经修饰的级联核糖核蛋白及其用途

经修饰的级联核糖核蛋白及其用途
【专利摘要】一种用于适应性抗病毒防御的成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关复合物(级联)；所述级联蛋白质复合物至少包含CRISPR相关蛋白质亚基Cas7、Cas5和Cas6，其包括至少一个具有额外的氨基酸序列的亚基，该额外的氨基酸序列具有核酸或染色质修饰、可视化、转录激活或转录抑制活性。所述具有额外的活性的级联复合物与RNA分子组合，以产生核糖核蛋白复合物。该RNA分子被选择为与靶序列具有实质互补性。靶向的核糖核蛋白可用作遗传工程工具，在同源重组、非同源末端连接、基因修饰、基因整合、突变修复中用于核酸的精确切割，或用于它们的可视化、转录激活或抑制。与FokI二聚体融合的一对核糖核苷酸可用于在DNA中产生双链断裂，从而以序列特异性的方式促进这些应用。
【专利说明】经修饰的级联核糖核蛋白及其用途
[0001] 本发明涉及遗传工程领域，更具体地涉及生物体（包括原核生物和真核生物）的 基因和/或基因组修饰领域。本发明还涉及制作在基因组分析和遗传修饰方法中使用（无 论体内还是体外）的位点特异性工具的方法。本发明更具体地涉及以序列特异性方式识别 并关联于核酸序列的核糖核蛋白的领域。
[0002] 细菌和古细菌具有多种多样的针对侵入性DNA的防御机制。所谓的CRISPR/Cas 防御系统通过将质粒和病毒DNA片段整合到宿主染色体上的成簇规律间隔短回文重复序 列（CRISPR)的基因座中来提供适应性免疫。病毒或质粒来源的序列，被称为间隔区，由重 复的宿主来源的序列彼此隔开。这些重复元件是该免疫系统的遗传记忆，并且每个CRISPR 基因座都含有在先前遇到外来遗传元件期间获得的独特"间隔区"序列的多样的所有组成 成分（repertoire) 〇
[0003] 外来DNA的获得是免疫的第一步，但是保护则需要将CRISPR转录，并且需要将这 些长的转录物加工成短的CRISPR来源的RNA(crRNA)，这些CRISPR来源的RNA各自含有与 外来核酸攻击物（challenger)互补的独特间隔区序列。
[0004] 除了 CrRNA，在若干生物体中的遗传实验已表明，获得免疫力的步骤、CrRNA生物 发生和靶向干扰还需要一组独特的CRISPR相关（Cas)蛋白质。另外，来自在系统发生上不 同的CRISPR系统的Cas蛋白亚组已被证明装配成包括crRNA的大复合物。
[0005] 最近对CRISPR/Cas系统的多样性的重新评估导致分类为三种不同的类型 (Makarova K?等人（2011)Nature Reviews Microbiology-A0P, 2011 年 5 月 9 日； doi : 10. 1038/nrmicro2577)，这些类型在cas基因含量上有所不同，并在整个CRISPR防御 途径中显现出很大的差异。（本说明书中对CRISPR相关基因采用了 Makarova分类和命名 法。）CRISPR基因座的RNA转录物（前crRNA)在I型和III型系统中被CRISPR相关（Cas) 内切核糖核酸酶或在II型系统中被RNAase III在重复序列上特异性切割；生成的crRNA 被Cas蛋白复合物所利用，作为引导RNA来检测入侵DNA或RNA的互补序列。靶核酸的切 割已在体外针对以尺子锚定机制（ruler-anchored mechanism)切割RNA的强烈火球菌 (Pyrococcus furiosus) III-B型系统得到证实，并且最近在体内针对在互补祀序列（原间 隔区（protospacer))上切割 DNA 的嗜热链球菌（Streptococcus thermophiles) II 型系统 得到证实。相比之下，对I型系统而言，CRISPR干扰的机制仍然在很大程度上是未知的。
[0006] 模式生物体大肠杆菌（Escherichia coli)菌株K12拥有CRISPR/Cas I-E型（之 前被称为CRISPR E亚型（Cse))。它含有八个cas基因（casl、cas2、cas3和csel、cse2、 cas7、cas5、cas6e)和下游CRISPR(2型重复）。在大肠杆菌K12中，这八个cas基因编码在 CRISPR基因座的上游。Casl和Cas2似乎不是靶向干扰所需要的，而很有可能参与新靶序列 的获得。相比之下，六种〇 &8蛋白刃861、〇862工&83、0&87工 &85和〇8866(之前也分别被称 为CasA、CasB、Cas3、CasC/Cse4、CasD和CasE/Cse3)对于针对入噬菌体攻击的保护而言 是必需的。这些蛋白质中的五种<861、〇862乂 &87、0&85和0&866(之前分别被称为0 &8八、 CasB、CasC/Cse4、CasD 和 CasE/Cse3)与 crRNA -起装配以形成被称为级联（Cascade)的 多亚基核糖核蛋白（RNP)。
[0007] 在大肠杆菌中，级联（Cascade)是一种405kDa的核糖核蛋白复合物，其由化学计 量不等的五种功能上必需的Cas蛋白Csel 1CseZ2CasT6CasS1Casee1 (即，按以前的命名法为 CasA1B2C6D1E 1)以及61-nt CRISPR来源的RNA所组成。级联是专性RNP，其依赖于crRNA以 供复合物装配和稳定性以及入侵核酸序列的鉴别。级联是一种监视复合物，其发现并结合 与crRNA的间隔区序列互补的外来核酸。
[0008]标题为"Structural basis for CRISPR RNA-guided DNA recognition by Cascade" 的 Jore 等人（2011)，Nature Structural&Molecular Biologyl8:529 - 537 描述 了前crRNA转录物如何被级联的Cas6e亚基所切割，从而导致成熟的6 Int crRNA被CRISPR 复合物所保留。crRNA作为引导RNA，用于通过crRNA间隔区与互补的原间隔区之间的碱基 配对，级联与双链（ds)DNA分子的序列特异性结合，从而形成所谓的R-环。已知这是一个 ATP非依赖性的过程。
[0009]标题为 "Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes，'的 fcouns S. J. J?等人（2008)，Science 321:960-964 教导了载有 crRNA 的级联需要 Cas3 来 形成体内噬菌体抗性。
[0010]标题为 "CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea，' 的 Marraffini L.和 Sontheimer E. (2010), Nature Reviews Genetics 11:181-190是一篇综述文章，其总结了本领域现有技术的知识状态。针对基于CRISPR的应 用和技术提出了一些建议，但这主要是在产生用于乳制品行业的驯化细菌的噬菌体抗性株 的领域。提出强烈火球菌中crRNP复合物对RNA分子的体外特异性切割还有待于进一步开 发。还提出对CRISPR系统的操作是一种可能的在医院中减少抗生素抗性菌株传播的方式。 作者强调，将需要进一步的研究工作来探索该技术在这些领域的潜在效用。
[0011] 名称为"Genetic cluster of strains of Streptococcus thermophilus having unique rheological properties for dairy fermentation，'的 US2011236530A1(Manoury 等人）公开了能发酵牛奶从而使其具有高度粘性和弱拉丝性（weakly ropy)的某些嗜热链 球菌（S. thermophilus)菌株。公开了限定序列的特定CRISPR基因座。
[0012] 名称为"Cas6polypeptidesandmethodsofuse"的US2011217739A1(Terns 等人）公开了具有Cas6内切核糖核酸酶活性的多肽。该多肽切割具有Cas6识别域和切 割位点的靶RNA多核苷酸。切割可在体外或体内进行。对诸如大肠杆菌或沃氏富盐菌 (Haloferaxvolcanii)的微生物进行遗传修饰以使其表达Cas6内切核糖核酸酶活性。
[0013]名称为"BifidobacteriaCRISPRsequences，'的W02010054154 (Danisco)公开了 在双歧杆菌中发现的各种CRISPR序列，以及它们在制备细菌的遗传改变的菌株中的用途， 其中该遗传改变的菌株在其噬菌体抗性特征方面进行了改变。
[0014]名称为"Prokaryotic RNAi-like system and methods of use" 的 US2011189776A1 (Terns等人）描述了在体外或在原核微生物体内灭活靶多核苷酸的方法。 该方法使用具有5-10个核苷酸的5'区的psiRNA，该核苷酸选自来自紧临间隔区上游的 CRISPR基因座的重复序列。3'区与靶多核苷酸的一部分实质互补。还描述了在psiRNA和 靶多核苷酸的存在下具有内切核酸酶活性的多肽。
[0015]名称为"UseofCRISPRassociatedgenes(CAS)" 的EP2341149A1 (Danisco)描 述了一个或多个Cas基因如何能用于调节细菌细胞对噬菌体的抗性；特别是在乳制品中提 供起子培养物或益生菌培养物的细菌。
[0016] 名称为 "Compositions and methods for downregulating prokaryotic genes，' 的 W02010075424 (The Regents of the University of California)公开了包含 CRISPR 阵列的分离的多核苷酸。CRISPR的至少一个间隔区与原核生物的基因互补，从而能够下调 该基因的表达；特别是当该基因与生物燃料生产相关时。
[0017]名称为"Culture s with improved phage resistance" 的 W02008108989 (Danisco)公开了选择细菌的噬菌体抗性菌株，以及选择具有与噬菌体RNA 的区域有100%同一性的额外的间隔区的菌株。描述了用于乳制品行业的改良的菌株组合 以及起子培养物轮换。描述了用作生物防治剂的某些噬菌体。
[0018]名称为"Molecular typing and subtyping of Salmonella by identification of the variable nucleotide sequences of the CRISPR loci" 的 W02009115861(Institut Pasteur)公开了检测和鉴定沙门氏菌属（Salmonella)细菌的方法，该方法利用了它们包 含在CRISPR基因座中的可变核苷酸序列。
[0019]名称为 " Det ec t ion and typ ing of bact er ial s trains " 的 W02006073445 (Danisco)描述了食物产品、膳食补充剂和环境样品中的细菌菌株的检测和 分型。通过特定CRISPR核苷酸序列来鉴定乳杆菌属（Lactobacillus)的菌株。
[0020] 标题为 "Genome editing with engineered zinc finger nucleases" 的 Urnov F 等人（2010)，Nature 11:636 - 646是一篇关于锌指核酸酶及其如何已经在一系列模式生 物中的反向遗传学领域中发挥作用的综述文章。已经开发了锌指核酸酶，从而使得精确靶 向基因组切割成为可能，其后是在随后的修复过程中的基因修饰。然而，锌指核酸酶是通过 将一些锌指DNA结合域与DNA切割域融合而产生的。DNA序列特异性是通过串联地偶联若 干锌指而实现的，其中每个锌指均识别三核苷酸基序。该技术的显著缺点在于需要为每一 个需要进行切割的新DNA基因座开发新的锌指。这需要蛋白质工程和广泛的筛选，以确保 DNA结合的特异性。
[0021] 在遗传工程和基因组研究领域中，持续需要用于序列/位点特异性核酸检测和/ 或切割的改进试剂。
[0022] 本发明人惊奇地发现,某些表达具有解旋酶-核酸酶活性的Cas3的细菌将Cas3 表达为与Csel的融合体。本发明人还出乎意料地已经能够生产Csel与其他核酸酶的人工 融合体。
[0023] 本发明人还发现，级联进行的Cas3非依赖性靶DNA识别标记出DNA以供Cas3切 害I]，并且发现该级联DNA结合受该靶DNA的拓扑学要求支配。
[0024] 本发明人进一步发现，级联无法结合松弛的靶质粒，但令人惊讶的是级联对具有 负超螺旋（nSC)拓扑结构的靶标显现出高亲和性。
[0025] 因此，在第一方面，本发明提供了一种用于抗病毒防御的成簇规律间隔短回文重 复序列（CRISPR)相关复合物（级联），该级联蛋白复合物或其部分至少包含如下CRISPR相 关蛋白质亚基：
[0026]-Cas7(或COG 1857)，其具有SEQ ID NO: 3的氨基酸序列或与之有至少18%同一 性的序列，
[0027] 4&85(或〇?1688)，其具有5￡0 10勵:4的氨基酸序列或与之有至少17%同一性 的序列，和
[0028] -Cas6(或COG 1583)，其具有SEQ ID NO: 5的氨基酸序列或与之有至少16%同一 性的序列；
[0029] 并且其中至少一个亚基包括提供核酸或染色质修饰、可视化、转录激活或转录抑 制活性的额外的氨基酸序列。
[0030] 包括具有核酸或染色质修饰、可视化、转录激活或转录抑制活性的额外的氨基酸 序列的亚基是可被称为"连接到至少一个功能性部分上的亚基"的一个实例；功能性部分是 由所述额外的氨基酸序列组成的多肽或蛋白质。转录激活活性可以是导致期望基因的激活 或上调的活性；转录抑制活性导致期望基因的抑制或下调。如下文所进一步描述的，基因的 选择是由于具有RNA分子的本发明级联复合物的靶向。
[0031] 具有核酸或染色质修饰、可视化、转录激活或转录抑制活性的额外的氨基酸序列 优选由连续的氨基酸残基形成。这些额外的氨基酸可被视为多肽或蛋白质，其为连续的，并 形成所关注的Cas或Cse亚基的一部分。这样的多肽或蛋白质序列优选地通常不是任何 Cas或Cse亚基氨基酸序列的部分。换言之，具有核酸或染色质修饰、可视化、转录激活或转 录抑制活性的额外的氨基酸序列可能不同于Cas或Cse亚基氨基酸序列或其部分，即可能 不同于Cas3亚基氨基酸序列或其部分。
[0032] 根据需要，具有核酸或染色质修饰、可视化、转录激活或转录抑制活性的额外的氨 基酸序列可获自或来源于相同的生物体，例如大肠杆菌，作为Cas或Cse亚基。
[0033] 除以上内容以外和/或可替代地，具有核酸或染色质修饰、可视化、转录激活或转 录抑制活性的额外的氨基酸序列可能是与Cas或Cse亚基的氨基酸序列"异源"的。因此， 所述额外的氨基酸序列可获自或来源于与Cas和/或Cse亚基所来源或起源的生物体不同 的生物体。
[0034] 本文中，序列同一性可通过在国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information)网络服务器上的BLAST和随后的Cobalt多序列比对来确定， 在该网络服务器上将所讨论的序列与参考序列（例如，SEQ ID N0:3、4或5)进行比较。可以 依据基于BL0SUM62矩阵的序列相似性百分比，或与给定的参考序列（例如，SEQ ID N0:3、4 或5)的同一性百分比来定义氨基酸序列。序列的相似性或同一性涉及在计算与参考序列 的保守百分比之前进行最优排列的初始步骤，并反映序列的进化关系的度量。
[0035] Cas7可具有与SEQ ID N0:3至少31%的序列相似性；Cas5可具有与SEQ ID N0:4 至少26%的序列相似性。Cas6可具有与SEQ ID N0:5至少27%的序列相似性。
[0036]对于 Csel/CasA(502 个氛基酸）：
[0037] >gi 116130667 I ref I NP_417240. 11 含有 CRISP RNA(crRNA)的级联抗病毒复合蛋 白[大肠杆菌菌株K-12亚株MG1655]
[0038] MNLLIDNWIPVRPRNGGKVQIINLQSLYCSRDQWRLSLPRDDMELAALALLVCIGQIIAPAKDDVEFRH RIMNPLTEDEFQQLIAPWIDMFYLNHAEHPFMQTKGVKANDVTPMEKLLAGVSGATNCAFVNQPGQGEALCGGCTAI ALFNQANQAPGFGGGFKSGLRGGTPVTTFVRGIDLRSTVLLNVLTLPRLQKQFPNESHTENQPTWIKPIKSNESIPA SSIGFVRGLFWQPAHIELCDPIGIGKCSCCGQESNLRYTGFLKEKFTFTVNGLWPHPHSPCLVTVKKGEVEEKFLAF TTSAPSWTQISRVVVDKIIQNENGNRVAAVVNQFRNIAPQSPLELIMGGYRNNQASILERRHDVLMFNQGWQQYGNV INEIVTVGLGYKTALRKALYTFAEGFKNKDFKGAGVSVHETAERHFYRQSELLIPDVLANVNFSQADEVIADLRDKL HQLCEMLFNQSVAPYAHHPKLISTLALARATLYKHLRELKPQGGPSNG[SEQIDN0:1]
[0039]对于Cse2/CasB(160个氨基酸）：
[0040] >gi 116130666|ref|NP_417239. 11 含有CRISPRNA(crRNA)的级联抗病毒复合蛋 白[大肠杆菌菌株K-12亚株MG1655]
[0041] MADEIDAMALYRAWQQLDNGSCAQIRRVSEPDELRDIPAFYRLVQPFGWENPRHQQALLRMVFCLSAG KNVIRHQDKKSEQTTGISLGRALANSGRINERRIFQLIRADRTADMVQLRRLLTHAEPVLDWPLMARMLTWWGKRE RQQLLEDFVLTTNKNA[SEQIDNO:2]
[0042]对于Cas7/CasC/Cse4(363 个氛基酸）：
[0043] >gi 116130665IrefINP_417238. 11 含有CRISPRNA(crRNA)的级联抗病毒复合蛋 白[大肠杆菌菌株K-12亚株MG1655]
[0044] MSNFINIHVLISHSPSCLNRDDMNMQKDAIFGGKRRVRISSQSLKRAMRKSGYYAQNIGESSLRTIHLA QLRDVLRQKLGERFDQKIIDKTLALLSGKSVDEAEKISADAVTPWVVGEIAWFCEQVAKAEADNLDDKKLLKVLKED IAAIRVNLQQGVDIALSGRMATSGMMTELGKVDGAMSIAHAITTHQVDSDIDWFTAVDDLQEQGSAHLGTQEFSSGV FYRYANINLAQLQENLGGASREQALEIATHVVHMLATEVPGAKQRTYAAFNPADMVMVNFSDMPLSMANAFEKAVKA KDGFLQPSIQAFNQYWDRVANGYGLNGAAAQFSLSDVDPITAQVKQMPTLEQLKSWVRNNGEA[SEQIDNO:3]
[0045]对于Cas5/CasD(224个氛基酸）：
[0046] >giI9Olll483IrefINPjl7237.2I含有CRISPRNA(crRNA)的级联抗病毒复合蛋 白[大肠杆菌菌株K-12亚株MG1655]
[0047] MRSYLILRLAGPMQAWGQPTFEGTRPTGRFPTRSGLLGLLGACLGIQRDDTSSLQALSESVQFAVRCDE LILDDRRVSVTGLRDYHTVLGAREDYRGLKSHETIQTWREYLCDASFTVALWLTPHATMVISELEKAVLKPRYTPYL GRRSCPLTHPLFLGTCQASDPQKALLNYEPVGGDIYSEESVTGHHLKFTARDEPMITLPRQFASREWYVIKGGMDVS Q[SEQIDNO:4]
[0048]对于Cas6e/CasE(199AA):
[0049] >gi 116130663IrefINP_417236.IICRISPRRNA前体切割酶；含有CRISP RNA(crRNA)的级联抗病毒复合蛋白[大肠杆菌菌株K-12亚株MG1655]
[0050] MYLSKVIIARAWSRDLYQLHQGLWHLFPNRPDAARDFLFHVEKRNTPEGCHVLLQSAQMPVSTAVATVI KTKQVEFQLQVGVPLYFRLRANPIKTILDNQKRLDSKGNIKRCRVPLIKEAEQIAWLQRKLGNAARVEDVHPISERP QYFS⑶GKSGKIQTVCFEGVLTINDAPALIDLVQQGIGPAKSMGCGLLSLAPL[SEQIDNO:5]
[0051] 在定义落入本发明范围内的序列变体的范围时，为避免疑问，以下为分别对变异 程度的可选限制，将应用于SEQ ID NO: 1、2、3、4或5中的每一个，起始于如依据上述各个 同一性百分比所规定的变体的相应最宽范围。因此，变体的范围可包括：至少16%、或至少 17%、或至少18%、或至少19%、或至少20%、或至少21 %、或至少22%、或至少23%、或至 少24%、或至少25%、或至少26%、或至少27%、或至少28%、或至少29%、或至少30%、 或至少31 %、或至少32%、或至少33%、或至少34%、或至少35%、或至少36 %、或至少 37 %、或至少38 %、或至少39 %、或至少40 %、或至少41 %、或至少42 %、或至少43 %，至少 44 %、或至少45 %、或至少46 %、或至少47 %、或至少48 %、或至少49 %、或至少50 %、或至 少51 %、或至少52 %、或至少53 %、或至少54%、或至少55 %、或至少56 %、或至少57 %、或 至少58 %、或至少59 %、或至少60 %、或至少61 %、或至少62 %、或至少63 %、或至少64 %、 或至少65 %、或至少66 %、或至少67%、或至少68%、或至少69%、或至少70%、或至少 71 %，至少72 %、或至少73 %、或至少74 %、或至少75 %、或至少76 %、或至少77 %、或至少 78 %、或至少79 %、或至少80 %、或至少81 %、或至少82 %、或至少83 %、或至少84%、或至 少85 %、或至少86 %、或至少87 %、或至少88 %、或至少89 %、或至少90 %、或至少91 %、或 至少92 %、或至少93 %、或至少94 %、或至少95 %、或至少96 %、或至少97 %、或至少98 %、 或至少99 %或100 %的氨基酸序列同一性。
[0052] 本文中，在Cas蛋白亚基的定义中一直使用Makarova等人（2011)的命名法。 Makarova等人的文章在第5页的表2中列出了 Cas基因以及它们所属的家族和超家族的名 称。本文中，对Cas蛋白或Cse蛋白亚基的引用包括对其一部分由这些亚基构成的家族或 超家族的交叉引用。
[0053] 本文中，本发明的Cas和Cse亚基的参考序列可被定义为编码氨基酸序列的核苷 酸序列。例如，针对Cas7的SEQ ID NO: 3的氨基酸序列还包括编码该氨基酸序列的所有核 酸序列。因此，包含在本发明范围内的Cas7变体包括与参考核酸序列至少具有所限定的氨 基酸同一性或相似性百分比的核苷酸序列；以及具有介于该下限与100%之间的所有可能 的同一性或相似性百分比的核苷酸序列。
[0054] 本发明的级联复合物可由从超过一种不同的细菌或古细菌原核生物衍生或修饰 得到的亚基组成。并且，来自不同Cas亚型的亚基可以混合。
[0055] 在一个优选的方面，Cas6亚基为以下SEQ ID NO: 17的Cas6e亚基，或为与SEQ ID NO: 17有至少16%同一1丨生的序列。
[0056] 优选的 Cas6e 亚基的序列为〉gi 116130663 I ref I NP_417236. 11 CRISPR RNA 前体切 割酶；含有CRISP RNA(crRNA)的级联抗病毒复合蛋白[大肠杆菌菌株K-12亚株MG1655]:
[0057] MYLSKVIIARAWSRDLYQLHQGLWHLFPNRPDAARDFLFHVEKRNTPEGCHVLLQSAQMPVSTAVATVI KTKQVEFQLQVGVPLYFRLRANPIKTILDNQKRLDSKGNIKRCRVPLIKEAEQIAWLQRKLGNAARVEDVHPISERP QYFS⑶GKSGKIQTVCFEGVLTINDAPALIDLVQQGIGPAKSMGCGLLSLAPL[SEQ ID NO:17]
[0058] 本发明的级联复合物或其部分一其包含至少一个包括具有核酸或染色质修饰、可 视化、转录激活或转录抑制活性的额外的氨基酸序列的亚基一可进一步包含具有SEQ ID N0:2的氨基酸序列或与之有至少20%同一性的序列的Cse2(或YgcK样）亚基或其部分。 或者，Cse亚基被限定为与SEQ ID NO:2有至少38%的相似性。任选地，在本发明的蛋白质 复合物中，是Cse2亚基包括具有核酸或染色质修饰活性的额外的氨基酸序列。
[0059] 此外或可替代地，本发明的级联复合物可进一步包含具有SEQ ID NO: 1的氨基酸 序列或与之有至少9%同一性的序列的Csel (或YgcL样）亚基或其部分。任选地，在本发 明的蛋白质复合物中，是Csel亚基包括具有核酸或染色质修饰、可视化、转录激活或转录 抑制活性的额外的氨基酸序列。
[0060] 在优选的实施方案中，本发明的级联复合物为I型CRISPR-Cas系统蛋白质复合 物；更优选为I-E亚型CRISPR-Cas蛋白质复合物，或其可基于I-A型或I-B型复合物。I-C、 D或F型复合物是可能的。
[0061] 在基于大肠杆菌系统的特别优选的实施方案中，亚基可具有以下化学计量： Csel1CseS2CasY6CasS 1CasG1 或 Csel1CseS2CasY6CasS1CasGe 10
[0062] 具有核酸或染色质修饰、可视化、转录激活或转录抑制活性的额外的氨基酸序列 可通过在天然或人工蛋白质表达系统中表达而翻译性地融合，或者通过化学合成步骤共 价连接到至少一个亚基上；优选地，至少一个功能性部分至少融合或连接到Csel、Cse2、 Cas7、Cas5、Cas6或Cas6e亚基中至少之一的N末端区域和/或C末端区域上。在特别优选 的实施方案中，具有核酸或染色质修饰活性的额外的氨基酸序列融合或连接到Csel、Cse2 或Cas5亚基的N末端或C末端上；更优选地，该连接位于Csel亚基的N末端、Cse2亚基的 N末端或Cas7亚基的N末端的区域。
[0063] 具有核酸或染色质修饰、激活、抑制或可视化活性的额外的氨基酸序列可为蛋白 质；任选地选自解旋酶、核酸酶、核酸酶-解旋酶、DNA甲基转移酶（例如，Dam)或DNA脱甲 基酶、组蛋白甲基转移酶、组蛋白脱甲基酶、乙酰化酶、脱乙酰酶、磷酸酶、激酶、转录（辅） 激活物、RNA聚合酶亚基、转录阻抑物、DNA结合蛋白、DNA结构化蛋白、标志物蛋白、报告蛋 白、突光蛋白、配体结合蛋白（例如，mCherry或重金属结合蛋白）、信号肽（例如，Tat-信 号序列）、亚细胞定位序列（例如，核定位序列）或抗体表位。
[0064] 所关注的蛋白质可为来自除级联蛋白亚基具有其序列起源的细菌物种以外的物 种的异源蛋白质。
[0065] 当蛋白质为核酸酶时，它可为选自诸如FokI的II型限制性内切核酸酶或其突变 体或活性部分中的核酸酶。其他可使用的II型限制性内切核酸酶包括Ec 〇Rl、EC〇RV、BgII、 BamHI、BsgI和BspMI。优选地，本发明的一种蛋白质复合物可与FokI的N末端结构域融 合，而本发明的另一种蛋白质复合物可与FokI的C末端结构域融合。随后这两种蛋白质复 合物可一起使用，以实现核酸中有利的基因座特异性双链切割，借此，如RNA组分（下文将 定义和描述）所指导的，并且由于靶核酸链（下文也将更详细地描述）中所谓的"原间隔区 邻近基序"（PAM)序列的存在，遗传物质中切割的位置由使用者来设计和选择。
[0066] 在一个优选的实施方案中，本发明的蛋白质复合物具有为经修饰的限制性内切核 酸酶如FokI的额外的氨基酸序列。该修饰优选地位于催化域中。在优选的实施方案中，经 修饰的FokI为与蛋白质复合物的Csel蛋白融合的KKR Sharkey或ELD Sharkey。在本发 明的这些复合物的优选应用中，这些复合物中的两种（KKR Sharkey和ELD Sharkey)可以 组合在一起。采用经不同修饰的FokI的蛋白质复合物的异二聚体对在核酸的靶向双链切 割中具有特别的优势。若使用同型二聚体，则由于非特异性活性，有可能在非靶位点处具有 更多的切割。异二聚体方法有利地提高了材料样品中切割的保真度。
[0067] 以上所限定和描述的含有具有核酸或染色质修饰、可视化、转录激活或转录抑制 活性的额外的氨基酸序列的级联复合物是本发明总体系统的组成部分，其有利地允许使用 者采用本文所限定的核酸或染色质修饰、可视化、转录激活或转录抑制实体中的任一个，以 预先确定的方式选择需要进行切割、标记或以某种方式进行其他改变（例如，甲基化）的精 确遗传基因座。该系统的其他组成部分是RNA分子，其充当将本发明的级联复合物引导至 打算进行修饰、切割或标记的DNA或RNA上的正确基因座的引导物。
[0068]优选地，本发明的级联复合物还包含RNA分子，该RNA分子包含与期望的靶核酸序 列有至少50%同一性的核糖核苷酸序列，并且其中该蛋白质复合物与RNA分子形成核糖核 蛋白复合物。优选地，当RNA分子与其预期靶核酸序列杂交时，形成核糖核蛋白复合物。当 级联-功能性部分组合的必需组分、RNA分子和核酸（DNA或RNA)在合适的生理条件下（无 论是在体内还是在体外）一起存在时，形成核糖核蛋白复合物。不希望受到任何特定理论 的束缚，本发明人认为，在dsDNA尤其是负超螺旋DNA的情况下，与dsDNA关联的级联复合 物会导致双链的局部解旋，这随后使RNA与一条链关联；然后整个核糖核蛋白复合物沿着 DNA链移动，直至到达与该RNA序列的至少一部分实质互补的靶序列，在此位点处在RNA和 DNA链之间发生稳定的相互作用，并且功能性部分的功能发挥作用，无论是通过在该基因座 处DNA的修饰、核酸酶切割还是标记。
[0069] 在优选的实施方案中，RNA分子的一部分具有与祀核酸序列至少50%的同一'丨生； 更优选与靶序列至少95%的同一性。在更优选的实施方案中，RNA分子的该部分沿其长度 与靶DNA序列实质互补；S卩，只有一个、两个、三个、四个或五个可能连续或不连续的错配。 RNA分子（或其部分）可具有与靶序列至少51 %、或至少52%、或至少53%、或至少54%、 或至少55%、或至少56%、或至少57%、或至少58%、或至少59 %、或至少60 %、或至少 61 %、或至少62 %、或至少63 %、或至少64 %、或至少65 %、或至少66 %、或至少67 %、或至 少68 %、或至少69 %、或至少70 %、或至少71 %、或至少72 %、或至少73 %、或至少74 %、或 至少75 %、或至少76 %、或至少77 %、或至少78 %、或至少79 %、或至少80 %、或至少81 %、 或至少82 %、或至少83 %、或至少84%、或至少85%、或至少86%、或至少87%、或至少 88 %、或至少89 %、或至少90 %、或至少91 %、或至少92 %、或至少93 %、或至少94%、或至 少95%、或至少96%、或至少97%、或至少98%、或至少99%或100%的同一性。
[0070] 靶核酸可为DNA (ss或ds)或RNA。
[0071] 在其他优选的实施方案中，RNA分子或其部分具有与靶核酸至少70%的同一性。 在这样的同一性水平下，靶核酸优选为dsDNA。
[0072] RNA分子将优选地需要对靶核酸序列的高特异性和亲和性。如优选地通过非变 性凝胶电泳或者等温滴定量热法、表面等离子体共振或基于荧光的滴定法所确定的，在 IpM至I ii M、优选I - IOOnM范围内的解离常数（Kd)是理想的。可使用电泳迁移率变动分 析（EMSA)，也称为凝胶阻滞分析（参见 Semenova E 等人（2011) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108:10098 - 10103)来确定亲和力。
[0073] RNA分子优选地模仿来自大自然的原核生物中被称为CRISPR RNA (crRNA) 分子的那些分子。crRNA分子的结构已经确立并在Jore等人（2011)Nature Structural&Molecular Biology 529 - 537中更详细地解释。简而言之，I-E型成熟 crRNA通常为61个核苷酸长，并由8个核苷酸的5' "柄"区、32个核苷酸的"间隔区"序列 和形成具有四核苷酸环的发夹的21个核苷酸的3'序列组成。然而，本发明中使用的RNA 不是必须要严格设计成天然存在的crRNA的设计，无论是在长度、区域或特异性RNA序列方 面。很明显地，本发明中使用的RNA分子可基于公共数据库中的或新发现的基因序列信息 来设计，然后人工制成，例如，全部或部分通过化学合成。本发明的RNA分子还可通过在遗 传修饰的细胞或无细胞表达系统中表达的方式来设计和产生，这种选择可包括部分或全部 RNA序列的合成。
[0074] crRNA 的结构和要求也已在 Semenova E 等人（2011)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1^:10098 - 10103中描述。存在所谓的"SEED (种子）"部分，其形成间隔区序列的5'端， 并且其5'侧翼为8个核苷酸的5'柄区。Semenova等人（2011)已经发现，SEED序列的所有 残基应与靶序列互补，尽管对于第6位的残基而言，错配是可被容忍的。类似地，在设计和 制备针对靶基因座的本发明核糖核蛋白复合物的RNA组分（即序列）时，可应用针对SEED 序列的必要的匹配和错配规则。
[0075]因此，本发明包括检测和/或定位靶核酸分子中的单碱基改变的方法，其包括：使 核酸样品与如上文所述的本发明的核糖核蛋白复合物接触，或与如上文所述的本发明的级 联复合物和单独的RNA组分接触，并且其中RNA组分（包括当在核糖核蛋白复合物中时） 的序列使得它借助8个核苷酸残基的连续序列中的6位上的单碱基改变来区别正常的等位 基因和突变的等位基因。
[0076] 在本发明的实施方案中，RNA分子可具有在35 - 75个残基范围内的长度。在优 选的实施方案中，与需要的核酸序列互补并用于靶向该核酸序列的RNA部分为32或33个 残基的长度。（在天然存在的crRNA的情况下，其将对应于间隔区部分；如Semenova等人 (2011)的图1所示）。
[0077] 本发明的核糖核蛋白复合物可另外具有RNA组分，该RNA组分包含位于与核酸靶 序列至少有基本互补实质互补性的RNA序列的5'侧的8个残基。（与核酸靶序列至少有 基本互补实质互补性的RNA序列将被理解为对应于在crRNA的情况下对应于作为间隔区序 列。RNA的5'侧翼序列将被认为与crRNA的5'柄区相对应。这在Semenova等人（2011) 的图1中示出）。
[0078] 本发明的核糖核蛋白复合物可具有位于RNA序列的3'侧的发夹和四核苷酸环形 成序列，该RNA序列与DNA靶序列至少有实质互补性。（在crRNA的情况下，这将对应于如 Semenova等人（2011)的图1中所不的间隔区序列侧翼的3'柄）。
[0079] 在一些实施方案中，该RNA可为CRISPR RNA (crRNA)。
[0080] 本发明的级联蛋白和复合物在体外可针对其与RNA引导组分相结合从而在靶核 酸（其可为DNA或RNA)的存在下形成核糖核蛋白复合物的活性进行表征。电泳迁移率变 动分析（EMSA)可用作针对本发明的复合物与其核酸靶标之间的相互作用的功能分析。基 本地，将本发明的级联-功能性部分复合物与核酸靶标混合，通过EMSA或通过功能性部分 的特定读取来监测该级联-功能性部分复合物的稳定的相互作用，例如靶DNA在期望的位 点处的内切核苷酸切割。这可通过采用具有已知特异性并在靶DNA分子中具有切割位点的 市售酶的进一步的限制性片段长度分析来确定。
[0081] 可使用扫描/原子力显微镜（SFM/AFM)成像来实现在引导RNA的存在下本发明的 级联蛋白或复合物与DNA或RNA的结合的可视化，并且这可提供一种针对本发明的功能性 复合物的存在的试验。
[0082] 本发明还提供了一种编码至少一种成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR)相关 蛋白质亚基的核酸分子，该蛋白质亚基选自：
[0083] a. Csel亚基，其具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列或与之有至少9%同一性的序列；
[0084] b.Cse2亚基，其具有SEQIDN0:2的氨基酸序列或与之有至少20%同一性的序 列；
[0085] c.Cas7亚基，其具有SEQ ID N0:3的氨基酸序列或与之有至少18%同一性的序 列；
[0086] d. Cas5亚基，其具有SEQ ID NO: 4的氨基酸序列或与之有至少17%同一性的序 列；
[0087] e.Cas6亚基，其具有SEQ ID N0:5的氨基酸序列或与之有至少16%同一性的序 列；并且
[0088] 其中至少a、b、c、d或e包括具有核酸或染色质修饰、可视化、转录激活或转录抑 制活性的额外的氨基酸序列。
[0089] 具有核酸或染色质修饰、可视化、转录激活或转录抑制活性的额外的氨基酸序列 优选地与CRISPR相关蛋白质亚基融合。
[0090] 在上文限定的本发明的核酸中，核苷酸序列可以是分别编码SEQIDN0:1、SEQ IDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4或SEQIDNO:5的核苷酸序列，或者在定义其变异序 列的范围时，其可以是优选在严格条件下，更优选在极高严格性的条件下，可与该核苷酸序 列杂交的序列。各种严格的杂交条件将是本领域熟练的读者所熟悉的。当两个互补核酸 分子经历一定量的彼此氢键键合（称为Watson-Crick碱基配对）时，发生核酸分子的杂 交。杂交的严格性可根据核酸周围的环境（即化学/物理/生物）条件、温度、杂交方法 的性质以及所使用的核酸分子的组成和长度而不同。关于达到特定严格性程度所需的杂 交条件的计算在Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual(ColdSpring HarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY, 2001)；以及Tijssen,Laboratory TechniquesinBiochemistryandMolecularBiology-HybridizationwithNucleic AcidProbes,第一部分第二章（Elsevier,纽约，1993)中描述。Tm是核酸分子的50%的 给定链与其互补链杂交时的温度。以下是一组示例性的杂交条件，而非限定性的：
[0091] 极高严格件（允许享有至小90%同一;丨牛的序列杂夺)
[0092] 杂交：5xSSC，于 65°C，16 小时
[0093] 洗涤两次：2xSSC，于室温（RT)，每次15分钟
[0094] 洗涤两次：0? 5xSSC，于65°C，每次20分钟
[0095] 高严格件（允许享有至小80%同一;丨牛的序列杂夺）
[0096] 杂交：5x_6xSSC，于 65°C-7(TC，16-20 小时
[0097] 洗涤两次：2xSSC，于RT，每次5-20分钟
[0098] 洗涤两次：lxSSC，于55°C_70°C，每次30分钟
[0099] 低严格件（允许享有至小50%同一;丨牛的序列杂夺）
[0100] 杂交：6xSSC，于RT至 55°C，16-20 小时
[0101] 洗涤至少两次：2x-3xSSC，于RT至55°C，每次20-30分钟。
[0102] 核酸分子可为分尚的核酸分子，并且可为RNA或DNA分子。
[0103] 所述额外的氨基酸序列可选自解旋酶、核酸酶、核酸酶-解旋酶（例如，Cas3)、DNA 甲基转移酶（例如，Dam)、DNA脱甲基酶、组蛋白甲基转移酶、组蛋白脱甲基酶、乙酰化酶、脱 乙酰酶、磷酸酶、激酶、转录（辅）激活物、RNA聚合酶亚基、转录阻抑物、DNA结合蛋白、DNA 结构化蛋白、标志物蛋白、报告蛋白、荧光蛋白、配体结合蛋白（例如，mCherry或重金属结 合蛋白）、信号肽（例如，Tat-信号序列）、亚细胞定位序列（例如，核定位序列）或抗体表 位。所述额外的氨基酸序列可以是或来自从中衍生出相关级联蛋白质亚基的生物体的不同 蛋白质。
[0104] 本发明包括一种包含如上文所限定的核酸分子的表达载体。一种表达载体可含有 编码单一级联蛋白质亚基的核苷酸序列，并且还可含有编码额外的氨基酸序列的核苷酸序 列，从而在表达时该亚基和额外的序列融合。其他表达载体可包含仅编码不与任何额外的 氨基酸序列融合的一种或多种级联蛋白质亚基的核苷酸序列。
[0105]具有核酸或染色质修饰活性的额外的氨基酸序列可通过接头多肽与任何级联亚 基融合。接头可为多达约60个或多达约100个氨基酸残基的任何长度。优选地，接头具有 在10个至60个、更优选10-20个的范围内的氨基酸数目。氨基酸优选地为极性的和/或 小的和 / 或带电荷的氨基酸（例如，Gin、Ser、Thr、Pro、Ala、Glu、Asp、Lys、Arg、His、Asn、 Cys、Tyr)。接头肽优选地设计成获得融合的功能性部分与级联亚基的正确间隔及定位，其 中该部分与该级联亚基融合以允许与靶核苷酸的适当的相互作用。
[0106]本发明的表达载体（含有或不含有编码在表达时将与级联蛋白质亚基融合的氨 基酸残基的核苷酸序列）可进一步包含编码如上文所限定的RNA分子的序列。因此，这样 的表达载体可在合适的宿主中使用，以产生可靶向期望的核苷酸序列的本发明的核糖核蛋 白。
[0107]相应地，本发明还提供了一种修饰、可视化靶核酸，或激活或抑制靶核酸的转录的 方法，该方法包括使核酸与如上文所限定的核糖核蛋白复合物接触。该修饰可通过切割核 酸或与之结合来进行。
[0108]本发明还包括一种修饰、可视化靶核酸，或激活或抑制靶核酸的转录的方法，该方 法包括使核酸接触如上文所限定的级联蛋白质复合物，加上如上文所限定的RNA分子。
[0109]按照上述方法，靶核酸的修饰、可视化或其转录的激活或抑制因此可在体外和在 无细胞环境中进行；即，该方法作为生化反应进行，不论是游离在溶液中还是是否涉及固 相。例如，靶核酸可结合到固相上。
[0110] 在无细胞环境中，加入靶核酸、级联蛋白质复合物和RNA分子中的每一种的顺序 由普通技术人员来选择。这三种组分可同时加入，以任意期望的顺序依次加入，或在不同的 时间并以期望的顺序单独加入。因此，将靶核酸和RNA同时加入到反应混合物中，然后将本 发明的级联蛋白质复合物随后以具体方法步骤的次序单独地加入是可能的。
[0111] 靶核酸的修饰、可视化或其转录的激活或抑制可在细胞中原位进行，不论是分离 的细胞还是作为多细胞组织、器官或生物体的一部分。因此，在完整组织和器官的情况下以 及在生物体的情况下，该方法可在体内进行，或者其可通过将细胞从完整组织、器官或生物 体中分离，然后使经核糖核蛋白复合物处理过的细胞返回至其之前的位置或不同的位置来 进行，不论是在相同的还是不同的生物体内。因此，该方法将包括同种异体移植、自体移植、 同种移植和异种移植。
[0112] 在这些实施方案中，本发明的核糖核蛋白复合物或级联蛋白质复合物需要适当的 向细胞内的递送形式，其将是本领域技术人员所熟知的，包括显微注射，不论是注射到细胞 质内还是注射到细胞核内。
[0113]并且，在单独存在时，RNA分子需要适当的向细胞内的递送形式，不论是与级联蛋 白质复合物同时、分别还是依次地。这样的将RNA引入细胞的形式是本领域技术人员所熟 知的，并且可包括经由常规转染方法的体外或离体递送。可分别使用诸如显微注射和电穿 孔等物理方法，以及钙共沉淀和市售的阳离子聚合物和脂质，以及细胞穿透肽、细胞穿透颗 粒（基因枪）。例如，病毒可用作递送载体，不论是递送至细胞质和/或细胞核--例如，通 过本发明的级联蛋白质复合物或本发明的核糖核蛋白复合物与病毒颗粒的（可逆）融合。 可使用病毒递送（例如，腺病毒递送）或土壤杆菌（Agrobacterium)介导的递送。
[0114]本发明还包括一种在细胞中修饰、可视化靶核酸、或激活或抑制靶核酸的转录的 方法，该方法包括用如上文所述的任何表达载体转染、转化或转导该细胞。转染、转化或转 导的方法是本领域技术人员所熟知的类型。在存在一种用于产生本发明的级联复合物的表 达的表达载体且当RNA直接加入到细胞的情况下，可使用相同或不同的转染、转化或转导 的方法。类似地，当存在一种正用于产生本发明的级联-功能性融合复合物的表达的表达 载体且当另一种表达载体正用于通过表达而原位产生RNA时，可使用相同或不同的转染、 转化或转导的方法。
[0115] 在其他实施方案中，将编码本发明的级联复合物的mRNA引入细胞内，以使该级联 复合物在细胞中表达。将级联蛋白复合物引导至期望的靶序列的RNA也被引入至该细胞 中，不论是与该mRNA同时、分别还是依次地引入，从而在细胞中形成必需的核糖核蛋白复 合物。
[0116] 在上述修饰或可视化靶核酸的方法中，所述额外的氨基酸序列可以是标志物，并 且该标志物与靶核酸相关联；优选地，其中该标志物为蛋白质；任选地为荧光蛋白，例如， 绿色荧光蛋白（GFP)或黄色荧光蛋白（YFP)或mCherry。不论在体外、离体还是体外，本 发明的方法可用于直接可视化核酸分子中的靶基因座，该核酸分子优选为更高阶结构的形 式，诸如超螺旋质粒或染色体或诸如mRNA的单链靶核酸。靶基因座的直接可视化可使用电 子显微镜检查或荧光显微镜检查。
[0117] 可以使用其他种类的标签来标记靶核酸，包括有机染料分子、放射性标签和可为 小分子的自旋标签。
[0118] 在上述的本发明方法中，靶核酸为DNA ;优选为dsDNA，尽管靶标可为RNA ;优选为 mRNAo
[0119] 在用于修饰、可视化靶核酸、激活靶核酸的转录或抑制靶核酸的转录（其中靶核 酸为dsDNA)的本发明的方法中，具有核酸或染色质修饰活性的额外的氨基酸序列可为核 酸酶或解旋酶_核酸酶，并且该修饰优选为期望的基因座处的单链或双链断裂。采用这种 方式，可通过使用级联-功能性部分复合物来使DNA的独特序列特异性切割工程化。最终 核糖核蛋白复合物的RNA组分的所选序列为额外的氨基酸序列的作用提供了所需的序列 特异性。
[0120] 因此，本发明还提供了一种使细胞中的dsDNA分子在期望的基因座处进行非同源 末端连接，从而从该dsDNA分子中除去至少一部分核苷酸序列，任选地敲除一个基因或多 个基因的功能的方法，其中该方法包括采用如上文所述的任何修饰靶核酸的方法来制造双 链断裂。
[0121] 本发明进一步提供了一种将核酸同源重组到细胞中期望的基因座处的dsDNA分 子内以修饰存在的核苷酸序列或插入期望的核苷酸序列的方法，其中该方法包括采用如上 文所述的任何修饰靶核酸的方法在期望的基因座处产生双链或单链断裂。
[0122] 本发明因此还提供了一种修饰、激活或抑制生物体中的基因表达的方法，该方法 包括根据上文所述的任何方法来修饰靶核酸序列、激活靶核酸序列的转录或抑制靶核酸序 列的转录，其中该核酸为dsDNA，并且该功能性部分选自DNA修饰酶（例如，脱甲基酶或脱乙 酰酶）、转录激活物或转录阻抑物。
[0123] 本发明另外提供了一种修饰、激活或抑制生物体中的基因表达的方法，该方法包 括根据上文所述的任何方法来修饰靶核酸序列、激活靶核酸序列的转录或抑制靶核酸序列 的转录，其中该核酸为mRNA，并且该功能性部分为核糖核酸酶；任选地选自内切核酸酶、3' 外切核酸酶或5'外切核酸酶。
[0124] 在如上所述的本发明的任何方法中，经受该方法的细胞可以是原核细胞。类似地， 该细胞可为以是真核细胞，例如，植物细胞、昆虫细胞、酵母细胞、真菌细胞、哺乳动物细胞 或人细胞。当细胞是哺乳动物或人的细胞时，它可以是干细胞（但可能不是任何的人胚胎 干细胞）。本发明中使用的这类干细胞优选为分离的干细胞。任选地，按照本发明的任何方 法对细胞进行体外转染。
[0125] 优选地，在本发明的任何方法中，靶核酸具有特定的三级结构，任选地为超螺旋 的，更优选地其中该靶核酸为负超螺旋的。有利的是，本发明的核糖核蛋白复合物，不论是 在体外产生的，或在细胞内形成的，还是通过细胞的表达机器在细胞内形成的，均可用于靶 向以其他方式难以接近的基因座，以便应用期望的组分的功能活性，不论是特异性序列的 标注或标记、核酸结构的修饰、基因表达的开启或关闭，还是涉及单链或双链切割、随后插 入一个或多个核苷酸残基或盒的靶序列本身的修饰。
[0126] 本发明还包括一种药物组合物，其包含如上文所述的本发明的级联蛋白质复合物 或核糖核蛋白复合物。
[0127] 本发明进一步包括一种药物组合物，其包含如上文所述的本发明的分离的核酸或 表达载体。
[0128] 还提供了一种试剂盒，其包含如上文所述的本发明的级联蛋白质复合物，以及如 上文所述的本发明的RNA分子。
[0129] 本发明包括一种用作药物的如上文所述的级联蛋白质复合物或核糖核蛋白复合 物或核酸或载体。
[0130] 本发明允许在指定的基因组基因座处物理地改变原核或真核宿主的DNA，或者改 变给定基因座处基因的表达模式的多种可能性。可通过分别与合适的级联_亚基融合的功 能域如核酸酶、甲基化酶、荧光蛋白、转录激活物或阻抑物，来对宿主基因组DNA进行切割、 或甲基化修饰、荧光可视化、转录激活或抑制。此外，级联的RNA引导的RNA结合能力允许 用荧光级联融合蛋白监控活细胞中的RNA运输，并提供了隔离或破坏宿主mRNA从而对宿主 细胞的基因表达水平造成干扰的方法。
[0131] 在本发明的任何方法中，可通过至少一种以下核苷酸三联体的存在来限定靶核 酸，如果是 dsDNA 则优选如此：5' -CTT-3'、5' -CAT-3'、5' -CCT-3' 或 5' -CTC-3'（或者如 果靶标为 RNA，则为 5' -CUU-3'、5' -CAU-3'、5' -CCU-3' 或 5' -CTC-3'）。三联体的位置是 在与本发明的核糖核蛋白的RNA分子组分杂交的序列相邻的靶链上。三联体标记靶链序列 中的位点，在该位点处，与核糖核蛋白的RNA分子组分的在靶标的5'至3'（下游）方向上 不发生碱基配对（然而，碱基配对在该位点的靶序列的上游发生，其具有本发明核糖核蛋 白的RNA分子组分的RNA序列的优选长度）。在天然I型CRISPR系统的情况下，三联体与 被称为"PAM"（原间隔区邻近基序）的序列相对应。对于ssDNA或ssRNA靶标，三联体之一 的存在并非如此必要。
[0132] 现将参考具体实施例和附图对本发明进行详细的描述，附图中：
[0133] 图1显示了凝胶移位分析的结果，其中级联结合负超螺旋（nSC)质粒DNA而不结 合松弛的DNA。A)具有J3-级联（含有靶向（J3) crRNA)的nSC质粒DNA的凝胶移位。将 pUC-入与2倍渐增量的J3-级联混合，pUC-入：级联摩尔比从1:0. 5直至1:256摩尔比。 第一泳道和最后泳道仅含有PUC-A。B)具有R44-级联（含有非靶向（R44)cRNA)的如（A) 中所述的凝胶移位。C)具有Nt. BspQI切刻的pUC-A的如（A)中所述的凝胶移位。D)具 有PdmI线性化的pUC-A的如（A)中所述的凝胶移位。E)针对游离J3-级联的浓度绘制 的与J3-级联结合的pUC-A分数的拟合给出了特异性结合的解离常数（Kd)。F)针对游离 R44-级联的浓度绘制的与R44-级联结合的pUC- A分数的拟合给出了非特异性结合的解离 常数（Kd)。G)使用原间隔区序列中独特的BsmI限制位点，通过限制性分析监测的级联与 原间隔区的特异性结合。泳道1和5仅含pUC-入。泳道2和6含有与级联混合的pUC-入。 泳道3和7含有与级联混合的pUC-入，并且随后加入BsmI。泳道4和8含有与BsmI混合的 pUC-A与级联结合并且随后对质粒的一条链进行Nt. BspQI切割的pUC-A的凝胶移位。 泳道1和6仅含pUC-入。泳道2和7含有与级联混合的pUC-入。泳道3和8含有与级联 混合并且随后进行Nt. BspQI切刻的pUC-入。泳道4和9含有与级联混合的pUC-入，接着 加入与R-环中的替代链互补的ssDNA探针，随后用Nt. BspQI进行切刻。泳道5和10含有 用Nt. BspQI切刻的pUC-入。H)与级联结合并且随后对质粒进行Nt. BspQI切刻的pUC-入 的凝胶移位。泳道1和6仅含pUC-入。泳道2和7含有与级联混合的pUC-入。泳道3和 8含有与级联混合并且随后进行Nt. BspQI切割的pUC-入。泳道4和9含有与级联混合的 pUC-入，接着加入与R-环中的替代链互补的ssDNA探针，随后用Nt. BspQI进行切割。泳道 5和10含有用Nt. BspQI切割的pUC-A。I)与级联结合并且随后对质粒的两条链都进行 EcoRI切割的pUC-入的凝胶移位。泳道1和6仅含pUC-入。泳道2和7含有与级联混合 的pUC-入。泳道3和8含有与级联混合并随后进行EcoRI切割的pUC-入。泳道4和9含 有与级联混合的PUC-入，接着加入与R-环中的替代链互补的ssDNA探针，并随后用EcoRI 进行切割。泳道5和10含有用EcoRI切割的pUC-入。
[0134] 图2示出了扫描力显微照片，证明级联如何诱导靶DNA在原间隔区结合时的弯曲。 A-P)具有包含靶向（J3)crRNA的J3-级联的nSC质粒DNA的扫描力显微镜图像。pUC-X与 J3-级联以1:7的pUC-X :级联比例混合。每张图像示出了 500x 500nm的表面区域。白点 对应于级联。
[0135] 图3示出了 BiFC分析如何揭示级联和Cas3在靶标识别后相互作用。A)表达级联 八〇861和〇?15?1?71'111(其靶向入噬菌体基因组上的7个原间隔区）以及0861-附55￥6皿8 和Cas3-C85Venu S融合蛋白的细胞的Venus荧光。B) (A)中的细胞的亮视野图像。C) (A) 与（B)的重叠。D) X噬菌体感染的细胞的Venus荧光，该细胞表达级联ACsel和CRISPR 7Tm，以及Csel-N155Venus和Cas3-C85Venus融合蛋白。E) (G)中的细胞的亮视野图像。F) (G)与（H)的重叠。G) A噬菌体感染的细胞的Venus荧光，该细胞表达级联A Csel和非靶 向CRISPR R44,以及N155Venus和C85Venus蛋白。H) (J)中的细胞的亮视野图像。I) (J) 与（K)的重叠。J)每个菌株的4-7个个体细胞的荧光强度平均值，如使用LSM指示器（Carl Zeiss)的图谱工具（profile tool)所确定的。
[0136] 图4示出了 CRISPR-干扰期间Cas3核酸酶和解旋酶的活性。A)用pUC-入转化表 达级联、Cas3突变体和CRISPR J3的感受态BL21-AI细胞。对每个表达Cas3突变体的菌株 描述每微克pUC-X的菌落形成单位（cfu/iig DNA)。表达野生型（wt)Cas3和crispr j3 或crispr r44的细胞分别作为阳性对照和阴性对照。B)携带级联、Cas3突变体和CRISPR 编码质粒以及puc-入的BL21-AI细胞在抑制cas基因和CRISPR表达的条件下生长。当t =O时，表达被诱导。示出了丢失PUC-A的细胞随时间推移的百分数，如通过氨苄青霉素 敏感细胞与氨苄青霉素抗性细胞的比例所确定的。
[0137] 图5示出了级联-Cas3融合复合物如何提供体内抗性并具有体外核酸酶活性。A) 纯化的级联和级联-Cas3融合复合物的考马斯蓝染色的SDS-PAGE。B)A噬菌体对表达级 联_Cas3融合复合物和靶向（J3)或非靶向（R44)CRISPR的细胞的成斑率，以及对单独表 达级联和Cas3以及靶向（J3)CRISPR的细胞的成斑率。C)具有J3-级联-Cas3融合复合 物的nSC靶质粒的凝胶移位（在不存在二价金属离子的情况下）。pUC-A与2倍渐增量的 J3-级联-Cas3混合，pUC- X : J3-级联-Cas3摩尔比从1: 0? 5至高达1:128摩尔比。第一 泳道和最后的泳道仅含有PUC- A。D)具有J3-级联-Cas3融合复合物的nSC非靶质粒的凝 胶移位电泳（在不存在二价金属离子的情况下）。pUC-p7与2倍渐增量的J3-级联-Cas3 混合，pUC-p7:J3-级联-Cas3摩尔比从1:0. 5至高达1:128摩尔比。第一泳道和最后的泳 道仅含有pUC-p7。E)在IOmM MgCl2的存在下，nSC靶质粒（pUC-入，左）或nSC非靶质粒 (pUC-p7,右）与J3-级联-Cas3的温育。泳道1和7仅含有质粒。F)在2mM ATP的存在下 进行的如（E)中所述的试验。G)用突变的J3-级联-Cas3K320N复合物进行的如（E)中所 述的试验。H)在2mM ATP的存在下进行的如（G)中所述的试验。
[0138] 图6为显示大肠杆菌中CRISPR-干扰I型途径的模型的示意图。
[0139] 图7为显示本发明的级联-FokI融合实施方案如何被用来创建FokI二聚体的示 意图，该FokI二聚体切割dsDNA以产生平末端作为非同源末端连接或同源重组过程的部 分。
[0140] 图8示出了 BiFC分析如何揭示级联和Cas3在靶标识别时相互作用。表达不含 Csel的级联、Csel-N155Venus和Cas3-C85Venus以及CRISPR 7Tm(其靶向入噬菌体基因 组上的7个原间隔区）或非靶向CRISPR R44的细胞的亮视野图像和Venus荧光的重叠。表 达CRISPR7Tm的细胞仅在被入噬菌体感染时是荧光的，而表达CRISPR R44的细胞为非荧 光的。高强度的荧光点（细胞外）是由于反光的盐晶体。白色线条对应于10微米。
[0141] 图9显示了编码CRISPR J3、级联和Cas3(野生型或S483AT485A)的4个克隆的 pUC-A序列[SEQ ID NO: 39-42]，表明它们是携带原间隔区（部分）缺失或携带种子区中 的单点突变的逃逸突变体，这解释了为什么不能恢复这些质粒。
[0142] 图10示出了来自含有I-E型CRISPR/Cas系统的生物体的cas3基因的序列比 对。来自链霉菌（Str 印 tomyces sp.)SPB78(第一序列，登录号：ZP_07272643.1)[SEQ ID N0:43]、灰色链霉菌（Streptomyces griseus)(第二序列，登录号：YP_001825054) [SEQ ID N0:44]和嗜酸细链抱菌（Catenulispora acidiphila)DSM 44928(第三序列，登录号： YP_003114638)[SEQ ID N0:45]中的cas3-csel基因以及包括来自灰色链霉菌的多肽接头 序列的人工大肠杆菌Cas3-Csel融合蛋白[SEQ ID N0:46]的比对。
[0143]图11示出了级联KKK/EU)核酸酶对的设计，其中对FokI核酸酶结构域进行突变，以 致只有由KKR和ELD核酸酶结构域组成的异二聚体和相对的结合位点之间的距离可发生变 化，以确定级联核酸酶对之间的最佳距离。
[0144] 图12是示出了级联-FokI核酸酶对的基因组靶向的示意图。
[0145] 图13示出了级联-核酸酶复合物的SDS-PAGE凝胶。
[0146] 图14示出了级联KKK/ElD对质粒DNA的体外切割试验的电泳凝胶。
[0147] 图15示出了级联K_LD的切割模式和频率[SEQ ID N0:47]。
[0148] 实施例--所用的材料与方法
[0149] 菌株、基因克隆、质粒和载体
[0150] 全部使用大肠杆菌BL21-AI和大肠杆菌BL21(DE3)菌株。表1列出了本研究中 使用的所有质粒。之前所述的PWUR408、pWUR480、pWUR404和pWUR547用来产生Str印-标 记II R44-级联，而pWUR408、pWUR514和pWUR630用来产生Str印-标记II J3-级联 (Jore 等人，（2011)Nature Structural&Molecular Biology 18, 529-536 ;Semenova 等人， (201I)Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America l〇8，10〇98_101〇3)。pUC-入（pWUR610)和 pUC-p7 (PWUR6I3)已经在别处（Jore 等人，2011 ;Semenova 等人，2011)有所描述。C85Venus 蛋白由 pWUR647 编码，pWUR647 对应于含有在BamHI和NotI位点之间克隆的合成GA1070943构建体（表2) (Geneart) 的 pET52b (Novagen)。NI55Venus 蛋白由 pWUR648 编码，pWUR648 对应于含有在 NotI 和 XhoI位点之间克隆的合成GA1070941构建体（表2) (Geneart)的pRSFlb (Novagen)。 Cas3-C85Venus融合蛋白由pWUR649编码，pWUR649对应于含有使用引物BG3186和 BG3213 (表3)在NcoI和BamHI位点之间扩增的Cas3扩增产物的pWUR647。CasA-N155Venus 融合蛋白由PWUR650编码，pWUR650对应于含有使用引物BG3303和BG3212(表3)在NcoI 和BamHI位点之间扩增的CasA扩增产物的pWUR648。CRISPR 7Tm由pWUR651编码，pWUR651 对应于含有在NcoI和KpnI位点之间克隆的合成GA1068859构建体（表2) (Geneart)的 pACYCDuet-1 (Novagen)。编码级联的 pWUR400、编码级联 A Csel 的 WUR401 和编码 Cas3 的 PWUR397在之前已有描述（Jore等人，2011)。编码Cas3H74A的pWUR652是使用引物BG3093、 BG3094 (表3)对pWUR397进行定点诱变而构建的。
[0151] 表1--所用的质粒
[0152]
【权利要求】
1. 一种用于抗病毒防御的成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR)相关复合物（级 联），该级联蛋白质复合物或其部分至少包含CRISPR相关蛋白质亚基： -Cas7,其具有SEQ ID N0:3的氨基酸序列或与之有至少18%同一性的序列， -Cas5,其具有SEQ ID N0:4的氨基酸序列或与之有至少17%同一性的序列，和 -Cas6,其具有SEQ ID NO: 5的氨基酸序列或与之有至少16%同一性的序列； 并且其中至少一个亚基包括提供核酸或染色质修饰、可视化、转录激活或转录抑制活 性的额外的氨基酸序列。
2. 如权利要求1所述的蛋白质复合物，其中所述Cas6亚基为Cas6e亚基，其具有SEQ ID NO: 17的氨基酸序列或与之有至少16%同一性的序列。
3. 如权利要求1或权利要求2所述的蛋白质复合物，其进一步包含Cse2亚基，该Cse2 亚基具有SEQ ID N0:2的氨基酸序列或与之有至少20%同一性的序列；任选地，其中正是 该Cse2亚基包括所述额外的氨基酸序列。
4. 如权利要求1至3中的任一项所述的蛋白质复合物,其进一步包含Csel亚基,该 Csel亚基具有SEQ ID N0:1的氨基酸序列或与之有至少9%同一性的序列；任选地，其中正 是该Csel亚基包括所述额外的氨基酸序列。
5. 如权利要求4所述的蛋白质复合物，其为I型CRISPR-Cas系统蛋白质复合物；优选 为I-E亚型CRISPR-Cas蛋白质复合物。
6. 如权利要求1至5中的任一项所述的蛋白质复合物，其中所述额外的氨基酸序列被 翻译地融合或共价连接到所述至少一个亚基上；优选地，所述额外的氨基酸序列融合或连 接到Csel、Cse2、Cas7、Cas5、Cas6或Cas6e亚基中的至少一个的至少N末端和/或C末端。
7. 如权利要求6所述的蛋白质复合物，其中所述额外的氨基酸序列融合或连接到 Csel、Cse2或Cas5亚基的N末端或C末端；优选Csel亚基的N末端、Cse2亚基的N末端 或Cas7亚基的N末端。
8. 如权利要求7所述的蛋白质复合物，其中所述额外的氨基酸序列为蛋白质；任选地 选自解旋酶、核酸酶、核酸酶-解旋酶（例如，Cas3)、DNA甲基转移酶（例如，Dam)或DNA 脱甲基酶、组蛋白甲基转移酶、组蛋白脱甲基酶、乙酰化酶、脱乙酰酶、磷酸酶、激酶、转录 (辅）激活物、RNA聚合酶亚基、转录阻抑物、DNA结合蛋白、DNA结构化蛋白、标志物蛋白、 报道蛋白、荧光蛋白、配体结合蛋白（例如，mCherry或重金属结合蛋白）、信号肽（例如， Tat-信号序列）、亚细胞定位序列（例如，核定位序列）或抗体表位。
9. 如权利要求8所述的蛋白质复合物，其中所述核酸酶选自II型限制性内切核酸酶； 优选FokI ;更优选经修饰的FokI,例如，KKR Sharkey或ELD Sharkey。
10. 如任一前述权利要求所述的蛋白质复合物，其进一步包含RNA分子，该RNA分子包 含与靶核酸序列有至少50%同一性的核糖核苷酸序列，并且其中所述蛋白质复合物和所述 RNA分子形成核糖核蛋白复合物。
11. 如权利要求10所述的核糖核蛋白复合物，其中所述RNA分子的一部分与所述靶序 列具有至少50%的同一性。
12. 如权利要求11所述的核糖核蛋白复合物，其中所述RNA分子的所述部分沿其长度 与所述靶序列至少实质互补。
13. 如权利要求10至12中的任一项所述的核糖核蛋白复合物，其中所述RNA分子的所 述长度在35-75个残基的范围内。
14. 如权利要求10至13中的任一项所述的核糖核蛋白复合物，其中用于靶向期望的核 酸序列的所述RNA分子的所述部分为32或33个残基长。
15. 如权利要求10至14中的任一项所述的核糖核蛋白复合物，其中所述RNA分子包含 位于与所述靶序列有至少实质互补性的所述RNA序列的5'侧的8个残基。
16. 如权利要求10至15中的任一项所述的核糖核蛋白复合物，其中所述RNA分子具有 发夹和四核苷酸环形成序列，该序列位于与所述靶序列有至少实质互补性的所述RNA序列 的3'侦U。
17. -种分离的核酸分子，其编码至少一种成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR)相 关蛋白质亚基，该蛋白质亚基选自： a. Csel亚基，其具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列或与之有至少9%同一性的序列； b. Cse2亚基，其具有SEQ ID NO: 2的氨基酸序列或与之有至少20%同一性的序列； c. Cas7亚基，其具有SEQ ID NO: 3的氨基酸序列或与之有至少18%同一性的序列； d. Cas5亚基，其具有SEQ ID NO: 4的氨基酸序列或与之有至少17%同一性的序列； e. Cas6亚基，其具有SEQ ID NO: 5的氨基酸序列或与之有至少16%同一性的序列；并 且 其中至少a、b、c、d或e包括提供核酸或染色质修饰、可视化、转录激活或转录抑制活 性的额外的氨基酸序列。
18. 如权利要求17所述的分离的核酸分子，其中所述提供核酸或染色质修饰、可视化、 转录激活或转录抑制活性的额外的氨基酸序列与CRISPR相关蛋白质亚基融合。
19. 如权利要求18所述的分离的核酸分子，其中所述额外的氨基酸序列选自解旋酶、 核酸酶、核酸酶-解旋酶（例如，Cas3)、DNA甲基转移酶（例如，Dam)、DNA脱甲基酶、组蛋白 甲基转移酶、组蛋白脱甲基酶、乙酰化酶、脱乙酰酶、磷酸酶、激酶、转录（辅）激活物、RNA聚 合酶亚基、转录阻抑物、DNA结合蛋白、DNA结构化蛋白、标志物蛋白、报道蛋白、荧光蛋白、 配体结合蛋白（例如，mCherry或重金属结合蛋白）、信号肽（例如，Tat-信号序列）、亚细 胞定位序列（例如，核定位序列）或抗体表位。
20. -种表达载体，其包含如权利要求17至19中的任一项所述的核酸分子。
21. 如权利要求20所述的表达载体，其进一步包含编码如权利要求10至16中的任一 项所限定的RNA分子的核苷酸序列。
22. -种修饰、可视化靶核酸、激活其转录或抑制其转录的方法，其包括使所述核酸接 触： a. 如权利要求10至16中的任一项所述的核糖核蛋白复合物；或 b. 如权利要求1至9中的任一项所述的蛋白质复合物，以及如权利要求10至16中的 任一项所限定的RNA分子。
23. -种修饰、可视化细胞中的靶核酸、激活其转录或抑制其转录的方法，其包括用如 权利要求22所述的表达载体以及额外的表达载体来转染、转化或转导所述细胞，该额外的 表达载体包含编码如权利要求10至18中的任一项所限定的RNA分子的核苷酸序列。
24. -种修饰、可视化细胞中的靶核酸、激活其转录或抑制其转录的方法，其包括用如 权利要求22所述的表达载体转染、转化或转导所述细胞，然后将如权利要求10至18中的 任一项所限定的RNA分子施用至所述细胞或施用至所述细胞中。
25. -种修饰、可视化细胞中的靶核酸、激活其转录或抑制其转录的方法，其包括用如 权利要求21所述的表达载体转染、转化或转导所述细胞。
26. 如权利要求22至25中的任一项所述的修饰或可视化靶核酸的方法，其中具有核酸 或染色质修饰或可视化活性的所述额外的氨基酸序列是标志物，并且该标志物与所述靶核 酸或染色质相关联；优选地，其中所述标志物为蛋白质；任选为荧光蛋白，例如绿色荧光蛋 白（GFP)或黄色荧光蛋白（YFP)。
27. 如权利要求22至26中的任一项所述的方法，其中所述靶核酸为DNA ;优选dsDNA。
28. 如权利要求22至26中的任一项所述的方法，其中所述靶核酸为RNA ;优选mRNA。
29. 如权利要求22至26中的任一项所述的修饰靶核酸的方法，其中所述核酸为 dsDNA，所述具有核酸或染色质修饰活性的额外的氨基酸序列为核酸酶或核酸酶-解旋酶， 并且所述修饰为期望的基因座处的单链或双链断裂。
30. -种使细胞中的dsDNA分子在期望的基因座处进行非同源末端连接，从而从所述 dsDNA分子中除去至少一部分核苷酸序列，任选地敲除一个基因或多个基因的功能的方法， 其中该方法包括采用如权利要求29所述的修饰靶核酸的方法来制造双链断裂。
31. -种将核酸同源重组到细胞中期望的基因座处的dsDNA分子内以修饰存在的核苷 酸序列或插入期望的核苷酸序列的方法，其中该方法包括采用如权利要求29所述的修饰 靶核酸的方法在期望的基因座处制造单链或双链断裂。
32. -种修饰、激活或抑制生物体中的基因表达的方法，其包括修饰如权利要求22至 25中的任一项的方法中所述的靶核酸序列，其中所述核酸是dsDNA，并且所述具有核酸或 染色质修饰、转录激活或抑制活性的额外的氨基酸序列选自DNA修饰酶（例如，脱甲基酶或 脱乙酰酶）、转录激活物或转录阻抑物。
33. -种修饰、激活或抑制生物体中的基因表达的方法，其包括修饰如权利要求22至 25中的任一项的方法中所述的靶核酸序列，其中所述核酸是mRNA，并且所述具有核酸或染 色质修饰或转录激活或抑制活性的额外的氨基酸序列为核糖核酸酶；任选地选自内切核酸 酶、3'外切核酸酶或5'外切核酸酶。
34. 如权利要求22至33中的任一项所述的方法，其中所述细胞是原核细胞。
35. 如权利要求22至33中的任一项所述的方法，其中所述细胞是真核细胞，例如，植物 细胞、酵母细胞、真菌细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞或人细胞。
36. 如权利要求35所述的方法，其中所述哺乳动物或人的细胞是除人胚胎干细胞以外 的干细胞；优选分离的干细胞。
37. 如权利要求33至35中的任一项所述的方法，其中所述细胞在体外转染。
38. 如权利要求22至36中的任一项所述的方法，其中所述靶核酸具有三级结构，任选 为超螺旋的，优选地，其中所述靶核酸为负超螺旋的。
39. -种药物组合物，其包含如权利要求1至9中的任一项所述的级联蛋白质复合物。
40. -种药物组合物，其包含如权利要求10至16中的任一项所述的核糖核蛋白复合 物。
41. 一种药物组合物，其包含如权利要求17至19中的任一项所述的分离的核酸，或如 权利要求20或权利要求21所述的表达载体。
42. -种试剂盒，其包含如权利要求1至9中的任一项所述的级联蛋白质复合物，以及 如权利要求10至16中的任一项所限定的RNA分子。
43. 如权利要求1至9中的任一项所述的级联蛋白质复合物，其用作药物。
44. 如权利要求10至16中的任一项所述的核糖核蛋白复合物，其用作药物。
45. 如权利要求17至19中的任一项所述的分离核酸，其用作药物。
46. 如权利要求20或权利要求21所述的表达载体，其用作药物。
【文档编号】C07K14/195GK104321429SQ201280071058
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2012年12月21日 优先权日:2011年12月30日
【发明者】斯坦·乔翰·约瑟夫·布朗兹, 约翰·万德奥斯特 申请人:瓦赫宁根大学