抗体相比又不显著提高所述抗原结合分子在中性PH下对预存ADA的结合活性的方法，所述方法包括以下步骤: a)提供包含亲本FcRn结合结构域的抗原结合分子， b)通过在选自以下的一个或多个位置上取代亲本FcRn结合结构域的氨基酸序列中的氨基酸来改变亲本 FcRn 结合结构域:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU256、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434 和 EU436 和 EU428 ;和 c)通过在选自以下的一个或多个位置上取代亲本FcRn结合结构域的氨基酸序列中的氨基酸来改变步骤b)的修饰的FcRn结合结构域:EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438 和 EU440。
55.一种用于提高抗原结合分子消除血浆抗原的能力而与亲本抗体相比又不显著提高在中性PH下对预存ADA的结合活性的方法，所述方法包括以下步骤: a)提供包含亲本FcRn结合结构域的抗原结合分子， b)通过在选自以下的一个或多个位置上取代亲本FcRn结合结构域的氨基酸序列中的氨基酸来改变亲本 FcRn 结合结构域:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU256、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434 和 EU436 和 EU428 ;和 c)通过在选自以下的一个或多个位置上取代亲本FcRn结合结构域的氨基酸序列中的氨基酸来改变步骤b)的修饰的FcRn结合结构域:EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438 和 EU440。
56.一种用于改 进抗原结合分子的药代动力学而与亲本抗体相比又不显著提高在中性PH下对预存ADA的结合活性的方法，所述方法包括以下步骤: a)提供包含亲本FcRn结合结构域的抗原结合分子， b)通过在选自以下的一个或多个位置上取代亲本FcRn结合结构域的氨基酸序列中的氨基酸来改变亲本 FcRn 结合结构域:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU256、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434 和 EU436 ;和 c)通过在选自以下的一个或多个位置上取代亲本FcRn结合结构域的氨基酸序列中的氨基酸来改变步骤b)的修饰的FcRn结合结构域:EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438 和 EU440。
57.一种用于降低血浆总抗原浓度或血浆游离抗原浓度而与亲本抗体相比又不显著提高在中性PH下对预存ADA的结合活性的方法，所述方法包括以下步骤: a)提供包含亲本FcRn结合结构域的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包含可结合所述抗原的抗原结合结构域， b)通过在选自以下的一个或多个位置上取代亲本FcRn结合结构域的氨基酸序列中的氨基酸来改变亲本 FcRn 结合结构域:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU256、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434 和 EU436 ;和 c)通过在选自以下的一个或多个位置上取代亲本FcRn结合结构域的氨基酸序列中的氨基酸来改变步骤b)的修饰的FcRn结合结构域:EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438 和 EU440。
58.一种用于产生抗原结合分子的方法，所述抗原结合分子包含在中性或酸性pH下对FcRn的结合活性提高且在中性pH下对预存ADA的结合活性降低的FcRn结合结构域，所述方法包括以下步骤:(a)提供在中性或酸性pH范围内对FcRn的结合活性提高且在中性pH范围内对预存ADA的结合活性提高的FcRn结合结构域， (b)在选自以下的一个或多个位置上取代氨基酸:EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438 和 EU440， (c)选择抗原结合分子的抗原结合结构域并且改变抗原结合结构域中的至少一个氨基酸以得到PH依赖性抗原结合结构域，或选择钙离子依赖性抗原结合结构域； (d)获得编码其中将(a)和(b)中制备的人FcRn结合结构域和抗原结合结构域连接的抗原结合分子的基因，和 (e)使用(c)中制备的基因产生抗原结合分子，其中与具有完整FcRn结合结构域的亲本抗原结合结构域相比，所产生的所述抗原结合分子在中性或酸性PH下对FcRn的结合活性提高且在 中性PH下对内源ADA的结合活性降低。
59.权利要求58的方法，其中在中性或酸性pH范围内对FcRn和预存ADA的结合活性提高且在中性pH范围内对预存ADA的结合活性提高的FcRn结合结构域在选自以下的一个或多个位置上包含氨基酸取代:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU256、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434 和 EU436。
60.权利要求53-57中任一项的方法，其中在步骤a)中引入的氨基酸取代位于3个或更多个位置，其中所述3个或更多个位置是表4-7提供的组合之一。
61.权利要求53-60中任一项的方法，其中在步骤b)中引入的氨基酸取代位于3个或更多个位置，其中所述3个或更多个位置为表10提供的组合之一。
【文档编号】C07K16/28GK103958547SQ201280058760
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2012年9月28日 优先权日:2011年9月30日
【发明者】井川智之, 前田敦彦, 味元风太, 仓持太一 申请人:中外制药株式会社