专利名称：抗血栓剂及其制造方法
技术领域：
本发明涉及抗血栓剂、血栓形成抑制剂或血栓形成因素抑制剂。
更详细地说，是通过新的或具有创造性的改良的制法得到具有优良的抑制血栓形成因素作用和稳定性，以药理上可允许的绿茶叶提取物的粉末为有效成分的抗血栓剂、血栓形成抑制剂或血栓形成因素抑制剂。(以下，将抗血栓剂、血栓形成抑制剂及血栓形成因素抑制剂统称为“抗血栓剂”。)绿茶，在以中国、日本等为中心的远东地区作为日常的嗜好品是占据一定位置的饮料，据说对于健康也很有益处。
在绿茶的叶中含有绿茶丹宁类、咖啡因、抗坏血酸、维生素E类、黄酮醇类、多糖类及β-胡萝卜素等成分。其中抗坏血酸及绿茶丹宁类等是主要构成成分。其中咖啡因及抗坏血酸在来自其他植物的茶中也含有，但以儿茶素类为代表的绿茶丹宁类只是绿茶中才能得到的固有成分，已知作为主成分有表儿茶素(epicatechin)、表儿茶素棓酸盐(epicatechingallate)、表棓儿茶素(epigallocatechin)、表棓盐儿茶素棓酸盐(epigallicatechingallate)四种。另外还含有氟、锌、钙盐的无机物等。
业已知道绿茶儿茶素类的主要功能是具有抑制脂质过氧化作用，此外认为对与各种疾病有关的活性氧作用的抑制、致癌物质变异原性的抑制、胆固醇再吸收抑制作用、抗菌抗病毒抑制作用、虫牙的预防及消臭作用等的多种效果。特别是进入1990年代，多方面公开了这些成分中的表棓儿茶素棓酸盐对于致癌物质的引发(initiation)过程及致癌促进剂(promotor)的抑制作用，并作了肯定的结论，所以从绿茶儿茶素开发抗癌制剂受到有力的重视。
本发明者，就绿茶成分药理学的作用进行了长时间的研究，其结果惊奇地发现绿茶成分具有卓越的抗血栓效果，从而完成了本发明。
因此，本发明的目的是在于提供含有以绿茶提取物为有效成分，并含有通常的赋形剂、稀释剂、抗氧化剂及其他药学制剂中通常使用的辅助剂的抗血栓剂。
本发明的另一个目的在于提供含有以绿茶提取物为有效成分，并含有通常的赋形剂、稀释剂、抗氧化剂及其他药学制剂中通常使用的辅助剂的抗血栓剂的制造方法。
绿茶儿茶素类的分离过程可以分为1)提取过程、2)除去过程及3)精制过程三个阶段。按以往报告中的提取过程是利用热水、冷水、戊醇或乙醇及其适当的混合物进行提取。从提取液除去有效成分以外的其他成分的过程，主要是用与水不混合的有机溶剂来达到最大的除去效果，主要使用极性大的氯仿、乙酸乙酯或二乙酯等。最终的精制过程主要是利用有机溶剂间互相不同的极性差异的分配提取法，目前使用了柱色谱法或高速液相色谱法进行精制。用分配提取法的精制过程，提取操作时需要很多时间，并且要大量使用氯仿、甲基异丁基酮等有机溶剂，所以在分离操作时，其经济性及稳定性上存在问题。用色谱进行精制的方法要使用通过交联葡聚糖凝胶或聚合物树脂的精制方法，溶剂的洗脱条件不是单一的、需要一定的洗脱时间及很多的人力，在这些方面应加以改善。另一方面，用高速液相色谱法虽然可以迅速高效率地进行纯度极好的精制，但是也存在着购买测定装置及洗脱溶剂的价格昂贵以及分离柱的老化等问题。
本发明者为了解决这些问题进行了广泛的研究，用离心分离法能一次完全除去热水提取液中的残余物。使用柱色谱用交联葡聚糖凝胶(Sephadex)LH-20，纯化分离溶剂，通过用15%-丙酮或二烷混合溶液一次洗净，不仅可除去水溶性的咖啡因、游离氨基酸类及糖类，而且还可以完全洗掉萜类化合物类及着色成分。所以，不需要像已知方法那样有一个另外的去咖啡因操作，可以防止使用氯仿、甲基异丁基酮等有机溶剂，在最终产品中混入有机溶剂或来自有机溶剂的污染物质。其结果只是红黄色部分存在于柱的顶端，这用肉眼能容易地观察出来。另一方面，对于残留的红黄色部分用60%水-丙酮或二烷混合溶剂能一次溶解离析出来，因此可以最大的收率得到活性成分，所以用本发明的方法可以完全克服公知方法存在的缺点。以这种发现为基础反复进行广泛研究的结果，完成了本发明。
在本发明中，初阶段用热水提取绿茶后，在提取液浓缩过程考虑到有效成分的抗氧化效果，必须加入1/4左右提取液的正丁醇，提取液在浓缩时，正丁醇暴露在上部空气中，为了不产生氧化变化要在经常保持正丁醇的体积下进行浓缩。另一方面要用冷冻干燥方式进行最终提取出的有效成分的浓缩操作。这样不仅可以完全除去水分，而且浓缩液的组成和冷冻干燥后有效成分的组成比几乎没有变化。
干燥了的有效成分粉末是黄褐色，易溶于水，即使保管6个月以上也没有吸收性，是很稳定的。因此，干燥了的粉末易于制成药学制剂。
反复实施上述方法的结果，各批(batch)中含有活性成分的制品的各组成成分几乎是一致的。
调查此活性成分组成的结果，确认了含有30%的聚戊醇(ポリペノ )类、60%的表棓儿茶素棓酸盐和表儿茶素的混合物、6%以下的表棓儿茶素。
本发明中的绿茶提取物的一般提取方法通过下述各方法进行说明。
提取方法将作为原料物质的干燥绿茶叶直接地或者将烘干茶叶，用70-90℃的热水提取10分钟以上。最好一边搅拌生成的混合物，一边在不沸腾的状态下完成提取。用加压过滤、吸滤或离心分离过滤等公知方法过滤出提取液中的不溶性物质，并收集过滤液。
用于提取的热水相当绿茶重量的5-100倍，优选的是10-30倍。热水提取溶剂中也可以混合5-50%左右的醇性溶剂后使用。提取时间依提取温度而不同。一般30秒至1小时，优选的是5-20分钟。
减压下的浓缩方法使用热水作为提取溶剂时，在得到的热水提取物中要加入10-50%(V/V)，最好为20%左右的正丁醇，直至在减压下浓缩操作完全终止之前都要保持此比例，这样做一方面防止提取物沸腾，另一方面由于存在于热水提取物的上层，可防止提取物内的有效成分直接与空气接触，从而防止成分组成的变化。
在约50-70℃下边加热，边在减压下如10-70mmHg下进行浓缩，制造出粘性提取物[水含量约10-30%(w/w)]。
减压下浓缩所需要的时间依减压的程度有所不同，但约为30分钟-2小时。在减压下的浓缩方法中，为了防止提取物中的成分损失或受到破坏，温度不要升到90℃以上。
冷冻干燥方法用减压下浓缩方法，在不加热的常温下浓缩从柱中得到的精制液后，急速地使之冷冻并保存。冷冻干燥方法是利用-100℃以下的致冷剂形成极低温状态，将试样置于真空状态中，这样可以完全除去具有升华性的物质和残留的水分。干燥时间取决于试样的量、表面的致冷剂温度及真空泵的容量，但一般在约12-24小时以内可以得到完全干燥品。
在用上述工序得到的干燥粉末中或绿茶中所含有的有效成分之一如下述通式， 式中的表棓儿茶素酸盐(EGCG)是以在提取物中含有量约50-70%(w/w)的比例残留在本发明的生成物中。
由于用这样方法得到的干燥粉末无吸湿性，而且是比容积小的粉末，所以适合于用公知方法来制造像粉末、微细颗粒、颗粒或片剂那样的药学制剂。
另外，这样得到的干燥粉末毒性小，可以经口给药。干燥了的粉末可以通过与药学上允许的赋形剂(例如，谷物粉末、乳糖、碳酸钙、磷酸钙等)、结合剂(如，谷物粉末、阿拉伯胶、羧甲基纤维素、羟甲基纤维素、结晶纤维素等)、润滑剂(如，硬脂酸镁、滑石等)及崩解剂(羧甲基纤维素、钙、滑石、合成铝、硅酸盐等)、稀释剂(水、植物类等)的混合制造出胶囊、粉末、颗粒、微细颗粒或片剂、软胶囊及液剂等药学的制剂。
在下述实施例中进一步详细说明本发明，但本发明不受这些限制。
实施例1将绿茶叶的干燥物、烘干绿茶或者市售绿茶200g用4000ml的70-90℃热水提取20分钟。得到的提取液进行一次过滤除去不溶物后，再以2000rpm将滤液离心分离10分钟，除去沉淀下的残渣。收集上层滤液(约3500ml)，用真空旋转蒸发器，在70℃下减压浓缩到约400ml。用400ml氯仿提取，完全除去非极性化合物。上述的提取进行三次以上。接着，用400ml乙酸乙酯三次反复提取水层后，将得到的约1200ml有机溶剂层，用真空旋转蒸发器在50℃下浓缩至50ml。浓缩液中加入丙酮或二烷200ml后，再次浓缩到20ml。20ml浓缩液加到交联葡聚糖凝胶LH-20柱的上部(内径35mm，长度550mm，交联葡聚糖凝胶重量200g)。首先用水-丙酮或水-二烷(84∶15，体积比)的溶液3000ml充分洗涤后，当判断出在柱内完全洗脱出绿黄色及褐色层后，用水-丙酮或水-二烷(40∶60体积比)溶液开始洗脱当吸附在柱上层部分的黄褐色乃至黄色带(band)开始在柱的顶端洗脱时，接受此时的馏分。而后用真空蒸发干燥器在70℃下浓缩到50ml。浓缩液在-20℃以下保存1日后，在冷冻干燥器中每次少量地使之完全干固，得到8.6g干燥粉末(EGCG残留比∶70%)。
干燥粉末中的EGCG的残留比可用以下方程式计算。
EGCG的残留比(%)＝相当EGCG峰面积/全体峰面积×100。
精确地称取用上述方法得到的干燥粉末5.0mg，并溶解在5.0ml甲醇中，将其中的5μl加在高速液相色谱上测定EGCG的含量。
高速液相色谱的测定条件测定仪器高速液相色谱仪(P-6300，日本日立工业社)洗脱条件乙腈-乙酸乙酯-0.05%磷酸(12∶2∶86，V/V)混合溶剂分离柱Cosmosil5C18(4.6mmi.d.x15mmL)(日本NakalaiTesque社)柱温度40℃测定波长280nm在这样的条件下，EGCG的残留时间是6.9分钟。
上述试验的结果表明，EGCG的残留比是70%。
实施例2-6中得到的干燥粉末的EGCG的残留比也用与上述同样方法测定。
实施例2将绿茶叶干燥物、烘干绿茶或市售的绿1.5Kg用20.0升的70℃的水-乙醇(90∶10，体积比)混合液提取20分钟。得到的提取液用滤纸进行一次过滤除去不溶物。收集滤液(约19.0升)，用真空旋转蒸发器，在70℃下减压浓缩，得到粘性提取物。将粘性提取物再次溶解至2升温水中后，每500ml用500ml的氯仿-正已烷混合溶剂(80∶20，体积比)提取，完全除去非极性化合物等。上述的提取除去操作进行三次以上。接着用500ml的乙酸乙酯反复三次提取水层，用真空旋转蒸发器，在50℃下将得到的约1500ml有机层完全干燥。干燥物中加入500ml丙酮中，再次浓缩到50ml。将50ml浓缩液加入到交联葡聚糖凝胶LH-20柱的上部(内径20mm×长500mm，交联葡聚糖凝胶纯重400g)。首先用4.0升水除去水溶性物质后，用水-丙酮(70∶30，体积比)的溶液3.0升充分洗涤，判断出柱内的绿黄色及褐色层完全被洗脱出后，开始用水-丙酮(40∶60，体积比)溶液洗脱，当吸附在柱上层部的黄褐色乃至黄色带开始在柱的顶端洗脱时，接受此时的馏分，并将该馏分用真空蒸发干燥器在70℃下浓缩到100ml。浓缩液在-20℃以下保存1日后，保存1日后，每次少量地在冷冻干燥器中完全干燥，得到43.8g的干燥粉末(EGCG残留比54%)。
实施例3将绿茶叶干燥物、烘干绿茶或市售的绿茶200g用4000ml70-90℃的热水提取20分钟。得到的提取液进行一次过滤除去不溶物后，再次以2000rpm离心分离滤液10分钟，除去沉淀下来的残渣。收集上层滤液(约3500ml)，用真空旋转蒸发器，在70℃下减压浓缩至约400ml。接着，水层用400ml乙酸乙酯反复提取三次，将得到的有机溶剂层约1200ml，用真空旋转蒸发器，在50℃下浓缩到50ml。浓缩液中加入200ml异丙醇，再次浓缩至20ml。将20ml浓缩液加入到交联葡聚糖凝胶LH-20柱的上部(内径35mm×长550mm，交联葡聚糖凝胶净重量200g)。首先用水-丙酮(85∶15，体积比)的溶液3000ml充分洗涤，当判断出柱内的绿黄色及褐色层完全洗脱出后，开始用水-丙酮(55∶45，体积比)溶液5.0升洗脱，当吸附在柱上层部的黄褐色乃至黄色带开始在柱的顶部洗脱时，接受此时的馏分，将该馏分用真空蒸发干燥器，在70℃下浓缩到50ml。用2.0升丙酮将残留在LH-20柱内的非极性物质洗脱出后，交联葡聚糖凝胶LH-20柱还可再使用。浓缩液在-20℃以下保存1日后，每次少量地在冷冻干燥器内使其完全干固后，可得到14.7g干燥粉末(EGCG残留比62%)。
实施例4将绿茶叶干燥物、烘干绿茶或市售绿茶100g用1升的70-90℃的热水提取10分钟。得到的提取液进行一次过滤降去不溶物后，再次以2000rpm离心分离滤液10分钟，除去沉淀的残渣。收集上层滤液(约0.8升)，用真空旋转蒸发器，在70℃下减压浓缩到约100ml。接着，用100ml乙酸乙酯反复3次提取水层后，将得到的有机溶剂层约280ml用真空蒸发器，在50℃下浓缩至粘稠状态。向浓缩液中加入150ml甲醇，再次浓缩至15ml。将15ml浓缩液加入的交联葡聚糖凝胶LH-20柱的上部(内径35mm×长550mm，交联葡聚糖凝胶净重200g)。首先用水-甲醇(85∶15，体积比)的溶液4.0升充分洗涤，判断出柱内的绿黄色及褐色层完全洗脱出后，开始用水-甲醇(30∶70，体积比)溶液洗脱，当吸附在柱上部的黄褐色乃至黄色带开始在柱的顶部洗脱时，接受此馏分，用真空蒸发干燥器，在70℃下浓缩到30ml。浓缩液在-20℃以下保存1日后，每次少量地在冷冻干燥器中使之完全冻结干固，得到5.5g干燥粉末(EGCG残留比58%)。
实施例5将绿茶叶干燥物、烘干绿茶或市售的绿茶200g用4000ml70-90℃的热水提取20分钟。得到的提取液进行一次过滤除去不溶物后，再次以2000rpm离心分离滤液10分钟，除去沉淀下来的残渣。收集上层滤液(约3500ml)用真空旋转干燥器在70℃下减压浓缩到约400ml。接着，用400ml乙酸乙酯反复三次提取水层，将得到的有机溶剂层约1200ml用真空旋转蒸发器在50℃下浓缩到50ml。向浓缩液中加入200ml异丙醇，再次浓缩到20ml。将浓缩液20ml注入到交联葡聚糖凝胶LH-20柱的上部(内径35mm×长550mm，交联葡聚糖凝胶净重200g)。首先用水-异丙醇(90∶10，体积比)的溶液2.5升充分洗涤，判断出柱内的绿黄色及褐色层完全被洗脱出后，开始用水-异丙醇(50∶50，体积比)溶液洗脱，当吸附在柱上层部的黄褐色乃至黄色带开始在柱的顶端洗脱时，接受此时的馏分，用真空蒸发干燥器，在70℃下浓缩到40ml。浓缩液在-20℃以下保存1日后，每次少量地在冷冻干燥器使之完全干固，得到10.2g的干燥粉末(EGCG残留比70%)。
实施例6将绿茶叶干燥物、烘干绿茶或市售的绿茶200g用4.0ml40-65℃的水-甲醇(50∶50，体积比)提取60分钟。得到的提取液进行一次过滤除去不溶物后，再次以2000rpm离心分离滤液10分钟，除去沉淀下的残渣。收集上层滤液(约3.0升)用真空旋转干燥器在70℃下充分减压受缩。在边加温下将浓缩干燥物溶解在水-甲醇(80∶20，体积比)的混合溶液500ml中，用乙酸乙酯400ml反复提取3次，将得到的有机溶剂层约1200ml用真空旋转蒸发器，在50℃下浓缩到50ml。向浓缩液中加入200ml二烷，再次浓缩到20ml。将浓缩液20ml注入到交联葡聚糖凝胶LH-20柱(内径35mm×长550mm，交联葡聚糖凝胶净重200g)的上部。首先用水-二烷(85∶15，体积比)的溶液3000ml充分洗涤，判断出柱内的绿黄色及褐色层完全被洗脱出后，开始用水-二噁烷(40∶60，体积比)溶液洗脱，当吸附在柱上部的黄褐色乃至黄色带开始在柱的顶端开始洗脱时，接受此时的馏分，并用真空蒸发干燥器，在70℃下浓缩到50ml。浓缩液在-20℃以下保存1日后，每次少量地在冷冻干燥器使之完全干固，得到7.8g的干燥粉末(EGCG残留比)。
以这种成分测定血小板凝集抑制能的活性。血液的凝固现象大致区分为作为血中有效成分的血小板起作用的一次止血和除去有形成分的所谓与血浆成分相关的二次止血。其中对于抑制血栓形成及为了防止血液凝固来说，一次止血的阻断剂的开发，可以说具有根本治疗制剂的价值。
在本发明说明书中，所谓烘干绿茶是指绿茶叶干燥物切细后，在制造绿茶前的半加工品。
对一次止血的效果1.抑制血小板凝集试验使用凝集记录计IIPa-3220(京都第一化学株式会社)按照Born的浊度计测定方法(Turbidimetric method)测定抗血小板凝集效果。检查原理是制作血小板富集现象(platelets rich plasma;PRP)，使血小板数达到200，000-400，000/mm3左右，而后向其中加入促凝物质(ADP，肾上腺素(Epinephrine)、胶原(collagen)、瑞斯托菌素(Ristocetin)，使之边凝集，边记录由于凝集而引起的吸光度(OD)变化。检查方法是从血小板机能正常的健康人体中，用抗凝固剂在3.8%柠檬酸钠(Sod.citrate)的管中以1∶9的比例采血。为了得到PRP用160G(1000rpm)离心分离10分钟后，调节此时的血小板数为200，000-400，000/mm3。为了得到血小板欠缺现象(plateletspoorplasma;PPP)，用2000G(3400rpm)进一步离心分离10分钟。使用凝集记录计IIPA-3220进行试验。温度为37℃、转速固定在1000rpm，用血小板欠缺血浆补偿。将血小板欠缺血浆和试料移到测定设备上后，预先放置3-5分钟左右。而且加入血小板促凝物质后，测定10分钟后的凝聚程度。血小板促凝物质使用ADP、肾上腺素、胶原、瑞斯托菌素。
实验结果，绿茶提取物以1mg/ml量时显示了强烈地抑制由促凝进物质而引起的血小板凝集。对于ADP显示60%的抑制效果，对肾上腺素显示96.5%的抑制效果，对胶原显示35.3%的抑制效果，对瑞斯托菌素显示36.5%的抑制效果。相反，作为对照药物的阿斯匹林(Aspirin)(0.1mM)，对ADP显示13.5%的抑制效果，对肾上腺素显示79.5%抑制效果，对胶原显示72.6%的抑制效果，而对于瑞斯托菌素完全未看出有抑制效果。
图1表示给与凝集促进剂ADP和本发明的抗血栓剂时的抑制凝集效果图。
图2表示给与凝集促进剂肾上腺素和本发明的抗血栓剂时的抑制凝集效果图。
图3表示给与凝集促进剂胶原和本发明的抗血栓剂时的抑制凝聚效果图。
图4表示给与凝集促进剂瑞斯托菌素和本发明的抗血栓剂时的抑制凝集效果图。
从本实验结果可以明显地看出本发明的抗血栓剂具有卓越的抑制血小板凝集效果。
2.抗血栓作用的测定实验的血栓诱发是按吉米诺(Dimino)的实验方法实施血。此时使用的大鼠是体重20-30g左右的雄性ICR大鼠，血栓的诱发是通过将血小板凝集促进物(肾上腺素、胶原)注射到大鼠的尾静脉中，使之急速地分布于微小血管内而完成的。所使用的凝集促进物是将15μg的胶原和400μM浓度的肾上腺素调制在100μl生理盐水中，每20g大鼠的体重以100μl的容量注射到尾静脉中。为了测定绿茶提取物的抗血栓效果，在实验开始2小时前按大鼠的体重每Kg各投与100mg和10mg的试料，此时投药的全体容量是0.4ml以下。绿茶提取物的抗血栓效果可用从由于给与血小板凝集促进物质而没有发生大鼠后肢麻痹和死亡的被保护的实验动物数的百分数进行计算，这里麻痹的标准是指15分钟以上后肢丧失机能或者有持续的振颤状态。
在确认肾上腺素和胶原的合适血栓诱发体积试验中，把15μg的胶原和400μM的肾上腺素溶解在100μl的生理食盐水中后，进行静脉内注射，结果可以诱发95%的血栓。血栓生成与否是以投与血小板凝集促进物后，是否致死和后肢麻痹持续15分钟以上的情况来判定，后肢麻痹是以拖着后肢爬行或者伴有振颤现象的状态作为判断基准。每Kg体重向腹腔内投入100mg绿茶提取物时，可看到66%的预防效果，腹腔内投入10mg时，可以看到44%的预防效果。另一方面，对于作为对照药物的阿斯匹林(100mg/Kg)则看到45%的预防效果。
图5表示投与凝集促进剂肾上腺素及胶原和本发明的抗血栓剂时的血栓抑制效果图。
按照本试验，可从确认本发明的抗血栓剂具有卓越的抗血栓效果，此效果表明以阿斯匹林的约1/10容量就具有与阿斯匹林同等的效果。
3.血液凝固试验(1)出血时间(BleedingTime)的测定。
对于体重180-200g的雄性Sprague-Dawley白鼠，每日一次连续10日投与试料。向白鼠腹腔内注入戊巴比妥钠(Sodiumpentobarbital∶400mg/Kg)进行麻醉，从距尾部顶端5mm处切掉尾尖，而后将尾巴浸入到37.5℃的盐水(Saline)溶液中直至距尾根部5cm处，测定止血时间。
试验结果，对照群的出血时间是65.0±12.9秒，而试料投与群，当10mg/Kg时是113.2±19.6秒，当100mg/Kg时是250.7±117.3秒，当300mg/Kg时是509.8±71.6秒，从此可看出出血时间是依试料容量的增加而延长。相反作为对照药物的阿斯匹林(100mg/Kg)是165.1±34.3，比对照药物显示了优良的作用。其结果表示在图6中。图6表示投与本发明的抗血栓剂和作为对照药物的阿斯匹林时的出血时间图。
(2)全血凝固时间(wholebloodclottingtime)的测定测定出血时间，将经过1日后的白鼠用乙醚麻醉，再用预先装有3.13%柠檬酸钠溶液0.5ml的塑料注射器从心脏采集血液5ml。慢慢地混合采集的血液后，集中在注射器中，将1ml血液加入到玻璃试管内，再加入1.7%CaCl2·2H2O200μl，在室温下缓慢振荡，并测定血凝块产生的时间。
试验结果，对照群的全血凝固时间是109.4±14.0秒，而试料投与群，当10mg/Kg时是130.1±20.5秒、当100mg/Kg时是140.9±14.2秒，当300mg/Kg时是150.6±17.6秒，可看出随容量增加而有若干增加。相反对于作为对照药物的阿斯匹林(100mg/Kg)，其全血凝固时间是137.2±19.4秒。其结果示于图7中。图7是投与本发明的药物和阿斯匹林时的全血凝固时间的比较图。
(3)血浆凝固时间(plasmaclottingtime)的测定将以上得到血液的一部分以25000rpm离心分离后，得到血浆，将血浆100μl、盐水100μl及50nMCaCl250μl加到玻璃试管中，在37℃下边缓慢振荡，边测定至产生块(clot)的时间。
试验的结果，对照群的血浆凝固时间是146.2±26.5秒，而对于试料投与群，当10mg/Kg时是177.5±37.6秒，当100mg/Kg时是219.8±57.9秒，当300mg/Kg时是233.1±83.2秒，可看出依投入容量而增加。相反，作为对照物的阿斯匹林(100mg/Kg)表现出的时间是222.5±40.2秒。其结果示于图8中。图8表示投与本发明的药物和阿斯匹林时的血浆凝固时间。
4.对血小板内的脂质过氧化及酶的抑制作用a)抑制丙二醛[malondialdehyde(MDA)]生成效果的测定将血小板浮游液1ml在37℃加到绿茶提取物的等渗透溶液中(最终浓度1mg/ml)，再加入Ca++及胶原。加入TBA试剂2ml，在90℃下加温20分钟后，在室温下冷却，以3000rpm离心分离10分钟。以535nm测定沉淀的血小板上部的红色溶液的吸光度，以1.56×105计算MDA-TRA包合体的摩尔吸光系数，通过MDA的生成量比较对于绿茶提取物的脂质过氧化抑制活性。
MDA生成量在与脂质过氧化过程中的第二次生成物的反应中，可以作为总脂质过氧化标准使用。绿茶提取物与抑制磷脂酶A2抑制剂的伯氨喹(primaquine)、阿的平(quinacrine)、氧酶(oxygenase)性的阿斯匹林(Aspirin)比较，对于脂质过氧化的抑制效果显示出同等程度的水平(level)。
b)测定花生四烯酸放出活性在37℃下，边培养(incubate)血小板浮游液1ml，边加入绿茶提取物(最终浓度1mg/ml)，再加入Ca++和胶原。30分钟后用薄膜过滤器迅速地除去血小板，使滤液呈pH3以下的酸性。用2ml的提取溶剂(氯仿∶甲醇＝1∶1，v/v)提取二次后，进行离心分离，将下部的氯仿层移到其他试管中后，用氮气干燥。将此干燥物溶解在50μl的二甲基甲酰胺(DMF)中，加入12nM单丹酰尸胺(monodancylcadaverine)的DMF溶液50μl及二乙基磷氰化物(diethilphosphorocyanidate)2μl，在常温下放置15分钟后，用萤光标识花生四烯酸。
用萤光标识了的花生四烯酸用逆相色谱柱，按50%甲醇∶乙腈的线性梯度溶离进行洗脱，以激发波长340nM、萤光波长520nM检测。
观察花生四烯酸量的变化结果，从依赖于绿茶提取物的花生四烯酸的变化少于伯胺喹及阿的平的变化可以推断出绿茶提取物在血小板内的作用部位与其说抑制磷脂酶A2倒不如说是通过抑制环氧合酶(cylooxygenase)或脂氧合酶(lipoxygenase)来达到脂质过氧化及血小板凝集的抑制效果。
6.高脂血症的治疗效果-抗过氧化作用(invitro)向小鼠(Rat)的肝微粒体(microsome)成分(1.5mgprotein/ml)中加入提取物，加入半膀氨酸(cystein)(最终浓度500μM、硫酸亚铁(最终浓度5μM)，在37℃培养(incubation)30分钟。加入10%的三氯乙酸3ml，离心分离后取上层液2ml。向其中加入0.67%TBA溶液，在沸水中反应15分钟后，冷却，测定吸光度。
7.对生物体机能性的研究-抗高血压效果(invitro)。
对血管紧涨素变化酶(Angiotensinconvertingenzyme;ACE)的抑制效果。
血管紧张素变化酶(ACE)是作用在担当生物体内血压及体液、电解质重要调节作用的肾素-血管紧张素(reninangiotensin)系统上的酶。该酶(ACE)可以在从肾素(renin)产生出的血管紧张素变化酶Ⅰ(ANGⅠ)的C末端游离出二肽(dipeptide)(His-Leu)，并转化成具有活性形式的血管紧张素变化酶Ⅱ(ANGⅡ)。此酶在生产出增高血压系(hypertensivesystem)的ANGⅡ的同时，还使得降压系(hypotensivesystem)的舒缓激肽(bradykinnin)惰性化，所以对调节生物体循环起着重要作用。
因此，根据绿茶提取物对于此酶的抑制效果的研究，可认为可以起到血压上升抑制剂作用。
阿斯匹林是抗血压凝固作用极为卓越的药物。可是阿斯匹林对于胃肠有很大的伤害，所以连续地服用是不可能的。相反，业已证实本发明的抗血栓剂不仅对胃肠没有伤害，而且在效果上是具有与阿斯匹林同等以上的卓越效果的药物。
像由以上试验确认的那样，本发明的绿茶提取物具有极其卓越的抗血栓效果。
因而，本发明的绿茶提取物可以作为抗血栓剂、血栓形成抑制剂或血栓形成因素抑制剂使用。
实验例1急性毒性实验从1CR系大鼠的静脉及口分别投入绿茶提取物的生理盐水溶液，通过72小时后的生死判断计算出LD50。计算时使用up and down方法(1969年日本南山堂发行、高木、小泽共编“药物学实验”第204-205页)。其结果如下投与物质投与方法动物数 LD50mg/Kg绿茶提取物静脉内投与10500经口投与101000像由以上实验确认的那样，本发明的抗血栓剂的急性毒性是极其小的。
本发明的绿茶提取物依患者或应给药人的年龄、性别或症状或预防的目的来给药，按每Kg体重1日1次乃至数次服用1.00-2000.00mg。
本发明的绿茶提取物可与通常的赋形剂、结合剂、润滑剂、崩解剂、稀释剂等辅助剂混合，制成药学制剂。
例举出以下制剂实施例制剂实施例1片剂的制造绿茶提取物10mg乳糖20mg淀粉20mg硬脂酸镁适量将上述成分按通常的片剂制法，压成50mg的片剂而制造出片剂。
制剂实施例2胶囊剂的制造绿茶提取物10mg乳糖20mg淀粉19mg滑石1mg硬脂酸镁适量将上述成分按通常的胶囊剂的制法，充填到50mg容量的胶囊中。
制剂实施例3液剂的制造绿茶提取物100mg异性化糖10g蜂蜜500mg尼古酰胺(药典)20mg无水咖啡因(药典)30mg苯甲酸钠70mg将上述成分按通常的液剂制造方法制造，充填到100ml容量的褐色瓶中，用塞盖好后进行低温杀菌处理。
制剂实施例4注射剂的制造绿茶提取物5mg减菌蒸馏水适量将上述成分按通常注射剂制法制造，充填到2ml的安瓿中，密封后杀菌。
制剂实施例6软质胶囊剂的制造1)充填组成物绿茶提取物10mg聚乙二醇230mg丙三醇13mg2)干燥外皮组成物(重量%)明胶52%丙三醇32%ANIDRISORB35/7012%水5%将上述组成物按通常的软质胶囊制法，制造软质胶囊。
制剂实施例7颗粒剂的制造绿茶提取物10mg
乳糖25mg将上述成分用通常的挤压组合机进行挤出，制造成颗粒剂。
本发明的抗血栓绿茶提取物也可以作为与具有其他药效的药理物质混合的组合物使用。这样的组合物当然也属于本发明的范围。
4.图的简单说明图1至图4是一边用凝集促进物ADP、肾上腺素、胶原以及瑞斯托菌素进行凝集，一边加入本发明的抗血栓剂，从而比较抗血栓效果的图。
图5是合并投与肾上腺素和胶原，测定投入本发明抗血栓剂的抗血栓效果图。
图6是表示投与本发明的抗血栓剂和作为对照物的阿斯匹林时的出血时间的图。
图7是比较投入本发明抗血栓剂和阿斯匹林时的栓血凝固时间图。
图8是表示投入本发明的抗血栓剂和阿斯匹林时的血浆凝固时间图。
权利要求
1.一种抗血栓剂，其中含有以绿茶提取物作为有效成分，与通常药剂学上使用的辅助剂一起用通常方法制成通常的剂形。
2.权利要求1的抗栓剂，其中通常的制剂是散剂。
3.权利要求1的抗栓剂，其中通常的制剂是片剂。
4.权利要求1的抗栓剂，其中通常的制剂是胶囊剂。
5.权利要求1的抗栓剂，其中通常的制剂是液剂。
6.权利要求1的抗栓剂，其中通常的制剂是软胶囊剂。
7.权利要求1的抗栓剂，其中通常的制剂是注射剂。
8.权利要求1的抗栓剂，其中通常的制剂是颗粒剂。
9.一种抗血栓剂的制造方法，其中是以绿茶提取物为有效成分，与通常药剂学上使用的辅助剂一起用通常方法制成通常的剂形。
10.绿茶提取物的制造方法，其中是用水或水和低级醇的混合物热水提取绿茶叶干燥物、烘干绿茶或市售的绿茶，除去不溶物质的溶液浓缩后，再次溶解在水中，用有机溶剂提取，除去非极性化合物后，浓缩水层，用色谱柱浓缩分离出的液体而得到绿茶提取物。
全文摘要
本发明涉及抗血栓剂、血栓形成抑制剂或血栓形成因素抑制剂。更详细地说是涉及通过新颖的又有创造性的改良方法，制造出具有优良的阻断血栓形成因素作用和稳定性的，以药理上可允许的绿茶提取物的粉末为有效成分的抗血栓剂、血栓形成抑制剂或血栓形成因素抑制剂。本发明提供了含有以绿茶的提取物为有效成分并含有通常的赋形剂、稀释剂、抗氧化剂、以及其他药学的制剂的制造中通常使用的辅助剂的抗血栓剂及其制造方法。
文档编号C07D311/62GK1107355SQ9411529
公开日1995年8月30日 申请日期1994年9月13日 优先权日1993年9月13日
发明者尹汝杓, 文东辙, 李镕文, 李世昌, 朴钟凡 申请人:许桂成