一种ods协同hsccc提取酱油渣中大豆异黄酮的方法
【专利摘要】本发明公开了一种ODS协同HSCCC提取酱油渣中大豆异黄酮的方法，该方法将酱油渣提取物经MPLC纯化，洗脱；将正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水放置，分离上相与下相；以上相作为固定相，下相为流动相，制得分离样品溶液；将上相作为固定相泵入高速逆流色谱仪，将下相为流动相，将流动相泵入到多层胶管前端；注入加有ODS的上相与下相的混合液，每毫升每毫升上相与下相的混合物中的混合物中加入ODS150‐250毫克，进行高速逆流色谱分离，得大豆异黄酮。本发明在逆流色谱柱中引入ODS，利用逆流色谱的液液分配及其硅胶微球改性基团吸附的协同作用，改善强极性天然产物的分离效果，将有效解决高速逆流色谱中强极性物质分离的难题。
【专利说明】—种ODS协同HSCCC提取酱油渣中大豆异黄酮的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及大豆异黄酮，特别是涉及一种ODS(十八烷基硅烷键合硅胶)协同HSCCC提取酱油渣中大豆异黄酮的方法，属于农副产品深加工及食品工业【技术领域】。
【背景技术】
[0002]酱油渣是酱油生产的副产品，生产过程有大量酱油渣生成。目前对其开发利用有限，主要用作饲料或肥料的配料，附加值低，对其有效成分的提取分离及高值化利用是酱油渣开发利用的一个重要方向。因此，提取分离出有药用价值的大豆异黄酮，对酱油渣循环利用的研究将具有重要的意义。即使在制取酱油后的豆渣仍含有丰富的大豆异黄酮成分，大豆异黄酮是大豆中的一种天然植物雌激素，具有多种生物学作用，与人体健康密切相关，除具有抗肿瘤作用外，还对衰老、心血管疾病、骨质疏松症及更年期综合症具有预防和治疗作用。因此，为了利用酱油渣资源，提取分离出有药用价值的大豆异黄酮，对酱油渣循环利用的研究将具有重要的意义。
[0003]现时对大豆异黄酮进行提取，主要是以加热回流提取和超声辅助提取为主，但加热回流提取对热不稳定成分不适用，温度过高导致部分黄酮类化合物分解；在放大到工业生产时超声提取效果较差。高速逆流色谱技术在分离一些简单体系和中、低极性样品体系方面存在其它分离技术无可超越的优势，但对于强极性的物质分离效果却受到溶剂体系的制约。
[0004]本实验在高效逆流色谱分离天然产物的过程中加入ODS (十八烷基硅烷键合硅胶)，利用高速逆流色谱(HSCCC)溶剂系统和硅胶微球的协同作用，来改善天然产物的分离效果。由于ODS是长链烷基键合相，有较高的碳含量和更好的疏水性，且其表面键合的硅醇基具有吸附功能。因此能利用ODS协同HSCCC进行分离酱油渣提取的样品。相关研究未见文献报道，因此值得我们对其深入研究。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是克服现有技术存在的问题，提供一种分离效果好，分离效率高的ODS协同HSCCC提取酱油渣中大豆异黄酮的方法。
[0006]本发明利用逆流色谱的液液分配及其硅胶微球改性基团吸附分离的协同作用，来改善逆流色谱的分本发明离效果，提高分离效率。主要是:(1)通过把强极性基团键合到硅胶微球的表面，可解决强极性物质的分离问题，而亲水作用色谱可满足这种分离的需要；
(2)将逆流色谱柱中引入0DS，利用逆流色谱的液液分配及其硅胶微球改性基团吸附的协同作用，来改善强极性 天然产物的分离效果；(3)在不改变逆流色谱仪器的基础上，借鉴高效液相色谱的研究思路，将逆流色谱液液分配原理与ODS的吸附分离功能有机的结合起来，在逆流色谱柱中填入硅胶微球并对其进行改性，引入功能化基团，利用逆流色谱的液液分配及其硅胶微球改性基团吸附分离的协同作用，来改善逆流色谱的分离效果，提高分离效率。[0007]本发明为了实现上述目的，采用如下技术方案:
[0008]一种ODS协同HSCCC提取酱油渣中大豆异黄酮的方法，包括以下步骤:
[0009](1)粗提物的制备:将酱油渣提取物经MPLC纯化，以乙醇-蒸馏水为洗脱液，流速为15 - 25ml/min进行梯度洗脱，然后将溶剂减压浓缩，得到大豆异黄酮粗提物，置冰箱保存；
[0010](2)样品溶液的制备:将正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水加入到分液漏斗中，充分震荡后放置12 - 24小时，将上相与下相分离；按体积份数计，正己烷为100份，乙酸乙酯为150 - 200份，甲醇为150 - 250份，水为150 - 200份；以上相作为固定相，下相为流动相；将100体积份上相与80 -130份下相混合，每毫升上相与下相的混合物中溶解大豆异黄酮粗提物3 - 15毫克，制得分离样品溶液；
[0011](3)高速逆流分离:高速逆流分离:将上相作为固定相泵入高速逆流色谱仪，将高速逆流色谱仪的多层胶管柱充满；当高速逆流色谱仪稳定运行时，将下相为流动相，将流动相泵入到多层胶管前端；当有15 -25ml的固定相被推出的时候，注入I _3ml加有ODS的上相与下相的混合液，每毫升每毫升上相与下相的混合物中的混合物中加入0DS150 - 250毫克；当有流动相从多层胶管尾端流出时，将5 - 15ml分离样品溶液从进样口注入，再补充注入10 - 20ml固定相，进行高速逆流色谱分离，得大豆异黄酮。
[0012]为进一步实现本发明目的，优选地，所述梯度洗脱是在前15min内，以100%水进行洗脱；15 - 30min内，以体积计，洗脱液为20%乙醇-80%水；30 - 45min内，洗脱液为40%乙醇-60%水；45 - 60min内，洗脱液为60%乙醇-40%水；60 - 75min内，以80%乙醇-20%水进行洗脱；75 -90min内，以95%乙醇-5%水进行洗脱；然后将溶剂减压浓缩，得到大豆异黄酮粗提物，置冰箱保存。
[0013]所述将上相作为固定相泵入高速逆流色谱仪是以8.5 -10.5ml/min的流速将上相作为固定相泵入高速逆流色谱仪。所述稳定运行的速度为600 - 800rpm。所述将流动相泵入到多层胶管前端是将流动相以1.2 - 1.8ml/min的流速泵入到多层胶管前端。
[0014]用紫外检测器在254nm波长持续检测高速逆流色谱分离的流出物，得到酱油渣提取物的HSCCC色谱图，根据谱图中不同峰的出峰时间，收集每个峰的流出物，得大豆异黄酮。
[0015]与已有技术相比，本发明具有如下有益效果:
[0016](I)本发明不用任何固态载体的液、液色谱技术，分离效率高，产品纯度高。
[0017](2)本发明不存在载体对样品的吸附和污染，制备量大和溶剂消耗少。
[0018](3)本发明显著提高了酱油渣的附加值，有利于酱油渣的综合开发利用。
[0019](4)本发明也适用于其他中高极性天然产物的提取，对极性样品的吸附作用更显著。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1A、1B、1C为对比实施例和实施例1中ODS微球加入量分别为0mg、300mg和600mg的酱油渣提取物的HSCCC色谱图。
【具体实施方式】[0021]以下结合实施例来对本发明作进一步说明，但本发明所要求保护的范围并不局限于实施例所表述的范围。
[0022]对比实施例:以MPLC法提取酱油渣中大豆异黄酮的方法
[0023]将酱油渣提取物经MPLC纯化，以乙醇-蒸馏水为洗脱液，流速为20ml/min进行梯度洗脱。O - 15min时，以100%水进行洗脱；15 - 30min时，洗脱液为20%乙醇-80%水；30 - 45min时，洗脱液为40%乙醇-60%水；45 - 60min时，洗脱液为60%乙醇-40%水；60 - 75min时，以80%乙醇-20%水进行洗脱；75 - 90min时，以95%乙醇-5%水进行洗脱。以波长254nm检测目标物大豆异黄酮。然后将溶剂减压浓缩，得到大豆异黄酮粗提物，置冰箱保存；
[0024]将正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水按体积比1:2:2:1.8加入到分液漏斗中，充分震荡后放置一晚，将上相与下相分离，以上相作为固定性，下相为流动相。每毫升上相与下相(体积比为1:1)的混合物中溶解粗提物5毫克，制得分离样品溶液。
[0025]将上相作为固定相以9.9ml/min通过输液泵输入高速逆流色谱仪，将多层胶管中充满。将仪器以700rpm的速度稳定运行，使仪器内形成单向流体动力体系，将下相为流动相以1.2ml/min的流速泵入到多层胶管前端，达到单向流体动力平衡状态。当有流动相从尾端流出时，将2ml分离样品溶液(每毫升上相与下相混合物中溶解50mg样品)从进样口注入，继续用流动相进行洗脱。用紫外检测器在254nm持续检测胶管尾部的流出物，如图1A所示，根据谱图中的峰形，手动收集每个峰流出物，然后经高效液相鉴定纯度，以甲醇一 0.1%乙酸水作为流动相，流动相的流速为0.8mL/min，进行二元线性梯度洗脱(甲醇:10 -20min，45 -65%; 20 -50min, 65%;20 -25min, 65 -75%)，以波长254nm检测目标物大豆异黄酮。最后用量筒测得相应的保留值。
[0026]实施例1`[0027]将酱油渣提取物经MPLC纯化，以乙醇-蒸馏水为洗脱液，流速为20ml/min进行梯度洗脱。O - 15min时，以100%水进行洗脱；15 - 30min时，以体积计，洗脱液为20%乙醇，80%水；30 -45min时，洗脱液为40%乙醇，60%水；45 -60min时，洗脱液为60%乙醇，40%水；60 - 75min时，以80%乙醇，20%水进行洗脱；75 - 90min时，以95%乙醇，5%水进行洗脱。以波长254nm检测目标物大豆异黄酮。然后将溶剂减压浓缩，得到大豆异黄酮粗提物，置冰箱保存；
[0028]将正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水按体积比1:2:2:1.8加入到分液漏斗中，充分震荡后放置一晚，将上相与下相分离，以上相作为固定性，下相为流动相。每毫升上相与下相(体积比为1:1)的混合物中溶解粗提物5毫克，制得分离样品溶液。
[0029]高速逆流色谱技术是一种无固体载体的连续高效的液液分配色谱分离技术，采用多层缠绕的螺旋胶管柱，由柱体的高速行星式运动产生的不对称离心力场实现两相溶剂体系的高效混合、分配及充分保留，形成连续流萃取，从而实现不同溶解分配系数的溶质在两相溶剂中的高效分离。以9.9ml/min的流速将上相作为固定相泵入高速逆流色谱仪，将多层胶管柱充满；当仪器以700rpm的速度稳定运行时，将下相为流动相以1.2ml/min的流速泵入到多层胶管前端；当有20ml的固定相被推出的时候，通过六通阀注入2ml ODS微球(购买自苏州纳微生物科技有限公司)的上下相混合液；当有流动相从多层胶管尾端流出时，将IOml分离样品溶液从进样口注入，再补充注入15ml固定相，进行高速逆流色谱分离；用紫外检测器在254nm波长持续检测流出物，根据如下不同的ODS微球的加入量，分别得到图1BUC为所示的ODS微球加入量分别为300mg和600mg的酱油渣提取物的HSCCC色谱图。根据图1B、1C中峰I和峰II的出峰时间，手动分别收集每个峰的流出物，得到溶于流动相的大豆异黄酮，然后经高效液相色谱鉴定纯度，根据大豆异黄酮的标准物质的HPLC测定结果比对，表明峰I为大豆苷元，峰II为染料木素(统称为大豆异黄酮)。最后用量筒测得相应的保留值。检测结果如表1所示，表1中加入的Y -氨丙基硅胶微球的量为0mg、300mg和600mg，即每毫升上相与下相(体积比为1:1)的混合物中加入Y -氨丙基硅胶微球0，150,300毫克。对比实施例未加入ODS微球。
[0030]表1不同量的ODS对HSCCC分离参数影响
【权利要求】
1.一种ODS协同HSCCC提取酱油渣中大豆异黄酮的方法，其特征在于包括以下步骤:(1)粗提物的制备:将酱油渣提取物经MPLC纯化，以乙醇-蒸馏水为洗脱液，流速为15 - 25ml/min进行梯度洗脱，然后将溶剂减压浓缩，得到大豆异黄酮粗提物，置冰箱保存； (2)样品溶液的制备:将正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水加入到分液漏斗中，充分震荡后放置12 - 24小时，将上相与下相分离；按体积份数计，正己烷为100份，乙酸乙酯为150 - 200份，甲醇为150 - 250份，水为150 - 200份；以上相作为固定相，下相为流动相；将100体积份上相与80 -130份下相混合，每毫升上相与下相的混合物中溶解大豆异黄酮粗提物3-15毫克，制得分离样品溶液； (3)高速逆流分离:高速逆流分离:将上相作为固定相泵入高速逆流色谱仪，将高速逆流色谱仪的多层胶管柱充满；当高速逆流色谱仪稳定运行时，将下相为流动相，将流动相泵入到多层胶管前端；当有15 - 25ml的固定相被推出的时候，注入1- 3ml加有ODS的上相与下相的混合液，每毫升每毫升上相与下相的混合物中的混合物中加入0DS150 -250毫克；当有流动相从多层胶管尾端流出时，将5 - 15ml分离样品溶液从进样口注入，再补充注入10 - 20ml固定相，进行高速逆流色谱分离，得大豆异黄酮。
2.根据权利要求1所述的ODS协同HSCCC提取酱油渣中大豆异黄酮的方法，其特征在于:所述梯度洗脱是在前15min内，以100%水进行洗脱；15 -30min内，以体积计，洗脱液为20%乙醇-80%水；30 - 45min内，洗脱液为40%乙醇-60%水；45 - 60min内，洗脱液为60%乙醇-40%水；60 - 75min内，以80%乙醇-20%水进行洗脱；75 - 90min内，以95%乙醇-5%水进行洗脱；然后将溶剂减压浓缩，得到大豆异黄酮粗提物，置冰箱保存。
3.根据权利要求1所述的ODS协同HSCCC提取酱油渣中大豆异黄酮的方法，其特征在于:所述将上相作为固定相泵入高速逆流色谱仪是以8.5 - 10.5ml/min的流速将上相作为固定相泵入高速逆流色谱仪。
4.根据权利要求1所述的ODS协同HSCCC提取酱油渣中大豆异黄酮的方法，其特征在于:所述稳定运行的速度为600 - 800rpm。
5.根据权利要求1所述的ODS协同HSCCC提取酱油渣中大豆异黄酮的方法，其特征在于:所述将流动相泵入到多层胶管前端是将流动相以1.2 - 1.8ml/min的流速泵入到多层胶管前端。
6.根据权利要求1所述的ODS协同HSCCC提取酱油渣中大豆异黄酮的方法，其特征在于:用紫外检测器在254nm波长持续检测高速逆流色谱分离的流出物，得到酱油渣提取物的HSCCC色谱图，根据谱图中不同峰的出峰时间，收集每个峰的流出物，得大豆异黄酮。
【文档编号】C07D311/40GK103739583SQ201410013128
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2014年1月10日 优先权日:2014年1月10日
【发明者】梁勇, 邹爱国, 陈穗, 杨明泉, 刘占, 孙丽霞, 樊瑞 申请人:广东美味鲜调味食品有限公司