一种复合胶原海绵及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种复合胶原海绵及其制备方法，其特征在于：其由一定比例的鱼源胶原蛋白、白芨胶与独一味提取物冷冻干燥后添加交联剂进行交联，经水洗至中性，再次二次冷冻干燥而制成的多孔松软的海绵状敷料；所述鱼源胶原蛋白、白芨胶和独一味提取物的质量比为70-80：10-20：5-10。本发明采用胶原蛋白、白芨胶和独一味为主要原料，研制一种新型的创伤敷料，无毒副作用，具有良好生物相容性；在临床上有止血，促进创面愈合，阻止渗液溢出的功效，抗撕强度≥600g/cm3，吸水率≥30倍；具有良好的吸湿性，并改善了胶原海绵的降解性，且其制备过程简单、价廉易得，是一种较好的生物医用材料。
【专利说明】一种复合胶原海绵及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物制品领域，具体涉及到一种复合胶原海绵及其制备方法。
【背景技术】
[0002]胶原海绵主要的成份是胶原蛋白，它与人体胶原蛋白结构相似，很适合人体器官的修复和再生。胶原蛋白能促进伤口愈合和肉芽组织的生长，具有良好的止血和填充作用，可用于促进创面愈合、止血、手术残腔填充等。在制备多孔支架的过程中应考虑支架材料以及支架的三维结构对细胞活性的影响。对一个可以促进细胞粘附和生长的具有生物活性的支架来说，必须具有良好的生物相容性，且能够保持一定的体内可降解速率。支架应具有适当的平均孔径，使细胞在孔间进行迁移的同时保证恰当的细胞粘附面积，胶原海绵被公认为是一种合适的医用材料。
[0003]目前，国内使用的胶原蛋白主要来自猪和牛的皮肤和跟腱，但牛、猪等哺乳动物为主要来源的胶原蛋白产品存在原料来源有限、生产成品高以及疯牛病、口蹄疫等病源传播的潜在危险等诸多问题；且由于宗教和习俗等原因，猪来源的胶原蛋白在某些地区的应用受到了限制。因此，迫切需要寻求质量和安全性更好的胶原蛋白来源。我国每年鱼鳞鱼皮等水产品废弃物约有40多万吨，这些水产品废弃物均含有丰富的胶原蛋白(如皮、骨、鳞等)，其氨基酸组成与陆生哺乳动物胶原无明显差异，且其不存在人畜共患的传染性疾病，具有极大的开发和利用价值，但这些废弃物除小部分被用于生产饲料外，大部分却被丢弃。因此，开发鱼皮等水产品废弃物的利用新途径，不仅可提高水产品加工的附加值，而且能减少环境污染，具有良好的经济和社会效益。胶原海绵作为构建活性人工皮肤的三维支架已得到广泛认可，但其体内降解快，柔韧性差，降解受局部因素的影响大，降解速度可控性不如人工多聚物，机械性能差， 在液体中很难保持其孔隙结构，限制了其应用。
[0004]目前鱼源胶原蛋白的制备方法很多，包括酸法、碱法、酶法、盐法、热水法等等，但这些传统方法均存在制备时间长、工艺复杂等缺点。鱼源胶原蛋白的变性温度在30°C左右，提取温度过高导致胶原蛋白失去了生物活性，胶原蛋白内部结构发生改变、功能下降，从而难以达到预期效果。
[0005]意大利产品GELFIX(解尔分思片)，系取自牛跟腱的冻干胶原，能促进伤口愈合，作为外科手术填充剂和止血药的效果显著，用途广泛，于1992年进口中国。但进口的解尔分思片，价格昂贵，仅为胶原敷料，无抗炎镇痛作用，对伤口的促愈性不如载药敷料明显。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供了一种复合胶原海绵及其制备方法，由本发明制备的复合胶原海绵可改善胶原海绵易降解等缺点，且克服了现有胶原海绵的不足。
[0007]本发明是通过如下技术方案实现的:
[0008]一种复合胶原海绵，其特征在于:其由一定比例的鱼源胶原蛋白、白芨胶与独一味提取物冷冻干燥后添加交联剂进行交联，经水洗至中性，再次二次冷冻干燥而制成的多孔松软的海绵状敷料；所述鱼源胶原蛋白、白芨胶和独一味提取物的质量比为70-80:10-20:
5-10。
[0009]更进一步的，所述的复合胶原海绵的制备方法，其特征在于包括下列步骤:
[0010]I)将鱼源胶原蛋白溶于体积分数为2%的乙酸溶液中，制成质量分数为0.5%的胶原蛋白溶液；
[0011]2)将白芨胶浸入蒸馏水，待充分膨胀后，置50-60°C的水浴中使其溶解，加水稀释至制成质量分数为1-5%的白芨胶溶液；
[0012]3)将上述制得的胶原蛋白溶液和白芨胶溶液混合，加入独一味提取物细粉，搅拌均匀；
[0013]4)将混匀后的混合溶液浇模，经冷冻干燥得到海绵状材料，将海绵状材料浸入交联剂进行交联，交联产物反复经蒸馏水冲洗至中性；所述交联剂为体积分数为0.2-0.3%的戊二醛或浓度为40-60mM的EDC，交联时间为12_24h ；
[0014]5)将反复冲洗至中性的制备的海绵状交联产物置于真空干燥箱中干燥，得到复合胶原海绵，然后经切成不同规格后，环氧乙烷消毒，包装，即得。
[0015]优选的，所述鱼源胶原蛋白的制备方法为:以下所有操作均在低于20°C的条件下进行；将解冻后的鱼皮 原料用0.lmol/L的NaOH溶液浸泡24h脱除杂蛋白，随后用去离子水充分洗涤至中性并用10%的正丁醇溶剂浸泡脱脂24h，用去离子水反复洗涤、浙干后加入瞬间变压提取灌上的高压浸溃罐中，加适量的0.5mol/L的乙酸溶液，充气加压8~IOkgf/cm2，浸泡1-2小时；将高压浸溃罐内的物料放入瞬间变压提取灌上的低压提取灌内，加
0.5mol/L的乙酸溶液搅拌提取12h，重复提取2次，提取残渣继续用含有1.0%(ff/V)胃蛋白酶的0.5mol/L乙酸搅拌提取24h，合并3次提取液离心分离，得到粗提液；向粗提液中添加NaCl至盐浓度为0.9mol/L，静置盐析24h后过滤，胶原蛋白沉淀用0.5mol/L的乙酸溶液复溶后依次用0.lmol/L的乙酸和蒸馏水透析，最后冷冻干燥后得到鱼源胶原蛋白样品；
[0016]所述瞬间变压提取灌包括设有搅拌器的低压提取灌，低压提取灌上设有通过联通阀连接的高压浸溃罐，所述高压浸溃罐上部设有可封闭的进料口、压力表、和连接气泵的进气阀；所述低压提取灌的罐体上设有可封闭的进料口、出洛口和放料阀。
[0017]优选的，所述白芨胶的制备方法为:将白芨，粉碎，加6-8倍量的50_60°C水浸泡
6-8h，时时搅拌、滤过，滤液备用；药渣再4-6倍量的50-60°C水浸泡2次，每次浸泡4h，滤过；合并3次滤液，浓缩成稠膏状，冷却后加95%乙醇，使含醇量达70%-75%，搅拌，即析出大量絮状沉液，静置lh，真空抽滤至干，真空干燥，研细，即得。
[0018]优选的，所述独一味提取物的制备方法:取粉碎后的独一味药材，用水或40-70%乙醇提取2-3次，合并提取液，浓缩，将浓缩液上大孔吸附树脂，以水和10-30%乙醇洗脱除杂，再用40-80%乙醇洗脱，收集40-80%乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得独一味提取物。
[0019]白芨作为收敛、止血药应用由来已久，且止血效果确切可靠，其作用机理与其所含的大量的白芨胶有关。白芨质地黏腻，含有胶质，它能改善局部血液循环，促进上皮细胞修复，能止血、敛疮、润肤和生肌。动物实验将从白芨中提取的白友胶制成一定厚度的膜剂，敷于出血点或面，马上与创面溶合，难以剥离，具有较强的黏附力，且接触伤口的一面溶融，不接触的一面仍然保持原状，起到了迅速止血、防止感染的作用。白芨提取物还被实验证明具有缩短凝血时间、抑制肌体对纤维素的溶解作用，可迅速形成人工血栓，不仅外伤止血常用，对内脏出血也有较好的效果。白芨有明显的促进角质形成细胞作用，这种促游走作用对治疗皮肤创伤、止血和早期愈合有重要影响，进一步说明了白芨胶直接参与了受损组织或细胞的修复和代谢过程。
[0020]独一味Lamiophlomis rotata(Benth.)Kudo系唇形科无莖多年生草本植物，以全草或根及根状茎人药，是藏、蒙、纳西等民族民间常用草药。具有止血、镇痛消肿、活血化瘀、补髓行气和续筋接骨之功效。最早载于藏医名著《四部医典》、《月王药诊》，具有活血止痛，化淤止血的功能，临床上用于多种外科手术后的刀口疼痛、出血，外伤骨折，筋骨扭伤，风湿痹痛以及崩漏、痛经、牙跟肿痛、出血等。其主要活性成分为黄酮类、环烯醚萜类和苯乙醇苷类。
[0021]相对于现有技术，本发明的有益效果是:
[0022]I)本发明采用胶原蛋白、白芨胶和独一味为主要原料，研制一种新型的创伤敷料，经毒理学检测(急性毒性试验、刺激性试验、过敏性试验和溶血性试验)均呈阴性，无毒副作用，具有良好生物相容性；在临床上有止血，促进创面愈合，阻止渗液溢出的功效，具有良好的临床疗效，而且原材料来源丰富，价格低廉，具备推广应用的前景。经试验，本发明的复合胶原海绵的抗撕强度≥600g/cm3 (解尔分思片≥500g/cm3)，吸水率≥30倍(解尔分思片≥20倍)，其吸湿性和抗撕强度明显好于解尔分思片。
[0023]2)白芨胶、独一味与胶原蛋白的结合除了可促进伤口愈合外，还可能增强其力学性能；白芨胶属多糖类，胶原属蛋白质类，蛋白质和糖类在一起可能存在氢键作用和静电作用，再加上交联作用，在胺基、羟基等之间相互交联，进一步提高其力学强度。白芨胶作为成膜材料因其质黏可以增加胶原海绵的溶胀性和柔韧性，其对创面的粘附速度快，粘附牢度强’弹性好，透气性好；白芨胶具有止血抗菌和促进伤口愈合,改善局部血液循环，能止血、敛疮、润肤和生肌；独一味具有止痛止血、活血化瘀、抗菌消炎等作用。本发明将具有收敛止血的白芨胶和胶原蛋白与活血化瘀、止痛止血的独一味配伍，一散一收，有止血而不留瘀之妙,并可加速止血生新作用。
[0024]3)本发明采用酸法和酸+酶法提取胶原蛋白，前处理后的原料经高压浸溃后，水大量进入细胞膜内，然后经瞬间释放压力进入低压提取灌内，可有效撑破细胞膜，有利于有效成分的快速溶出，其方法操作简便，产品收率高(以鱼皮为原料计产品收率达45%以上)。酸提取法将原料中未交联的游离状态为主的胶原蛋白提取出来后，残渣再用酸+酶法提取，通过胃蛋白酶的水解作用，解离并提取处于天然交联状态下的胶原蛋白，将I型胶原两端的非螺旋结构的端肽部分切除，使之变为可溶而又不影响胶原分子的螺旋结构；在整个提取、纯化过程中，多次采用NaCl盐析手段来去除降解或变性的胶原部分，同时因为提取环境温度始终保持在20°C以下，使提取的胶原蛋白生物活性没有得到破坏，很好的保证了胶原蛋白的品质。采用温浸+醇沉法提取纯化白芨胶，不但减少了杂质含量，而且工艺简单、大大降低了生产成本，所制得的白芨胶纯度高。
[0025]4)本发明将白芨胶、独一味与鱼源胶原蛋白冷冻干燥后进行交联，经反复水洗除去交联剂避免了其在材料中的残留，再次进行冷冻干燥，交联工艺和二次冷冻干燥工艺不但使产品的机械强度大大改善，生物相容性好，而且改善了降解率和孔隙率，试验表明其孔隙率在90%以上；复合胶原海绵的降解率要低于解尔费思片的降解率，在一定程度上克服了胶原易降解的特点。【专利附图】
【附图说明】
[0026]下面结合附图对本发明用到的设备作进一步说明:
[0027]图1是瞬间变压力提取灌的结构示意图；
[0028]图中:1为高压浸溃罐、2为视镜、3为可封闭的进料口、4为压力表、5为连接气泵的进气阀、6为低压提取罐、7为搅拌器、8为联通阀、9为出渣口、10为放料阀。
【具体实施方式】
[0029]下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
[0030]实施例一:复合胶原海绵的制备
[0031]1、鱼源胶原蛋白的制备:以下所有操作均在低于20°C的条件下进行；将解冻后的鱼皮原料用0.lmol/L的NaOH溶液浸泡24h脱除杂蛋白，随后用去离子水充分洗涤至中性并用10%的正丁醇溶剂浸泡脱脂24h，用去离子水反复洗涤、浙干后加入瞬间变压提取灌上的高压浸溃罐中，加0.5mol/L的乙酸溶液(1:2，W/V)，充气加压8~10kgf/cm2，浸泡2小时；将高压浸溃罐内的物料放入瞬间变压提取灌上的低压提取灌内，加0.5mol/L的乙酸溶液(1:40, W/V)搅拌提取12h，重复提取2次，提取残渣继续用含有1.0%(ff/V)胃蛋白酶的
0.5mol/L乙酸(1:40， W/V)搅拌提取24h，合并3次提取液离心分离，得到粗提液；向粗提液中添加NaCl至盐浓度为0.9mol/L，静置盐析24h后过滤，胶原蛋白沉淀用0.5mol/L的乙酸溶液复溶后依次用0.lmol/L的乙酸和蒸馏水透析，最后冷冻干燥后得到鱼源胶原蛋白样品O
[0032]如图1所示，所述瞬间变压提取灌包括设有搅拌器7的低压提取灌6，低压提取灌
6上设有通过联通阀8连接的高压浸溃罐I，所述高压浸溃罐I上部设有可封闭的进料口 3、压力表4和连接气泵的进气阀5 ;所述低压提取灌6的罐体上设有可封闭的进料口 3、出渣口 9和放料阀10。
[0033]2、白芨胶的制备:将白芨，粉碎，加8倍量的60°C水浸泡8h，时时搅拌、滤过，滤液备用；药渣再加6倍量的60°C水浸泡2次，每次浸泡4h，滤过；合并3次滤液，浓缩成稠膏状，冷却后加95%乙醇，使含醇量达70%，搅拌，即析出大量絮状沉液，静置lh，真空抽滤至干，真空干燥，研细，即得。
[0034]3、独一味提取物的制备:取粉碎后的独一味药材,用10倍量水煎煮提取3次,合并提取液，浓缩至药液体积为药材质量的1.5倍量时，将浓缩液上大孔吸附树脂DM130，以5倍柱体积的水洗脱除杂，再以3倍柱体积的30%乙醇洗脱除杂，再用80%乙醇洗脱，收集80%乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得独一味提取物。
[0035]4、复合胶原海绵的制备:
[0036]I)将上述鱼源胶原蛋白溶于体积分数为2%的乙酸溶液中，制成质量分数为0.5%的胶原蛋白溶液；
[0037]2)将上述白芨胶浸入蒸馏水，待充分膨胀后，置50-60°C的水浴中使其溶解，加水稀释至制成质量分数为1%的白芨胶溶液；
[0038]3)将上述制得的胶原蛋白溶液和白芨胶溶液混合，再加入独一味提取物搅拌均匀；所述鱼源胶原蛋白、白芨胶和独一味提取物的质量比为75:15:10 ；[0039]4)将混匀后的混合溶液浇模，经冷冻干燥得到海绵状材料，将海绵状材料浸入交联剂进行交联，交联产物反复经蒸馏水冲洗至中性；所述交联剂为体积分数为0.2-0.3%的戊二醛，交联时间为12h;
[0040]5)将反复冲洗至中性的制备的海绵状交联产物置于真空干燥箱中干燥，得到复合胶原海绵，然后经切成不同规格后，环氧乙烷消毒，包装，即得。
[0041]实施例二:复合胶原海绵的制备
[0042]1、鱼源胶原蛋白的制备:以下所有操作均在低于20°C的条件下进行；将解冻后的鱼皮原料用0.lmol/L的NaOH溶液浸泡24h脱除杂蛋白，随后用去离子水充分洗涤至中性并用10%的正丁醇溶剂浸泡脱脂24h，用去离子水反复洗涤、浙干后加入瞬间变压提取灌上的高压浸溃罐中，加0.5mol/L的乙酸溶液(1:1，W/V)，充气加压8~10kgf/cm2，浸泡I小时；将高压浸溃罐内的物料放入瞬间变压提取灌上的低压提取灌内，加0.5mol/L的乙酸溶液(1:40, W/V)搅拌提取12h，重复提取2次，提取残渣继续用含有1.0%(ff/V)胃蛋白酶的
0.5mol/L乙酸(1:40，W/V)搅拌提取24h，合并3次提取液离心分离，得到粗提液；向粗提液中添加NaCl至盐浓度为0.9mol/L，静置盐析24h后过滤，胶原蛋白沉淀用0.5mol/L的乙酸溶液复溶后依次用0.lmol/L的乙酸和蒸馏水透析，最后冷冻干燥后得到鱼源胶原蛋白样品O
[0043]2、白芨胶的制备:将白芨，粉碎，加6倍量的50°C水浸泡6h，时时搅拌、滤过，滤液备用；药渣再加4倍量的50°C水浸泡2次，每次浸泡4h，滤过；合并3次滤液，浓缩成稠膏状，冷却后加95%乙醇，使含醇量达75%，搅拌，即析出大量絮状沉液，静置lh，真空抽滤至干，真空干燥，研细，即得。
[0044]3、独一味提取物的制备:取粉碎后的独一味药材，用10倍量体积的60%乙醇提取2次，合并提取液，浓缩至相对密度为1.05时，将浓缩液上大孔吸附树脂D101，以6倍量柱体积的水和10%乙醇洗脱除杂，再用40%乙醇洗脱，收集40%乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得独一味提取物。
[0045]4、、复合胶原海绵的 制备:
[0046]I)将上述鱼源胶原蛋白溶于体积分数为2%的乙酸溶液中，制成质量分数为0.5%的胶原蛋白溶液；
[0047]2)将上述白芨胶浸入蒸馏水，待充分膨胀后，置50-60°C的水浴中使其溶解，加水稀释至制成质量分数为1-5%的白芨胶溶液；
[0048]3)将上述制得的胶原蛋白溶液和白芨胶溶液混合，搅拌均匀，再混合加入独一味提取物细粉，搅拌均匀；所述鱼源胶原蛋白、白芨胶和独一味提取物的质量比为80:10:5。
[0049]4)将混匀后的混合溶液浇模，经冷冻干燥得到海绵状材料，将海绵状材料浸入交联剂进行交联，交联产物反复经蒸馏水冲洗至中性；所述交联剂为浓度为40-60mM的EDC，交联时间为24h ；
[0050]5)将反复冲洗至中性的制备的海绵状交联产物置于真空干燥箱中干燥，得到复合胶原海绵，然后经切成不同规格后，环氧乙烷消毒，包装，即得。
[0051]实施例三:复合胶原海绵的制备:
[0052]I)将鱼源胶原蛋白(同实施例二)溶于体积分数为2%的乙酸溶液中，制成质量分数为0.5%的胶原蛋白溶液；[0053]2)将实施例一的白芨胶浸入蒸馏水，待充分膨胀后，置50-60°C的水浴中使其溶解，加水稀释至制成质量分数为2%的白芨胶溶液；
[0054]3)将上述制得的胶原蛋白溶液和白芨胶溶液混合，搅拌均匀，再混合加入独一味提取物细粉(同实施例二)，搅拌均匀；所述鱼源胶原蛋白、白芨胶和独一味提取物的质量比为 70:20:10o
[0055]4)将混匀后的混合溶液浇模，经冷冻干燥得到海绵状材料，将海绵状材料浸入交联剂进行交联，交联产物反复经蒸馏水冲洗至中性；所述交联剂为浓度为40-60mM的EDC，交联时间为24h ；
[0056]5)将反复冲洗至中性的制备的海绵状交联产物置于真空干燥箱中干燥，得到复合胶原海绵，然后经切成不同规格后，环氧乙烷消毒，包装，即得。
[0057]实施例四:复合胶原海绵的制备:
[0058]1)将鱼源胶原蛋白(购自法国罗赛洛公司，为鱼鳞胶原蛋白)溶于体积分数为2%的乙酸溶液中，制成质量分数为0.5%的胶原蛋白溶液；
[0059]2)将实施例一的白芨胶浸入蒸馏水，待充分膨胀后，置50-60°C的水浴中使其溶解，加水稀释至制成质量分数为2%的白芨胶溶液；
[0060]3)将上述制得的胶原蛋白溶液和白芨胶溶液混合，搅拌均匀，再混合加入独一味提取物细粉(同实施例一)，搅拌均匀；所述鱼源胶原蛋白、白芨胶和独一味提取物的质量比为 75:15:8o
[0061]4)将混匀后的混合溶液浇模，经冷冻干燥得到海绵状材料，将海绵状材料浸入交联剂进行交联，交联产物反复经蒸馏水冲洗至中性；所述交联剂为体积分数为0.2-0.3%的戊二醛，交联时间为24h;
[0062]5)将反复冲洗至中性的制备的海绵状交联产物置于真空干燥箱中干燥，得到复合胶原海绵，然后经切成不同规格后，环氧乙烷消毒，包装，即得。
[0063]实施例五:复合胶原海绵的止血效果实验
[0064]本实验是对胶原海绵的止血疗效、止血可靠性及体内吸收情况进行初步研究，并用解尔费思作对照。所用动物为2.5~3.0kg大耳白免，雌雄不限。
[0065]实验方法包括在免耳部制造2cm*lcm大小的出血创面，在兔肝、脾脏切除lcm*lcm组织形成渗血创面。用海绵材料敷压止血后，记录止血时间，观察敷料与创面的粘合情况，以及定期观察创面愈合和体内吸收情况。
[0066]止血效果观察及对比:
[0067]1)止血疗效观察
[0068]表免耳部、肝脏和脾脏的止血情况。
【权利要求】
1.一种复合胶原海绵，其特征在于:其由一定比例的鱼源胶原蛋白、白芨胶与独一味提取物冷冻干燥后添加交联剂进行交联，经水洗至中性，再次二次冷冻干燥而制成的多孔松软的海绵状敷料；所述鱼源胶原蛋白、白芨胶和独一味提取物的质量比为70-80:10-20:5-10。
2.权利要求1所述的复合胶原海绵的制备方法，其特征在于包括下列步骤: 1)将鱼源胶原蛋白溶于体积分数为2%的乙酸溶液中，制成质量分数为0.5%的胶原蛋白溶液； 2)将白芨胶浸入蒸馏水，待充分膨胀后，置50-60°C的水浴中使其溶解，加水稀释至制成质量分数为1-5%的白芨胶溶液； 3)将上述制得的胶原蛋白溶液和白芨胶溶液混合，加入独一味提取物细粉，搅拌均匀； 4)将混匀后的混合溶液浇模，经冷冻干燥得到海绵状材料，将海绵状材料浸入交联剂进行交联，交联产物反复经蒸馏水冲洗至中性；所述交联剂为体积分数为0.2-0.3%的戊二醛或浓度为40-60mM 的EDC，交联时间为12_24h ； 5)将反复冲洗至中性的制备的海绵状交联产物置于真空干燥箱中干燥，得到复合胶原海绵，然后经切成不同规格后，环氧乙烷消毒，包装，即得。
3.根据权利要求2所述的复合胶原海绵的制备方法，其特征在于所述鱼源胶原蛋白的制备方法为:以下所有操作均在低于20°C的条件下进行；将解冻后的鱼皮原料用0.1mol/L的NaOH溶液浸泡24h脱除杂蛋白，随后用去离子水充分洗涤至中性并用10%的正丁醇溶剂浸泡脱脂24h，用去离子水反复洗涤、浙干后加入瞬间变压提取灌上的高压浸溃罐中，加适量的0.5mol/L的乙酸溶液，充气加压8~lOkgf/cm2，搅拌浸泡1_2小时；将高压浸溃罐内的物料放入瞬间变压提取灌的高压浸溃罐上的低压提取灌内，加0.5mol/L的乙酸溶液搅拌提取12h，重复提取2次，提取残渣继续用含有1.0%(ff/V)胃蛋白酶的0.5mol/L乙酸搅拌提取24h，合并3次提取液离心分离，得到粗提液；向粗提液中添加NaCl至盐浓度为0.9mol/L，静置盐析24h后过滤，胶原蛋白沉淀用0.5mol/L的乙酸溶液复溶后依次用0.lmol/L的乙酸和蒸馏水透析，最后冷冻干燥后得到鱼源胶原蛋白样品； 所述瞬间变压提取灌包括设有搅拌器的低压提取灌，低压提取灌上设有通过联通阀连接的高压浸溃罐，所述高压浸溃罐上部设有可封闭的进料口、压力表、和连接气泵的进气阀；所述低压提取灌的罐体上设有可封闭的进料口、出渣口和放料阀。
4.根据权利要求2所述的复合胶原海绵的制备方法，其特征在于所述白芨胶的制备方法为:将白芨，粉碎，加6-8倍量的50-60°C水浸泡6-8h，时时搅拌、滤过，滤液备用；药渣再4-6倍量的50-60°C水浸泡2次，每次浸泡4h，滤过；合并3次滤液，浓缩成稠膏状，冷却后加95%乙醇，使含醇量达70%-75%，搅拌，即析出大量絮状沉液，静置lh，真空抽滤至干，真空干燥，研细，即得。
5.根据权利要求2所述的复合胶原海绵的制备方法，其特征在于所述独一味提取物的制备方法:取粉碎后的独一味药材，用水或40-70%乙醇提取2-3次，合并提取液，浓缩，将浓缩液上大孔吸附树脂，以水和10-30%乙醇洗脱除杂，再用40-80%乙醇洗脱，收集40-80%乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得独一味提取物。
【文档编号】C07K1/30GK103756005SQ201410010048
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月9日 优先权日:2014年1月9日
【发明者】宋理平, 马国红, 张延华, 冒树泉, 许 鹏, 王爱英, 王秉利, 吴君 申请人:山东省淡水渔业研究院