一种从东方伊萨酵母生物转化液中分离纯化胞二磷胆碱的方法
【专利摘要】本发明公开一种从东方伊萨酵母生物转化液中分离纯化胞二磷胆碱的方法。该方法将东方伊萨酵母CDP-c生物转化液通过一种阴离子交换树脂柱，先用去离子水淋洗掉未吸附物质，再采用0.01～0.50M盐溶液洗脱CDP-c、0.10～1.00M盐溶液洗脱胞苷酸，一次性即可获得高纯度（＞99%）、高收率（＞88%）的CDP-c，并可回收未完全反应的胞苷酸。本发明大大简化了分离过程，操作简便，成本低，环保节约，适应于工业化大规模生产。
【专利说明】一种从东方伊萨酵母生物转化液中分离纯化胞二磷胆碱的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及胞二磷胆碱的分离纯化方法，尤其涉及从东方伊萨酵母生物转化液中分离纯化胞二磷胆碱的方法，属于生物分离【技术领域】。
【背景技术】
[0002]胞二磷胆碱又名胞苷-5’-二磷酸胆碱(Cytidine-5’ -diphosphate choline,CDP-c, CDP-胆碱)，是磷脂代谢的重要前体及磷脂酰胆碱合成的中间体，为卵磷脂生物合成必需的辅酶，对中枢神经系统损害模型和脑病有显著疗效(Sugino, Biochimica etBiophysica Acta, 1960.40:425-434)。研究证明CDP-胆碱能促进生物代谢，尤其是磷脂的生物合成反应(Roe J.H., Journal of Biological Chemistry, 1954.210(2):703-707.)0
20世纪 50 年代 kennedy (Kennedy E.P., Journal of the American ChemicalSociety, 1955.77 (I): 250-251.)博士等人发现并确定其分子结构，稍后Rossiter(Rossiter, R.., 1.McLeod, and K.Strickland, Canadian Journal of Biochemistry andPhysiology, 1957.35(11):945-951.)等阐明其功能。60年代，日本武田公司研发并用于治疗脑外伤、脑手术等伴随的意识障碍，临床上获得成功，其商品名为Nicholin，中译名尼柯灵(李良铸，李明晔，最新生化药物制备技术.2001:中国医药科技出版社.)。由此，关于胞二磷胆碱的研究在世界范围内展开。我国自上世纪70年代，开发了利用酵母细胞生产胞二磷胆碱的工艺技术(王永智，尉亚辉，聂利芳，西北药学杂志，2009.24 (3):235-236.)；华东理工大学牛红星等人，将k-卡拉胶-魔芋-多糖复配胶包埋的啤酒酵母细胞，经冻融处理后用于合成胞嘧啶核苷二磷酸胆碱(牛红星，邱蔚然，丁庆豹，华东理工大学学报，2002.)。
[0003]生物合成法制备胞二磷胆碱的反应液中，含有蛋白质、色素、未完全反应的磷酸胆碱钙、胞苷酸、磷酸盐、硫酸镁以及`葡萄糖代谢副产物和胞苷等物质，这些杂质给胞二磷胆碱的分离纯化带来很多困难。从上述反应液中提取胞二磷胆碱需要经过菌体和蛋白的去除，769活性炭吸附，离子交换树脂吸附，分步洗脱，碳粉脱色等步骤(黄颖，中国医药工业杂志，1985.1:001.)，过程复杂，得率只有45%，损耗严重，反应剩余的胞苷酸没有得以回收利用，不适应于工业大规模生产。
【发明内容】
[0004]针对现有技术存在的不足，本 申请人:经过研究改进，提供一种从东方伊萨酵母生物转化液中分离纯化胞二磷胆碱的方法。本发明仅利用一种阴离子交换树脂柱实现了一次性从东方伊萨酵母生物转化液中分离高纯度、高收率的CDP-c及回收未完全反应胞苷酸，操作简便，过程简单，成本低，适应于工业化大规模生产。
[0005]本发明的技术方案如下:
[0006]一种从东方伊萨酵母生物转化液中分离纯化胞二磷胆碱的方法，包括如下步骤:[0007](I)将⑶P-c含量为0.1~10g/L (优选为2~5g/L)的东方伊萨酵母生物转化液通过强碱或弱碱性阴离子交换树脂柱；
[0008](2)上柱完毕，用去离子水淋洗所述阴离子交换树脂柱，冲洗掉未吸附物质；
[0009](3)用0.01~0.50M的盐溶液洗柱，直至柱出口处流出液不再含有⑶P_c，收集洗脱液，得到高纯度⑶P-C溶液；
[0010](4)用0.10~1.0OM的盐溶液洗柱，直至柱出口处流出液不再含有胞苷酸，收集洗脱液，蒸发浓缩，透析袋去盐，冻干，回收得到胞苷酸。
[0011 ] 具体地，步骤(1)所述强碱或弱碱性阴离子交换树脂柱选自大孔苯乙烯系强碱性阴离子交换树脂柱或大孔苯乙烯系弱碱性阴离子交换树脂柱，包括717、D301、D318，颗粒度0.3~1.2mm≥95%，上柱总量为柱交换总量的5~40% (质量比)，优选为10~15% (质量比)，柱高径比为10:1~50:1，优选为10:1~20:1。
[0012]具体地，步骤(1)所述强碱或弱碱性阴离子交换树脂柱上柱流速为0.2~2mL/min,优选为 0.5 ~L 5mT,/miη。
[0013]优选地，步骤(3)所述盐溶液浓度为0.02~0.20Μ。
[0014]优选地，步骤(4)所述盐溶液浓度为0.20~0.50Μ。
[0015]具体地，步骤(3)和(4)所述洗脱用盐溶液选自NaCl、NH4HCO3^ NaHC03、NH4Cl,Na2C03、KCl、KHCO3> K2CO3,优选为 NaCl、NaHCO3 或 Na2C03。
[0016]本发明还包括将步骤(3)所得⑶P-C溶液浓缩后，通过截留分子量100的透析袋去盐，冻干，得到纯度98%以上胞二磷胆碱固体的步骤。
[0017]本发明还包括在⑶P-C分离纯化结束后，将所述阴离子交换树脂柱用盐、酸和碱分别冲洗以循环使用的步骤。
[0018]本发明的有益技术效果在于:
[0019]本发明以东方伊萨酵母生物胞二磷胆碱转化液为提纯原料，仅采用一种强碱或弱碱性阴离子交换树脂层析法将其中的大部分物质吸附在柱子上，利用各物质同树脂结合能力的不同，精心摸索优化洗脱浓度和条件，最终实现较低浓度(0.01~0.50M，优选为
0.02~0.20M)盐溶液洗脱胞二磷胆碱，较高浓度(0.10~1.00M，优选为0.20~0.50M)盐溶液洗脱苷酸，达到一次性分离纯化胞二磷胆碱和回收反应剩余胞苷酸的目的。本发明生物转化液只需过一次柱即可得到高纯度(> 99%)、高收率(> 88%)的胞二磷胆碱，并可回收大部分未完全反应的胞苷酸，其他杂质均被去除，与现有技术相比，操作简便、过程简单，环保节约，成本低、产品收率高，分离效果好，克服了现有CDP-c分离工艺需经过两种以上的分离柱组合来实现、⑶P-c和胞苷酸回收率低、分离过程繁琐的缺陷，适应于工业化大规模生产。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1为本发明⑶P-C分离纯化工艺流程示意图。
【具体实施方式】
[0021]以下结合过实施例对本发明的【具体实施方式】进行具体说明。
[0022]以下实施例1~实施例3中东方伊萨酵母胞二磷胆碱生物转化液制备方法如下:[0023]以葡萄糖为能量供体，一方面提供菌体的能量需求，另一方面为胞二磷胆碱合成酶系提供ATP;通过添加钾离子、镁离子和锰离子中的一种或组合改变代谢流向，提高ATP的再生效率，从而与胞二磷胆碱酶系速率相匹配，实现高效制备胞二磷胆碱。(具体制备方法参见如下专利文件:张梁，石贵阳，尤翠萍，等.一株东方伊萨酵母及其全细胞转化产胞二磷胆碱的方法:中国，CN102286386A[P].2011-12-21.)，其中东方伊萨酵母(1.0rientalis)Zl购自中国典藏培养物保藏中心，菌种编号为=CCTCC NO:2011272。
[0024]以实施例所涉及分析检测方法如下:蛋白质采用考马斯亮蓝显色法测定，钙镁离子采用铬黑T指示剂测定，⑶P-c和胞苷酸采用HPLC法测定。
[0025]实施例1
[0026]3OOmL东方伊萨酵母胞二磷胆碱生物转化液,含Q)P-cl350mg,胞苷酸650mg,磷酸盐3750mg,磷酸胆碱|丐500mg,硫酸盐900mg。
[0027](I)将上述胞二磷胆碱生物转化液通过717HC03_型阴离子交换树脂柱，柱尺寸20 X 300mm，柱体积60mL，上柱流速0.5mL/min，上柱总量为柱交换总量的13.5% (质量比)。
[0028](2)上柱完毕，用300mL去离子水淋洗交换柱以冲洗掉未吸附物质，直至流出液全为水。
[0029](3)用0.03M氯化钠溶液洗柱，直至柱出口处流出液不再含有⑶P_c，收集洗脱液200mL，得到高纯度⑶P-c溶液。
[0030](4)用0.3M氯化钠溶液洗柱，直至柱出口处流出液不再含有胞苷酸，收集洗脱液150mLo
[0031](5)将步骤(3)收集的200mL CDP_c洗脱液浓缩至30mL，通过截留分子量100的透析袋去盐，冻干，可得胞二磷胆碱固体1153mg，收率为85.4%，经检测胞二磷胆碱纯度99%，未检测出磷酸盐及镁离子， 蛋白质检测为阴性；将步骤(3)收集的150mL胞苷酸洗脱液做同样处理，得胞苷酸581mg，收率为89.4%。
[0032]实施例2
[0033]1000mL东方伊萨酵母胞二磷胆碱生物转化液，含胞二磷胆碱4500mg，胞苷酸2039mg，磷酸盐11380mg，磷酸胆碱钙1520mg，硫酸盐2750mg。
[0034](I)将上述胞二磷胆碱生物转化液通过717HC03_型阴离子交换树脂柱，柱尺寸30 X 500mm，柱体积200mL，上柱流速1.0mL/min。上柱总量为柱交换总量的12.8%(质量比)。
[0035](2)上柱完毕，用1000mL去离子水淋洗交换柱以冲洗掉未吸附物质，直至流出液全为水。
[0036](3)用0.04M氯化钠溶液洗柱，直至柱出口处流出液不再含有⑶P_c，收集洗脱液800mL，得到高纯度⑶P-c溶液。
[0037](4)用0.2M氯化钠溶液洗柱，直至柱出口处流出液不再含有胞苷酸，收集洗脱液650mLo
[0038](5)将步骤(3)收集的8001!^ CDP_c洗脱液浓缩至IOOmL,通过截留分子量100的透析袋去盐，冻干，可得胞二磷胆碱固体4025mg，收率为89.4%，经检测胞二磷胆碱纯度99%，未检测出磷酸盐及镁离子，蛋白质检测为阴性；将步骤(3)收集的650mL胞苷酸洗脱液做同样处理，得胞苷酸1837mg，收率为90.1%。
[0039]实施例3[0040]300mL胞二磷胆碱生物转化液，含胞二磷胆碱1350mg，胞苷酸650mg，磷酸盐3750mg,磷酸胆碱|丐500mg,硫酸盐900mg。
[0041](1)将上述胞二磷胆碱生物转化液通过D301HC03_型阴离子交换树脂柱，柱尺寸20X300mm，柱体积60mL，上柱流速0.5mL/min。上柱总量为柱交换总量的11.3%(质量比)。
[0042](2)上柱完毕，用300mL去离子水淋洗交换柱以冲洗掉未吸附物质，直至流出液全为水。
[0043](3)用0.03M氯化钠溶液洗柱，直至柱出口处流出液不再含有⑶P_c，收集洗脱液200mL，得到高纯度⑶P-c溶液。
[0044](4)用0.3M氯化钠溶液洗柱，直至柱出口处流出液不再含有胞苷酸，收集洗脱液150mLo
[0045](5)将步骤(3)收集的200mL CDP_c洗脱液浓缩至30mL，通过截留分子量100的透析袋去盐，冻干，可得胞二磷胆碱固体1051mg，收率为77.9%，经检测胞二磷胆碱纯度98%，未检测出磷酸盐及镁离子，蛋白质检测为阴性；将步骤(3)收集的150mL胞苷酸洗脱液做同样处理，得胞苷酸573mg，收率为88.2%。
[0046]上述试验结果证明:利用本发明方法一次性即可获得即可获得高纯度(> 99%)、高收率(> 88%)的⑶P-c，并可回收未完全反应的胞苷酸。
[0047]以上所述的仅是本发明的优选实施方式，本发明不限于以上实施例。可以理解，本领域技术人员在不脱离本发明的精神和构思的前提下直接导出或联想到的其他改进和变化，均应认为包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种从东方伊萨酵母生物转化液中分离纯化胞二磷胆碱的方法，其特征在于包括如下步骤: (1)将⑶P-C含量为0.1~10g/L的东方伊萨酵母生物转化液通过强碱或弱碱性阴离子交换树脂柱； (2)上柱完毕，用去离子水淋洗所述阴离子交换树脂柱，冲洗掉未吸附物质； (3)用0.01~0.50M的盐溶液洗柱，直至柱出口处流出液不再含有⑶P-c，收集洗脱液，得到高纯度⑶P-c溶液； (4)用0.10~1.0OM的盐溶液洗柱，直至柱出口处流出液不再含有胞苷酸，收集洗脱液，蒸发浓缩，透析袋去盐，冻干，回收得到胞苷酸。
2.如权利要求1所述分离纯化胞二磷胆碱的方法，其特征在于:步骤(1)所述强碱或弱碱性阴离子交换树脂柱选自大孔苯乙烯系强碱性阴离子交换树脂柱或大孔苯乙烯系弱碱性阴离子交换树脂柱，上柱总量为柱总交换量的5~40% (质量比)，柱高径比为10:1~50:1。
3.如权利要求2所述分离纯化胞二磷胆碱的方法，其特征在于:所述大孔苯乙烯系强碱性阴离子交换树脂柱或大孔苯乙烯系弱碱性阴离子交换树脂柱包括717、D301、D318，颗粒度0.3~1.2mm≥95%。
4.如权利要求2所述分离纯化胞二磷胆碱的方法，其特征在于:所述大孔苯乙烯系强碱性阴离子交换树脂柱或大孔苯乙烯系弱碱性阴离子交换树脂柱上柱总量为柱总交换量的10~15% (质量比)，柱高径比为10:1~20:1。
5.如权利要求1所述分离纯化胞二磷胆碱的方法，其特征在于:步骤(1)所述强碱或弱碱性阴离子交换树脂柱上柱流速为0.2~2mL/min。
6.如权利要求1所述分离纯化胞二磷胆碱的方法，其特征在于:步骤(3)所述盐溶液浓度为 0.02 ~0.20M。
7.如权利要求1所述分离纯化胞二磷胆碱的方法，其特征在于:步骤(4)所述盐溶液浓度为 0.20 ~0.50M。
8.如权利要求1所述分离纯化胞二磷胆碱的方法，其特征在于:步骤(3)和(4)所述洗脱用盐溶液选自 NaCl、NH4HC03、NaHCO3> NH4Cl,Na2C03> KC1、KHC03、K2C03。
9.如权利要求1所述分离纯化胞二磷胆碱的方法，其特征在于还包括将步骤(3)所得CDP-c溶液浓缩后，通过截留分子量100的透析袋去盐，冻干，得到纯度98%以上胞二磷胆碱固体的步骤。
10.如权利要求1所述分离纯化胞二磷胆碱的方法，其特征在于还包括在CDP-C分离纯化结束后，将所述阴离子交换树脂柱用盐、酸和碱分别冲洗以循环使用的步骤。
【文档编号】C07H1/06GK103819522SQ201410068841
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年2月27日 优先权日:2014年2月27日
【发明者】张梁, 石贵阳, 宋丽芳, 尤翠萍, 李赢, 顾正华, 丁重阳 申请人:江南大学