专利名称：一种苏云金芽孢杆菌晶体融合蛋白的制备方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种融合蛋白的制备方法，具体涉及一种苏云金芽孢杆菌晶体融合蛋白的制备方法。
背景技术：
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)是一种广泛分布于土壤中的革兰氏阳性菌，在其芽孢的形成过程中，会形成具有杀虫活性的晶体蛋白(Cry蛋白)。该蛋白对鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目等多种害虫具有较高的毒性，是应用最为广泛的毒蛋白。由于此特性，编码Cry蛋白的基因被生物学者认作是转基因作物的热门备选基因，并已有多个转基因作物品种转入该基因并商品化，在全球范围内广泛种植。Bt菌系含有大量不同的杀虫晶体蛋白编码基因，至今已有近180个不同的Bt杀虫晶体蛋白基因被克隆和测序，cry34B就是其中一种。转基因作物的种植满足了人类对粮食产量、经济效益需求。同时，也存在着环境安全风险，外源基因导入的随机性和不确定性，基因表达对作物的生理生化作用的改变，对生态环境构成的威胁等等都难以预测。人们对转基因作物的安全性存在担忧，而消除这一担忧的有效途径就是对转基因作物所表达的外源蛋白进行安全性评价。因此，获取各种Bt杀虫晶体蛋白基因所表达的外源蛋白，对进行安全性评价意义重大，为后续的检验方法建立、检测标准的实施提供基础，从而可以有效防止安全隐患的发生，避免转基因作物对生态环境的破坏，充分发挥转基因技术在农业生产上的巨大应用潜力
发明内容
本发明的一个目的是提供一种苏云金芽孢杆菌晶体蛋白Bt Cry34B的编码基因。本发明所提供的苏云金芽孢杆菌晶体蛋白Bt Cry34B的编码基因，具有序列表中SEQ ID Na:1中第5179-5574位核苷酸序列。本发明的另一个目的是提供一种苏云金芽孢杆菌晶体融合蛋白的编码基因，具有序列表中SEQ ID No:1中第5071-5601位核苷酸序列。含有上述苏z 金芽抱杆菌晶体蛋白Bt Cry34B和晶体融合蛋白的编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或宿主菌也属于本发明的保护范围。所述重组载体优选为重组表达载体或重组克隆载体。本发明的另一个目的是提供一种Bt Cry34B融合蛋白的制备方法。本发明所提供的Bt Cry34B融合蛋白的制备方法，包括以下步骤:I)将SEQ ID Ns.1中第5173-5580位核苷酸所示的DNA插入pET28a表达载体中，得到重组表达载体；2)将所述重组表达载体导入大肠杆菌BL21 (DE3)，得到重组菌；3)培养所述重组菌，并进行诱导表达，收集菌体；裂解菌体，即得。Bt Cry34B融合蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID Ns:2所示，共有176个氨基酸残基，包括苏云金芽孢杆菌晶体蛋白Bt Cry34B的氨基酸序列和组氨酸标签序列。上述方法中，所述步骤3)包括以下步骤:a)将所述重组菌接种于含有50ug/mL Kan的LB培养基，37°C振荡培养16h，得到培养物；b)将所述培养物按1%的体积接入含50ug/mL Kan的LB培养基，37°C振荡培养3小时，得到培养液c)向所述培养液中加入IPTG至终浓度为lmM，30°C震摇培养6小时；d)将步骤c)所得产物4°C，IOOOOg离心lOmin，收集菌体。氨基酸序列如SEQ ID Na.2所示的蛋白也属于本发明的保护范围。本发明的表达载体含有T71ac启动子，受乳糖操纵子调控，它的调控快速而灵敏。本发明方法克服了苏云金杆菌晶体蛋白表达提取烦琐、成本高的缺陷，具有简便、快捷和高效的特点。本发明应用基因工程方法在国内首次合成Bt Cry34B基因，并首次制备出了 BtCry34B融合蛋白，为进一步探讨该蛋白的检测方法、生理功能及其作用机制、降解机制打下了基础。
图1 为 Bt Cry34B 融合蛋白 SDS-PAGE 图
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。实施例1、Bt Cry34B融合蛋白的制备方法(一)Bt Cry34B基因编码序列的优化和基因片段的获得将Bt Cry34B基因序列(GenBank:AY536900.1)进行密码子优化,优化后序列如SEQ ID Na:1中第5179-5574位核苷酸所示。(二)Bt Cry34B基因克隆载体的构建人工合成SEQ ID No:1中第5173-5580位核苷酸所示的核苷酸序列，即在目的基因两端连上了酶切位点EcoR I和Xho I序列。将上述合成的核苷酸序列连接到pG0V4 (购自基因合成公司Gene Oracle Inc.)克隆载体质粒中，得到Bt Cry34B基因重组质粒,记作pG0V4_34B。对质粒进行测序验证,结果表明质粒中插入的外源基因的序列如SEQ ID Na:1中第5173-5580位核苷酸所示。(三)BtCry34B基因重组表达载体及重组菌的构建将上述构建的克隆质粒pG0V4-34B用EcoR I和Xho I进行酶切，回收目的基因片段。将上述目的基因片段插入pET28a载体的EcoR I和Xho I酶切位点间，得到重组表达载体。 将重组表达载体转化BL21 (DE3)感受态细菌，得到重组菌，记作BL21(DE3) -pET28a-34B。在含有50ug/mL Kan的LB培养基上选择培养16h。从LB平板培养基上挑选单个菌落，经测序鉴定，鉴别出正向插入SEQ ID Ns:1中第5173-5580位核苷酸所示Bt Cry34B基因的重组表达载体，命名为pET28a-34B。上述重组表达载体pET28a_34B的全序列如序列表中SEQ ID Ns:1所示，其中，SEQID Na:1中第5071-5601位核苷酸为编码框，编码本发明所述的Bt Cry34B融合蛋白，BtCry34B融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID Ns:2所示，共有176个氨基酸残基，包括苏云金芽孢杆菌晶体蛋白Bt Cry34B的氨基酸序列和组氨酸标签序列。(四)利用重组菌制备BtCry34B融合蛋白挑取鉴定阳性的重组菌BL21 (DE3) _pET28a_34B进行表达。a)将重组菌 BL21 (DE3)-pET28a_34B 接种于含有 50ug/mL Kan 的 LB 培养基，37°C振荡培养16h，得到培养物；b)将所述培养 物按1%的体积接入含50ug/mL Kan的LB培养基，37°C振荡培养3小时，得到培养液；c)向所述培养液中加入IPTG至终浓度为ImM，30°C震摇培养6小时；d)将步骤c)所得产物4°C，IOOOOg离心lOmin，收集菌体。e)室温下用吸打或温和润旋使BugBuster Master Mix与菌体混勻，Img菌体:5ml BugBuster Master Mix。室温下，50-100rpm 振荡培养 20min,得到裂解液。BugBusterMaster Mix购自MERCK公司，产品目录号为71456-3。f)将上述裂解液以4°C，16000g离心20min，收集沉淀(包涵体)，再向沉淀中加入BugBuster Master Mix稀释液(用去离子水稀释BugBuster Master Mix,使它的浓度是步骤e中BugBuster Master Mix浓度的1/10，所用体积为步骤e中所加体积的6倍),充分润旋后4°C、5000g离心IOmin后倾去上清，重复3次后4°C、12000g离心15min，倾去上清得到高纯度包涵体；向包涵体中加入包涵体溶解液(0.05M CAPS缓冲液，含0.3% (0.3g/100mL)N-十二烧基肌胺酸钠；10mg包涵体对应ImL包涵体溶解液)，轻摇缓重悬包涵体；4°C、12000g离心20min后吸取上清，得到包涵体溶解液；g)将包涵体溶解液中的Bt Cry34B融合蛋白使用BugBuster N1-NTA His Bind和BugBuster His^Bind纯化试剂盒进行进一步的纯化(纯化试剂盒购自Novagen公司，产品目录号分别为70751-3和70899-3)。对照组:以转入pET28a空载体的大肠杆菌BL21 (DE3)作为对照。将pET28a空载体转化BL21 (DE3)感受态细菌，得到重组菌，记作BL21(DE3)-pET28a。在含有50ug/mL Kan的LB培养基上选择培养16h。从LB平板培养基上挑选单个菌落，然后进行重组菌的培养和表达，最后对粗提的混合蛋白上清液进行电泳鉴定。电泳结果见附图1中“空载体”电泳条带。条带显示，对照组中没有Bt Cry34B融合蛋白。(五)BtCry34B融合纯化效果将步骤(四)得到的纯化样品，采用SDS-PAGE进行Bt Cry34B蛋白纯化结果的验证。Bt Cry34B融合蛋白的SDS-PAGE方法参照张龙翔等所著《生化实验方法和技术》第二版，高等教育出版社(2006)，第100-106页。采用5%浓缩胶，电压50V。分离胶采用10%胶浓度，电压120V。上样量为30ul (样品:上样缓冲液为1:1)。SDS-PAGE结果如图1所示。该图表明得到目的蛋白。(六)BtCry34B融合蛋白产量检测检测方法:采用BCA蛋白定量试剂盒(BCA Protein Assay Kit,购自Novagen公司，产品目录号为71285-3)进行Bt Cry34B融合蛋白产量检测。检测结果:结果表明Bt Cry34B融合蛋白产量为0.01335mg蛋白/mg初始菌体。(七)BtCry34B融合蛋白虫饲实验将纯化得到的Bt Cry34B融合蛋白，用0.l%Triton-100 (V/V)水溶液倍半梯度稀释成5个浓度，以0.l%Triton-100水溶液溶解的BSA (胎牛血清蛋白)80ug/mL作为对照组。每个浓度设置4重复处理组。将清洗干净的玉米苗的根浸入稀释液10秒后室内自然晾干，放入培养皿中，每皿放入30只玉米根虫的幼虫，用透气薄膜封口，在25°C，40%-50%相对湿度黑暗培养箱中放置4天。 之后观察幼虫的死亡状态。结果表明，Bt Cry34B融合蛋白对玉米根虫幼虫的LC50值为8.05mg/L。
权利要求
1.一种苏云金芽孢杆菌晶体蛋白Bt Cry34B的编码基因，其特征在于，具有序列表中SEQ ID Na:1中第5179-5574位核苷酸序列。
2.—种苏云金芽孢杆菌晶体融合蛋白的编码基因，其特征在于，具有序列表中SEQ IDNa:1中第5071-5601位核苷酸序列。
3.含有权利要求1或2所述的编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或宿主菌；所述重组载体优选为重组表达载体或重组克隆载体。
4.一种Bt Cry34B融合蛋白的制备方法，包括以下步骤: 1)将SEQID Na.1中第5173-5580位核苷酸所示序列的DNA片段插入pET28a表达载体中，得到重组表达载体； 2)将所述重组表达载体导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌； 3)培养所述重组菌，并进行诱导表达，收集菌体；裂解菌体，即得。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)包括以下步骤:a)将所述重组菌接种于含有50ug/mLKan的LB培养基，37°C振荡培养16h，得到培养物； b)将所述培养物按1%的体积接入含50ug/mLKan的LB培养基，37°C振荡培养3小时，得到培养液 c)向所述培养液中加入IPTG至终浓度为lmM，30°C震摇培养6小时； d)将步骤c)所得产物4°C，IOOOOg离心lOmin，收集菌体。
6.一种蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID Ns.2所示。
全文摘要
本发明公开了一种苏云金芽孢杆菌晶体蛋白Bt Cry34B的制备方法。该方法包括如下步骤1)将SEQ ID №.1所示的DNA插入pET28a表达载体中，得到重组表达载体；2)将所述重组表达载体导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌；3)培养所述重组菌，并进行诱导表达，收集菌体；裂解菌体，即得。本发明应用基因工程方法在国内首次合成Bt Cry34B基因，并首次制备出了Bt Cry34B融合蛋白，为进一步探讨该蛋白的检测方法、生理功能及其作用机制、降解机制打下了基础。
文档编号C07K19/00GK103233020SQ201310122670
公开日2013年8月7日 申请日期2013年4月10日 优先权日2013年4月10日
发明者王保民, 张威, 谭桂玉, 曹振, 何丽珊, 郭素琴, 张亮, 张瑞 申请人:中国农业大学