一种黄曲霉毒素生物合成前体物st的人工抗原及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种黄曲霉毒素生物合成前体物ST的人工抗原及其制备方法。首先使羟基乙酸与黄曲霉毒素生物合成前体物ST中的二呋喃环的双键反应，得到带有羧甲氧基活性基团的黄曲霉毒素生物合成前体物ST半抗原，然后使ST半抗原中的羧基与载体蛋白质上的氨基相连，最后通过透析、冷冻干燥得到黄曲霉毒素生物合成前体物ST的人工抗原；本发明的有益效果：1.能够有效地制备出黄曲霉毒素生物合成前体物ST的人工抗原，从而生产出灵敏度高、特异性强的抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST单克隆抗体；2.制备过程简便可行，成本低廉，容易规模化生产和推广应用；3.合成的黄曲霉毒素生物合成前体物ST人工抗原具有较好的稳定性。
【专利说明】一种黄曲霉毒素生物合成前体物ST的人工抗原及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种黄曲霉毒素生物合成前体物ST的人工抗原及其制备方法。
【背景技术】
[0002]真菌毒素是产毒真菌分泌产生的次生代谢产物，是能引起人畜各种损害的天然有毒化合物。在已经发现的真菌毒素中黄曲霉毒素(aflatoxin，简称AFT)是毒性最强的真菌毒素，其毒性、致癌性和污染频率均居生物毒素的首位。黄曲霉毒素生物合成前体物杂色曲霉素即黄曲霉毒素生物合成前体物ST是黄曲霉毒素合成的前体物，主要是由杂色曲霉、黄曲霉、构巢曲霉、细皱曲霉等真菌产生，其可污染大多数粮食和饲草，尤其对小麦、玉米、花生和饲草等污染更为严重。黄曲霉毒素生物合成前体物ST的基本结构是由二呋喃环与氧杂蒽酮连接组成，其结构类似于黄曲霉毒素，毒性仅次于黄曲霉毒素，具有肝毒性，肾毒性，细胞遗传毒性和强致癌性，它污染食品及饲料后，会直接或间接进入人类食品链，威胁人类的健康和生命安全，危害程度与黄曲霉毒素生物合成前体物ST的摄入量成正相关。我国属于黄曲霉毒素生物合成前体物ST污染较重的地区，加强对食品及饲料中黄曲霉毒素生物合成前体物ST的检测是增强食品安全性的一个重要环节。因此，对可能污染黄曲霉毒素生物合成前体物ST的谷物及其制品进行ST含量检测非常必要。
[0003]目前，黄曲霉毒素生物合成前体物ST的检测方法主要有薄层层析法(TLC)和液相色谱法，其中，TLC方法具有操作简单，不需要复杂精密的仪器设备的优点，但灵敏度较低，准确性不高；其对大米、玉米、小麦样品中黄曲霉毒素生物合成前体物ST的最低检出量为25 μ g/kg ;对黄豆、花生样品中黄曲霉毒素生物合成前体物ST的最低检出量为50μ g/kg。近年来，高效液相色谱法(HPLC)在真菌毒素检测中得到广泛应用，对黄曲霉毒素生物合成前体物ST的检测也有报道`，但是其前处理繁琐、仪器设备昂贵、需要严格的操作环境以及专业的操作人员等限制了此方法在基层检测中的应用。因此，研究开发新兴的黄曲霉毒素生物合成前体物ST快速检测技术是我国检测市场的迫切需求，对保障我国食品消费安全具有重要意义。
[0004]免疫分析技术因其具有的灵敏度高、检测时间短、操作简单等优点，已逐渐成为黄曲霉毒素等污染物快速检测技术研究的热点，但针对黄曲霉毒素生物合成前体物ST的快速检测技术还鲜为报道。抗原和抗体是免疫分析技术的核心试剂和技术源头。黄曲霉毒素生物合成前体物ST分子量为324，属小分子化合物? 1000),不能直接刺激动物产生抗体，只有和牛血清蛋白(BSA)、卵清白蛋白(0VA)、多聚赖氨酸等载体蛋白质共价偶联后，才能转化为既具有反应原性又具有免疫原性的完全抗原，刺激动物产生抗体。目前报道的黄曲霉毒素生物合成前体物ST人工抗原(合成方法主要是硼氢化钠还原法)免疫获得的抗体灵敏度低、特异性差。
【发明内容】
[0005]本发明针对现有技术存在的不足，提供一种黄曲霉毒素生物合成前体物ST的人工抗原及其制备方法。其能生产出灵敏度高、特异性强的黄曲霉毒素生物合成前体物ST的抗体；制备过程简便可行，容易规模化生产和推广应用。
[0006]为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为:
一种黄曲霉毒素生物合成前体物ST的人工抗原，其特征在于:所述黄曲霉毒素生物合成前体物ST的人工抗原是由黄曲霉毒素生物合成前体物ST和载体蛋白质偶联制备得到，所述偶联的过程为:首先将黄曲霉毒素生物合成前体物ST中的二呋喃环的双键打开，连接上羧甲氧基活性基团，再使该羧甲氧基活性基团上的羧基与载体蛋白质上的氨基连接。
[0007]—种黄曲霉毒素生物合成前体物ST的人工抗原的制备方法，其特征在于:首先使羟基乙酸与黄曲霉毒素生物合成前体物ST中的二呋喃环的双键反应，得到带有羧甲氧基活性基团的黄曲霉毒素生物合成前体物ST半抗原，然后运用活泼酯法，在室温下使黄曲霉毒素生物合成前体物ST半抗原中的羧基与载体蛋白质上的氨基相连，最后通过透析、冷冻干燥得到黄曲霉毒素生物合成前体物ST的人工抗原。[0008]按上述方案，所述的羟基乙酸与黄曲霉毒素生物合成前体物ST中的二呋喃环的双键反应的过程为:首先，称取0.1~Ig羟基乙酸溶于0.4~4 mL三氟乙酸；然后,称取I~10 mg黄曲霉毒素生物合成前体物ST溶于0.4~4 mL乙腈中，得黄曲霉毒素生物合成前体物ST的乙腈溶液；最后，用注射器吸取黄曲霉毒素生物合成前体物ST的乙腈溶液轻轻吹打入羟基乙酸/三氟乙酸的混合物中，室温搅拌反应4~6 h，反应结束后，旋转蒸发溶剂，得到淡黄绿色油状物即为黄曲霉毒素生物合成前体物ST半抗原。
[0009]按上述方案，所述的黄曲霉毒素生物合成前体物ST半抗原中的羧基与载体蛋白质上的氨基相连的过程为:称取I~10 mg黄曲霉毒素生物合成前体物ST半抗原、4~30mg N-羟基琥拍酰亚胺置于反应瓶中反应I~2 h ;称取7~45 mg碳二亚胺溶于0.2~1.2 mL的1，4-二氧六烷中，得碳二亚胺的1，4-二氧六烷溶液，然后将其逐滴滴加于反应瓶中，常温下反应4~5 h，直至反应瓶中有白色沉淀生成，反应结束后，室温静置过夜，次日，离心取上清；然后将上清逐滴加入到溶有4~30 mg载体蛋白质的PBS溶液中，加样结束后计时，反应4~5 h，得到水相的黄曲霉毒素生物合成前体物ST完全抗原。
[0010]按上述方案，所述PBS溶液为0.2 mol/L, pH 8.0的磷酸盐缓冲液，所述PBS溶液的体积为5~8 mL。
[0011]按上述方案，所述的透析、冷冻干燥过程为:将水相的黄曲霉毒素生物合成前体物ST完全抗原密闭于透析袋中，以0.01~0.02 mol/L pH8.0的磷酸盐缓冲液作为透析液，共透析3天，每间隔4~12小时更换I次透析液；最后I次透析结束后，将透析袋中的溶液分装，经冷冻干燥，即得到黄曲霉毒素生物合成前体物ST人工抗原。
[0012]上述方案所述的载体蛋白质可选用牛血清白蛋白、卵清白蛋白、血蓝蛋白、多聚赖氨酸等生物蛋白质或人造多肽。
[0013]按上述方案，一种黄曲霉毒素生物合成前体物ST的人工抗原的制备方法，其特征在于:
(I)取市售的羟基乙酸0.1克溶于0.4 mL三氟乙酸；称取I mg黄曲霉毒素生物合成前体物ST溶于0.4 mL乙腈中；得黄曲霉毒素生物合成前体物ST的乙腈溶液；用注射器吸取黄曲霉毒素生物合成前体物ST的乙腈溶液轻轻吹打入羟基乙酸/三氟乙酸的混合物中，室温条件下搅拌反应4 h ;将反应溶液旋转蒸发溶剂，得到淡黄绿色油状物即为黄曲霉毒素生物合成前体物ST半抗原；
(2)取Img黄曲霉毒素生物合成前体物ST半抗原、4mg N-羟基琥珀酰亚胺置于反应瓶中反应Ih ;称取7mg碳二亚胺溶于0.2mL的1，4- 二氧六烷中，得碳二亚胺的1，4- 二氧六烷溶液，然后将其逐滴滴加于反应瓶中，室温下反应4h，直至反应瓶中有白色沉淀生成；反应结束后，将反应物室温静置过夜，次日，在8000 r/min条件下离心5min，取上清；称取4mg牛血清白蛋白溶于5 mL、0.2摩尔每升、pH 8.0的磷酸盐缓冲液中；将上述上清逐滴加入牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中，加样结束后计时，反应4 h，得到水相的黄曲霉毒素生物合成前体物ST完全抗原；
(3)将上述步骤(2)中水相的黄曲霉毒素生物合成前体物ST完全抗原密闭于透析袋中，以0.01摩尔每升、pH 8.0的磷酸盐缓冲液作为透析液，共透析3天，每间隔12小时更换I次透析液；最后I次透析结束后，将透析袋中的溶液分装于离心管中，经冷冻干燥，即得到黄曲霉毒素生物合成前体物ST人工抗原:黄曲霉毒素生物合成前体物ST-牛血清白蛋白。
[0014]本发明中，以BSA作载体蛋白质为例，黄曲霉毒素生物合成前体物ST和载体蛋白质偶联制备得到黄曲霉毒素生物合成前体物ST的人工抗原(黄曲霉毒素生物合成前体物ST-BSA)的合成路线如下:
【权利要求】
1.一种黄曲霉毒素生物合成前体物ST的人工抗原，其特征在于:所述黄曲霉毒素生物合成前体物ST的人工抗原是由黄曲霉毒素生物合成前体物ST和载体蛋白质偶联制备得至|J，所述偶联的过程为:首先将黄曲霉毒素生物合成前体物ST中的二呋喃环的双键打开，连接上羧甲氧基活性基团，再使该羧甲氧基活性基团上的羧基与载体蛋白质上的氨基连接。
2.权利要求1所述的黄曲霉毒素生物合成前体物ST的人工抗原的制备方法，其特征在于:首先使羟基乙酸与黄曲霉毒素生物合成前体物ST中的二呋喃环的双键反应，得到带有羧甲氧基活性基团的黄曲霉毒素生物合成前体物ST半抗原，然后运用活泼酯法，在室温下使黄曲霉毒素生物合成前体物ST半抗原中的羧基与载体蛋白质上的氨基相连，最后通过透析、冷冻干燥得到黄曲霉毒素生物合成前体物ST的人工抗原。
3.根据权利要求2所述的黄曲霉毒素生物合成前体物ST的人工抗原的制备方法，其特征在于，所述的羟基乙酸与黄曲霉毒素生物合成前体物ST中的二呋喃环的双键反应的过程为:首先，称取0.1~Ig羟基乙酸溶于0.4~4 mL三氟乙酸；然后,称取I~10 mg黄曲霉毒素生物合成前体物ST溶于0.4~4 mL乙腈中，得黄曲霉毒素生物合成前体物ST的乙腈溶液；最后，用注射器吸取黄曲霉毒素生物合成前体物ST的乙腈溶液轻轻吹打入羟基乙酸/三氟乙酸的混合物中，室温搅拌反应4~6 h，反应结束后，旋转蒸发溶剂，得到淡黄绿色油状物即为黄曲霉毒素生物合成前体物ST半抗原。
4.根据权利要求2所述的黄曲霉毒素生物合成前体物ST的人工抗原的制备方法，其特征在于，所述的黄曲霉毒素生物合成前体物ST半抗原中的羧基与载体蛋白质上的氨基相连的过程为:称取I~10 mg黄曲霉毒素生物合成前体物ST半抗原、4~30 mg N-羟基琥拍酰亚胺置于反应瓶中反应I~2 h ;称取7~45 mg碳二亚胺溶于0.2~1.2 mL的1，4- 二氧六烷中，得碳二亚胺的1，4- 二氧六烷溶液,然后将其逐滴滴加于反应瓶中，室温下反应4~5 h，直至反应瓶中有白色沉淀生成，反应结束后，室温静置过夜，次日，离心取上清；然后将上清逐滴加入到溶有4~30 mg载体蛋白质的PBS溶液中，加样结束后计时，反应4~5 h，得到水相的黄曲霉毒素生物合成前体物ST完全抗原。`
5.根据权利要求4所述黄曲霉毒素生物合成前体物ST的人工抗原的制备方法，其特征在于，所述PBS溶液为0.2 mol/L, pH 8.0的磷酸盐缓冲液，所述PBS溶液的体积为5~8 mL。
6.根据权利要求2所述黄曲霉毒素生物合成前体物ST的人工抗原的制备方法，其特征在于，所述的透析、冷冻干燥过程为:将水相的黄曲霉毒素生物合成前体物ST完全抗原密闭于透析袋中，以0.01~0.02 mol/L pH8.0的磷酸盐缓冲液作为透析液，共透析3天，每间隔4~12小时更换I次透析液；最后I次透析结束后，将透析袋中的溶液分装，经冷冻干燥，得到黄曲霉毒素生物合成前体物ST人工抗原。
7.根据权利要求2所述的黄曲霉毒素生物合成前体物ST的人工抗原的制备方法，其特征在于:(1)取市售的羟基乙酸0.1克溶于0.4 mL三氟乙酸；称取I mg黄曲霉毒素生物合成前体物ST溶于0.4 mL乙腈中；得黄曲霉毒素生物合成前体物ST的乙腈溶液；用注射器吸取黄曲霉毒素生物合成前体物ST的乙腈溶液轻轻吹打入羟基乙酸/三氟乙酸的混合物中，室温条件下搅拌反应4 h ;将反应溶液旋转蒸发溶剂，得到淡黄绿色油状物即为黄曲霉毒素生物合成前体物ST半抗原；(2)取Img黄曲霉毒素生物合成前体物ST半抗原、4mg N-羟基琥珀酰亚胺置于反应瓶中反应Ih ;称取7mg碳二亚胺溶0.2mL的1，4- 二氧六烷中，得碳二亚胺的1，4- 二氧六烷溶液，然后将其逐滴滴加于反应瓶中，室温下反应4h，直至反应瓶中有白色沉淀生成；反应结束后，将反应物室温静置过夜，次日，在8000 r/min条件下离心5min,取上清；称取4 mg牛血清白蛋白溶于5 mL、0.2摩尔每升、pH 8.0的磷酸盐缓冲液中；将上述上清逐滴加入牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中，加样结束后计时，反应4 h，得到水相的黄曲霉毒素生物合成前体物ST完全抗原； (3)将上述步骤(2)中水相的黄曲霉毒素生物合成前体物ST完全抗原密闭于透析袋中，以0.01摩尔每升、pH 8.0的磷酸盐缓冲液作为透析液，共透析3天，每间隔12小时更换I次透析液；最后I次透析结束后，将透析袋中的溶液分装于离心管中，经冷冻干燥，即得到黄曲霉毒素生物合成前体物ST人工抗原:黄曲霉毒素生物合成前体物ST-牛血清白蛋白。·
【文档编号】C07K1/107GK103848913SQ201410115645
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2014年3月26日 优先权日:2014年3月26日
【发明者】李培武, 张奇, 李敏, 马飞, 丁小霞 申请人:中国农业科学院油料作物研究所