还原敏感偶氮连接单元的合成及其在dna测序中的用途
【专利摘要】本发明公开了一种还原敏感偶氮连接单元的合成及其在DNA测序中的用途；该还原敏感偶氮连接单元结构式如下：其中m为0～44中任一整数，n为0～44中任一整数。该还原敏感偶氮连接单元与核苷酸及荧光素连接得到可逆终端，所述可逆终端用于DNA合成测序。与现有技术相比，本发明合成了一类新的可裂解连接单元，并用于合成了基于这种连接单元的可逆终端；该类可逆终端在温和的条件下可以实现高效率的裂解，可用于DNA合成测序；同时，其合成所需原料简单易得，合成过程均为常规化学反应，可用于大规模推广使用。
【专利说明】还原敏感偶氮连接单元的合成及其在DNA测序中的用途
【技术领域】
[0001]本发明属于化学合成和生物化学领域，涉及可用于DNA合成测序的化合物，具体涉及一类还原敏感型偶氮连接单元的合成及其在DNA测序中的用途。
【背景技术】
[0002]DNA测序技术是现代生物学研究中重要的手段之一。人类基因组计划完成后，DNA测序技术得到了迅速发展。DNA测序(DNA sequencing)是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)的排列方式。发展精确、高通量、低成本的DNA测序方法对于生物、医药科学等具有非常重要的意义。
[0003]合成法测序(Sequencing By Synthesis, SBS)是新一代DNA测序技术之一。合成法测序方法通过把大量被测的模板DNA片段进行固定，并在固定化的DNA测序模板上杂交结合通用的DNA引物，分别控制4种核苷酸在DNA引物上的延伸。通过检测延伸反应过程或延伸核苷酸，实现高通量并行的DNA序列信息的检测。
[0004]在合成法测序中，首先要合成DNA链延长的四种核苷酸原料，又叫“可逆终端”(reversible terminator)。这类核苷酸除了要求3'-羟基阻断外，为了不影响下一个指示核苷酸的并入和识别，还要求通过一个可裂解的连接单元把核苷酸和指示分子，例如荧光素，连接起来。然后，在下一个指示核苷酸并入之前，在温和的条件下使这个连接单元断裂，继续DNA链的延长，从而读出DNA碱基的序列。该连接单元对合成法测序的读长和效率有重要的影响，因此，人们也一直致力于发展新的可裂解连接单元，来提高DNA测序的效率。目前已报道的连接单元有还原剂敏感(二硫键，偶氮化合物)；光裂解(邻硝基苄基衍生物，苯甲酰甲基酯衍生物及其它光可裂解连接单元)；亲电子试剂/酸敏感(酸裂解；叠氮化合物)；金属作用下的裂解；氧化剂敏感等。然而还原敏感连接单元却从来没有用于DNA 测序(Bioorganic&Medicinal Chemistry2012，20，571-582)。
[0005]可裂解连接单元对DNA测序的读长和效率有重要的影响，而现有的连接单元存在裂解条件不够温和、裂解效率不高，用于测序时读长太短等缺点，因此，设计、合成新的可裂解连接单元，并探索合适的裂解条件对于提高测序的效率、发展新的测序方法有非常重要的意义。文献(Eur.J.0rg.Chem.2010，4360-4364)报道了不同的偶氮苯为还原性连接单元应用于蛋白质组学，不同的偶氮化合物在连二亚硫酸钠作用下有很好的裂解速率，而还原剂对DNA链没有损伤，还未有报道偶氮化合物作为可裂解连接单元应用于DNA测序上，所以设计、合成对还原敏感的连接单元并用于DNA测序具有非常重要的意义。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种还原敏感偶氮连接单元的合成及其在DNA测序中的用途。本发明设计合成的一类新的还原敏感偶氮连接单元(可逆终端)，该类化合物合成原料简单易得，合成过程均为常规化学反应，易于实现大量合成；该类化合物可与核苷酸和荧光素实现高效率的连接。通过研究该类化合物的裂解性能，发现该类化合物在温和的条件下可以实现高效率的裂解，具有应用于DNA测序的价值。所以，基于偶氮结构的连接单元在DNA测序体系中能够提闻测序效率。
[0007]本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:
[0008]第一方面，本发明涉及一种还原敏感偶氮连接单元，其结构式如式(I)所示:
【权利要求】
1.一种还原敏感偶氮连接单元，其结构式如式(I)所示:
2.如权利要求1所述的还原敏感偶氮连接单元，其特征在于，所述m为O~10中任一整数，η为O~10中任一整数。
3.如权利要求2所述的还原敏感偶氮连接单元,其特征在于,所述m=l,η为O~10中任一整数。
4.一种如权利要求1所述的还原敏感偶氮连接单元的合成方法，其特征在于，包括如下步骤:第一步、在DMF存在的条件下，碳酸钾、化合物E
5.如权利要求4所述的还原敏感偶氮连接单元的合成方法，其特征在于，所述化合物E的合成包括如下步骤:A、在甲苯存在的条件下，摩尔比为(1.0~3.5):1.0的48 % HBr与化合物
6.如权利要求4所述的还原敏感偶氮连接单元的合成方法，其特征在于，所述化合物G的合成包括如下步骤:在水、甲醇存在的条件下，亚硝酸钠、4-氨基苯乙醇和化合物
7.—种如权利要求1所述的还原敏感偶氮连接单元在DNA测序中的用途，其特征在于，所述还原敏感偶氮连接单元与核苷酸及荧光素连接得到可逆终端，所述可逆终端用于DNA合成测序。
8.一种可逆终端，其特征在于，所述可逆终端由如权利要求1所述的还原敏感偶氮连接单元与核苷酸及荧光素连接而得。
9.如权利要求8所述的可逆终端，其特征在于，所述连接具体包括如下步骤: A、以无水DMF为溶剂，在TEA存在的条件下，所述还原敏感偶氮连接单元与TAMRA(5 /6)
10.如权利要求8所述的可逆终端，其特征在于，所述dUTP(AP3)是通过包含如下步骤的方法合成的: A、化合物F2的合成:在冰水浴搅拌条件下，摩尔比为1.0: (1.2~2)的丙炔胺与三氟
乙酸甲酯反应，得化合物F2
11.一种如权利要求8所述的可逆终端在DNA测序中的用途。
【文档编号】C07H1/00GK103539697SQ201310462509
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2013年9月30日 优先权日:2013年9月30日
【发明者】沈玉梅, 刘亚智, 赵小东, 邵志峰, 汤道年, 江敏, 龚兵, 伍新燕, 李小卫 申请人:上海交通大学, 华东理工大学