一种双水相体系分离富集牡丹花色苷的方法
【专利摘要】本发明属于天然产物有效成分的分离纯化领域，特别公开了一种双水相体系分离富集牡丹花色苷的方法。本发明将牡丹鲜花低温烘干粉碎，加入由乙醇和硫酸铵构成的双水相体系，并添加蔗糖和有机酸作为花色苷的稳定剂，冰水浴条件下进行磁力搅拌，离心得上相、下相以及牡丹花残渣，进一步对残渣和下相进行多次萃取，然后合并上相进行醇沉除杂和萃取除杂，真空浓缩得牡丹花色苷。本发明采用双水相体系条件温和，提取时间短，有机相易回收，提取成本低，易于工业化放大生产。
【专利说明】一种双水相体系分离富集牡丹花色苷的方法
[0001] (一）【技术领域】 本发明属于天然产物有效成分的分离纯化领域，特别涉及一种双水相体系分离富 集牡丹花色苷的方法。
[0002] (二）【背景技术】 牡丹又名鹿亜、白术、木巧药，属巧药科、巧药属的多年生 落叶灌木。菏泽市是著名的牡丹之乡，是全国乃至全世界最大的牡丹栽培中心和种质资源 中心，栽培面积达0.8万公顷。伴随着牡丹产业的迅速发展，对花卉种植地区的旅游业和经 贸业起到一定的促进作用，但是受到花期和气候条件的限制，形成了花开时经贸和旅游活 动繁荣，花落时惨淡经营的不良局面，并且由于深加工技术的落后，每年有成千上万吨的牡 丹花被白白地浪费在田间地头。
[0003] 花色苷是花色素与糖以糖苷键结合形成的一种化合物，其广泛存在于植物的花、 果实、茎、叶等组织器官的细胞液中，使其呈现由红、紫红到兰等不同颜色。牡丹花瓣中 含有丰富的花色苷类成分，经鉴定主要为：矢车菊-3-0-葡萄糖苷、矢车菊_3, 5-0-二葡 萄糖苷、天竺葵-3-0-葡萄糖苷、天竺葵-3, 5-0-二葡萄糖苷、芍药-3-0-葡萄糖苷和芍 药-3, 5-0-二葡萄糖苷。大量文献研究表明花色苷类成分具有多种生理药理功效，包括清 除自由基、抗突变、抗发炎、抗癌、抗病毒、抗菌、抗过敏、防止血管舒张、预防糖尿病、保护胃 黏膜、缓解眼疲劳、抑制脂质过氧化和血小板凝集等。花色苷作为一种安全、无毒的天然色 素，对人体具有多种保健功能，被广泛应用于食品、保健品、化妆品、医药等行业。
[0004] 花色苷易溶于水、甲醇、乙醇等溶剂，传统提取方法包括水提、有机溶剂浸提，或以 超声、微波、酶法进行辅助提取，但此类方法所需溶剂量大、提取时间长，设备要求高，提取 物中杂质较多，还需进一步分离纯化，不利于工业化放大生产，此外，花色苷稳定性差，提取 过程中易受温度、pH、金属离子等外界因素的影响而褐变或降解，导致提取率相对较低。
[0005] 双水相萃取技术始于20世纪60年代，传统的双水相包括双聚合物体系、聚合物/ 葡萄糖体系、聚合物/无机盐体系等，但由于高聚物价格昂贵、粘度大、回收处理困难，无法 适应工厂化大规模生产，近年来，小分子亲水醇/盐双水相萃取在生物分离纯化方面成为 研究的热点，相对于传统高聚物双水相萃取其具有分相快、效果好、有机相易回收、成本低 等优点，此外双水相萃取条件温和，有利于分离过程中花色苷的结构稳定性。
[0006](三）
【发明内容】
本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种条件温和、提取时间短、成本低的双水相 体系分离富集牡丹花色苷的方法。
[0007] 本发明是通过如下技术方案实现的： 一种双水相分离富集牡丹花色苷的方法，以牡丹鲜花为原料，包括如下步骤： (1) 将牡丹鲜花于35-40°C下低温烘干至恒重，粉碎至40-60目，得到牡丹花干粉； (2) 将硫酸铵溶于蒸馏水中，然后添加无水乙醇，充分震荡混匀，构成双水相体系； (3) 在双水相体系中添加牡丹花干粉、蔗糖和有机酸，调节pH为3-4,在冰水浴条件下 进行磁力搅拌，冷冻离心，得到上相、下相以及牡丹花残渣，取牡丹花残渣，重复上述步骤； (4) 取分离所得的下相溶液和牡丹花残渣，分次添加无水乙醇进行多级萃取，调节pH 为3-4,在冰水浴条件下进行磁力搅拌，离心，合并多级萃取和首次萃取所得的上相溶液； (5) 在上相溶液中添加5倍体积的无水乙醇，0-4°C避光静置24h，过滤，醇沉除去蔗糖 以及残留在上相中的杂质； (6) 真空浓缩除去上相中的乙醇，用蒸馏水对固形物进行分散，用乙醇和正丁醇的混合 溶液对牡丹花色苷进行萃取，最后得到产品。
[0008] 本发明将牡丹鲜花低温烘干粉碎，加入由乙醇和硫酸铵构成的双水相体系，并添 加蔗糖和有机酸作为花色苷的稳定剂，冰水浴条件下进行磁力搅拌，离心得上相、下相以及 牡丹花残渣，进一步对残渣和下相进行多次萃取，然后合并上相进行醇沉除杂和萃取除杂， 真空浓缩得牡丹花色苷。
[0009] 本发明包括原料预处理、建立双水相体系、萃取分离牡丹花色苷、多级萃取、醇沉 除杂、萃取除杂等步骤。
[0010] 本发明的更优技术方案为； 步骤（2)中，无水乙醇和蒸馏水的体积比为1:1. 5-2. 5,硫酸铵在双水相体系中的质量 分数为10-14%。
[0011] 步骤（2)中，震荡次数为3次，每次30s。
[0012] 步骤（3)中，牡丹花干粉与双水相体系的料液比为lg:30-50mL，蔗糖在双水相体 系中的浓度为20-50mg/mL，有机酸的浓度为0. 05-0.Imol/mL，有机酸为丙二酸、单宁酸和 草酸中的一种或多种。
[0013] 步骤（3)和（4)中，磁力搅拌时间为1.5-3h，冷冻离心温度为4°C，转速为5000r/ min，时间为5min。
[0014] 步骤（3)中，牡丹花残渣重复萃取的次数为2-3次。
[0015] 步骤（4)中，多级萃取过程中，无水乙醇的添加量与下相溶液的体积比为 0. 5-0. 75:1，萃取次数为2-4次。
[0016] 步骤（6)中，蒸馏水的添加量为固形物质量的40倍，萃取相混合溶液中乙醇和正 丁醇的体积比为1:3,萃取相与水相的体积比为1:1,萃取次数为2-3次。
[0017] 本发明花色苷含量的测定采用分子示差法。
[0018] 本发明的有益效果是： (1) 采用双水相体系对牡丹花色苷进行分离富集，使花色苷类成分集中在上层有机相， 而多糖等杂质主要集中下层水相，达到边提取边纯化的目的； (2) 花色苷在溶解状态下稳定性较差，在提取过程中易受温度、pH、金属离子等外界因 素的影响而降解，在双水相体系中添加稳定剂可最大程度保证花色苷的稳定性，提高花色 苷得率。糖可通过减小水分活度或水分可利用程度而稳定花色苷，起到护色作用，有机酸作 为辅色剂可通过离子相互作用、疏水作用及范德华力与花色苷形成稳定性强的复合物，防 止亲核集团的攻击而褪色； (3) 通过改变上相的极性对下相和牡丹花残渣进行多级萃取，可获得不同极性的花色 苷，使花色苷的萃取更加完全； (4) 双水相体系条件温和，提取时间短，有机相易回收，提取成本低，易于工业化放大生 产。
[0019] (四）【具体实施方式】 下面结合实施例对本发明的方法作进一步说明，但不限于此。
[0020] 实施例1: (1)乙醇与水添加比例的选择 考察有机相添加量时，一般要求最后形成的双水相体系相比接近于1，这样有利于物质 的分离。分别添加体积比1:1. 5、1:1· 75、1:2、1:2· 25、1:2· 5、1:2· 75、1:3的乙醇和水混合 溶液，硫酸铵添加量接近饱和状态，充分振荡摇匀，构成双水相体系，按原料与体系之比为 l:40(g/mL)加入牡丹花干粉，添加蔗糖、丙二酸、单宁酸作为稳定剂，使其浓度分别为20mg/ mL、0. 075mol/L、0. 075mol/L，调节pH为3,冰水浴条件下磁力搅拌2h，然后4°C条件下冷冻 离心5min，测定上相中花色苷含量，计算花色苷提取率分别为I. 70wt%，I.68wt%，I. 65wt%， I. 56wt%，I. 44wt%，I. 25wt%。实验结果表明，随着乙醇与水体积比的减小，上相中花色苷提 取率逐渐减小。原因可能是由于乙醇比例较低时，形成的双水相体系相比较小，不利于花色 苷的萃取。考虑乙醇使用成本以及实际萃取效果，选择乙醇与水体积比为1:2进行后续实 验。
[0021] (2)硫酸铵添加量的选择 在圆底烧瓶中添加体积比1:2的乙醇和水混合溶液，添加不同质量的硫酸铵作为分相 盐，使其在整个体系中的浓度分别为10% (g/mL)，ll% (g/mL)，12% (g/mL)，13% (g/mL)，14% (g/mL)，15% (g/mL)，充分振荡摇匀，构成双水相体系，原料和稳定剂添加量同（1)，调节pH 为3,冰水浴条件下磁力搅拌2h，然后4°C条件下冷冻离心5min，测定上相中花色苷含量，计 算花色苷提取率分别L 57wt%，I. 64wt%，I. 73wt%，I. 74wt%，I. 69wt%，I. 65wt%。实验结果表 明，随着硫酸铵添加量的增加，花色苷提取率先增加后减少，硫酸铵浓度为12% (g/mL)和 13% (g/mL)时，提取率最高，且相差不大。原因是由于随着分相盐添加量的增加，双水相体 系的分相能力逐渐增强，上下相物理化学性质的差别趋于显著，有利于花色苷与多糖等杂 质的分离；但分相盐添加量过大时，下相易析出晶体，双水相体系不稳定，影响花色苷的萃 取。
[0022] (3)双水相体系pH值的选择 在圆底烧瓶中添加体积比1:2的乙醇和水混合溶液，以硫酸铵为分相盐，使其在体系 中的浓度为12% (g/mL)，充分振荡摇匀，构成双水相体系，原料和稳定剂添加量同（1)，分别 调节pH至3、4、5、6、7,冰水浴条件下磁力搅拌2h，然后4°C条件下冷冻离心5min，测定上相 中花色苷含量，计算花色苷提取率分别为I. 73wt%，I. 72wt%，I. 56wt%，I. 50wt%，I. 44wt%。实 验结果表明随着pH值升高，花色苷提取率逐渐降低，pH值为3和4条件下，花色苷提取率 最高，且相差不大，原因可能是花色苷在强酸性条件下以黄烊盐阳离子状态存在，呈稳定的 红色，随着PH增加，花色苷会形成无色的甲醇碱。
[0023] (4)稳定剂添加量的选择 在圆底烧瓶中添加体积比1:2的乙醇和水混合溶液，以硫酸铵为分相盐，使其在体系 中的浓度为12% (g/mL)，充分振荡摇匀，构成双水相体系，原料添加量同（1)，稳定剂的添 加比例及添加量如下表所示，调节pH至4,冰水浴条件下磁力搅拌2h，然后4°C条件下冷 冻离心5min，测定上相中花色苷含量，计算花色苷提取率，实验结果如表所示，蔗糖、丙二 酸、单宁酸的添加量分别为30mg/mL、0.050m〇l/L、0.lOOmol/L时，花色苷提取率最高，为 I. 81wt%〇
[0024] 稳定剂对花色苷提取率的影响
【权利要求】
1. 一种双水相分离富集牡丹花色苷的方法，以牡丹鲜花为原料，其特征为，包括如下步 骤：（1)将牡丹鲜花于35-40°C下低温烘干至恒重，粉碎至40-60目，得到牡丹花干粉；（2) 将硫酸铵溶于蒸馏水中，然后添加无水乙醇，充分震荡混匀，构成双水相体系；（3)在双水 相体系中添加牡丹花干粉、蔗糖和有机酸，调节pH为3-4,在冰水浴条件下进行磁力搅拌， 冷冻离心，得到上相、下相以及牡丹花残渣，取牡丹花残渣，重复上述步骤；（4)取分离所得 的下相溶液和牡丹花残渣，分次添加无水乙醇进行多级萃取，调节pH为3-4,在冰水浴条件 下进行磁力搅拌，离心，合并多级萃取和首次萃取所得的上相溶液；（5)在上相溶液中添加 5倍体积的无水乙醇，0_4°C避光静置24h，过滤，醇沉除去蔗糖以及残留在上相中的杂质； (6)真空浓缩除去上相中的乙醇，用蒸馏水对固形物进行分散，用乙醇和正丁醇的混合溶液 对牡丹花色苷进行萃取，最后得到产品。
2. 根据权利要求1所述的双水相分离富集牡丹花色苷的方法，其特征在于：步骤 (2) 中，无水乙醇和蒸馏水的体积比为1:1.5-2. 5,硫酸铵在双水相体系中的质量分数为 10-14%。
3. 根据权利要求1所述的双水相分离富集牡丹花色苷的方法，其特征在于：步骤（2) 中，震荡次数为3次，每次30s。
4. 根据权利要求1所述的双水相分离富集牡丹花色苷的方法，其特征在于：步骤 (3) 中，牡丹花干粉与双水相体系的料液比为lg:30-50mL，蔗糖在双水相体系中的浓度为 20-50mg/mL，有机酸的浓度为0. 05-0. Imol/mL，有机酸为丙二酸、单宁酸和草酸中的一种或 多种。
5. 根据权利要求1所述的双水相分离富集牡丹花色苷的方法，其特征在于：步骤（3)和 (4) 中，磁力搅拌时间为1. 5_3h，冷冻离心温度为4°C，转速为5000r/min，时间为5min。
6. 根据权利要求1所述的双水相分离富集牡丹花色苷的方法，其特征在于：步骤（3) 中，牡丹花残渣重复萃取的次数为2-3次。
7. 根据权利要求1所述的双水相分离富集牡丹花色苷的方法，其特征在于：步骤（4) 中，多级萃取过程中，无水乙醇的添加量与下相溶液的体积比为0.5-0. 75:1，萃取次数为 2-4 次。
8. 根据权利要求1所述的双水相分离富集牡丹花色苷的方法，其特征在于：步骤（6) 中，蒸馏水的添加量为固形物质量的4 0倍，萃取相混合溶液中乙醇和正丁醇的体积比为 1:3,萃取相与水相的体积比为1:1,萃取次数为2-3次。
【文档编号】C07H17/065GK104341473SQ201410496565
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2014年9月25日 优先权日:2014年9月25日
【发明者】王成忠, 袁亚光, 赵晓红 申请人:齐鲁工业大学