四翅滨藜锌指蛋白基因克隆及其应用的制作方法

四翅滨藜锌指蛋白基因克隆及其应用的制作方法
【专利摘要】四翅滨藜锌指蛋白基因克隆及其应用属植物基因工程【技术领域】，一种植物抗逆相关蛋白AcZFP1，由序列表中SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；所述植物抗逆性相关蛋白AcZFP1的编码基因AcZFP1的编码序列为下列之一:1)编码序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1的5’端第47-1087位脱氧核苷酸；2)编码序列表中SEQ ID NO:2蛋白质序列的核苷酸分子；一种重组表达载体，含有植物抗逆性相关蛋白AcZFP1的编码基因AcZFP1；一种重组菌，含有植物抗逆性相关蛋白AcZFP1的编码基因AcZFP1；在本源植物四翅滨藜中通过qRT-PCR检测，该基因在NaCl和PEG胁迫下上调表达。同时，将AcZFP1导入酿酒酵母得到转基因酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，进行胁迫处理，结果亦可表明AcZFP1可以提升酵母耐干旱(山梨醇)和耐盐(NaCl)的能力。
【专利说明】四翅滨藜锌指蛋白基因克隆及其应用

【技术领域】
[0001 ] 本发明属植物基因工程【技术领域】，尤其涉及使用酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae INVScl菌株表达与植物抗逆（具体为盐和干旱）相关的蛋白AcZFPl，同时采 用实时荧光定量PCR(实时PCR，Real-Time-PCR，）的方法来研究该基因对非生物胁迫NaCl 和PEG的功能。

【背景技术】
[0002] 目前农业生产中逆境胁迫是影响粮食产量最重要的因素和挑战之一。农作物在 整个生长季节中，会受到各种逆境因素的影响，如生物胁迫的病虫害等及非生物胁迫的盐、 碱、高温、低温、干旱等，这些胁迫限制了植物的生长发育，最终会导致作物产量降低，品质 下降，直接影响甚至威胁到粮食安全，在这些严重影响作物生产的逆境因子中，极端温度、 干旱、高盐、营养失调（包括矿物质中毒和矿物质缺乏）是影响作物产量的主要限制因子， 每年直接从盐、碱、干旱、低温胁迫等逆境造成的农作物减产仍然超过总产量的20%，而干 旱和盐胁迫是最主要的制约因素。因此，研究与非生物胁迫有关的基因并将其导入作物进 行分子育种引起了科研工作者的广泛兴趣，而通过基因工程的方法进行逆境相关基因的克 隆及其功能的解析能够为植物抗逆育种提供有价值的信息和材料。然而，从直接解决农业 生产中关键问题的角度来看，在农业生产上能起显著作用的转基因作物种类还不多，人类 对植物逆境适应性分子机理的研究还远远不够，远不能满足植物分子育种的需求，同世界 发达国家相比，我国拥有自主知识产权和具有重要利用价值的基因相对较少。同时，目前的 研究也主要集中在草本植物，而对木本植物及其耐盐和干旱的分子遗传研究也相对较少。 然而，草本和木本植物在结构、生长、发育、生理、及在应对生物和非生物胁迫等方面存在较 大的差异性。所以，从木本植物中寻找抗逆相关的基因并进行研究，能够为通过基因工程提 高作物的生物和非生物胁迫耐受性这种手段提供更多的候选基因。
[0003] 四翅滨藜（Atriplex canescens [Pursh]Nute)是一种盐生灌木，在分类上为藜科， 滨藜属，普遍存在于干旱、半干旱地区，具有较强的耐干旱、抗盐碱、耐寒冷和耐重金属的特 性，尤其是耐干旱和盐特性。四翅滨藜在每年降雨量> 180_的干旱半干旱地区，年平均气 温仅为5°C左右的低温地区，甚至在极端低温为-40°C地区以及盐碱地等恶劣环境下依然 生长良好，同时在海拔2000米左右的地区也适合生长，根据已有报道，四翅滨藜被有些国 家称为"生物脱盐器"，它一年时间就可以从6. 07亩的土地上吸收到1吨以上的盐分，灌木 生物量也能达到15t/hm2,枝叶中的粗蛋白含量在12%以上，高产优质、富含营养，相关科学 家们认为，四翅滨藜有及其丰富的营养价值和可观的饲料用途，因此成为了荒漠、半荒漠干 旱地区非常有价值的优良饲料灌木树种。同时，四翅滨藜还具有积累硒的能力，因此在美国 也广泛用于水土保持和路坡固定，但牧场改良仍然是其主要用途。近年来，四翅滨藜先后在 中国的新疆，甘肃，宁夏，青海和其它地方种植，通过大量研究，充分体现了四翅滨藜较强的 抗盐，碱，干旱，低温，贫瘠等优良特性，渐渐成为绿化和水土保持的优良树种。
[0004] 酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae)具有典型的真核系统，是二倍体，它在 蛋白翻译后加工过程中能形成二硫键，具有糖基化以及蛋白折叠等特征，使得其基因表达 模式更加接近于真核植物中的表达模式，它还具有生长快速、遗传操作简便和易于培养等 的优点，所以在对植物功能基因的相关研究中，用酵母表达系统筛选具有原核表达系统不 可替代的优势性。酿酒酵母菌株INVScl (基因型为MATa his3Dlleu2trpl-289ura3-52)是 经过人工改造后的尿嘧啶营养缺陷型菌株，该菌株的酵母转化子运用SC-U缺培养基筛选 时，假阳性低，转化效率高，因此是理想的酵母表达菌株。利用酵母营养缺陷型菌株对植物 cDNA文库的研究和挖掘，在植物中受到越来越多关注。Frommer等和Hsu等（1993年）在筛 选拟南芥cDNA文库中克隆到氨基酸透过酶的NAT2/AAP1基因，该基因可以互补酵母的氨基 酸转运缺陷突变体；酵母系统研究植物耐盐性表达基因的功能研究也被广泛应用，Yamada 等（2002年）就利用酵母转化子来验证丙二烯环化氧化酶（AOC)基因可以大大提高抗盐 性，进一步推测到AOC基因在植物中也可能具有抗盐功能。唐玉林等（2007年）利用酵母 研究了大豆SALI3-2蛋白可以使酵母转化子的耐盐能力得到显著提高，从而推测SALI3-2 基因所具有的抗逆能力。由此可见，利用酵母表达外源蛋白并研究其功能已经受到广泛应 用。
[0005] Real-Time PCR(RT-PCR)是一种目前应用普遍的检测基因表达的技术，它通过 添加荧光基团，并利用荧光信号累积来实时监测整个PCR的进程，最后通过标准曲线对未 知模板进行定量分析，该方法能够避免传统PCR定量终产物时产生的偏差，从而使实验的 重复性得到提高，该技术现已被广泛用于监测细胞mRNA的表达量变化。SYBR green是 Real-time PCR的常用方法之一，该法灵敏度高，通用性好，方法简单等优点而被国内外科 研中普遍使用。
[0006] 锌指蛋白（Zinc Finger Protein, ZFP)是指具有指状特征结构域且能结合Zn2+ 的一类蛋白，其通过与靶分子的DNA、RNA、DNA-RNA的序列特异性结合，以及与自身或其他 锌指蛋白的结合，在转录和翻译水平上调控特异基因的表达。植物锌指蛋白包含特有的 QALGGH保守结构，参与调控植物的生长发育及抗逆反应。根据保守基序的特征，锌指蛋自主 要分为C2H2型、C8型和C6型。C2H2型锌指蛋白在植物体内分布广泛，该类蛋白可以识别 和特异性结合植物体内DNA序列，被认为是植物体内最主要的一类锌指蛋白。此外，植物体 内还有一些不同于C2H2型的锌指蛋白，他们既可以与DNA结合，也可以结合RNA，这类锌指 蛋白参与了一些重要调控过程，如植物的形态建成，生殖阶段配子体的产生及胚胎发育等。 逆境胁迫会诱导很多植物C2H2型锌指蛋白的表达，这些锌指蛋白可以通过特异性识别激 活植物基因组中许多抗逆基因同时表达或者直接参与上游抗逆信号的传导、级联放大从而 提高植物的抗逆性。通过现代分子生物学技术，将一些与逆境胁迫相关的锌指蛋白基因在 植物体内过表达，明显的提高了目标转基因植物对逆境胁迫的抗性，说明锌指类蛋白可以 作为增强植物抗逆性的候选基因。然而在目前的众多研究中，还无有关四翅滨藜AcZFPl基 因在抗逆等生理功能方面的研究报道。


【发明内容】

[0007] 本发明通过构建四翅滨藜（Atriplex canescens)的低温（-10 °C )及盐胁迫 (400mM NaCl)全长cDNA文库，并利用Gateway技术将cDNA文库LR重组到酵母表达载 体（PYES-DEST52)中，混合质粒载体经转化到酵母菌株INVScl中，并通过模拟逆境胁迫 (NaCl、山梨醇）筛选出与逆境胁迫相关的基因，同时利用RT-PCR技术检测该基因在逆境胁 迫（NaCl，PEG6000)条件下的表达量变化，以初步研究该基因在四翅滨藜中逆境胁迫的相 应作用。本发明不仅对四翅滨藜的耐干旱和耐盐分子机制的研究提供新的依据，同时为获 得具有抗逆能力的转基因农作物和林木（耐盐、干旱）奠定基础。本发明中，转pYES-AcZFPl 的重组酵母转化子表现出了明显的抗干旱和抗盐胁迫的能力。同时在本源植物四翅滨藜 中，AcZFPl基因的表达也对盐胁迫和旱胁迫表现出了明显的响应。
[0008] 本发明提供了四翅滨藜中一种含锌指蛋白功能域的与植物抗逆（盐和旱）相关的 蛋白及其编码基因序列，通过利用酵母系统进行功能验证，并在本源植物中通过RT-PCR检 测的方法对该基因进行进一步解析及其在植物抗逆中的应用：
[0009] 本发明提供的锌指蛋白基因，名称为AcZFPl，为序列表中SEQ ID NO :1所示的核 苷酸序列。通过四翅滨藜全长cDNA文库测序得到AcZFPl基因。该基因共由1332个碱基 组成，完整的开放阅读框含有l〇35bp，同时还含有5'非翻译区和3'非翻译区序列，开放阅 读框的起始密码子为ATG，终止密码子为TGA。
[0010] 本发明所提供的蛋白耐干旱和盐胁迫，名称为AcZFPl，来源于盐生灌木四翅滨藜， 植物抗逆相关蛋白AcZFPl，由序列表中SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
[0011] 所述植物抗逆性相关蛋白AcZFPl的编码基因 AcZFPl的编码序列为下列之一：
[0012] 1)编码序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 1的5'端第47-1087位脱氧核 苷酸；
[0013] 2)编码序列表中SEQ ID NO:2蛋白质序列的核苷酸分子。
[0014] 一种重组表达载体，含有植物抗逆性相关蛋白AcZFPl的编码基因 AcZFPl。
[0015] 一种重组菌，含有植物抗逆性相关蛋白AcZFPl的编码基因 AcZFPl。
[0016] 序列表中的序列2根据DNAMN分析，蛋白由345个氨基酸组成，等电点11. 25,蛋 白总量39. 3KDa。一般情况下，蛋白二级结构含243个卷曲，14个螺旋，89个折叠，有15个 抗原肽段，精氨酸（Arg)含量最高，为26. 77%，丝氨酸（Ser)含量为12.92%。蛋白含297 个亲水氨基酸，49个疏水氨基酸，具有较强的亲水性，根据Expasy protscale的Hphob. / Kyte&Doolittle分析到球蛋白可能的表面区域在N端。PSORT Prediction预测蛋白最可 能定位到细胞核中。
[0017] 本发明涉及的酵母表达载体pYES-DEST52(购自Invitrogen公司）与AcZFPl基因 重组为pYES-AcZFPl，且该重组酵母表达载体转化的宿主感受态细胞为酿酒酵母INVScl。 该酵母表达载体除了含有AcZFPl的编码DNA序列外，还携带有GALl启动子、T7启动子、 URA3基因、氨苄青霉素抗性标记基因、CYCl终止转录信号、LR重组位点attRl和attR2、用 于逆向筛选的致死基因 ccdB，蛋白纯化的6xHis Tag,蛋白表达检测的V5epitope等外源基 因蛋白在酵母中高效表达所需的各种调控元件。
[0018] 本发明通过RT-PCR方法检测了该基因在对于干旱和盐胁迫的响应（PEG，NaCl处 理），基因在两种胁迫处理下表现出了基因上调，进一步推测该基因在植物参与逆境响应尤 其是干旱和盐胁迫中起重要作用，该基因的上调表达有助于提高四翅滨藜的抗干旱和抗盐 的能力。
[0019] 本发明在通过酵母（NaCl，山梨醇）及RT-PCR(NaCl，PEG)关于干旱和盐的研究 后，结果表明AcZFPl基因在逆境方面的应用：该基因过量表达可能提高植物的抗逆性，所 述植物抗逆性具体可为对非生物胁迫和生物胁迫的抗逆性，非生物胁迫如干旱、极端温度、 盐碱等，特别是植物的抗干旱和盐胁迫的能力。

【专利附图】

【附图说明】
[0020] 图1为四翅滨藜总RNA提取图片
[0021] 图 2 为 IKb Plus DNA Ladder
[0022] 图3为cDNA文库插入片段长度PCR检测图片
[0023] 图4为为cDNA文库插入片段长度PCR检测图片
[0024] 图 5 为 IKb Plus DNA Ladder
[0025] 图6为pYES-AcZFPl重组质粒PCR扩增凝胶电泳图
[0026] M :DL2000DNA Marker ;M :2000bp、IOOObp、750bp、500bp、250bp、IOObp ;1，2 :扩增 片段
[0027] 图7为AcZFPl在NCBI中功能域比对分析结果
[0028] 图8为AcZFPl与其它物种的同源蛋白系统进化分析
[0029] 图9为pYES-AcZFPl阳性重组酵母转化子PCR凝胶电泳图
[0030] M :DL2000DNAMarker ;M :2000bp、IOOObp、750bp、500bp、250bp、IOObp ;1，2 :阳性酵 母转化子PCR电泳鉴定
[0031] 图10为重组酵母pYES-AcZFPl和pYES-DEST52非胁迫下的结果
[0032] 图11为重组酵母pYES-AcZFPl和pYES-DEST52在3M山梨醇胁迫下的结果
[0033] 图12为重组酵母pYES-AcZFPl和pYES-DEST52在2MNaCl胁迫下的结果
[0034] 图10-12中：pYES-AcZFPl酵母转化在对3M山梨醇和2MNaCl的抗逆能力明显强 于空载体PYES-DEST52酵母转化子。
[0035] 图13为AcZFPl基因在400mM NaCl胁迫处理后的表达量变化图
[0036] 图14为AcZFPl基因在20% PEG6000胁迫处理后的表达量变化图
[0037] 图13和14中：AcZFPl基因在NaCl处理12h后开始上调表达；同时，在PEG处理 24h后该基因开始上调表达，表达量提高20倍以上。

【具体实施方式】
[0038] 实施例一：AcZFPl基因全长cDNA的获得及序列分析
[0039] 1.胁迫处理四翅滨藜：
[0040] -KTC条件下生长三个月的四翅滨藜植株，移栽到人工气候培养箱，正常培养10 天后，待植株复苏存活，发出新叶，生长健壮。将植株转移到含有营养的水培条件下，正常生 长两天后，用500mL的含NaC1400mM的盐液水培处理四翅滨藜植株，胁迫处理4天后，采摘 叶片，嫩茎部和幼根清洗干净并液氮速冻，_80°C冻存，以备建库。
[0041] 2.构建 cDNA 文库：
[0042] 将NaCl处理4天后的四翅滨藜样品（叶片、嫩茎和幼根）提取总RNA(图、图2)， 然后使用Invitrogen公司的'cap antibody module'将含有完整帽子结构的单链cDNA进 行富集，并按照 SupcrScriptu Full-Length cDNA Library Construction Kit 试剂盒构建 全长cDNA文库，并通过Gateway技术将该cDNA文库LR重组到酵母表达载体pYES-DEST52 中，随机对cDNA文库进行PCR检测（图3、图4、图5)，将长度500bp以上的片段进行测序， 利用NCBI的BlastX进行功能域的比对及相关生物信息学分析，获得了四翅滨藜盐胁迫的 表达序列标签（ESTs)。
[0043] 2. 1四翅滨藜总RNA提取的方法：
[0044] 2. I. 1取IOOmg植物样品，在预冷的研钵中用液氮迅速研成粉末，快速转移到遇冷 的2mL离心管中。（保证全过程在通风厨中，防止RNA降解。）
[0045] 2. 1. 2加入ImlTrizol试剂，剧烈振荡混匀15s，静置IOmin充分裂解细胞。
[0046] 2. 1.3加入0.2mL氯仿（三氯甲烷），迅速震荡混匀15s，静置5min。
[0047] 2. 1. 4 高速低温（12, OOOrpm，4°C )离心 15min。
[0048] 2. I. 5将上清小心转移到新的I. 5mL离心管，加0. 5mL异丙醇，颠倒混匀，静置 IOmin0
[0049] 2. 1. 6 再次高速低温（12, OOOrpm，4°C )离心 lOmin。
[0050] 2. 1. 7去除上清，加0. 5mL75%的乙醇，7, 500rpm低温离心5min以洗漆沉淀。
[0051] 2. 1. 8重复步骤2. 1. 7 -次，进一步洗漆沉淀，去除离子。
[0052] 2. 1. 9小心吸取上清，并通风厨中干燥RNA沉淀，并用50 μ L的DEPC水溶解RNA。
[0053] 3.筛选AcZFPl基因片段的克隆：
[0054] 根据测序分析，获得四翅滨藜ESTs，从中获得了一个编码ZFP的cDNA全序 列AcZFPl，将LR重组得到的酵母表达载体pYES-AcZFPl转化至大肠杆菌感受态细胞中 (DH5 α )，过夜培养后，挑取单菌落，并于LB (含100mg/L的Amp)液体培养基过夜培养，通过 质粒提取试剂盒（鼎国公司）提取质粒。并根据载体上的通用序列PCR引物，并进行质粒 PCR扩增验证，以鉴定获得的cDNA序列。
[0055] 上游（T7) :5, -TAATACGACTCACTATAGGG-3'
[0056] 下游（R) :5, -AGGGTTAGGGATAGGCTTACCTTC-3，
[0057] PCR 反应体系（25 μ L) :Buffer2· 5 μ L、上下游引物（T7、R)各 0· 5 μ L、Tag 酶 0· 5 μ UdNTPO. 5 μ L、模板 0· 2 μ L、ddH2020. 8 μ L。PCR 反应的条件：在 94°C预变性 5 分钟； 94 °C变性30秒；迅速冷却至58 °C退火30秒；72 °C延伸2分钟，30个循环；72 °C延伸10分 钟；4°C冷却保存。扩增产物经1 %的琼脂糖凝胶电泳检测，在大约1332bp的位置上有特异 性的目的条带（图6)。
[0058] 实施例二：AcZFPl基因的序列分析
[0059] 经测序分析后，AcZFPl基因的全长cDNA序列1332bp，包含1035bp的开放阅读框， 根据DNAMAN分析，蛋白由345个氨基酸组成，等电点11. 25,蛋白总量39. 3KDa。一般情况 下，蛋白二级结构含243个卷曲，14个螺旋，89个折叠，有15个抗原肽段，精氨酸（Arg)含 量最高，为26. 77%，丝氨酸（Ser)含量为12. 92%。蛋白含297个亲水氨基酸，49个疏水 氨基酸，具有较强的亲水性，根据Expasy protscale的Hphob. /Kyte&Doolittle分析到球 蛋白可能的表面区域在N端。PSORT Prediction预测蛋白最可能定位到细胞核中，这是锌 指蛋白家族蛋白的主要特征。通过分析表明，获得了 AcZFPl基因的全长cDNA序列，并且在 GenBank上的登录号为KJ027022。
[0060] 利用 NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/Structure/cdd/wrpsb. cgi)对该编 码基因进行保守区域分析（图7)，该基因编码的蛋白属于锌指家族蛋白。通过NCBI对 AcZFPl基因编码的氨基酸序列进行BLASTX，通过与已确定功能的其它物种的氨基酸序列 进行同源性分析和系统进化分析，利用MEGA4软件进行进化树分析，结果表明：AcZFPl与草 莓中的ZFP编码的氨基酸进化关系最近。（图8)。
[0061] 实施例三：重组酵母的转化及检测
[0062] 酿酒酵母菌株INVScl为尿氨酸营养缺陷型（UraO的模式菌株，在缺乏尿氨酸 的酵母基本培养基（SC-UraO上，该酵母菌株几乎不能生长和繁殖。而酵母表达载体 (PYES2-DEST52)上含有URA3基因，且该基因的表达可以使酵母转化子在SC-Ura-培养基 上正常生长。因此，SC-Urf选择培养基可以进行阳性和非阳性酵母转化子的筛选。通过醋 酸锂法将载体质粒pYES-AcZFPl和pYES-DEST52分别转化到酵母感受态菌株INVScl中，将 转化酵母菌液涂在SC-Urf固体选择培养基上，以未转化的酵母做对照，进行培养，2d后除 了空酵母完全不长外，转化两种质粒的酵母均可以生长并有菌落长出，说明酵母转化成功， 挑取酵母单菌落，过夜培养后进行破除细胞壁，并通过菌液PCR方法进行阳性转化子的进 一步鉴定。
[0063] 1.运用醋酸锂化学转化法转化酿酒酵母INVScl，其具体转化步骤：
[0064] I. 1将一个酵母菌株单克隆（INVScI)加入到IOmLYPD液体培养基中，30°C过夜摇 培。
[0065] 1. 2检测酵母菌液的OD6c?值，利用50mL YH)液体培养基将过夜培养的酵母菌液稀 释至OD6tltl为0· 4, 30°C继续摇培2-4h。
[0066] 1. 3低温离心（4°C，2500rpm)5min后，去除上清收集菌体，用40mLlxTE缓冲液重悬 菌体。
[0067] L 4再次低温离心（4°C，2500rpm)5min后，收集菌体，用2mLlxLiAc/0. 5xTE缓冲液 重悬菌体。
[0068] 1. 5将获得的重悬菌体按照每管100 μ L的体系分装到I. 5mL离心管。
[0069] 1. 6将分装的酵母细胞置于室温孵育lOmin。
[0070] 1. 7在每个转化体系（100 μ L)中，加入1 μ g质粒DNA，100 μ g变性鲑鱼精DNA，混 匀。
[0071] 1. 8 每个体系中加入 700μ Llx LiAc/40% PEG-3350/lx TE，混匀。
[0072] I. 930°C孵育步骤1. 8中的混合液30min。
[0073] I. 10在每个体系中再加入88μ L的DMSO,混匀后，42°C条件下水浴热击7min。
[0074] I. 115000rpm低温离心lmin，去除上清。
[0075] 1. 12用备好的ImLlxTE的缓冲液重悬菌体，5000rpm低温离心Imin,进一步去除上 清。
[0076] 1. 13用IOOyLlxTE的缓冲液将菌体重悬，并涂于酵母选择培养基上，30°C培养 24h。
[0077] 2.阳性转化子的鉴定
[0078] 从酵母选择培养基上随机挑取5个酵母转化子（pYES2_AcZFPl)的单菌落，30°C振 荡培养过夜（200rpm)，收集过夜培养菌体，沸水煮5min，迅速置于冰上5min以破碎细胞， 重复几次，以细胞破碎液离心浓缩样品作为模板进行菌液PCR，以引物T7和R进行PCR扩 增，PCR 反应体系为（25μ L) :Buffer2. 5μ L、上下游引物（T7、R)各 0. 5μ UTag 酶 0. 5μ L、 dNTPO. 5 μ L、模板 5 μ L、ddH2015. 5 μ L。
[0079] PCR产物在1%的琼脂糖凝胶上电泳检测，扩增片段大小为1332bp，与目标长度吻 合（图9)。证明重组质粒pYES2-AcZFPl已经转化到酵母菌株中。
[0080] 实施例四：阳性转化酵母逆境胁迫处理
[0081] L逆境胁迫处理前准备
[0082] 取适量阳性酵母转化子（pYES-DEST52，pYES2-AcZFPl)菌液，接种到含2%葡萄糖 的SC-U液体培养基中，30°C条件下200rpm振荡培养24h，测OD 6c?值，并用SC-U液体培养基 (2 %葡萄糖）将菌液OD6tltl统一调整为0. 4,总体积5mL，8000rpm离心lmin，吸取上清液，力口 2mL含2%半乳糖的酵母诱导培养基重悬菌体，以1:50的比例接到5mL的诱导培养基中扩 大培养，30°C振荡培养 24h，检测酵母 INVScl(pYES-DEST52)和 INVScl(pYES2-AcZFPl)的 0D_值，并统一调整到0D_值为2,备用。对这两种酵母转化子进行不同的非生物胁迫处 理，比较两种酵母转化子抗盐和干旱胁迫能力，实验重复3次。
[0083] 2.模拟逆境胁迫处理
[0084] 存在于自然界中的植物面对各种生物和非生物逆境，非生物胁迫中最主要的是盐 胁迫（NaCl、KCl等）和干旱胁迫。
[0085] 在实验室条件下进行盐和干旱的模拟，用2M NaCl模拟盐胁迫，3M的山梨醇模拟 干旱胁迫。运用以上两种模拟条件处理酵母转化子，通过酵母的生长情况对比，从而评价该 基因在酵母中诱导表达后对酵母抗逆性的影响，以对该基因在酵母中的抗逆功能进行初探 (图 10、图 11、图 12)。
[0086] 2. INaCl处理：将上述备用菌体分别以不稀释和稀释10、100、1000、10000倍的菌 体，吸取2 μ L菌液接种到含2%半乳糖的SC-U固体培养基上，30°C培养两天后，比较两种酵 母转化菌的菌落生长状态。
[0087] 2. 23M山梨醇干旱模拟处理：将上述备用菌体分别以不稀释和稀释10、100、1000、 10000倍的菌体，吸取2 μ L菌液接种到含2%半乳糖的SC-U固体培养基上，30°C培养两天 后，比较两种酵母转化菌的菌落生长状态。
[0088] 实施例五：AcZFPl基因在四翅滨藜PEG和NaCl胁迫下的应答
[0089] 1.四翅滨藜胁迫处理：
[0090] 将四翅滨藜种子种在营养土中正常条件生长50天后，选取生长良好的四翅滨藜 转移到MS营养液中进行水培，每天更换营养液，水培3天待四翅滨藜生长健壮后，分别用 400mM NaCl和20% PEG6000处理，并在0、6、12、24、48h后取根茎叶，液氮速冻，-80°C保存。
[0091] 2. RNA提取及反转录：
[0092] 采用Trizol法提取总RNA(如实施例一，2. 1)，利用Takara公司的PrimcScriptu RT reagent Kit With gDNA Eraser (Perfect Real Time)试剂盒进行反转录以制备 cDNA，用 于 quantity Real-time PCR 分析。
[0093] 3.荧光定量PCR分析：
[0094] 利用SYBR?| Green Reagent试剂盒，使用7500荧光定量系统检测AcZFPl基因 (F: TCTAGGGTTTTCGTGCTCCG ; R: ACAAGCGGCCAACATACAGA)在不同处理下随时间变化的表达 量差异。真核延伸生长因子（EFl-α)作为内参基因（F:5' -CCCCAGTTCTCGACTGTCAC-3' ； R5' -TGGTGGGAACCATCTTCACG-3'）。反应条件为：95°C预变性 30 秒；95°C变性 5 秒，60°C退 火延伸34秒，进行40个循环；95°C变性15秒，60°C退火延伸1分钟，95°C变性15秒；60°C 延伸15秒。采用2_ΔΛα法分析表达量差异（图13、图14)。
【权利要求】
1. 一种植物抗逆相关蛋白AcZFPl，其特征在于由序列表中SEQ ID NO: 2所示的氨基酸 序列组成的蛋白质。
2. 按权利要求1所述植物抗逆性相关蛋白AcZFPl的编码基因AcZFPl，其特征在于所 述编码基因AcZFPl的编码序列为下列之一： 1) 编码序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 1的5'端第47-1087位脱氧核苷酸； 2) 编码序列表中SEQ ID NO:2蛋白质序列的核苷酸分子。
3. -种重组表达载体，其特征在于含有权利要求2所述植物抗逆性相关蛋白AcZFPl的 编码基因AcZFPl。
4. 一种重组菌，其特征在于含有权利要求2所述植物抗逆性相关蛋白AcZFPl的编码基 因 AcZFPl。
【文档编号】C07K14/415GK104371015SQ201410497473
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年9月23日 优先权日:2014年9月23日
【发明者】潘洪玉, 余刚, 李敬涛, 孙新华, 张祥辉, 贾承国, 刘金亮 申请人:吉林大学