重组牛alpha干扰素及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及重组牛alpha干扰素，其相应的基因为牛共有IFN-α基因（CoBoIFN-α）、遗传密码子优化的牛共有IFN-α基因（Y-CoBoIFN-α）和遗传密码子优化的牛IFN-αG亚型基因（Y-BoIFN-αG），以及编码的蛋白在抗病毒方面的生物活性。本发明首次设计并合成了CoBoIFN-α基因，并首次鉴定了CoBoIFN-α和BoIFN-αG的抗病毒活性，结果证实BoIFN-α-G和CoBoIFN-α的抗病毒活性至少高于其他同类十倍，更适于临床应用与工业化开发。
【专利说明】重组牛a Ipha干扰素及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及重组牛alpha干扰素及其应用，具体涉及牛共有IFN- α(CoBoIFN- α )、遗传密码子优化的牛共有IFN- a (Y-CoBoIFN- α )和遗传密码子优化的牛IFN-a G亚型(Y-BoIFN-aG)的核苷酸序列及其表达蛋白，以及其生物活性，属于分子生物学领域。
【背景技术】
[0002]牛IFN-α是由10多个相关功能基因编码的蛋白质家族，由567个核苷酸编码一个开放阅读框(ORF)，成熟的牛IFN-a由166个氨基酸组成，诱导其分泌表达的信号肽由23个氨基酸组成。和人IFN-a —样，牛IFN_a具有4个保守的半胱氨酸，分别位于第1，29，98和138位，可形成两个分子内二硫键(Cysl-Cys98，Cys29_Cysl38)，在自然状态下牛IFN-a没有糖基化位点。
[0003]早在1985年，Velan等就曾对牛IFN-α基因及牛IFN-α作了详细研究。Velan等从牛的cDNA文库中以人IFN-α基因为探针分离出了牛IFN-α基因，当时推测该基因至少包含10-12个亚型，对其中的A，B, C，D四个亚型进行了测序，并将牛IFN-a C亚型在大肠杆菌E.coli中进行了表达。1996年，Chaplin等从轮状病毒感染的犊牛肠上皮细胞中分离了牛IFN-α E亚型，并以杆状病毒AcMNPV为载体在昆虫细胞中进行了表达，表达的重组蛋白在牛肾细胞上有明显的抗病毒活性。随后Paul等又从轮状病毒感染的牛肠上皮细胞中克隆了牛IFN-aG，F，H亚型，并进行了测序。
[0004]牛IFN-α含有10_12个亚型，不同亚型之间同源性很高，已报道的牛IFN-a A、B、C、D、E、F、G、H八个亚型核苷酸和氨基酸同源性均超过了 90%以上。不同亚型可能是由不同细胞或同一细胞在不同时期分泌的，但由于缺乏系统的对比研究，其生物学活性是否有差异目前还不清楚。
[0005]共有IFN- a，又名交互IFN- a，是一种重组的非天然的I型干扰素,它是由IFN- a家族各个位置的原始的交互氨基酸构成的合成组建基因。Yitzhak Stabinsky等人根据人IFN-α基因家族的共有序列设计克隆了一种称为共有IFN-α的人工IFN-a。研究发现共有 IFN-a 与 IFN-a、IFN-β、IFN-ω 的同源性分别为 89%，30% 和 60%。Li Huang 等人通过扫描17种天然猪IFN-α亚型的序列，将各个相应位置最常出现的氨基酸组合起来，成功设计并合成出了一种猪的共有IFN-a。研究发现共有IFN-a的抗病毒、抗细胞增殖、促进NK活性、诱导细胞因子产生及诱导基因表达的能力比天然IFN-a高。牛全基因组测序计划已经完成，因此人工设计并合成牛共有IFN-a具有重要的生产和应用价值。
[0006]迄今为止已经发现牛IFN-a可以抵抗非洲猪瘟病毒、口蹄疫病毒、病毒性腹泻病毒、水泡性口炎病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛轮状病毒等多种病毒的增殖与复制；而且在人与猪上的研究表明，共有IFN-a与其同类相比，CoIFN-a因抗病毒显著增强、副作用更小而更适用于临床应用，因此设计并合成牛共有IFN-a基因，并将其突变成为与之只相差一个氨基酸的牛IFN- a G亚型基因(两种基因均为从未被研究过的新型牛IFN- a )，分析其抗病毒活性，可为研制新型牛抗病毒干扰素制剂提供有意义的探索。
【发明内容】
[0007]本发明涉及重组牛alpha干扰素牛共有IFN-α基因，优化其遗传密码子，以提高蛋白表达量，将牛共有IFN-α突变成为与之只相差一个氨基酸的牛IFN-a G亚型基因，利用毕赤酵母表达系统表达不含任何修饰序列的人工基因(牛共有IFN-a、基因优化的牛共有IFN- a和牛IFN- a G亚型)，并测定其抗病毒活性。
[0008]本发明涉及重组牛alpha 干扰素 CoBoIFN-a ,Y-CoBo IFN-a 和 Y-BoIFN-a G，所述的干扰素CoBoIFN-a ,Y-CoBoIFN-a和Y-BoIFN-a G的氨基酸序列分别为SEQ ID N0.32、SEQ ID N0.34 和 SEQ ID N0.36。
[0009]编码上述的干扰素CoBoIFN- a ,Y-CoBoIFN- a和Y-BoIFN- a G的核苷酸序列分别为 SEQ ID N0.31、SEQ ID N0.33 和 SEQ ID N0.35。
[0010]本发明还包括含有上述核苷酸序列的表达载体以及含有所述表达载体的宿主细胞。
[0011]此外，本发明还包括上述氨基酸序列和核苷酸序列在制备治疗或预防牛病毒病的药物中的应用。导致所述牛病毒病的病毒包括水泡性口炎病毒、病毒性腹泻病毒等多种RNA病毒。
[0012]CoBoIFN-a、Y-CoBoIFN-a和Y-BoIFN-a G在毕赤酵母中实现了高效可溶性分泌表达，表达量分别为0.382mg/mL、0.579mg/mL、0.564mg/mL,并通过细胞病变抑制法测得CoBoIFN-a ,Y-CoBoIFN-a、Y-BoIFN-a G 和牛 IFN-a A 亚型(BoIFN-a A)的抗病毒活性分别为 8.98X 107U/mg、9.16X 107U/mg、9.12X 107U/mg、8.93X 106U/mg。结果证实，通过基因优化，Y-CoBoIFN- a比CoBoIFN- a的表达量提高了 0.5倍，统计学分析显示CoBoIFN- a和BoIFN- a G抗病毒活性无显著差异，且较BoIFN- a A高10倍。本发明证实BoIFN- a -G和CoBoIFN-a的抗病毒活性显著高于其他同类，更适于临床应用与工业化开发，并且通过遗传密码子优化使BoIFN- a -G和CoBoIFN- a得到了高效表达。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为CoBoIFN-a的构建示意图；
[0014]图2为Y-BoIFN- a G的构建示意图；
[0015]图3为片段A、B、C、D的PCR扩增结果图；
[0016]图4为CoBoIFN- a基因PCR扩增结果；
[0017]图5为密码子利用率的百分数优化结果图:其中，A为CoBoIFN-a优化前，B
[0018]为CoBoIFN- a优化后，C为BoIFN- a G优化前，D为BoIFN- a G优化后；
[0019]图6为优化后牛共有IFN-a及牛IFN-a G亚型基因PCR扩增结果图；其中M为DNA分子质量标准；I为Y-CoBoIFN- a基因PCR扩增结果；2为Y-BoIFN- a G基因PCR扩增
结果;
[0020]图7 为质粒 pPICZ a Α-CoBoIFN-a、pPICZ a A-Y-CoBoIFN-a 和pPICZ a A-Y-BoIFN- a G鉴定结果图；其中，M为DNA分子质量标准；1、3、5为XhoI单酶切鉴定结果；2、4、6为Xho I和Xba I双酶切鉴定结果；[0021]图8为重组毕赤酵母的PCR鉴定结果图；其中，M为DNA分子质量标准；1、11为阴性对照；2、12为阳性对照；3_10为八株不同毕赤酵母的CoBoIFN-α基因PCR扩增结果；13为Y-CoBoIFN- α基因PCR扩增结果；14为Y-BoIFN- a G基因PCR扩增结果；
[0022]图9为八株重组酵母表达量的比较图；其中，6、10:空载体GS115_pPICZaA诱导后；1:1号菌株；2:2号菌株；3:3号菌株；4:4号菌株；5:5号菌株；7:6号菌株；8:7号菌株；9:8号菌株；
[0023]图10为八株重组酵母表达蛋白间接ELISA检测图；
[0024]图11为SDS-PAGE分析酵母分泌蛋白各时间点的表达量图；其中，M.蛋白质分子质量标准；1:空载体GS115-pPICZaA诱导后；2:12h后分泌蛋白；3:24h后分泌蛋白；4:36h后分泌蛋白；5:48h后分泌蛋白；6:60h后分泌蛋白；7:72h后分泌蛋白；8:84h后分泌蛋白；9:96h后分泌蛋白；
[0025]图12为各时间点重组酵母表达蛋白的间接ELISA分析结果图；
[0026]图13为SDS-PAGE分析酵母分泌蛋白的表达结果图；其中，M为蛋白质分子质量标准;2、4、5为空载体pPICZ a A诱导后；1为诱导G-p-CoBoIFN-a 96h后分泌蛋白；3为诱导G-p-Y-CoBoIFN- a 96h后分泌蛋白；6为诱导G-p-Y-BoIFN- a G96h后分泌蛋白；
[0027]图14为重组酵母表达蛋白间接ELISA检测图；
[0028]图15为酵母分泌蛋白的Western blot分析图；其中，M为蛋白质分子质量标准；1、3、5为空载体阴性对照；2为酵母表达的分泌蛋白CoBoIFN-a ；4为酵母表达的分泌蛋白Y-CoBoIFN- a ；6为酵母表达的分泌蛋白Y-BoIFN- a G ；
[0029]图16为酵母分泌蛋白对VS`V增殖的抑制作用图；
[0030]图17为酵母分泌蛋白Y-CoBoIFN- a对VSV增殖的抑制作用图；
[0031]图18为酵母分泌蛋白Y-BoIFN- a G对VSV增殖的抑制作用图；
[0032]图19 为兔抗 BoIFN-a 免疫多抗血清阻断 CoBoIFN-a、Y-CoBoIFN-a、Y-BoIFN- a G抗病毒活性曲线图。
【具体实施方式】
[0033]下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0034]试验材料:
[0035]I质粒、宿主菌、病毒
[0036]宿主菌E.coil TGU DH5 a均由东北农业大学动物医学学院微生物与免疫学教研室保存。水泡性口炎病毒(VSV)由东北农业大学动物医学学院任晓峰老师惠赠。毕赤酵母GSl 15由中国农科院哈尔滨兽医研究所高宏雷研究员惠赠。
[0037]2细胞、血清、蛋白
[0038]牛肾细胞(MDBK)细胞株，纯化后的兔抗BoIFN-a多克隆抗体、酵母分泌表达蛋白BoIFN-a A，BoIFN-a 多基因家族各亚型基因:pMD18-T_BoIFN-a -l、pMD18-T_BoIFN-a -6、pMD18-T-BoIFN-a -7、pMD18-T-BoIFN-a -14 均由本实验室克隆并保存。[0039]实施例1 蛋白 CoBoIFN- α、Y-CoBoIFN- α 和 Y-BoIFN- a G 的获得
[0040]1.CoBoIFN- α的设计及CoBoIFN- α和BoIFN- a G的基因优化与合成
[0041]1.1CoBoIFN-a基因序列的设计
[0042]CoBoIFN-a是一种合成的非天然出现的IFN-a杂合体，其氨基酸序列是通过扫描GenBank中已经公布的所有IFN- α亚型序列，将各个相应位置最常出现的氨基酸组合设计而成，其所有氨基酸均来自于BoIFN-α家族各亚型基因序列。本例中CoBoIFN-α的DNA序列是采用融合PCR的方法，利用已克隆基因BoIFN-α -l、BoIFN_a -6、BoIFN_a -7和BoIFN-a-14的各相应片段(A、B、C、D)拼接而成，但CoBoIFN-a的DNA的获取并不仅限于此例。
[0043]1.2引物的设计与合成
[0044]由于采用融合PCR的方法合成CoBoIFN-a，所以相邻引物之间均存在18_25bp的互补末端；为了使重组蛋白分泌到细胞外，故在设计连接酵母表达载体的上游引物时补充了 pPICZ a A载体上蛋白酶(Kex2)酶切位点的碱基序列AAAAGA，并在引物上游、下游分别引入Xho I和Xba I限制性内切酶识别位点，以便将基因连接至表达载体pPICZ a A上。各引物如下:
[0045](I)合成 CoBoIFN-α 的融合 PCR 引物为 SEQ ID N0.3-SEQ ID N0.8，其中，SEQ IDN0.3 为 Aa2、SEQ ID N0.4 为 Bsl、SEQ ID N0.5 为 Bs2、SEQ ID N0.6 为 Csl、SEQ ID N0.7为 Ca2、SEQ ID N0.8 为 Dsl。
[0046](2)连接酵母表达载体的引物为SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.10，其中:SEQ ID N0.9为 Ye-BoIF5S、SEQ ID N0.10 为 Ye_BoIF3a。
[0047]1.3CoBoIFN- α 的 PCR 扩增
[0048]CoBoIFN-α的融合PCR扩增包括三个反应步骤:
[0049]( I)待融合片段的独立扩增；
[0050](2)各片段间的融合反应，添加第一步反应的已纯化产物，不添加引物，通过10个循环，复性延伸片段之间的重叠部分；
[0051](3)对各融合片段的全长扩增，将第二步反应的未纯化产物，添加外侧引物，进行25个循环。
[0052]CoBoIFN-α的PCR扩增示意图见图1。
[0053]1.4CoBoIFN- α 及 BoIFN- a G 的基因优化
[0054]借助软件在牛共有CoBoIFN-α及BoIFN-a G的氨基酸序列不变的前提下，通过改变序列的密码子适应指数、GC含量、mRNA 二级结构以及密码子利用率等方法，进行CoBoIFN- a和BoIFN- a G的基因优化，以期提高CoBoIFN- a和BoIFN- a G的表达量。
[0055]1.5引物的设计与合成
[0056]将优化后的序列拆分成16条小片段，合成后作为引物，相邻引物之间均存在20_25bp的互补末端。由于BoIFN-a G与CoBoIFN-a的基因序列只相差一个氨基酸，所以只需额外多设计两条引物即可得到优化后的BoIFN-aG基因序列。各引物为SEQ IDN0.11-28，其中 SEQ ID N0.11 为 pl、SEQ ID N0.12 为 p2、SEQ ID N0.13 为 p3、SEQ ID N0.14为 p4、SEQ ID N0.15 为 p5、SEQ ID N0.16 为 p6、SEQ ID N0.17 为 p7、SEQ ID N0.18 为 p8、SEQ ID N0.19 为 p9、SEQ ID N0.20 为 plO、SEQ ID N0.21 为 pll、SEQ ID N0.22 为 pl2、SEQID N0.23 为 pl3、SEQ ID N0.24 为 pl4、SEQ ID N0.25 为 pl5、SEQ ID N0.26 为 pl6、SEQ IDN0.27 为 GL7、SEQ ID N0.28 为 GL8。1.6CoBoIFN-a 和 BoIFN-a G 优化基因的合成
[0057]Y-CoBoIFN-a的合成采用重叠延伸PCR的方法，先将各相邻引物平均分成四组，通过10个循环，延伸片段之间的重叠部分；将第一步反应产物，不添加引物，通过10个循环，继续延伸片段之间的重叠部分；然后将第二步反应的产物，添加两端引物(PU P16)，进行25个循环，得到Y-CoBoIFN- a，以GL7和GL8代替p7和p8，用同样的重叠延伸PCR方法得到 Y-BoIFN-a G。
[0058]Y-BoIFN- a G PCR扩增示意图见图2。
[0059]2含有CoBoIFN- a、Y-CoBoIFN- a和Y-BoIFN- a G的重组酵母的构建及表达
[0060]2.1 酵母分泌表达载体 pPICZ a A-CoBoIFN- a、pPICZ a A-Y-CoBoIFN- a 和pPICZ a A-Y-BoIFN- a G 的构建
[0061](I) CoBoIFN-a ,Y-CoBoIFN-a、Y_BoIFN_ a G 基因和载体 pPICZ a A 双酶切纯化产物的制备
[0062]将回收得到的PCR 产物 CoBoIFN- a、Y-CoBoIFN- a、Y-BoIFN- a G 和 pPICZ a A 表达载体分别用Xho I和Xba I限制性内切酶进行双酶切，酶切体系如下:
[0063]
【权利要求】
1.重组牛alpha 干扰素，包括:CoBoIFN_ a、Y-CoBoIFN- α 和 Y-BoIFN- a G,其特征在于，所述的干扰素CoBoIFN- a ,Y-CoBoIFN- α和Y-BoIFN- a G的氨基酸序列分别为SEQ IDN0.32、SEQ ID N0.34 和 SEQ ID N0.36。
2.根据权利要求1所述的重组牛alpha干扰素，其特征在于，编码所述的干扰素CoBoIFN-α、Y-CoBoIFN-α 和 Y-BoIFN-a G 的核苷酸序列分别为 SEQ ID N0.31、SEQ IDN0.33 和 SEQ ID N0.35。
3.—种表达载体，其特征在于，含有权利要求2所述的核苷酸序列。
4.一种宿主细胞，其特征在于，含有权利要求3所述的载体。
5.权利要求1所述的氨基酸序列在制备治疗或预防牛病毒病的药物中的应用。
6.权利要求2所述的核苷酸序列在制备治疗或预防牛病毒病的药物中的应用。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，引起所述的牛病毒病的病毒包括水泡性口炎病毒、病毒性腹泻病毒等多`种RNA病毒。
【文档编号】C07K14/56GK103450355SQ201310381419
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年8月28日 优先权日:2013年8月28日
【发明者】王君伟, 孙旭燕, 高明春, 马波, 崔子寅 申请人:东北农业大学