专利名称：叶酸修饰肽合成工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药生产领域的一种叶酸修饰肽合成工艺。
背景技术：
叶酸(Folic acid)维生素B复合体之一,相当于蝶酰谷氨酸(pteroylglutamicacid，PGA)，是米切尔(H.K.Mitchell，1941)从菠菜叶中提取纯化的，故而命名为叶酸。有促进骨髓中幼细胞成熟的作用，人类如果缺乏叶酸可引起巨红细胞性贫血以及白细胞减少症，对孕妇尤其重要。肽是α —氨基酸以肽链连接在一起而形成的化合物，它也是蛋白质水解的中间产物。由两个氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫做二肽，同理类推还有三肽、四肽、五肽等。通常由1(Γ100氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫多肽。它们的分子量低于10，OOODa (Dalton道尔顿)，能透过半透膜，不被三氯乙酸及硫酸铵所沉淀。也有文献把由2 10个氨基酸组成的肽称为寡肽(小分子肽)；10^50个氨基酸组成的肽称为多肽；由50个以上的氨基酸组成的肽就称为蛋白质。目前关于叶酸与多肽的结合的功能性方面的研究是一个热点方向。但是市场上对叶酸与多肽的偶联的方法仍处于初级阶段，本发明工艺是在前人研究基础上做出了优化。可以有效的提高偶联的成功率和及收率，降低合成的成本。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，优化现有的工艺流程，提供一种可有效的提高偶联的成功率、及收率和降低合成的成本的叶酸修饰肽合成新工艺。本发明是通过以下技术方案实现的:
一种叶酸修饰肽合 成工艺，其合成工艺步骤如下:
1)树脂溶涨
将 2-Chlorotrityl Chloride Resin 树脂放入反应管中，加 DCM(15ml/g),振荡 30min ；
2)接第一个氨基酸
通过沙芯抽滤掉溶剂，加入3倍摩尔过量的Fmoc-L-Pro-OH氨基酸，再加入10倍摩尔过量的DIEA，最后加入DMF溶解，振荡30min ；
3)脱保护
去掉DMF，加20%哌啶DMF溶液(15ml/g)，5min,去掉再加20%哌啶DMF溶液(15ml/g)，15min ；
4)检测
抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，KCN,苯酚溶液各一滴，1050C- 110°C加热5min，变深蓝色为阳性反应；
5)洗
DMF(IOml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次；
6)缩合
方法a:保护氨基酸(FmocAAA-OH)三倍过量，HBTU三倍过量，均用尽量少DMF溶解，加入反应管，立刻加入NMM十倍过量.反应30min ；
7)洗DMF(10ml/g) 一次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(IOml/g)两次；8)重复二至七步操作，从右到左依次连接序列中的氨基酸；
9)称量5倍当量叶酸，加入到反应管中，然后加入5倍当量的HBTU，10倍当量的DIEA，反应30min既抽掉反应液，取树脂进行茚三酮检测；
10)从树脂上切割多肽
配制切割液(10/g) TFA 94.5% ;水 2.5% ；EDT 2.5% ； TIS 1% ；
切割时间:120min ；
11)吹干洗涤
将裂解液用氮气尽量吹干，用乙醚洗六次，然后常温挥干；
12)用HPLC纯化多肽；
13)最后将纯化后的溶液冻干，既得到成品；
14)鉴定
分别取少量的成品多肽，做MS的分子量鉴定，和HPLC分析的纯度鉴定；
15)将白色粉末状的多肽，密封包装，_20°C保存。本发明与现有技术相比具有以下有益效果:
1.提闻偶联的成功率和及收率；
2.降低合成的成本。
具体实施例方式下面将结合实施例对本发明内容做进一步的详细描述:
本发明工艺是在多肽的固相合成的基础上，利用多肽固相合成的优点，结合叶酸的实际情况，而提出的一种叶酸修饰肽合成工艺，首先是确定要合成的叶酸肽的多肽部分序列，然后按照固相合成的方法将多肽合成出来，但是先不裂解，只将多肽的末端NH2裸露出来即可，然后根据多肽的实际摩尔当量，以叶酸:多肽=5:1的比例将叶酸投入反应，然后用茚三酮可以很方便的检测一NH2是否存在即可判断反应是否完全。此工艺大大提高了传统工艺上中的成功率，也由于是多肽和叶酸的连接是在合成中同步完成的，故人工成本也大大的降低了，效率得到很大的提高。以下为合成原料及相关试剂:
1)保护氨基酸原料 Fmoc-AAA-OH，叶酸
2)缩合试剂 HBTU, DIEA
3)溶剂
DMF, DCM,乙腈
4)树脂
2-Chlorotrityl Chloride Resin
5)脱保护试剂 哌唳6)切割试剂
TFA, TIS, EDT，H20
7)氮气
8)无水乙醚
9)精密电子天平 合成工艺步骤如下:
1)树脂溶涨
将 2-Chlorotrityl Chloride Resin 树脂放入反应管中，加 DCM(15ml/g),振荡 30min ；
2)接第一个氨基酸
通过沙芯抽滤掉溶剂，加入3倍摩尔过量的Fmoc-L-Pro-OH氨基酸，再加入10倍摩尔过量的DIEA，最后加入DMF溶解， 振荡30min ；
3)脱保护
去掉DMF，加20%哌啶DMF溶液(15ml/g)，5min,去掉再加20%哌啶DMF溶液(15ml/g)，15min ；
4)检测
抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，KCN,苯酚溶液各一滴，1050C- 110°C加热5min，变深蓝色为阳性反应；
5)洗
DMF(IOml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次
6)缩合
方法a:保护氨基酸(FmocAAA-OH)三倍过量，HBTU三倍过量，均用尽量少DMF溶解，加入反应管，立刻加入NMM十倍过量.反应30min ；
7)洗
DMF(10ml/g) 一次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次；8)重复二至七步操作,从右到左依次连接序列中的氨基酸；
9)称量5倍当量叶酸，加入到反应管中，然后加入5倍当量的HBTU，10倍当量的DIEA，反应30min既抽掉反应液，取树脂进行茚三酮检测；
10)从树脂上切割多肽
配制切割液(10/g) TFA 94.5% ;水 2.5% ;EDT 2.5% ；TIS 1%;
切割时间:120min ；
11)吹干洗涤
将裂解液用氮气尽量吹干，用乙醚洗六次，然后常温挥干；
12)用HPLC纯化多肽；
13)最后将纯化后的溶液冻干，既得到成品；
14)鉴定
分别取少量的成品多肽，做MS的分子量鉴定，和HPLC分析的纯度鉴定；
15)将白色粉末状的多肽，密封包装，_20°C保存。
权利要求
1.一种叶酸修饰肽合成工艺，其特征在于:合成工艺步骤如下: 1)树脂溶涨 将 2-Chlorotrityl Chloride Resin 树脂放入反应管中，加 DCM(15ml/g),振荡 30min ； 2)接第一个氨基酸 通过沙芯抽滤掉溶剂，加入3倍摩尔过量的Fmoc-L-Pro-OH氨基酸，再加入10倍摩尔过量的DIEA，最后加入DMF溶解，振荡30min ； 3)脱保护 去掉DMF，加20%哌啶DMF溶液(15ml/g)，5min,去掉再加20%哌啶DMF溶液(15ml/g)，15min ； 4)检测 抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，KCN,苯酚溶液各一滴，1050C- 110°C加热5min，变深蓝色为阳性反应； 5)洗 DMF(IOml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(IOml/g)两次； 6)缩合 方法a:保护氨基酸(FmocAAA-OH)三倍过量，HBTU三倍过量，均用尽量少DMF溶解，加入反应管，立刻加入NMM十 倍过量.反应30min ； 7)洗 DMF(10ml/g) 一次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次；8)重复二至七步操作,从右到左依次连接序列中的氨基酸； 9)称量5倍当量叶酸，加入到反应管中，然后加入5倍当量的HBTU，10倍当量的DIEA，反应30min既抽掉反应液，取树脂进行茚三酮检测； 10)从树脂上切割多肽配制切割液(10/g) TFA 94.5%，水 2.5%，EDT 2.5%, TIS 1%; 切割时间:120min ； 11)吹干洗涤 将裂解液用氮气尽量吹干，用乙醚洗六次，然后常温挥干； 12)用HPLC纯化多肽； 13)最后将纯化后的溶液冻干，既得到成品； 14)鉴定 分别取少量的成品多肽，做MS的分子量鉴定，和HPLC分析的纯度鉴定； 15)将白色粉末状的多肽，密封包装，_20°C保存。
全文摘要
本发明公开了医药生产领域的一种叶酸修饰肽合成工艺，合成工艺步骤如下1)树脂溶涨；2)接第一个氨基酸；3)脱保护；4)检测；5)洗；6)缩合；7)洗；8)重复二至六步操作，从右到左依次连接序列中的氨基酸；9)称量5倍当量叶酸，加入到反应管中，然后加入5倍当量的HBTU，10倍当量的DIEA，反应30min既抽掉反应液，取树脂进行茚三酮检测；10)从树脂上切割多肽；切割时间120min；11)吹干洗涤；12)用HPLC纯化多肽；13)最后将纯化后的溶液冻干，既得到成品；14)鉴定；做MS的分子量鉴定，和HPLC分析的纯度鉴定；15)将白色粉末状的多肽，密封包装，-20℃保存。本发明提高了传统工艺中的成功率，也由于是多肽和叶酸的连接是在合成中同步完成的，故人工成本也大大的降低了，效率得到很大的提高。
文档编号C07K1/06GK103159823SQ20131012017
公开日2013年6月19日 申请日期2013年4月9日 优先权日2013年4月9日
发明者王锡平 申请人:苏州强耀生物科技有限公司