下游生物处理装置制造方法

下游生物处理装置制造方法
【专利摘要】在单一装置中提供分泌重组蛋白质的X大规模下游处理，其中在多个生物反应器的内含物的收集和纯化的同时合并多个生物反应器的内含物，由此显著节省制造的时间与成本。有时可能必需将批量分成多个次批量，然后使这些次批量在一起以形成最终均匀批量。在最终灭菌的情况下，通过高压釜的容量确定批量大小。在连续制造中，所述批量必须对应于所定义的生产部分，以其预期均匀性为特征。
【专利说明】下游生物处理装置

【技术领域】
[0001] 本发明大体上涉及使用分泌祀蛋白的生物培养物大规模制造祀蛋白的领域，其中 在多个生物反应器的内含物的收集和纯化的同时在下游生物处理装置中合并多个生物反 应器的内含物，由此显著节省制造的时间与成本。

【背景技术】
[0002] 使用例如中国仓鼠卵巢细胞（CH0)或其它类似细胞等哺乳动物细胞大规模制造 祀蛋白目前占现今所用所有重组制造方法的约四分之H。随着更多的祀蛋白、尤其是单克 隆抗体（MAB)的专利到期，存在W下正在上升的未得到满足的需求；将买得起的、容易安装 与操作并且调节挑战更少的制造系统。目前所用的系统无论其成本如何，都不提供该些优 点。作为一实例，用于提供至少20%的单一 MAB的世界市场的哺乳动物细胞制造设施可W 花费超过$1亿用于cGMP生产。对此类巨大投资的要求一直W来使许多公司在该个制造领 域之外，导致该些产品的全球垄断和价格控制。
[0003] 存在开发W可能的最低成本制造祀蛋白的方法的大量未得到满足的需求并且该 可W通过各种概念的新颖组合来实现，包括：
[0004] a.使用更小的生物反应器，通过合并输出W符合CGMP批量的定义的CFR 21要求 产生大批量，从而降低按比例扩大和验证的成本，降低污染失败的成本并且使用更小的制 造设施；
[0005] b.消除W下高成本步骤：细胞分离、营养介质体积减少和兀长的色谱柱加载；
[0006] C.允许使用逐步或梯度洗脱来纯化；
[0007] d.在单一容器中在全自动条件下进行所有W上操作W允许无人值守式操作。
[0008] 本发明提供一种用于通过在新颖系统中合并所有W上关键要素来控制祀蛋白制 造成本的新颖解决方案，所述新颖系统主要可W用于制造在营养介质中分泌的祀蛋白类 型，更具体地说如单克隆抗体的大剂量产品，其中资金成本要求明显降低并且可能的操作 成本最低，并且用于开发和制造新产品的周转时间最短。更一股地说，本发明可W用于汇 集、收集并且纯化所表达的或在任何纯化阶段的任何重组物质。代表性实例将是汇集并浓 缩在蛋白质再折叠阶段的祀蛋白。
[0009] 所主张的新颖下游处理系统不是已知技术的明显结果；必须创建若干新颖步骤、 硬件组件和方法W使该个系统功能达到最佳。


【发明内容】

[0010] 药物生产批量大小根据CFR 21 (联邦注册代码）定义为各成分的均匀混合物。"批 量"或"批次"如WHO GMP准则（TRS 908附件4)中定义为"在单一工艺或一系列工艺中处理 W使得其预计为均匀的所定义数量的起始材料、包装材料或产品。有时可能必需将批量划 分成多个次批量，然后一起引入该些次批量W形成最终均匀批量。在最终灭菌的情况下，通 过高压蓋的容量确定批量大小。在连续制造过程中，所述批量必须对应于所定义的生产部 分，w其预期均匀性为特征。批量大小可w定义为固定数量或w固定时间间隔产生的量"。
[0011] 在制造更小的次批量并且将其汇集在一起的那些情况下，需要将它们合并在更大 的容器中，在所述容器中，次批量可W混合为均匀混合物。然而，在许多情况下，更大的容器 可W是禁止使用的，例如在洁净室中，并且因此存在发明将允许在容器之间混合并且不需 要在更大容器中混合整个内含物的系统的未得到满足的需求。
[0012] 混合多个容器的内含物的想法还提供许多重要的财务和调节优点。
[0013] 在合并更小的次批量W产生更大批量方面存在其它优点。药物制造科学教示我们 改变批量的大小不是简单的练习。随着批量大小改变，混合动力学W及在制造工艺中发生 的任何反应的动力学也改变，并且因此，需要制造者进行研究W验证制造条件，从而确保特 定的批量大小将始终如一地产生相同产品。因此，制造者需要投入大量的时间和金钱来验 证不同批量大小，W符合其针对特定产品数量的需要。
[0014] 使用生物反应器生物制造例如蛋白质等产品面对甚至更大的挑战，因为生物反应 器容器中的液体（营养介质和生物培养物）体积的改变显著改变了始终如一地产生产品所 需的条件。具有显著重要性的因素包括容器的几何形状、气化量、液体的量和揽动性质并且 因此，除非实践制造工艺并且对制造工艺的各种参数进行适当校正，否则不可能预测制造 工艺的行为。
[0015] 因为产品的制造者通常面对一次制造更大或更小批量的选择，所W所进行的最明 显的练习是验证若干批量大小并且基于当前制造需要使用特定批量大小。不同批量大小的 使用还需要制造可用的不同大小的器皿，和生物反应器的其它技术附接件，使维持若干经 验证批量大小的成本极高。然而，因为祀蛋白制造最昂贵并且通常具有较短的存放期，因此 制造者不可避免的不维持若干经验证批量大小。
[0016] 因为生物反应器主要采用液体内含物，所W它们更容易混合并且寻找W将符合 FDA根据CFR 21针对单一批量的要求的方式混合若干生物反应器的内含物的解决方案将 通过降低验证所需的批量的数量并且向制造者提供在制造设备中使用更少的变化形式随 意生产不同批量大小的灵活性，显著降低制造成本。
[0017] 不存在教示关于使用小得多的混合器皿W连续方式合并若干生物反应器的内含 物W构成单一批量的现有技术。本发明不仅解决降低生产成本的该个关键障碍，而且教示 商用级应用，其中可W使用用于混合液体的低成本解决方案来处理成百上千升液体。本发 明提供用于从若干生物反应器合并极大体积的营养介质的两步法；首先，将所有生物反应 器倒入小型混合充实室中，所述充实室然后将液体引入到与生物反应器的大小相比小得多 的容器中。并不打算固持而是打算连续地混合并且排放出营养介质和生物培养物，并且通 过将活性祀蛋白结合到能够结合其的树脂，仅保留活性祀蛋白。
[0018] 本发明提供祀蛋白的连续混合捕捉。传统上，在祀蛋白已经在生物反应器中表达 之后，收集和纯化工艺目前需要分离细胞，减少营养介质的体积并且加载色谱柱。所有该些 都是极其费时的步骤，引起所表达的祀蛋白的大量降解并且需要极大的资本投资。
[0019] 本发明组合所有工艺，更具体地说针对如单克隆抗体的祀蛋白，通过首先使用能 够结合祀蛋白的色谱介质捕捉所表达的祀蛋白并且然后弃去营养介质和生物培养物；然后 洗涂祀蛋白和色谱介质的复合物并且最后洗脱，从而使用其中排放有生物反应器的单式下 游生物处理器获得祀蛋白的高度纯化形式。
[0020] 本发明利用许多能够大量结合祀蛋白的树脂的新近可用性。大多数现代树脂每毫 升树脂将结合20mg到125mg的祀蛋白。该些树脂中的多数对祀蛋白具有高度特异性并且其 中多数可W合并W通过简单的物理化学结合工艺从溶液中移出任何类型和数量的祀蛋白， 所述结合工艺强到足W在从生物反应器去除营养介质的同时保持祀蛋白与树脂连接。所述 技术在祀蛋白纯化领域中也有了巨大进展，其中我们现在具有更好的能力通过调节洗脱缓 冲液的抑、离子强度或其它特征来破坏树脂与祀蛋白之间的结合，从树脂洗脱该些结合祀 蛋白。该允许W高度浓缩的溶液形式从生物反应器移出祀蛋白，所述高度浓缩的溶液已准 备好进一步纯化并且在一些情况下其甚至可W是供使用的最终产物。
[0021] 亲和色谱法是基于分子构象的分离技术，其常常利用应用特异性树脂。该些树脂 具有连接到其表面的配体，其对有待分离的化合物具有特异性。最经常地，该些配体W类似 于抗体-抗原相互作用的方式起作用。配体与其祀化合物之间的该种"锁与钥匙"配合使 其具有高度特异性。
[0022] 许多膜产品是糖蛋白并且可W通过凝集素亲和色谱法纯化。可W使清洁剂溶解产 品结合到已经改性W具有共价连接的凝集素的色谱树脂。
[0023] 免疫亲和色谱树脂采用抗体与祀蛋白的特异性结合W选择性地纯化祀蛋白。所述 程序涉及将抗体固定到柱材料，所述柱材料然后选择性结合祀蛋白，而一切别的东西流动 通过。
[0024] 树脂结合技术的一些现有技术水平包括：
[00巧]a.诺维信（Novozymes)的新专利双重亲和多肤技术平台用类似的但一次性技术 替换蛋白A工艺步骤。
[0026] b.来自密理博公司（Millipore Co巧.）的刺激反应性聚合物能够复合并操控祀 蛋白并且允许控制聚合物与祀蛋白复合物的可溶性，该导致在无离也机或蛋白A介质的情 况下直接捕捉产物。
[0027] C.用于替换传统的蛋白A和离子交换的混合模式吸附剂，用于提高选择性和能力 并且降低滞留时间。该些具有新颖化学性质的介质包括疏水电荷诱导色谱，例如MEP和来 自帕尔公司（Pall Corp.)的 Q 与 S HyperCel。
[0028] d.整料，包括呈单件均匀柱形式的色谱介质，例如来自BIA分离炬IA S巧arations)的对流作用介质整体柱。
[0029] e.模拟移动床，包括多柱逆流色谱，例如来自培邦生物系统（Ta巧on Biosystems) 的 BioSMB。
[0030] f.蛋白G(多个供应商）。
[0031] g. IgG的单域骆驼衍生（骆驼科动物）的抗体，例如来自BAC的Cap化reSelect。
[0032] h.新的无机配体，包括合成染料，例如来自普洛梅特生物科学（Prometic Biosciences)的 Mabsorbent A1P 和 A2P。
[0033] i.扩展床吸附色谱系统，例如来自厄普弗朗特色谱化时ront化romatography) 的Miobust平台。
[0034] j.来自兹克罗分离狂ir化rom S巧arations)的超耐久氧化铅结合亲和配体色谱 介质。
[0CK3日]k.来自泰克诺格（Tecnoge)的化受体模拟配体。
[0036] 1.来自奈莎膜技术（Nysa Membrane Technologies)的 ADSEPT (先进分离技术）。
[0037] m.来自药物纯化技术（Pure化arm Technologies)的膜亲和纯化系统。
[0038] n.来自普洛梅特生物科学、戴克斯值yax)等用于亲和色谱法的专口设计的肤配 体。
[003引 0.涂有蛋白A和蛋白G的磁珠，例如来自茵维特罗根化vitrogen) /戴诺 值ynal)。
[0040] P.得到罗氏（Roche)(基因泰克（Genentech))许可的基于碑1蛋白或MAb的表达为 具有对色谱介质具有亲和力的可移动的部分（标签）（例如组氨酸标签）的融合祀蛋白的 新的亲和纯化方法。
[0041] q.开发过程中的蛋白A替代物，包括反胶束（脂质体）、液体营养介质萃取系统、 结晶、固定化金属亲和色谱和新颖的膜色谱系统。
[0042] r.来自通用电气医疗集团师Healthcare)的具有一次性组分的即插即用解决 方案（例如，ReadyToProcess)、具有实验设计能力的工艺开发AKTA和多柱连续捕捉。
[0043] 出人意料的是，虽然已经在设计可用W捕捉祀蛋白的树脂方面取得了重大进展， 但是一直W来该些仅用于下游纯化处理。向祀蛋白和宿主细胞的粗混合物中添加树脂将无 异于教示首先浓缩营养介质并且然后在所有杂质都在所述营养介质中的情况下将其加载 到柱上的当前实践。
[0044] W产生Img/血祀蛋白并且所用树脂的结合能力是50mg/血的细胞系为目标，当操 作1000L生物反应器时，该将需要2化树脂。适用于制造单克隆抗体的树脂的成本可在每 升例如蛋白A$15-$20, 000的范围内。因此，大多数制造者将宁可使用更小数量的树脂执行 若干次批量的纯化。然而，考虑到该些可W使用数百次，使用成本容易摊销并且避免了制备 次批量过程中的兀长乏味和调节障碍。
[0045] 可W根据本发明处理的生物组分描述在W下各段中并且包括（但不限于）来源于 W下来源的细胞培养物：例如动物（例如，仓鼠、小鼠、猪、兔、狗、鱼、邮、线虫和人类）、昆虫 (例如蛾和蝴蝶）、植物（例如，藻类、玉米、番茄、水稻、小麦、大麦、首荐、甘藏、大豆、马铃 墓、窝宦、羽扇豆、烟草、油菜巧（芥花）、向日葵、宪菁、甜菜甘藏糖蜜、种子、红花和花生）和 人类。唯一的要求是所用生物培养物应该通过在营养介质中分泌祀蛋白来表达祀蛋白，与 在一些情况下形成包涵体截然相反。

【具体实施方式】
[0046] 本发明提供一种将多个预验证较小规模的生物反应器连接到下游生物处理装置 的方式，所述生物处理装置固持能够结合生物反应器的营养介质中的祀蛋白的色谱介质W 备收集。营养介质和生物培养物允许进入下游生物处理装置，引起色谱介质向上漂浮并且 由此建立扩展床色谱系统。在本发明中提供对经典扩展床色谱的显著改性，其中色谱树脂 保持在整个容器中均匀分布的连续状态，容器例如圆筒，其固持营养介质、生物培养物和色 谱介质。该种改性对下游生物处理装置的成功W及对无人值守式和自动地操作所述装置是 至关重要的。
[0047] 随着营养介质和生物培养物上升到下游生物处理装置的顶部，该些物质流出而色 谱介质固持在下游生物处理装置中，因为在下游生物处理装置中安装了过滤器；过滤器的 孔隙度小于色谱树脂的大小（一股来讲50微米到300微米）。通过祀蛋白的结合能力的先 前实验准确计算色谱介质（例如蛋白A树脂）的数量，可W确保整个数量的祀蛋白结合到 色谱介质。然而，充分地认识到需要一定的反应时间来发生结合，因此必须小也地控制营养 介质从生物反应器进入下游生物处理装置的流速；用于校正流速的一种测试是测量到达下 游生物处理装置的顶部并且倾析的营养介质中的重组产物浓度。连续监测祀蛋白的浓度将 允许调节流速。一股来讲，流出的营养介质不应该含有超过进入浓度的1%的祀蛋白；对进 入的营养介质进行采样并且将其用作参考同时将离开装置的营养介质处理为测试顶目，判 定该点。只有当进入和出去介质之间的浓度比是1 : 100时，才允许营养介质流过；一股来 讲，截止范围将是1 : 100到2 : 100,从而保存最大数量的祀蛋白并且提供最高的装置效 率。
[0048] 在整个营养介质和生物培养物从多个生物反应器移出并且穿过下游生物处理装 置之后，在底部出口密封生物反应器。通过装置底部的入口添加洗涂缓冲液洗涂下游生物 处理装置中的祀蛋白-介质复合物并且允许从顶端流出直到移出预定层残渣为止。然后接 着引入洗脱缓冲液W破坏介质与祀蛋白之间的结合，通过使洗脱缓冲液穿过底端并且收集 通过上端的纯祀蛋白溶液或通过使色谱介质在下游生物处理装置中沉降下来并且使洗脱 缓冲液穿过压实的色谱介质床并且收集通过底端的纯祀蛋白溶液。
[0049] W上发明W该样的方式操作，其中仅使用重力流，通过将下游生物处理装置的入 口端口放置在生物反应器出口端口层的下方，将营养介质从生物反应器转移到下游生物处 理装置。将生物反应器放置在下游生物处理装置周围并且使用相同长度的连接管可W均匀 地维持遍及多个生物反应器的流速。显然，存在许多用于输送营养介质到下游生物处理装 置的机械构件，并且该些机械构件包括使用同样可W适用的各种粟。然而，重力的使用确保 转移工艺期间祀蛋白的降解降到最低。

【专利附图】

【附图说明】
[0050] 图1显示所主张的下游处理装置的截面侧视图。
[0051] 所主张的装置具有其最佳操作所需的许多独特并且特殊的特征。其包含圆筒1，充 当营养介质的主要处理空间的圆柱形硬壁容器；和从多个生物反应器进入圆筒1的生物培 养物2。圆筒1的体积在一些情况下出于一种原因是重要的并且在另一种情况下出于另一 种原因是重要的。当对其进行操作W执行为扩展床色谱系统，从而捕捉并且纯化祀蛋白时， 圆筒1的高度对于随着营养介质向上流过柱色谱树脂3有足够的停留时间来说很重要。圆 筒1的体积最佳是圆筒1中的色谱树脂3的体积的至少1. 5倍到3倍。一股来讲，圆筒1 的直径和其高度的最佳关系还将从祀蛋白与色谱树脂的结合效率的简单研究来建立；该些 研究是特异性结合反应并且尽管树脂的结合能力可W是已知的，但是结合率将取决于许多 因素，包括允许接触的时间、营养介质的温度和营养介质的揽动情况。应该意识到所主张的 装置提供一种用于使祀蛋白结合到色谱树脂的扩展色谱柱；允许结合的时间越长，结合程 度将越高；然而，柱高度的物理限制和如下文关于祀蛋白的纯化所论述的其它考虑因素将 限制所用圆筒1的高度。
[0052] 通过提供多孔结构小于色谱树脂3个的直径的底部过滤器4将色谱树脂3滞留在 圆筒1中；所述多孔结构一股来讲应该是50微米到300微米；请注意在典型色谱制备型柱 中，使用通常需要施加压力或需要非常长的时间使缓冲液穿过色谱树脂床的非常细的过滤 器。通过底盖5将底部过滤器4保持在适当的位置，所述底盖可W移开W便完全cGMP清洁 装置W及移出色谱介质3,所述色谱介质再使用。底盖5具有底部液体端口 6,其一股来讲 将在顶盖的中也中；底部液体端口 6具有底部采样端口 7,其又具有用于开始和停止营养介 质的流动的底部采样端口控制阀8和用于在采样之前去除生物培养物的过滤器9。底部液 体端口 6具有底部流量控制阀10,并且连接到充实室11，所述充实室具有多个端口 12和连 接到充实室端口 11中的每一个的控制阀13 ;充实室11能够连接到其它生物反应器和洗涂 或洗脱缓冲液的来源并且还用于使洗涂缓冲液或洗脱缓冲液离开装置。
[0053] 圆筒1的顶侧还设置有用于保持色谱树脂3的顶部过滤器14 ;通过顶盖15将顶 部过滤器14保持在适当的位置，所述顶盖具有至少一个上部液体端口 16,其连接到上部采 样端口 17和用于开始并停止营养介质的采样的上部采样端口阀18和用于在采样之前去除 生物培养物的过滤器19。上部液体端口 16连接到上部流量控制阀20,其然后排出营养介 质并且还用于在填充柱模式纯化方案中引入洗脱缓冲液。
[0054] 在圆筒1的内部安装螺旋体21，其通过螺旋轴22连接到放置在圆筒1外部的电动 机23 ;轴22穿过安装在顶部过滤器14的中也中的密封滚珠轴承24并且穿过顶盖15的中 也中的孔；螺旋轴22的底部安置在嵌入在底部过滤器4中的螺旋轴插口 25中；当螺旋体旋 转时，该有助于防止螺旋体摆动。
[0055] 螺旋体18是所主张的发明的关键要素；其形状是圆锥形，其中较大的叶片在底部 并且较小的叶片在顶部。因为使用螺旋体的目的是提供液体向上的层流运动，所W在底部 与在顶部的叶片的直径比是关键。最佳地，底部叶片将覆盖圆筒1的直径的约80%并且顶 部叶片将是圆筒1的直径的约20%。当W介于Irpm到20rpm范围内的缓慢速度旋转时，其 W保持营养介质层流的扫描移动引起营养介质从底部到顶部的温和运动。该通过保持营养 介质均匀地息浮在整个圆筒中产生新颖的色谱树脂流化床。没有该种特征，树脂与祀蛋白 之间的接触效率降到最低并且捕捉祀蛋白的效率降低。随着色谱树脂与祀蛋白变得饱和， 该变得更加重要。该种创新元素提供一种完全饱和色谱树脂同时维持营养介质的快速流动 的方法。
[0056] 维持圆筒中的雷诺数巧巧nolds number ;Re)小于10, 000很重要；该个数值由揽 拌容器中的密度、粘度、揽动器的直径、揽动器的转速（rpm)该五种因素通过W下方程式确 定：
[0057] Re = [(pND2)/u ]，其中P是密度并且y是粘度；ND是速度，D是直径并且 N是转速（RPMKR.K.辛诺特化K. Sinnott)库尔森和理查森的化学工程（Coulson & Richardson' s Chemical Engineering)，第 6 卷：化学工程设计（Chemical Engineering Desi即），第4版（己特沃斯-海涅曼炬utterworth-Heinemann))第473页]。
[0058] 圆筒1具有用于保持营养介质在最佳温度的附加的加热或冷却构件26 ;值得注意 的是，所主张的装置提供营养介质的连续流动但流速是较慢的速度并且因此有可能维持一 定温度，给出与圆筒1的壁的热交换的标准系数。描述各种方法并且所述方法包括使用夹 套圆筒1、用加热或冷却毯包裹圆筒1、当目的是加热内含物时使圆筒暴露于红外灯W及在 本领域中普遍地可用的许多其它装置。
[0059] 所主张的装置竖直地放在支座27上，所述支座一股是环架但将研究适合于将所 主张的装置牢牢地放置在竖直位置的任何其它构件。值得注意的是，所主张的发明采用将 营养介质从生物反应器转移到所主张的装置的重力流方法；出于该个原因，支撑构件26应 该具有该样的机械性质，其将允许所主张的发明安置在低于生物反应器的最低部分的那一 层，营养介质从生物反应器的最低部分移出并且转移到所主张的发明。
[0060] W上在图中所描述的祀蛋白收集和纯化装置一股在生物反应器周期结束时使用， 其中多个生物反应器同时连接到所主张的装置。每一个装置中所含色谱介质的量将通过祀 蛋白的结合效率容易地计算。举例来说，蛋白A色谱介质显示30mg/mL到50mg/mL色谱介 质的结合。假定在2,00化生物反应器中使用1，00化营养介质并且生产周期已经结束，CH0 不再产生足够数量的祀蛋白的时刻。进一步假定重组细胞系的生产力是约1G/L ;因此，在 此情况下，将在营养介质溶液中移出并且纯化约1000G祀蛋白。
[0061] 在理论的基础上，假定结合下端是30mg/mU将需要约3化色谱介质来结合溶液中 实质上所有的祀蛋白。应该注意到，虽然蛋白A对单克隆抗体具有相当大的特异性，但是有 可能色谱介质的结合能力将由于营养介质中其它组分的结合而受损。该可W容易地通过W 下加 W研究：抽取小体积的营养介质并且向其中添加递增量的所用色谱介质直到溶液中祀 蛋白的浓度达到预定低值为止。该将称作滴定营养介质。
[0062] 本发明合并多个生物反应器的处理，举例来说，如上所述，每一个需要3化体积的 蛋白A来纯化祀蛋白。假定合并五个生物反应器的内含物，该将需要16化色谱树脂并且 考虑到应该是主要固持容器体积的至少两倍，将需要23化来处理500化营养介质；合并 500化介质的传统系统将在500化容器中合并单独的体积，该是一种昂贵的练习。实际上， 在本发明中所需要的全部就是小于10%所述大小的容器。
[0063] 在W上实例中使用本发明，将允许营养介质从若干个生物反应器进入所主张的装 置的主容器中，在所述容器中，随着营养介质从底部上升通过过滤盘，祀蛋白将结合到色谱 树脂，所述过滤盘截留色谱介质W免离开容器；在顶部的另一个过滤器将介质截留在顶端。 成功捕捉步骤的关键是允许流动营养介质处于允许最佳结合的速率。温和混合是本发明到 关键并且该通过推动营养介质向上的螺旋叶片的新颖设计来提供。
[0064] 最佳处理将从营养介质移出实质上所有祀蛋白；为了确保该一点，本发明引入自 动化系统，其控制安装在装置两端的流量控制阀；双重采样方法，其中对进入的营养介质和 出去的营养介质连续采样并且使用进入的营养介质作为标准，容易计算流出所述装置并且 弃去的营养介质中祀蛋白的数量。如果所排出的液体中祀蛋白的浓度上升，那么关闭阀口 并且将营养介质截留在主容器中直到达到完全结合为止。假设大量营养介质流出，那么本 发明中所述的自动化系统允许自动化操作，该是大规模商业制造的关键要求。
[0065] 本发明引入自动处理批量的系统，其中在营养介质的入口点和出口点该两个点连 续地测量祀蛋白的浓度；使样品首先通过截留任何生物培养物的过滤器过滤W降低息浮粒 子的干扰。使用入口点的营养介质作为参考样品并且出口点的营养介质充当分光光度检 测装置中的样品。检测技术在现有技术中普遍可获得并且不是所主张的。（M.H.西莫尼 安（M.H.Simonian),分光光度测定蛋白质浓度（Spectro地otometric determination of protein concentration),细胞生物学实验室指南（Qirr. Protocol. Cell Biol),附录 3b, 2002)。使用在280皿A(280)和205皿A(205)测量的吸光度，通过与参考比较来计算蛋 白质浓度；但在本发明中，目的不是测量浓度而是参考与标准之间的相对浓度。考虑到介 质中将存在溶解的杂质和溶菌液和不纯蛋白质，可W使用A(280)和A(205)方法。可W使 用光谱英光计或滤光英光计来测量样品溶液的固有英光发射；将该个值与参考溶液的发射 进行比较W确定相对浓度。存在两种比色方法：布拉德福比色法炬ra壯ord colorimetric method),基于染料考马斯亮蓝（Coomassie brilliant blue)与相关蛋白的结合；和劳里法 (Lowry method),其测量蛋白质样品中酪氨醜基残基的比色反应。然而，本发明不限制所用 检测方法的类型；在不断发展的蛋白质检测科学的情况下，有可能设计包括分光光度法、英 光测定法、红外或激光的一连串试验，从而提供营养介质中祀蛋白浓度的相对测量结果。
[0066] 在整个营养介质已经穿过容器之后，使用洗涂缓冲液来替换营养介质W在连续的 基础上洗掉色谱树脂，在此之后，W类似方式引入洗脱缓冲液W在穿过顶部液体端口的流 出物中收集经纯化祀蛋白溶液。然而，若干种其它纯化方法可用于在同一装置设计内使用。 其中一种需要使洗脱缓冲液停留在容器中持续一段时间W允许色谱介质与祀蛋白之间的 结合完全分解并且然后去除穿过底部液体端口的洗脱缓冲液。或者，可W从底部液体端口 排出洗涂缓冲液并且当洗脱缓冲液可W通过顶部液体端口引入时，使色谱树脂沉降下来作 为填充柱，并且允许洗脱缓冲液W单一缓冲液形式或W梯度洗脱缓冲液形式穿过色谱树脂 床，W收集洗脱缓冲液的各个部分并且合并含有最高浓度和最少杂质的部分，从而得到最 终处理产物。
[0067] 在第一实施例中，本发明提供一种符合U. S. FDA CFR 21定义合并若干个次批量W 产生大的单一批量的方法，通过允许使用更小的生物反应器降低生产成本，降低较大批量 变坏的风险并且消除具有若干种大小的生物反应器W及用于混合若干个生物反应器的内 含物的较大容器的资金成本。该种新颖方法使甚至小型公司都可能W最低的资金和运作成 本开发并制造大商业规模批量。
[0068] 本发明排除了在产生较大数量的祀蛋白时安装较大生物反应器的需求。通过允许 多个生物反应器的内含物在进入所主张的装置之前在充实室中混合来满足混合较小次批 量W制造较大批量的调节遵从性；其次，随着多个生物反应器的整个内含物穿过含有固定 数量的色谱树脂的所主张的装置，所捕捉的祀蛋白W更小的体积量构成单一批量并且由此 减少了与处置大容器相关的问题。
[0069] 在第二实施例中，本发明提供一种在收集祀蛋白的过程中避免若干个步骤的方 法，包括分离细胞、减小营养介质的体积并且加载色谱柱，所有该些实质上都增加了设备的 资金成本、设备的运作成本、用于完成该些步骤和引起祀蛋白降解所需的兀长时间。在本发 明中，含有宿主细胞和祀蛋白的营养介质用装置中所含的将结合所有或实质上所有带电或 不带电分子物质的色谱介质或色谱介质的组合经历非特异性或特异性处理，该个步骤之后 是通过用洗涂缓冲液简单地洗涂色谱介质-祀蛋白复合物，从所述复合物去除细胞和其它 组分的残渣。
[0070] 本发明由此排除了在收集产物过程中的主要障碍，所述障碍涉及使用细滤器滤出 不大于5 y的宿主细胞，从而截留例如中国仓鼠卵巢细胞等宿主细胞。当使用大体积介质 时，该个工艺耗费非常长的时间，增加了过滤器、粟、容器和空间管理的巨大成本。该个步骤 然后一股接着浓缩步骤，在浓缩步骤中，使用错流或微滤工艺，将营养介质的体积最多减少 到其体积的十分之一，该耗费非常长的时间来完成并且再次增加了设备和人力的巨大成本 并且在一些情况下引起祀蛋白降解。
[0071] 本发明将该两个步骤合并成一个简单步骤。争论是如果打算从含有宿主细胞的复 合物混合物收集并浓缩祀蛋白，那么为何从混合物移出祀蛋白而不是去除W大得多的数量 存在的其它组分不是更有效。将此视为逆向教示。
[0072] 在本发明中，采用祀蛋白的那些特有的特征W通过与色谱介质或色谱介质的混合 物的非特异性结合而将它们与混合物的其余部分分离。显然，该样非特异性捕捉祀蛋白还 将捕捉混合物的其它组分并且仅仅需要使用更大数量的色谱介质或可W具有对祀蛋白的 特异性亲和力的特定类型的色谱介质。祀蛋白-色谱介质复合物的移出是比宿主细胞的 移出或混合物体积的减少简单得多的工艺；将研究任何机械工艺，例如倾析、离也或甚至过 滤。值得注意的是，所有工艺当中最慢的将是过滤但可W使用甚至非常大孔径的过滤器并 且因为目的是收集滤液，不是洗脱液，所W大大降低了制造成本。
[0073] 在第H实施例中，本发明允许使用扩展床色谱系统在捕捉祀蛋白的相同容器中纯 化祀蛋白。扩展床色谱系统允许所主张的装置的连续操作，提供自动化控制，从而W无人值 守式操作获得捕捉和纯化的最高水平。
[0074] 本发明还可W使用混合床色谱介质，其可W含有离子色谱介质、疏水性色谱介质 和亲和色谱介质，所有该些一起使用来优化收集效率。良好确立了离子色谱介质的使用由 于电离的对数性质因而不允许完全捕捉产物；本发明中所用的色谱介质的组合允许祀蛋白 的更完全回收。
[0075] 在第四实施例中，本发明允许使用标准柱纯化和梯度洗脱曲线W及逐步洗脱曲线 纯化祀蛋白；在该个比较中，所主张的发明类似于常规色谱柱起作用，具有其所有的限制但 是没有加载柱的兀长步骤。
[0076] 在第五实施例中，本发明教示用于将生物反应器的内含物转移到所主张的装置的 重力流方法；该种方法使得对祀蛋白的应力相比于按惯例使用蠕动粟时大大减少，并且因 此提高了生产产率。
[0077] 在第六实施例中，本发明教示在优选地包含圆锥螺旋体的装置中使用新颖混合组 分，所述螺旋体推动液体内含物向上同时维持液体的层流，降低对祀蛋白的应力并且还有 助于维持色谱介质的完整性；没有现有掲示内容使用混合系统用于色谱系统。
[0078] 上述实施例不W任何方式包含可能使用本发明的所有实施例并且本领域的普通 技术人员将发现许多其它的特定针对于复杂工艺的应用或甚至应用于该类需要可能不是 立即显现的那些工艺中。
[0079] 不存在关于使用色谱介质来收集祀蛋白的现有技术；阿罗拉（Arora)等人的在 2007年12月11日颁布的美国专利7306934教示多孔固体离子交换晶片的用途，其用于固 定生物分子，所述晶片包含含有+2价过渡金属阳离子的生物分子捕捉色谱介质的组合；其 还教示一种分离性生物反应器，其包含阳极和阴极、多个反应室，所述反应室中的至少一些 由多孔固体离子交换晶片（上述）形成，所述晶片具有生物分子捕捉色谱介质与离子交换 色谱介质的组合并且具有固定在所述生物分子捕捉色谱介质上的基因工程化标记的生物 分子，所述多孔固体离子交换晶片中的每一者内插在阳离子交换膜与阴离子交换膜之间， W及在阳极与阴极之间提供电势的机构。本发明显著不同于由阿罗拉教示的分离性生物反 应器。首先，本发明并不需要使用电极、具有+2价过渡阳离子的色谱介质或固定化金属离 子亲和色谱法。邸I (电去离子）的使用和标签的特殊使用W及用W去除捕捉的产物（主要 酶）的溶剂的限制性性质使得此专利的教示内容明显不同于本发明。此外，阿罗拉专利添 加了硬件，该增加了处理产物纯化的成本，而本发明将若干个工艺组合成一个而无需添加 任何新的成本要素。
[0080] 使用扩展床色谱来纯化祀蛋白的想法在现有技术中是已知的，例如美国专利 7, 608, 583,其教示使用扩展床色谱来纯化膜岛素。本发明的新颖方面是将扩展床色谱原理 与一种工艺组合，所述工艺合并多个生物反应器的内含物、捕捉并且纯化祀蛋白。然而，向 传统色谱法提供多功能性需要若干种创新修改，包括一种将柱中的色谱树脂截留在两个末 端的方法、一种混合色谱柱中的内含物的构件和一组允许使用逐步和梯度洗脱的端口和控 制件。
[0081] 本文所引用的所有参考文献，包括公开、专利申请和专利特此W引用的方式并入， 其引用程度就如同每一个参考文献单独地并且特定地指示为W引用的方式并入并且全文 阐述于本文中一股。
[0082] 除非本文另外指示或明显与内容相矛盾，否则在描述本发明的内容中（尤其在所 附权利要求书的内容中）使用术语"一（a/an)"和"所述"和类似指示物应理解为涵盖单数 与复数。除非另外指出，否则术语"包含"、"具有"、"包括"和"含有"应理解为开放式术语 (即，意指"包括（但不限于）"）。除非本文另外指示，否则本文中值范围的叙述仅打算充 当个别提及属于所述范围内的每个独立值的速记方法，并且每个独立值并入本说明书中， 如同在本文中个别地叙述一股。除非本文另外指示或另外明显与内容相矛盾，否则本文所 述的所有方法都可W按任何合适的顺序进行。除非另外主张，否则本文中所提供的任何和 所有实例或例示性语言（例如，"例如"）的使用仅打算更好地阐明本发明并且不对本发明 的范围施加限制。本说明书中的任何语言都不应该理解为指示实施本发明所必需的任何未 主张要素。
[0083] 本发明的优选实施例描述于本文中，包括本发明人已知的进行本发明的最佳模 式。在阅读前文描述之后，那些优选实施例的变化对于本领域普通技术人员可W变得显而 易见。本发明人期望熟练的业内人±适当时采用此类变化，并且本发明人打算W不同于本 文中特定描述的其它方式来实施本发明。因此，本发明包括适用法律所允许的随附权利要 求书中所引述的主题的所有修改和等效物。此外，除非本文另外指示或另外明显与内容相 矛盾，否则本发明涵盖上述要素 W其所有可能的变化形式的任何组合。
【权利要求】
1. 一种下游处理装置，其用于汇集、收集并且纯化靶蛋白，所述装置包含： a. 具有顶部开口、底部开口的容器，其中所述容器适用于固持营养介质、生物培养物和 色谱介质； b. 覆盖所述容器的所述顶部开口的顶部过滤器和覆盖所述底部开口的底部过滤器，所 述过滤器能够截留所述色谱介质； c. 可移动的顶盖，其用于将所述顶部过滤器固定在适当的位置并且进一步包含至少一 个顶部液体端口和顶部流量控制阀； d. 连接到所述顶部液体端口的顶部采样端口，其进一步包含顶部采样端口阀和能够去 除所述生物培养物的过滤器； e. 可移动的底盖，其用于将所述底部过滤盘固定在适当的位置并且进一步包含底部液 体端口、底部流量控制阀和充实室，所述充实室具有多个液体端口和关闭并打开所述液体 端口的构件； f. 连接到所述底部液体端口的底部采样端口、底部采样端口阀和用于去除所述生物培 养物的过滤器； g. 混合设备，其能够保持所述色谱介质均匀地悬浮在整个所述容器中；以及 h. 所述容器的立式支座。
2. 根据权利要求1所述的下游处理装置，其进一步包含加热元件、冷却元件、至少一个 用于测量所述容器的内含物的浊度的装置和/或用于测量所述容器的所述内含物的温度 的传感器。
3. 根据权利要求1或2所述的下游处理装置，其进一步包含自动控制以下的电子构 件： a. 响应于在所述顶部和所述液体端口中的所述靶蛋白的浓度比打开和关闭所述底部 流量控制阀； b. 所述加热和冷却元件； c. 所述容器的响应于所述营养介质的温度的所述内含物；和/或 d. 响应于所述容器中的浊度的测量结果的差异控制所述混合构件的强度。
4. 根据权利要求1到3所述的下游处理装置，其中所述容器是圆筒。
5. 根据权利要求1到4所述的下游处理装置，其中所述容器包含塑料、金属或玻璃。
6. 根据权利要求1所述的下游处理装置，其中所述容器是一次性的。
7. 根据权利要求1所述的下游处理装置，其中所述容器是柔性的并且容纳在刚性容器 内部。
8. 根据权利要求1所述的下游处理装置，其中所述容器具有介于所述容器中所固持的 所述色谱介质的体积的1. 5倍到3倍范围内的内体积。
9. 根据权利要求1所述的下游处理装置，其中所述顶部过滤器和所述底部过滤器两者 包含通过刚性多孔结构、刚性陶瓷板或多孔塑料隔板支撑的柔性塑料或金属网。
10. 根据权利要求1所述的下游处理装置，其中所述顶部过滤器和所述底部过滤器两 者具有介于50微米到300微米范围内的多孔结构。
11. 根据权利要求1所述的下游处理装置，其中所述混合设备包含通过在所述容器外 部的磁场源操作的水平安置的磁性搅拌器。
12. 根据权利要求1所述的下游处理装置，其中所述混合设备是通过在所述容器外部 的电动机驱动的中心旋转踏板、涡轮机或螺旋桨。
13. 根据权利要求1所述的下游处理装置，其中所述混合设备包含坚直安置在所述容 器中并且尖端朝上的圆锥螺旋叶片，并且轴的下端支撑在所述底部过滤器的中心中的插口 中并且所述轴的上端在穿过在所述顶部过滤器的中心中的密封滚珠轴承和所述顶盖之后 连接到外部电动机。
14. 根据权利要求13所述的下游处理装置，其中所述螺旋叶片的基底的直径介于所述 容器的直径的80%到95%的范围内并且所述螺旋叶片的所述尖端的直径介于所述容器的 直径的10%到25%的范围内。
15. 根据权利要求13所述的下游处理装置，其中所述螺旋体以lrpm到20rpm的速度旋 转并且沿着将所述容器的所述内含物以层流模式从底部移动到顶部的方向操作。
16. 根据权利要求2所述的下游处理装置，其中所述用于测量所述容器中的所述营养 介质的浊度的传感器至少一个安置在所述顶部过滤器下方并且至少一个安置在所述底部 过滤器上方，并且调节所述混合构件的强度以在所述容器中获得均匀浊度。
17. 根据权利要求1所述的下游处理装置，其中所述立式支座包含环架、吊钩、挂钩或 平坦表面。
18. 根据权利要求1所述的下游处理装置，其中所述色谱介质包含能够结合靶蛋白的 树脂。
19. 根据权利要求18所述的下游处理装置，其中所述树脂包含离子交换树脂、疏水性 树脂、亲和树脂或其混合物。
20. 根据权利要求18所述的下游处理装置，其中所述树脂包含蛋白质或肽作为配体。
21. 根据权利要求18所述的下游处理装置，其中所述树脂具有针对靶蛋白的特异性亲 和力。
22. 根据权利要求1所述的下游处理装置，其中所述色谱介质包含多种树脂。
23. 根据权利要求1所述的下游处理装置，其中所述充实室能够通过重力流从多个来 源接收所述营养介质和缓冲液。
24. 根据权利要求2所述的下游处理装置，其中所述加热和/或冷却元件包含包裹在所 述容器周围的电阻加热元件、包裹在所述容器周围的液体冷却或加热护套、经放置以包围 所述容器的加热或冷却箱、与所述容器紧密邻近放置的红外灯或将加热或冷却空气吹到所 述容器上的风扇。
25. 根据权利要求2所述的下游处理装置，其中在所述顶部采样端口和所述底部采样 端口中的所述靶蛋白的浓度比在1 : 100到2 : 100之间的范围内。
26. -种用于汇集、收集并纯化在多个生物反应器的营养介质中表达的靶蛋白的方法， 其包含： a. 提供根据权利要求1到25所述的下游处理装置； b. 使所述下游处理装置定位在使所述顶部液体端口在营养介质或缓冲液的多个来源 的最低层的下方的高度； c. 关闭所述底部流量控制阀； d. 将所述充实室的所述液体端口连接到含有所述营养介质的需要汇集、收集并且纯化 已经在所述营养介质中表达的重组蛋白质的多个生物反应器； e. 移开所述顶盖并且向所述容器中添加足以结合准备处理的所述营养介质中所存在 的基本上所有靶蛋白的量的色谱介质； f. 将所述顶盖放回原处并且打开所述顶部流量控制阀； g. 打开所述底部流量控制阀； h. 在重力压力下，起始所述营养介质从多个生物反应器穿过所述充实室进入所述容器 中的流动并且允许所述营养介质填充所述容器； i. 关闭所述底部流量控制阀； i.起始所述混合设备以获得所述色谱介质在所述容器中的均匀分布，如通过在所述容 器的顶部、中间和底部的所述传感器测量浊度并且通过所述电子构件自动调节所述混合构 件的速度以获得均匀浊度所指出； k. 如果需要，那么加热或冷却所述容器的所述内含物到预定水平，并且通过所述电子 控制构件自动维持所述营养介质中的所述预定温度； l. 将所述顶部采样端口连接到能够测量所述靶蛋白的浓度的分光光度计的测试连续 流动池并且将所述底部采样端口连接到对照连续流动池，并且当在所述顶部采样端口和所 述底部采样端口中的浓度比达到1 : 100时开启所述底部流量控制阀并且当所述比率达到 2 : 100时关闭所述底部流量控制阀； m. 允许所述电子控制构件打开并关闭所述底部流量控制阀并且维持营养介质从多个 生物反应器到所述容器中的流动并且允许所述营养介质从所述顶部液体端口流出并且弃 去所述营养介质直到所有生物反应器的内含物已经穿过所述容器为止； n. 关闭所述底部流量控制阀和所述充实室的所述液体端口并且从所述充实室断开所 述生物反应器； 〇.打开所述底部流量控制阀以允许所述容器中的所述营养介质通过所述充实室中的 未占用端口中的一者排放出去并且然后关闭所述端口； P.使所述充实室的所述液体端口连接到适用于洗掉所述容器中的任何残渣的洗涤缓 冲液的至少一个来源和能够破坏所述靶蛋白与所述色谱介质的结合的洗脱缓冲液的至少 一个来源； q. 起始所述洗涤缓冲液穿过所述充实室进入所述容器中的流动并且允许所述洗涤缓 冲液从所述顶部液体端口排放出去直到在所排出的洗涤缓冲液中达到预定最低水平的残 渔为止； r. 停止所述洗涤缓冲液的所述流动； s. 停止所述混合构件； t. 打开所述充实室中的所述未占用的液体端口中的一者以允许所述洗涤缓冲液从所 述容器排放出去并且关闭所述充实室的所述液体端口； u. 起始洗脱缓冲液穿过所述充实室的流动以填充所述容器并且关闭洗脱缓冲液到所 述充实室的流动； V. 关闭所述底部流量控制阀； W. 起始所述混合构件； X. 继续混合所述容器的所述内含物持续预定时间以允许完全破坏所述靶蛋白与所述 色谱介质之间的所述结合； y. 停止所述混合构件；以及 z. 打开所述底部流量控制阀和所述充实室中的所述未占用的液体端口中的一者并且 在预灭菌容器中收集所述洗脱缓冲液作为所述靶蛋白的经纯化浓缩溶液。
27. 根据权利要求26所述的方法，其中当相继使用一种以上洗涤缓冲液时，重复所述 步骤（P)到⑴。
28. 根据权利要求26所述的方法，其中当在逐步洗脱法中相继使用一种以上洗脱缓冲 液时，重复所述步骤（u)到（z)。
29. 根据权利要求26所述的方法，其中用以下步骤替换所述步骤（u)到（z):打开所 述底部流量控制阀；通过所述顶部液体端口以预定速率添加所述洗脱缓冲液；允许所述洗 脱缓冲液在重力流下穿过所述容器中的所述色谱介质；当其穿过所述充实室液体端口出现 时，以多个定时部分形式收集所述洗脱缓冲液；选择含有所述靶蛋白的最高浓度的部分并 且将它们汇集在灭菌容器中作为所述靶蛋白的经纯化浓缩溶液。
30. 根据权利要求29所述的方法，其中以梯度洗脱缓冲液形式引入所述洗脱缓冲液。
31. 根据权利要求27所述的方法，其中用以下步骤替换所述步骤（u)到（z):打开所述 顶部和底部控制阀；起始洗脱缓冲液通过所述充实室进入所述容器中的流动；起始所述混 合构件；允许所述洗脱缓冲液填充所述容器并且穿过所述顶部过滤器，并且收集在通过所 述顶部液体端口的所述洗脱缓冲液的流出物中的靶蛋白的经纯化形式；使所述洗脱缓冲液 的所述流动继续并且收集靶蛋白的经纯化形式直到所收集的洗脱缓冲液中的浓度达到预 定最低水平为止。
【文档编号】C07K1/16GK104395334SQ201380020287
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2013年2月21日 优先权日:2012年2月21日
【发明者】萨尔法拉茨·尼亚齐 申请人:医用蛋白国际有限责任公司