人cd30配体抗原结合蛋白的制作方法

人cd30配体抗原结合蛋白的制作方法
【专利摘要】本发明提供了涉及人CD30L抗原结合蛋白的组合物和方法。本文所述的组合物包括：人CD30L抗原结合蛋白、编码人CD30L抗原结合蛋白的多核苷酸、包含这些多核苷酸的载体、宿主细胞和药物组合物。还提供了制备和使用这些组合物中每一种的方法。
【专利说明】人CD30配体抗原结合蛋白
[0001] 背景 CD30配体（CD30L、CD153) (CD30的天然存在的配体）为II型细胞膜糖蛋白，其特异 性结合⑶30,触发⑶30经由其细胞质结构域传输信号。⑶30和⑶30L为相互作用细胞 表面糖蛋白，其分别为TNFR和TNF超家族的成员（Durkop等人，68:421，1992; Smith等人，73:1349，1993;美国专利号 5, 480, 981; 5,677,430; 6, 143, 869 和 6, 652, 854)。⑶30和⑶30L的表达受限于免疫系统的细胞且受紧密调节。⑶30主要在活化 B细胞和具有活化/记忆表型的T细胞亚群上表达（Ellis等人，J 151:2380， 1993;Falini等人，财oot/，85:1，1995KCD30L在活化小鼠和人T细胞上大量表达(Shimozato等人，Biochem. &Biophys.Res.Comm., 256:519, 1999;Armitage,J. Tfegw/ators邊 4§卻^5，14:142, 2000)。当B细胞通过生发中 心（germinalcenter)运输时，⑶30L的相对基因表达发生显著变化（Klein等人，/^roc. 他己JcatZ5bi., 100:2639, 2003)。因此，B细胞上CD30L的表达可以是阶段和情 形特异性的。CD30L也似乎为存在于脾滤泡中的独特的小鼠树突状细胞样辅佐细胞群体的 标记，在脾滤泡中，T细胞与B细胞相互作用（Kim等人，J遞以18:643，2003)。
[0002] 表达⑶30/⑶30L的细胞之间的相互作用似乎对产生强T细胞依赖性继发性或 类别切换性抗体反应是重要的。所述作用的证据包括来自小鼠系统中的体外（Shanebeck 等人，及/r.JJ遞《//?〇乂，25:2147-53，1995)和体内（Gaspal等人，?JJ遞《//?〇乂， 174:3891-6，2005)研宄的数据。此外，已显示在多种T细胞和/或B细胞依赖性自身免疫 性疾病模型中，用针对小鼠CD30L的阻断型但非消耗型大鼠mAb对小鼠进行体内处理抑制 疾病的发展或进程（美国专利号6, 667, 039)。在具有强体液免疫组分的模型中，疾病抑制 与疾病相关抗体反应的抑制相关。
[0003] 因此，具有包含结合于CD30L的人抗体和/或抗原结合区的组合物对于用于治疗 性和诊断性应用中是有用的。
[0004] 发明概述 提供结合CD30L(尤其人CD30L)的抗原结合蛋白。人CD30L抗原结合蛋白可降低、抑 制、阻碍和/或调节至少一种与⑶30L/⑶30相互作用有关的生物学反应，且因此可用于改 善CD30L相关疾病或病症的影响。CD30L抗原结合蛋白可用于例如降低、抑制、阻碍和/或 调节CD30L/CD30相互作用。
[0005] 在一个实施方案中，提供结合⑶30L的C末端区域（包括AA201-234)的分离的抗 原结合蛋白。在一个其他实施方案中，提供抗原结合蛋白，其结合CD30L的C末端区域（包 括AA201-234)和位于胞外区的N末端部分的CD30L中的进一步区域（其由AA75-95界定）。 在本发明的其他实施方案中，抗原结合蛋白具有至少一种选自以下的性质：a)抑制CD30/ CD30L相互作用；b)抑制CD30L诱导的IL-8诱导作用；c)与抗体A-F中的一种交叉竞争结 合人CD30L;d)与人CD30L的解离常数为至多70pM和e)以实质上相同或更高的抗体A-F 中的一种的亲和力（较低KD)结合于人CD30L。可以如本领域技术人员已知测定亲和力（或 KD)，诸如通过SPR或通过FACS，如本文中的实施例4中所述。
[0006] 在一个其他实施方案中，抗原结合蛋白结合⑶30L，且与抗体A、B、C、D、E和F中 的一种或多种的Fab针对与CD30L的结合进行竞争。或者，所述抗原结合蛋白被表征为与 hCD30L的结合受抗体A、B、C、D、E和F中的一种或多种的Fab的结合所抑制的抗原结合蛋 白。在其他特定实施方案中，Fab是包括41、42、43、44、45和46中每一种的抗体八的？&13。
[0007] 在一个实施方案中，提供结合⑶30L的分离的抗原结合蛋白，其包含至少一个重 链可变区，所述至少一个重链可变区包含选自以下的⑶RH1、⑶RH2和⑶RH3 :a)与如表3中 所示的⑶RH1相差不超过4、3、2或1个氨基酸取代、插入或缺失的⑶RH1 ;b)与如表3中 所示的⑶RH2相差不超过7、6、5、4、3、2或1个氨基酸取代、插入和/或缺失的⑶RH2 ;c) 与如表3中所示的⑶RH3相差不超过11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸取代、插入和 /或缺失的CDRH3 ;和包含至少一个轻链可变区，所述至少一个轻链可变区包含选自以下的 ⑶RL1、⑶RL2和⑶RL3 :d)与如表3中所示的⑶RL1相差不超过4、3、2或1个氨基酸取代、 插入和/或缺失的CDRL1 ;e)与如表3中所示的CDRL2相差不超过2个或1个氨基酸取代、 插入或缺失的CDRL2 ;f)与如表3中所示的CDRL3相差不超过2个或1个氨基酸取代、插入 或缺失的CDRL3。在相关实施方案中，提供选自以下的CDRH1:SEQIDNOs:14、15、16、17、18 和 33;选自以下的CDRH2:SEQIDNOs: 19、20、21、22、23、24和34;选自以下的〇)冊3:5￡0 IDNOs: 25、26、27、28、29 和 35;选自以下的CDRL1:SEQIDNOs: 1、2、3、4、5、6 和 30;选自 以下的CDRL2:SEQIDNOs: 7、8、9、10 和 31;和选自以下的CDRL3:SEQIDNOs: 11、12、 13 和 32。
[0008] 另一个实施方案提供结合人⑶30L的分离的抗原结合蛋白，其包含至少一个包含 CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区，其中CDR1包含SEQID勵8:36、28、40、42或44的氨基 酸残基23-36，CDR2包含SEQID勵8:36、28、40、42或44的氨基酸残基52-58且〇?3包含 SEQID勵8:36、28、40、42或44的氨基酸残基91-100;或13)包含0)1?1、0)1?2和0)1?3的轻 链可变区，其中CDR1包含SEQIDN0s:46的氨基酸残基25-36，CDR2包含SEQIDN0s:46 的氨基酸残基52-58且⑶R3包含SEQIDNOs: 46的氨基酸残基91-100 ;和至少一个包含 CDR1、CDR2 和CDR3 的重链可变区，其中CDR1 包含SEQIDN0s:48、50、52、54、56、58、60、62、 64、66、68、70或72的氨基酸残基31-35,〇?2包含5￡0 10勵8:48、50、52、54、56、58、60、 62、64、66、68、70 或 72 的氨基酸残基 50-65 且CDR3 包含SEQIDN0s:48、50、52、54、56、58、 60、62、64、66、68、70或72的氨基酸残基98-113。在一个相关实施方案中，提供抗原结合蛋 白，其包含至少一个重链可变区和至少一个轻链可变区。在另一个实施方案中，提供抗原结 合蛋白，其包含至少两个重链可变区和至少两个轻链可变区。
[0009] 在另一个实施方案中，提供结合CD30L的分离的抗原结合蛋白，其包含重链可变 区和轻链可变区，其中重链可变区序列与如表2中所示的重链可变区序列相差不超过31、 30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、 2或1个氨基酸取代、添加和/或缺失；且其中轻链可变区序列与如表1中所示的轻链可变 区序列相差不超过 30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、 10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸取代、添加和/或缺失。
[0010] 另一个实施方案提供结合CD30L的分离的抗原结合蛋白，其包含重链可变区，所 述重链可变区包含与SEQID勵:48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70和72具有至少 80%序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQIDN0:36、38、 40、 42、44和46具有至少88%序列同一性的氨基酸序列。
[0011] 在一个实施方案中，提供结合CD30L的分离的抗原结合蛋白，其选自以下：a)选自 SEQID勵8:48、50、52、54、56、58、60和62的重链可变区和5￡0 1〇勵:36的轻链可变区； b)SEQIDN0:64的重链可变区和SEQIDNO:38的轻链可变区；c)SEQIDNO:66的重链 可变区和SEQIDNO:40的轻链可变区；d)SEQIDNO:68的重链可变区和SEQIDNO:42的 轻链可变区；e)SEQIDNO: 70的重链可变区和SEQIDNO: 44的轻链可变区；和f)SEQID N0:72的重链可变区和SEQIDN0:46的轻链可变区。在一个相关实施方案中，分离的抗原 结合蛋白为抗体。在另一个相关实施方案中，抗体为单克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化 抗体、嵌合抗体、多特异性抗体或其抗体片段。在一个其他实施方案中，抗体片段为Fab片 段、Fab'片段、F(ab'）2片段、Fv片段、双抗体或单链抗体分子。在一个相关实施方案中，抗 原结合蛋白为人抗体。在另一个相关实施方案中，抗原结合蛋白为单克隆抗体。在一个其 他相关实施方案中，抗原结合蛋白为IgGl型、IgG2型、IgG3型或IgG4型。在一个相关实施 方案中，抗原结合蛋白为IgGl型或IgG2型。
[0012] 另一个实施方案提供分离的核酸分子，其编码如上所述的抗原结合蛋白。在一个 相关实施方案中，至少一个重链可变区由选自SEQIDN0s:49、51、53、55、57、59、61、63、65、 67、69、71和73的分离的核酸分子编码且至少一个轻链可变区由选自SEQIDN0s:37、39、 41、 43、45和47的分离的核酸分子编码。在另一个相关实施方案中，核酸分子与控制序列可 操作地连接。在一个其他相关实施方案中，提供包含上述核酸的载体和包含此类载体的宿 主细胞。在又一个其他实施方案中，提供足以用作杂交探针、PCR引物或测序引物的分离的 多核苷酸，其为如上所述的核酸分子的片段或其互补序列。
[0013] 另一个实施方案提供制备如上所述的抗原结合蛋白的方法，其包括由分泌抗原结 合蛋白的宿主细胞制备抗原结合蛋白的步骤。
[0014] 另一个实施方案提供如上所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白具 有至少一种选自以下的性质：a)抑制⑶30/⑶30L相互作用；b)抑制⑶30L诱导的IL-8诱 导作用；c)与抗体A-F中的一种交叉竞争结合人CD30L;d)解离常数彡70pM和e)以与抗 体A-F中的一种实质上相同的Kd结合于人CD30L。
[0015] 在又另一个实施方案中，提供药物组合物，其包含至少一种如上所述的抗原结合 蛋白和药学上可接受的赋形剂。一个相关实施方案进一步提供进一步包含标记基团或效应 物基团的此类药物组合物。在另一个相关实施方案中，标记基团选自以下：同位素标记、磁 性标记、氧化还原活性部分、光学染料、生物素化基团和由二级报道分子识别的预定多肽表 位。在一个其他相关实施方案中，效应物基团选自放射性同位素、放射性核素、毒素、治疗基 团和化学治疗基团。在另一个相关实施方案中，抗原结合蛋白与标记基团偶联。
[0016] 另一个实施方案提供治疗或预防患者中与CD30L相关的病况的方法，其包括向有 其需要的患者施用有效量的至少一种如上所述的分离的抗原结合蛋白。在又另一个相关实 施方案中，分离的抗原结合蛋白单独施用或作为组合治疗施用。
[0017] 另一个实施方案提供降低患者中⑶30L活性的方法，其包括施用有效量的至少一 种如上所述的抗原结合蛋白。
[0018] 在又另一个实施方案中，提供与至少一种如上所述的抗原结合蛋白竞争的抗原结 合蛋白。
[0019] 在另一个实施方案中，提供如上所述的抗原结合蛋白，其完全或部分无岩藻糖基 化（afucosylated)。
[0020] 附图 图1ARamos细胞和NK效应物，空心正方形：美罗华（Rituxan) (IgGl)，实心菱形：抗体A1IgGlf，实心正方形：抗体A1IgGl，空心圆形：抗体A1IgG2。
[0021] 图IBJD38细胞和NK效应物，空心正方形：美罗华（IgGl)，实心菱形：抗体A1 IgGlf，实心正方形：抗体A1IgGl，空心圆形：抗体A1IgG2。
[0022] 图1CDS179细胞和NK效应物，空心正方形：美罗华（IgGl)，实心菱形：抗体A1 IgGlf，实心正方形：抗体A1IgGl，空心圆形：抗体A1IgG2。
[0023] 图IDEW36细胞和NK效应物，空心正方形：美罗华（IgGl)，实心菱形：抗体A1 IgGlf，实心正方形：抗体A1IgGl，空心圆形：抗体A1IgG2。
[0024] 详述 本发明提供与⑶30L抗原结合蛋白（包括阻断⑶30L与⑶30之间相互作用的抗原结 合蛋白，诸如抗CD30L抗体、抗体片段和抗体衍生物，例如中和抗CD30L抗体、抗体片段或抗 体衍生物）有关的组合物、试剂盒和方法。还提供多核苷酸以及其衍生物和片段，其包含编 码结合于CD30L的所有多肽或其部分的核酸的序列，例如编码所有抗CD30L抗体、抗体片段 或抗体衍生物或其部分的多核苷酸，包含所述核酸的质粒和载体，和包含所述多核苷酸和/ 或载体和质粒的细胞或细胞系。所提供的方法包括例如制备、鉴定或分离CD30L抗原结合 蛋白（诸如抗CD30L抗体）的方法；确定分子是否阻断CD30L与CD30之间相互作用的方法； 确定分子是否拮抗CD30L的方法；制备包含CD30L抗原结合蛋白的组合物（诸如药物组合 物）的方法；和向主体施用CD30L抗原结合蛋白的方法，例如治疗由CD30L介导的病况和体 内或体外阻断⑶30L与⑶30之间相互作用的方法。
[0025] 除非本文中另有定义，否则结合本发明所用的科学和技术术语应具有本领域普通 技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数且复数术 语应包括单数。通常，与本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传 学以及蛋白和核酸化学和杂交结合使用的命名法和其技术是本领域中众所周知和常用的。 除非另有说明，否则本发明的方法和技术通常根据本领域中众所周知的常规方法和如本说 明书中引用和论述的各种通用和更特定参考文献中所述进行。参见例如，Sambrook等人， MolecularCloning:ALaboratoryManual, 3rded. ,ColdSpringHarborLaboratory Press，ColdSpringHarbor，N.Y. (2001)和Ausubel等人，CurrentProtocolsin MolecularBiology,GreenePublishingAssociates(1992)， 以及Harlow和Lane Antibodies:ALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratoryPress,Cold SpringHarbor,N.Y. (1990)。酶促反应和纯化技术根据制造商说明书以本领域中常用实 现方式或如本文所述进行。结合本文所述的分析化学、合成有机化学以及医药和药物化学 使用的术语和其实验室步骤和技术为本领域中众所周知和常用的。可使用标准技术进行化 学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及治疗患者。
[0026] 本申请中引用的所有文献或部分文献（包括但不限于专利、专利申请、论文、书籍 和专题论文）均以其整体通过引用明确地并入本文中以用于描述和说明目的，例如所述公 开中描述的方法可与本文所述的信息结合使用。
[0027] 术语"CD30配体"(CD30L)是指能够结合CD30的多肽类别（如Smith等人， 73:1349-1360，1993和美国专利号5, 480, 981中所公开），包括其CD30结合突变蛋白；所 述多肽包括膜结合蛋白（包含细胞质结构域、跨膜区和胞外结构域）以及保留CD30结合性 质的截短蛋白。所述截短蛋白包括例如仅包含细胞外（受体结合）结构域的可溶性CD30L。 还包括⑶30L片段，包括全长⑶30L多肽的部分，其保留⑶30结合能力或能够引发与⑶30 多肽或能够传输生物学信号（诸如NF-kB的活化）的一部分全长CD30特异性结合的抗体。
[0028] 术语"CD30"是指作为TNF/NGF受体超家族的成员的受体，其克隆方法描述于 Durkop等人（CfeB68:421，1992)中。短语"可溶性CD30"(sCD30)是指包含CD30蛋白的 所有胞外结构域或其部分且保留与CD30L特异性结合能力的可溶性分子。可溶性CD30多 肽涵盖高度纯化形式的重组s⑶30和天然存在s⑶30蛋白。
[0029] 如本文中所用，短语"⑶30的片段"是指全长⑶30多肽的一部分，其保留⑶30L结 合能力或能够引发与CD30多肽或能够传输生物学信号（诸如NF-kB的活化）的一部分全 长CD30特异性结合的抗体。
[0030] 如本文中所用，短语"⑶30/⑶30L相互作用"是指⑶30与⑶30L的特异性结合，其 引起由CD30进行的信号转导。此包括其中至少一个结合伴侣为CD30或CD30L的片段的实 例，即该术语可是指⑶30片段与⑶30L、⑶30与⑶30L片段或⑶30片段与⑶30L片段的结 合相互作用。此外，⑶30/⑶30L相互作用可涉及⑶30类似物（诸如等位基因变体或突变 蛋白），其能够特异性结合于CD30L，或可涉及CD30L类似物（诸如等位基因变体或突变蛋 白），其可与⑶30特异性结合。此外，⑶30/⑶30L相互作用可涉及内源⑶30或⑶30L蛋白 或可涉及由编码重组蛋白的核酸所转染的细胞表达的重组⑶30或⑶30L。
[0031] 术语"多核苷酸"包括单链和双链核酸且包括基因组DNA、RNA、mRNA、cDNA或其与 在自然界中通常发现的序列无关的合成来源或一些组合。包含指定序列的分离的多核苷酸 除指定序列外可包括多达10种或甚至多达20种其他蛋白或其部分的编码序列，或可包括 控制所述核酸序列的编码区的表达的可操作地连接的调节序列和/或可包括载体序列。包 含多核苷酸的核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任一类型核苷酸的修饰形式。 所述修饰包括碱基修饰，诸如溴尿苷和肌核苷衍生物；核糖修饰，诸如2'，3' -二脱氧核糖； 和核苷酸间键修饰，诸如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺硫代 磷酸醋、苯胺磷酸醋（phoshoraniladate)和磷酰胺酸醋。
[0032] 术语"寡核苷酸"意指包含100个或更少核苷酸的多核苷酸。在一些实施方案中， 寡核苷酸的长度为10至60个碱基。在其他实施方案中，寡核苷酸的长度为12、13、14、15、 16、17、18、19或20至40个核苷酸。寡核苷酸可以是单链或双链，例如用于构建突变基因。 寡核苷酸可以是有义或反义寡核苷酸。寡核苷酸可包括用于检测测定法的可检测标记，诸 如放射性标记、荧光标记、半抗原或抗原性标记。寡核苷酸可用作例如PCR引物、克隆引物 或杂交探针。
[0033] 术语"多肽"或"蛋白"意指具有天然蛋白的氨基酸序列的大分子，即由天然存在 且非重组细胞产生的蛋白；或其是由经遗传工程改造或重组细胞产生，且包含具有天然蛋 白的氨基酸序列的分子，或与天然序列相比具有一个或多个氨基酸残基缺失、插入和/或 取代的分子。该术语还包括氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸为相应天然存在的氨基 酸和聚合物的化学类似物。术语"多肽"和"蛋白"涵盖CD30L抗原结合蛋白（诸如抗体） 和序列，其与抗原结合蛋白序列相比具有一个或多个氨基酸残基缺失、添加和/或取代。术 语"多肽片段"是指与全长天然蛋白相比具有氨基端缺失、羧基端缺失和/或内部缺失的多 肽。所述片段与天然蛋白相比也可含有经修饰的氨基酸。在某些实施方案中，片段长度为 约5至500个氨基酸。例如，片段长度可以是至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20、50、70、100、110、150、200、250、300、350、400 或 450 个氨基酸。有用多肽片段包括 抗体的免疫功能性片段，包括结合结构域。在CD30L抗原结合蛋白（诸如抗体）情况下，有 用片段包括但不限于一个或多个CDR区、重链或轻链的可变结构域、抗体链的一部分、可变 区的一部分（包括不超过3个⑶R)等。
[0034] "氨基酸"包括其在本领域中的正常含义。20种天然存在的氨基酸和其缩写遵循 常规用法。参见Immunology-ASynthesis, 2ndEdition, (E.S.Golub和D.R.Gren, 编辑），SinauerAssociates:Sunderland,Mass. (1991)。20 种常规氨基酸的立体异构 体（例如D-氨基酸）、非天然氨基酸（诸如[a]-氨基酸、[a]-双取代氨基酸、N-烷基氨 基酸）和其他非常规氨基酸也可以是多肽的合适组分。非常规氨基酸的实例包括：4_羟脯 氨酸、[Y]_羧基谷氨酸、[e]-N，N，N_三甲基赖氨酸、[e]-N_乙酰基赖氨酸、0 -磷丝氨 酸、N-乙酰基丝氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、[0 ]-N_甲基精 氨酸和其他类似氨基酸和亚氨基酸（例如4-羟基脯氨酸）。在本文中使用的多肽记号中， 根据标准用法和惯例，左手方向为氨基端方向且右手方向为羧基端方向。
[0035] 术语"分离的蛋白"是指由蛋白或多肽或其他将妨碍其治疗性、诊断性、预防性、研 宄或其他用途的污染物纯化的蛋白，诸如抗原结合蛋白（其实例可以是抗体）。如本文中 所用，"实质上纯"意指所述的分子种类为存在的主要种类，即以摩尔计，其丰度大于相同混 合物中的任何其他个别种类。在某些实施方案中，实质上纯分子为组合物，其中目标种类 包含所有存在的大分子种类的至少50%(以摩尔计）。在其他实施方案中，实质上纯组合物 将包含组合物中所有存在的大分子种类的至少80%、85%、90%、95%或99%。在某些实施方案 中，基本上均匀物质已纯化至通过常规检测方法在组合物中无法检测到污染种类的水平且 因此组合物是由单一可检测大分子种类组成。
[0036] 多肽（例如抗原结合蛋白，诸如抗体）的"变体"包含氨基酸序列，其中相对于另 一多肽序列其氨基酸序列中插入、缺失和/或取代一个或多个氨基酸残基。变体包括融合 蛋白。多肽的"衍生物"为经与插入、缺失或取代变体不同的某一方式化学修饰（例如经缀 合于另一化学部分）的多肽。
[0037] 本说明书中结合生物材料（诸如多肽、核酸、宿主细胞等）使用的术语"天然存在 的"或"天然的"是指在自然界中发现的物质。在此上下文中，"重组蛋白"为使用重组技术 (即经本文所述的重组核酸的表达）制备的蛋白。制备重组蛋白的方法和技术在本领域中 众所周知。
[0038] 术语"抗体"是指任何同种型的完整免疫球蛋白或其可与完整抗体针对与目标抗 原的特异性结合进行竞争的片段，且包括例如嵌合抗体、人源化抗体、完全人抗体和双特异 性抗体。因此抗体为一种抗原结合蛋白。除非另有说明，否则术语"抗体"除包含两个全长 重链和两个全长轻链的抗体外，还包括其衍生物、变体、片段和突变蛋白，其实例描述于下 文中。完整抗体通常将包含至少两个全长重链和两个全长轻链，但在一些情况下，其可包括 较少的链，诸如天然存在于骆驼中的抗体，其可仅包含重链。抗体可仅由单一来源获得，或 可以是"嵌合型"，即抗体的不同部分可来源于两种不同的如下文进一步描述的抗体。可在 杂交瘤中、通过重组DNA技术或由完整抗体的酶促或化学裂解制备抗原结合蛋白、抗体或 结合片段。
[0039] 如本文中所用，抗体或免疫球蛋白链（重链或轻链）的术语"功能性片段"（或简 称为"片段"）为抗原结合蛋白，其包含缺少全长链中存在的至少一些氨基酸但仍能够特异 性结合于抗原的抗体的一部分（无论该部分如何获得或合成）。所述片段由于其特异性结 合于目标抗原且可与其他抗原结合蛋白（包括完整抗体）针对与给定表位的特异性结合进 行竞争而是生物学上有活性的。在一个方面，该片段将保留至少一个存在于全长轻链或重 链中的⑶R，且在一些实施方案中将包含单一重链和/或轻链或其部分。这些生物学活性片 段可由重组DNA技术制备，或可由抗原结合蛋白（包括完整抗体）的酶促或化学裂解制备。 片段包括但不限于免疫功能性片段，诸如Fab、Fab'、F(ab'）2、Fv、结构域抗体和单链抗体， 且可来源于任何哺乳动物来源，包括但不限于人、小鼠、大鼠、骆驼（camelid)或兔。此外涵 盖本文中公开的抗原结合蛋白的功能性部分（例如一个或多个CDR)可共价结合于第二蛋 白或小分子以产生针对体内特定目标、具有双功能治疗性质或具有延长的血清半衰期的治 疗剂。
[0040] 当在抗原结合蛋白（例如中和抗原结合蛋白或中和抗体）情形中使用时，术 语"竞争"意指如由测定法测定的抗原结合蛋白之间的竞争，其中所测试的抗原结合蛋 白（例如抗体或其免疫功能性片段）阻止或抑制参考抗原结合蛋白（例如配体或参考 抗体）与共同抗原（例如CD30L蛋白或其片段）的特异性结合。可使用多种类型的竞争 性结合测定法，例如：固相直接或间接放射免疫测定法（RIA)、固相直接或间接酶免疫测 定法（EIA)、夹心竞争测定法（参见例如Stahli等人，1983，MethodsinEnzymology 92:242-253);固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(参见例如Kirkland等人，1986， J.Immunol. 137:3614-3619)固相直接标记测定法、固相直接标记夹心测定法（参见例 如，Harlow和Lane, 1988,Antibodies,ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor Press);使用1-125标记的固相直接标记RIA(参见例如Morel等人，1988,Molec. Immunol. 25:7-15);固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(参见例如Cheung,等人，1990， Virology176:546-552);和直接标记RIA(Moldenhauer等人，1990，Scand.J.Immunol. 32:77-82)。通常，所述测定法涉及使用结合于固体表面或细胞的纯化抗原，该固体表面或 细胞具有未经标记的测试抗原结合蛋白和经标记的参考抗原结合蛋白这些的任一种。如本 领域技术人员已知，可使用不同方法。替代性选项包括使参考抗原结合蛋白结合于板，任选 地经由柔性基质。其他变化可基于添加顺序，即抗原是否首先与板结合的参考抗原结合蛋 白或测试抗原结合蛋白混合。在所有情况下均需要实现抗原结合蛋白的抗原饱和以避免错 误的非竞争性结果。
[0041] 通过在测试抗原结合蛋白存在的情况下测定结合于固体表面或细胞的标记量来 测量竞争性抑制。通常，测试抗原结合蛋白过量存在。由竞争测定法鉴定的抗原结合蛋白 (竞争抗原结合蛋白）包括与参考抗原结合蛋白结合于相同表位的抗原结合蛋白，和与由 参考抗原结合蛋白所结合的表位足够近的相邻表位结合从而发生位阻的抗原结合蛋白。通 常，当竞争抗原结合蛋白过量存在时，其将抑制参考抗原结合蛋白与共同抗原的特异性结 合达至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%。在一些情况下，抑制结合作用达至少80%、 85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或以上。
[0042] 竞争实验可以用可具有不同灵敏度的不同类型的分子进行。如果抗原结合蛋白是 抗体，则分子将是二价的。如果抗原结合蛋白是Fab，则其是单价的且实质上小于全长抗体， 这导致更小的空间位阻。在竞争实验中，可以这样。对于某些抗原结合蛋白，与hCD30L的 结合受如本文定义的抗体抗原结合蛋白的Fab(诸如任一抗体A、B、C、D、E和F)的结合抑 制。
[0043] 术语"表位"或"抗原决定簇"是指抗原上由抗原结合蛋白结合的位点。表位可以 从连续氨基酸或由蛋白的三级折叠而并置的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表 位通常可在暴露于变性溶剂后保留，而由三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丧 失。抗原决定簇可包括分子的化学活性表面基团（诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基） 且可具有特定三维结构特征和/或特定电荷特征。表位通常包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35个呈独特空间构型的氨基酸。可使用本领域中 已知的方法测定表位。
[0044] 抗原结合蛋白的结合也可由与抗原结合蛋白相互作用的抗原的一个或多个区域 描述。所述相互作用区域可由本领域中已知的各种方法测定，诸如通过使用变体抗原分子 进行结合测定法或通过如本文中示例性的HX-MS(参见实施例6)，从而测定抗原与抗原结 合蛋白的相互作用区域。
[0045] HX-MS技术使得可易于在蛋白的氢交换（HX)后进行质谱测定法（MS)。通过用含有 氘的含水溶剂置换含有氢的含水溶剂，在蛋白中的给定位点并入氘原子将引起质量增加1 Da。可在交换反应的猝灭样品中通过质谱测定法作为时间函数监测该质量增加。可通过猝 灭条件下的胃蛋白酶消化和根据所得肽的质量增加将氣标记信息亚定位（sub-localized) 至蛋白中的区域。可使用HX-MS通过鉴定蛋白-蛋白复合物形成后氢交换降低的区域来探 测与分子间相互作用（包括抗体-抗原相互作用）有关的位点。通常，将通过标记的氢交 换降低（由溶剂的空间排阻引起）来显示结合界面。可通过HX-MS简单地通过在存在和不 存在各个结合伴侣情况下测量并入任一蛋白成员中的氘的总量作为时间的函数来检测蛋 白-蛋白复合物形成。HX-MS技术使用天然组分（即蛋白和抗体或Fab片段）且在溶液中 进行。因此，HX-MS提供模拟体内条件的可能性（关于HX-MS技术的评述，参见例如Wales 和Engen,MassSpectrom.Rev. 25, 158 (2006))〇
[0046] 本文所述的某些抗原结合蛋白经由人⑶30L的C末端区域（由AA201-234界定） 与CD30L相互作用或结合。可以是抗原结合蛋白与人CD30L的由AA201-234界定的C末端 区域或诸如AA205-230或AA211-226的较小区域结合。如上所述，表位可以是非连续且因 此相互作用区域可以是非连续。在一个实施方案中，本发明的抗原结合蛋白结合于CD30L 的至少两个区域。本发明的此类其他抗原结合蛋白可与如上文所界定的C末端区域和人 ⑶30L中位于胞外结构域的N末端部分的另一区域（诸如由全长h⑶30L的AA70-100界定 的区域）相互作用。除由AA201-234、AA205-230或AA211-226界定的C末端区域外，此类 抗原结合蛋白也可结合于AA75-95或较短区域，诸如AA80-90或AA82-88。
[0047] CD30L抗原结合蛋白 如本文中所用，"抗原结合蛋白"意指特异性结合指定目标抗原的蛋白；本文中提供的 抗原为CD30L，尤其人CD30L。抗原结合蛋白包括例如阻断或抑制CD30L与CD30的相互作 用的抗原结合蛋白。所述"阻断"抗原结合蛋白可以针对CD30L或其片段、变体或衍生物开 发且在常规测定法中筛选其阻碍CD30L与CD30的相互作用的能力。合适测定法的实例为 本文所述的测试抗原结合蛋白抑制CD30L与CD30的相互作用的能力的测定法。抗原结合 蛋白还包括抑制CD30L或活化CD30L的抗原结合蛋白。与不存在抗原结合蛋白的情况下 的生物反应相比，所述抑制或中和作用在抗原结合蛋白存在的情况下破坏反应且可使用本 领域中已知和本文所述的测定法测定。本文中提供的抗原结合蛋白例如诱导CD30+细胞产 生IL-8。本文中公开的抗原结合蛋白还不与其他TNF超家族成员（尤其4-1BBL、0X-40L、 TNFa、TNF0、RANKL、Trail、CD40L或CD27L)结合。
[0048] 不同⑶30L抗原结合蛋白可结合于⑶30L的不同结构域或表位或通过不同作用机 制起作用。CD30L抗原结合蛋白不必完全抑制CD30L诱导的活性以发现本文所述的用途； 相反，还涵盖降低CD30L的特定活性的抗原结合蛋白来使用。抗原结合蛋白还包括以下抗 原结合蛋白：其与本文所述的任一种参考抗原结合蛋白针对与人CD30L的结合进行交叉竞 争；结合于人CD30L的与本文所述的任一种参考抗原结合蛋白相同的表位；以与本文所述 的任一种参考抗原结合蛋白实质上相同的Kd结合于人CD30L;以与本文所述的任一种参考 抗原结合蛋白实质上相同的解离速率结合于CD30L。各种测量所述特征的方法在本领域中 已知且描述于本文中。
[0049] 还提供消耗⑶30L+细胞的⑶30L抗原结合蛋白。通过所述消耗⑶30L抗原结合 蛋白，抗原结合蛋白与包含其抗原目标的细胞的结合引起抑制抗原或细胞功能或引起细胞 死亡。在一个实施方案中，本发明的消耗抗体与CD30L结合且可能阻断或可能不阻断CD30L 配体与CD30的结合。因此，消耗抗原结合蛋白具体包括阻断和非阻断抗原结合蛋白。在一 个方面，消耗CD30L+细胞的CD30L抗原结合蛋白可诱导细胞凋亡或编程性细胞死亡，如由 本领域中已知的细胞凋亡测定法测定。所述CD30L抗原结合蛋白可通过以下机制而具有 免疫调节作用：1)消除与CD30L+细胞相互作用以诱导免疫反应的细胞和/或2)消除其中 CD30L为一种细胞类型的细胞表面标记的细胞，该细胞类型参与特定免疫反应，但其可能无 需与⑶30L+细胞相互作用来做到这一点。在此情况下，⑶30L将为与特定疾病有关的细胞 类型的标记且⑶30/⑶30L相互作用可能不参与疾病本身的发病。另一个实施方案包括包 含缀合毒素或细胞毒性剂的消耗抗原结合蛋白，其中所述毒素或细胞毒性剂诱导结合抗原 结合蛋白缀合物的细胞的消耗。
[0050] 抗原结合蛋白可包含结合于抗原的部分和任选地使抗原结合部分采用促进抗原 结合蛋白与抗原的结合的构型的支架或构架部分。抗原结合蛋白的实例包括抗体、抗体片 段（例如抗体的抗原结合部分）、抗体衍生物和抗体类似物。抗原结合蛋白可包含替代性 蛋白支架或人工支架，该替代性蛋白支架或人工支架具有移植的CDR或CDR衍生物。所述 支架包括但不限于包含突变的抗体衍生型支架，所述突变经引入以例如使抗原结合蛋白 以及包含例如生物相容聚合物的全合成支架的三维结构稳定。参见例如，Korndorfer等 人，Proteins:Structure,Function,andBioinformatics, (2003)Volume53,Issue 1:121-129;Roque等人，Biotechnol.Prog. , 2004, 20:639-654。此外，可使用肽抗体 模拟物（"PAM"），以及基于抗体模拟物的支架（其利用纤维连接蛋白组分作为支架）。
[0051] 本文所述的某些抗原结合蛋白为抗体或来源于抗体。所述抗原结合蛋白包括但不 限于分别为单克隆抗体、双特异性抗体、微型抗体、结构域抗体、合成抗体、抗体模拟物、嵌 合抗体、人源化抗体、人抗体、抗体融合体、抗体缀合物、单链抗体和其片段。在一些情况下， 抗原结合蛋白为抗体的免疫片段（例如Fab、Fab'、F(ab'）2或scFv)。各种结构进一步描 述和定义于本文中。
[0052] 某些所提供的抗原结合蛋白可包含一个或多个如本文所述的⑶R(例如1、2、3、4、 5、6个或更多CDR)。在一些情况下，抗原结合蛋白包含（a)多肽结构和（b) -个或多个CDR， 所述一个或多个CDR插入多肽结构中和/或与多肽结构接合。多肽结构可采用多种不同形 式。例如，其可以是或包含天然存在的抗体的构架或其片段或变体，或可本质上为完全合成 的。各种多肽结构的实例进一步描述于下文中。
[0053] 某些如本文中提供的抗原结合蛋白特异性结合于人CD30L。如本文中所用的"特 异性结合"意指平衡解离常数（KD)为<1(T8M至〈10%M，或<1(T9M至〈10%M，更具体而 言为<10_nM至<1(T12M。在一个实施方案中，抗原结合蛋白以高亲和力结合，该高亲和力由 平衡解离常数（KD)表示为1(T8,或诸如5.0xl(T9或诸如1(T9或甚至5.0x10-。可如本领 域中已知的方式测定平衡解离常数。在所述实施方案中，通常通过以低密度固定物质（此 物质可以是多价）且注射滴定系列的单价物质（结合相），且然后考虑解离相（其中复合 物分开）来测定KD。与单价复合物的结合和解离对应的速率常数分别称为结合速率常数4 和解离速率常数I。然后将所得数据拟合至1:1结合模型，该模型拟合3个参数：结合速率 常数4、解离速率常数七和Rmax(其涉及表面密度和化学计量）。& / 4的比率等于平衡 解离常数Kd。
[0054] 还可如本文中的实施例4中所述使用FACS分析测定KD，其中抗体与表达于Ramos 细胞上的⑶30L结合。
[0055] -个实施方案涉及如本文所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白对 人⑶30L的亲和力（或KD)为至少75pM，诸如50pM，诸如40pM。在其他实施方案中，抗原 结合蛋白对人⑶30L的解离常数（KD)为至多35pM，诸如至多25pM，诸如20pM，诸如至多 15pM。在所述实施方案中，可如本文中的实施例4中所述通过FACS测定亲和力（或Kd)。
[0056] 另一个方面提供体外或体内（例如当向人主体施用时）半衰期为至少1天的抗原 结合蛋白。在一个实施方案中，抗原结合蛋白的半衰期为至少3天。在另一个实施方案中， 抗体或其部分的半衰期为4天或更长。在另一个实施方案中，抗体或其部分的半衰期为8 天或更长。在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合部分经衍生或修饰使得其半衰期长于 未衍生或未修饰的抗体。在另一个实施方案中，抗原结合蛋白含有点突变以延长血清半衰 期，诸如WIP0
【发明者】D. 安德森 M., 达尼兹勒 J., J. 阿米塔格 R., 克拉克 R. 申请人:诺和诺德A/S（股份有限公司）, 安姆根有限公司