与人mhc-i类分子结合的grp78多肽表位的制作方法
【专利摘要】与人MHC-I类分子结合的GRP78多肽表位，其特征在于：能与人MHC-I类分子的结合位点进行结合、可激活特异性的细胞毒性T淋巴细胞的多肽表位，为筛选自人葡萄糖调节蛋白78(GRP78)，且与人GRP78具有同源性的下列氨基酸序列，为选自GRP788-16，GRP78236-244，GRP78337-345，GRP78415-423，GRP78416-424中的游离型多肽、融合型多肽和嵌合型多肽；以及以所述5条多肽之一为单体的各种形式的聚合体。本发明的优点：有效杀伤肝素酶阳性的肿瘤组织，达到治疗进展期肿瘤的目的。使用计算机模拟技术与实验相结合的方法，进一步提高了预测多肽表位的准确性，不单纯考虑分子结合位点对多肽表位的预测影响，同时从空间构象上，预测了多肽表位。体外容易合成，经静脉给药后容易被机体吸收，因此具有非常大的商业产业化价植。
【专利说明】与人MHC-1类分子结合的GRP78多肽表位
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医药工程【技术领域】，包括筛选获得与人主要组织相容性复合物(MHC-1)类分子结合的GRP78多肽分子，以及编码这些多肽的DNA，RNA，特别涉及了与人MHC-1类分子结合的GRP78多肽表位。
【背景技术】
[0002]葡萄糖调节蛋白78 (Glucose regulated protein, GRP78)属于热休克蛋白70家族，由内质网合成和分泌，其基本功能是:作为分子伴侣，在真核生物内质网膜上，通过与新生多肽表面的疏水片段以非共价键短暂结合，促进蛋白质的正确折叠、装配以及跨内质网膜转运，在生物机体的生长发育中起重要作用；作为应激蛋白，在低糖、低氧等应激状态下大量表达，参与未折叠蛋白反应以维持细胞的稳定。
[0003]研究表明，GRP78在人类肝癌、肺癌、结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、纤维肉瘤及骨肉瘤等恶性肿瘤细胞的GRP78表达显著增高，说明GRP78与多种肿瘤发生相关；GRP78在恶性肿瘤的侵袭和转移过程中也有重要作用，抑制GRP78基因的表达可抑制肿瘤细胞在体内的侵袭能力以及转移能力；GRP78的过度表达还可使许多恶性肿瘤细胞不同程度的对多种化疗药物耐药，而如果抑制GRP78的表达则可使化疗药物对这些恶性肿瘤细胞的杀伤作用提高。综上所述，GRP78作为肿瘤相关抗原，与肿瘤的发生、侵袭转移及药物敏感性密切相关。
[0004]随着对免疫应答分子机制研究的深入，现已逐渐认识到机体的免疫细胞并不是对应于各种各样的病原体或天然抗原的整体分子，而是针对各种各样抗原分子的抗原表位，即蛋白质抗原是通过其表位来体现其免疫特异性。目前的研究表明，CD8+T细胞所识别的靶抗原需先经抗原提呈细胞处理，之后以“抗原肽-MHC-1类分子”复合物的形式呈现在抗原提呈细胞或靶细胞表面，相应的与MHC-1类分子结合的抗原肽即为CTL表位。
[0005]已有研究显示,利用GRP78核酸疫苗免疫非小细胞肺癌小鼠后，小鼠生存期明显延长，小鼠免疫细胞分泌细胞因子肿瘤坏死因子(TNF-a)、Y干扰素(IFN-Y)的水平和对靶细胞的杀伤率明增加，提示GRP78核酸疫苗激活了特异性的CTL反应。而将GRP78作为肿瘤相关抗原，采用生物信息学手段，研究其CTL表位，并将其作为肿瘤免疫治疗的一个新革巴点，到目前为止，未见有文献报道。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供能与人MHC-1类分子的结合位点进行结合、可激活特异性的细胞毒性T淋巴细胞的多肽表位；提供所述多肽表位在制备用于临床治疗和检测肿瘤性疾病疫苗中的用途。
[0007]本发明根据抗原肽与MHC-1类分子相互作用的机理，从肝素酶的全长基因序列中筛选出侯选多肽表位，最终得到能有效与MHC-1类分子结合并能激活特异性T淋巴细胞的多肽表位，该多肽表位长度仅9个氨基酸序列，体外容易合成，方便临床应用。
[0008]本发明的第一目的，即能与人MHC-1类分子的结合位点进行结合、可激活特异性的细胞毒性T淋巴细胞的多肽表位，筛选自人GRP78，为与人GRP78具有同源性的下列氨基酸序列，包括:
[0009]GRP788-16, Ala Met Leu Leu Leu Leu Ser Ala Ala ；
[0010]GRP78236-244, Tyr He Asp Asn Gly Val Phe Glu Val ；
[0011]GRP78337-345, Ser Tyr Met Lys Pro Val Gln Lys Val ；
[0012]GRP78415-423, Val Leu Leu His Val Cys Pro Leu Tyr ；
[0013]GRP78416-424, Leu Leu His Val Cys Pro Leu Tyr Leu。
[0014]本发明涉及的多肽表位，还可以为选自GRP788-16，GRP78236-244，GRP78337-345，GRP78415-423，GRP78416-424中的游离型多肽、融合型多肽和嵌合型多肽；以及以所述5条多肽之一为单体的各种形式的聚合体。
[0015]本发明所涉及的多肽表位与功能或性质已知的蛋白质融合或嵌合，即这些蛋白质分子或嵌合分子包含了本发明涉及的多肽氨基酸序列，具有这些多肽的相同或相似活性。
[0016]与本发明有关的多肽序列，可通过任何已有的体外多肽合成设备和不同技术原理人工合成。其获得方法主要有以下步骤，包括多肽的合成，纯化以及最后产品的收集，这些技术己经成熟并程式化，在相关领域被广泛应用。
[0017]本发明的优点:
[0018]本发明所述的与人MHC-1类分子结合的GRP78多肽表位，由于这些多肽与人MHC-1类分子的结合位点进行结合，可激活特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL细胞)，从而有效杀伤肝素酶阳性的肿瘤组织，达到治疗进展期肿瘤的目的。使用计算机模拟技术与实验相结合的方法，进一步提高了预测多肽表位的准确性，不单纯考虑分子结合位点对多肽表位的预测影响，同时从空间构象上，预测了多肽表位。而且本发明的多肽物质，仅为9肽的短肽，体外容易合成，经静脉给药后容易被机体吸收，因此具有非常大的商业产业化价植。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]下面结合附图及实施方式对本发明作进一步详细的说明:
[0020]图1为GRP788-16多肽表位的空间结构模拟图；
[0021]图2为GRP788-16多肽表位和MHC-1类分子结合的空间结构模拟图；
[0022]图3为GRP78415-423多肽表位的空间结构模拟图；
[0023]图4为GRP78415-423多肽表位和MHC-1类分子结合的空间结构模拟图；
[0024]图5为GRP78236-244多肽表位的空间结构模拟图；
[0025]图6为GRP78236-244多肽表位和MHC分子结合的空间结构模拟图；
[0026]图7为GRP78337-345多肽表位的质谱分析图；
[0027]图8为GRP78337-345多肽表位和MHC分子结合的空间结构模拟图；
[0028]图9为GRP78416-424多肽表位的空间结构模拟图；
[0029]图10为GRP78416-424多肽表位和MHC-1分子结合的空间结构模拟图；
[0030]图11为GRP788-16多肽表位的质谱分析图；
[0031]图12为GRP78415-423多肽表位的质谱分析图；
[0032] 图13为GRP78236-244多肽表位的质谱分析图；
[0033]图14为GRP78337-345多肽表位的质谱分析图；
[0034]图15为GRP78416-424多肽表位的质谱分析图；
[0035]图16为5个筛选出的多肽与MHC-1亲和力实验结果；
[0036]图17为5个筛选出的多肽对人乳腺癌MCF7细胞(HLA-A2-)杀伤效果线图；
[0037]图18为5个筛选出的多肽对人乳腺癌MB-MDA-231细胞(HLA-A2+)杀伤效果线图；
[0038]图19为5个筛选出的多肽对人骨肉瘤MG-63细胞(HLA-A2-)杀伤效果线图；
[0039]图20为5个筛选出的多肽对人骨肉瘤U2-0S细胞(HLA-A2+)杀伤效果线图。
【具体实施方式】
[0040]实施例1.多肽表位的筛选方法
[0041]本发明所获得的多肽序列是通过超基序法与量化基序法结合的方法，从肽库中直接调取，保持了与MHC-1类分子结合特性。通过对这些多肽序列进行概率统计分析，获得多肽与MHC-1类分子的结合模型。
[0042]1.人GRP78氨基酸序列的获得
[0043]自国际开放共享基因库NCBI GeneBank中查找出天然人GRP78的全长氨基酸序列(共654个氨基酸)表示为:
[0044]MKLSLVAAMLLLLSAARAEEEDKKEDVGTVVGIDLGTTYSCVGVFKNGRVEIIANDQGNRITPSYVAFTPEGERLI⑶AAKNQLT SNPENTVFDAKRLIGRTffNDPSVQQDIKFLPFKVVEKKTKPYIQVDIGGGQTKTFAPEEISAMVLTKMKETAEAYLGKKVTHAVVTVPAYFNDAQRQATKDAGTIAGLNVMRIINEPTAAAIAYGLDKREGEKNILVFDLGGGTFDVSLLTIDNGVFEVVATN⑶THLGGEDFDQRVMEHFIKLYKKKTGKDVRKDNRAVQKLRREVEKAKRALS SQHQARIEIESFYEGEDFSE TLTRAKFEELNMDLFRSTMKPVQKVLEDSDLKKSDIDEIVLVGGSTRIPKIQQLVKEFFNGKEPSRGINPDEAVAYGAAVQAGVLS⑶QDTCDLVLLDVCPLTLGIETVGGVMTKLIPRNTVVPTKKSQIFSTASDNQPTVTIKVYEGERPLTKDNHLLGTFDLTGIPPAPRGVPQIEVTFEIDVNGILRVTAEDKGTGNKNKITITNDQNRLTPEEIERMVNDAEKFAEEDKKLKERIDTRNELESYAYSLKNQI⑶KEKLGGKLSSEDKETMEKAVEEKIEWLESHQDADIEDFKAKKKELEEIVQPIISKLYGSAGPPPTGEEDTAEKDEL
[0045]表1氨基酸缩写表
[0046]
【权利要求】
1.与人MHC-1类分子结合的GRP78多肽表位，其特征在于:所述的与人MHC-1类分子结合的GRP78多肽表位，能与人MHC-1类分子的结合位点进行结合、可激活特异性的细胞毒性T淋巴细胞的多肽表位，为筛选自人葡萄糖调节蛋白78 (GRP78)，且与人GRP78具有同源性的下列氨基酸序列，包括:
GRP788-16, Ala Met Leu Leu Leu Leu Ser Ala Ala ；
GRP78236-244, Tyr He Asp Asn Gly Val Phe Glu Val ；
GRP78337-345, Ser Tyr Met Lys Pro Val Gln Lys Val ；
GRP78415-423, Val Leu Leu His Val Cys Pro Leu Tyr ；
GRP78416-424, Leu Leu His Val Cys Pro Leu Tyr Leu。
2.按照权利要求1所述的与人MHC-1类分子结合的GRP78多肽表位，其特征在于--为选自 GRP788-16，GRP78236-244，GRP78337-345，GRP78415-423，GRP78416-424 中的游离型多肽、融合型多肽和嵌合型多肽；以及以所述5条多肽之一为单体的各种形式的聚合体。
3.按照权利要求1所述的与人MHC-1类分子结合的GRP78多肽表位，其特征在于:所述的与人MHC-1类分子结合的GRP78多肽表位，通过原核细胞或真核细胞表达纯化获得，或人工合 成。
【文档编号】C07K14/47GK104163862SQ201310655527
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2013年12月4日 优先权日:2013年12月4日
【发明者】魏敏杰, 孙明立, 于兆进, 陈秋晨 申请人:魏敏杰