三烷基阳离子脂质及其使用方法
【专利摘要】本发明提供用于将治疗剂递送至细胞的组合物和方法。具体地说，这些包括新型三烷基阳离子脂质和提供有效包囊核酸并在体内将所述包囊的核酸有效递送至细胞的核酸-脂质颗粒。本发明的组合物为高度有效的，因此允许以相对低的剂量有效敲除特异性靶蛋白。
【专利说明】三烷基阳离子脂质及其使用方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年2月24日提交的美国临时申请61/602, 990的权益，所述临时 申请以引用的方式整体并入本文。
[0003] 发明背景
[0004] I.发明领域
[0005] 本发明涉及新型三烷基阳离子脂质、包含一种或多种三烷基阳离子脂质的脂质颗 粒、制造脂质颗粒的方法以及递送和/或施用脂质颗粒（例如，用于治疗哺乳动物体内的疾 病）的方法。
[0006] II.相关技术描述
[0007] 治疗性核酸包括例如小的干扰RNA(SiRNA)、微小RNA(miRNA)、反义寡核苷酸、核 酶、质粒以及免疫刺激性核酸。这些核酸经由各种机理发挥作用。在干扰RNA分子如SiRNA 和miRNA的情况下，这些核酸可以通过称为RNA干扰（RNAi)的方法下调特异性蛋白的细胞 内水平。在将干扰RNA引入到细胞质之后，这些双链RNA构建体可以与称为RISC的蛋白质 结合。将干扰RNA的有义链从RISC复合体中置换出来，从而在RISC内提供可以识别并且 结合具有与结合的干扰RNA序列互补的序列的mRNA的模板。结合互补mRNA，RISC复合体 裂解mRNA并且释放裂解的链。RNAi可以通过靶向编码用于蛋白质合成的相应mRNA的特异 性破坏来提供特异性蛋白的下调。
[0008] RNAi的治疗应用极其宽泛，因为可以用针对靶蛋白的任何核苷酸序列合成干扰 RNA构建体。迄今为止，siRNA构建体在体外模型和体内模型中均已示出特异性下调靶蛋白 的能力。另外，siRNA构建体目前在临床研究中被评价。
[0009] 然而，干扰RNA构建体目前面临的两个问题为：第一，它们对血浆中的核酸酶消化 的易感性和第二，它们获得进入细胞内区室的受限制的能力，在所述细胞内区室中，当呈自 由干扰RNA分子系统施用时它们可以结合RISC。这些双链构建体可以通过在分子内掺入化 学修饰的核苷酸接头例如硫代磷酸酯（phosphothioate)基团来稳定。然而，此类化学修饰 的接头仅提供不受核酸酶消化的受限制的保护并且可降低构建体的活性。可以通过使用载 体系统如聚合物、阳离子脂质体或通过将胆固醇部分共价附接至分子有利于干扰RNA的细 胞内递送。然而，改进的递送系统需要增加干扰RNA分子如siRNA和miRNA的效力并且减 少或消除对化学修饰的核苷酸接头的需要。
[0010] 另外，在治疗性核酸如干扰RNA穿过细胞膜的受限制的能力方面仍存在问题（参 见，Vlassov 等，Biochim.Biophys. Acta, 1197:95-1082(1994))并且在与系统毒性相关 的问题中仍存在问题，如补体介导的过敏反应、凝血性质改变以及血细胞减少（Galbraith 等，Antisense Nucl. Acid Drug Des. ,4:201-206(1994))。
[0011] 为了试图改进功效，调查研究者还采用基于脂质的载体系统来递送化学修饰的 或未修饰的治疗性核酸。Zelphati等（J. Contr. Rel. ,41:99-119 (1996))描述了使用 阴离子（常规）脂质体、PH敏感脂质体、免疫脂质体、融合脂质体以及阳离子脂质/反 义聚集物。类似地，已以阳离子脂质体形式系统施用siRNA，并且已报道这些核酸-脂 质颗粒在哺乳动物包括非人灵长类动物体内提供革巴蛋白的改进的下调（Zimmermann 等，Nature, 441:111-114 (2006))。
[0012] 尽管有此进步，本领域仍存在对适用于一般治疗使用的改进的脂质-治疗性核酸 组合物的需要。优选地，这些组合物将高效率地包囊核酸，具有高药物：脂质比，保护包囊 的核酸免于在血清中降解和清除，适用于系统递送并且提供包囊的核酸的细胞内递送。另 夕卜，这些核酸-脂质颗粒应该是耐受良好的并且提供合适的治疗指数，使得在有效剂量的 核酸下的患者治疗与对患者的显著毒性和/或危险毫不相关。
[0013] 发明简述
[0014] 本发明提供了新型三烷基阳离子（氨基）脂质和有利于核酸的体内递送的包含这 些脂质的脂质颗粒、以及适用于体内治疗使用的核酸-脂质颗粒组合物。本发明还提供了 制造这些组合物的方法以及使用这些组合物将核酸引入到细胞中例如用于治疗各种疾病 病状的方法。本发明还包括本文公开的所有新型化合物和中间体。
[0015] 如在本文实施例2中所描述，在鼠ApoB siRNA测定中，本发明的三烷基阳离子脂 质比其它具有更长烷基链的相同脂质更有效。
[0016] 一方面，本发明提供了一种具有结构式（I)的阳离子脂质：
[0017] X-A-Y-Z ；
[0018] (I)
[0019] 或其盐，例如药学上可接受的盐，其中：
[0020] X为烧基氣基；
[0021] A为C1至C6任选取代的烷基，其中所述C1至C 6任选取代的烷基可为饱和或不饱 和的，并且其中A可能存在或可能不存在；
[0022] Y选自由以下组成的组：缩酮、酯、任选取代的氨基甲酸酯、醚以及任选取代的酰 胺；并且
[0023] Z为由三个烷基链组成的疏水部分，其中烷基链中的每一个的长度均为C8至C11, 其中三个烷基链中的每一个均可为饱和或不饱和的，并且其中三个烷基链中的每一个均为 任选取代的。
[0024] 相对于式（I)的脂质，烧基氣基的代表性实例包括-甲基氣基、-乙基氣基以及 乙基甲基氣基。
[0025] 再相对于式（I)的脂质，存在于氨基甲酸酯和/或酰胺基团上的任选取代基的代 表性实例为饱和或不饱和的烷基（例如，C 1-C6烷基）。
[0026] 再相对于式（I)的脂质，可以存在于疏水部分Z的三个烷基链中的一个或多个上 的任选取代基的代表性实例为羟基。
[0027] 再相对于式（I)的脂质，将理解在疏水部分Z的烷基链含有一个或多个双键或三 键时，则所述烷基链称为不饱和的。
[0028] 再相对于式（I)的脂质，为了避免怀疑将理解疏水部分Z的一个或多个烷基链可 以包括环烧基（例如，环丙基）。
[0029] 再相对于式⑴的脂质，将理解术语"酯"包括具有结构_C( = 0)0_或_0C(= 〇)-的酯。术语"酰胺"包括具有结构-C ( = 0) NR-或-NR ( = 0) C-的酰胺。术语"氨基甲 酸酯"包括具有结构-OC ( = 0) NR-或-NRC ( = 0)0-的氨基甲酸酯。
[0030] 式⑴的脂质例如有用于制造本发明的脂质颗粒，所述脂质颗粒例如有用于向有 需要的哺乳动物（例如，人类）递送治疗剂（例如生物活性的核酸分子，如siRNA)。
[0031] 在式⑴的脂质的一些实施方案中，Z具有下式：
[0032]
【权利要求】
1. 一种具有结构式（I)的脂质： X-A-Y-Z； (I) 或其盐，其中： X为烷基氨基； A为C1至C6任选取代的烷基，其中所述C1至C6任选取代的烷基可为饱和或不饱和的， 并且其中A可能存在或可能不存在； Y选自由缩酮、酯、任选取代的氨基甲酸酯、醚和任选取代的酰胺组成的组；并且Z为由三个烷基链组成的疏水部分，其中所述烷基链中的每一个的长度均为C8至C11, 其中所述三个烷基链中的每一个均可独立地为饱和或不饱和的，并且其中所述三个烷基链 中的每一个均为任选取代的。
2. 如权利要求1所述的脂质，其中所述烷基链中的每一个的长度均为C9至C1(l。
3. 如权利要求1所述的脂质，其中所述烷基链中的至少一个具有双键。
4. 如权利要求1所述的脂质，其中所述烷基链中的至少一个具有顺式双键。
5. 如权利要求1所述的脂质，其中所述烷基链中的至少一个包含环烷基部分。
6. 如权利要求1所述的脂质，其中X选自由二甲基氨基、二乙基氨基和乙基甲基氨基组 成的组。
7. 如权利要求1所述的脂质，其中A为存在的。
8. 如权利要求1所述的脂质，其中Y为酯或缩酮。
9. 如权利要求1所述的脂质，其中Y为任选取代的氨基甲酸酯。
10. 如权利要求1所述的脂质，其中Y为醚。
11. 如权利要求1所述的脂质，其中Y为任选取代的酰胺。
12. 如权利要求1所述的脂质，其中Z具有下式：
其中，R1、R2和R3各自独立地选自由C8至C11烷基组成的组，其中R1、R2和R3中的每一 个均可独立地为饱和或不饱和的，并且其中％、R2和R3中的每一个均为任选取代的。
13. 如权利要求1所述的脂质，其中所述脂质选自由以下组成的组： 化合物9、
化合物11、
化合物90。
14. 一种包含如前述权利要求中任一项所述的脂质的脂质颗粒。
15. 如权利要求14所述的脂质颗粒，其中所述颗粒进一步包含非阳离子脂质。
16. 如权利要求15所述的脂质颗粒，其中所述非阳离子脂质选自由磷脂、胆固醇或磷 脂和胆固醇的混合物组成的组。
17. 如权利要求16所述的脂质颗粒，其中所述磷脂包含二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC)、 二硬脂酰磷脂酰胆碱（DSPC)或其混合物。
18. 如权利要求16所述的脂质颗粒，其中所述胆固醇为胆固醇衍生物。
19. 如权利要求14至18中任一项所述的脂质颗粒，其中所述颗粒进一步包含抑制颗粒 聚集的缀合的脂质。
20. 如权利要求19所述的脂质颗粒，其中所述抑制颗粒聚集的缀合的脂质包含聚乙二 醇（PEG)-脂质缀合物。
21. 如权利要求20所述的脂质颗粒，其中所述PEG-脂质缀合物包含PEG-二酰基甘油 (PEG-DAG)缀合物、PEG-二烷氧基丙基（PEG-DAA)缀合物或其混合物。
22. 如权利要求14至21中任一项所述的脂质颗粒，其中所述颗粒进一步包含治疗剂。
23. 如权利要求22所述的脂质颗粒，其中所述治疗剂为核酸。
24. 如权利要求23所述的脂质颗粒，其中所述核酸为干扰RNA。
25. 如权利要求24所述的脂质颗粒，其中所述干扰RNA选自由以下组成的组：小的 干扰RNA(siRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、微小RNA(miRNA)、切酶-底物dsRNA、小发夹 RNA(shRNA)及其混合物。
26. 如权利要求25所述的脂质颗粒，其中所述干扰RNA为siRNA。
27. 如权利要求22所述的脂质颗粒，其中在37°C下于血清中孵育所述颗粒30分钟之 后，所述治疗剂基本上没有降解。
28. 如权利要求22所述的脂质颗粒，其中所述治疗剂被完全包囊在所述颗粒中。
29. 如权利要求22所述的脂质颗粒，其中所述颗粒的脂质：治疗剂质量比为约5:1至 约 15:1。
30. 如权利要求14至29中任一项所述的脂质颗粒，其中所述颗粒的中值直径为约 30nm至约 150nm。
31. -种包含如权利要求14至30中任一项所述的脂质颗粒和药学上可接受的载体的 药物组合物。
32. -种用于将治疗剂引入到细胞中的方法，所述方法包括：使所述细胞与如权利要 求14所述的脂质颗粒接触。
33. 如权利要求32所述的方法，其中所述细胞在哺乳动物体内。
34. -种用于体内递送治疗剂的方法，所述方法包括：向哺乳动物施用如权利要求14 所述的脂质颗粒。
35. 如权利要求34所述的方法，其中所述施用选自由口服、鼻内、静脉内、腹膜内、肌肉 内、关节内、病灶内、气管内、皮下和皮内组成的组。
36. 如权利要求34所述的方法，其中所述哺乳动物为人。
37. -种用于治疗有需求的哺乳动物体内的疾病或病症的方法，所述方法包括： 向所述哺乳动物施用治疗有效量的如权利要求14所述的脂质颗粒。
38. 如权利要求37所述的方法，其中所述疾病或病症选自由病毒感染、肝脏疾病或病 症以及癌症组成的组。
39. 如权利要求37所述的方法，其中所述哺乳动物为人。
【文档编号】C07C271/20GK104321304SQ201380020104
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2013年2月22日 优先权日:2012年2月24日
【发明者】詹姆斯·海斯, 马克·伍德, 阿兰·马丁 申请人:普洛体维生物治疗公司