专利名称：新型的类视黄酸的制作方法
技术领域：
本发明涉及式I的新化合物和其可药用盐，酯和酰胺 式中C7-C8键为双键或叁键；当C7-C8键为双键时，R1和R2独立地为卤素或低级烷基，或当C7-C8键为叁键时，R1和R2独立地为低级烷基；或R1和R2一起为C3-C13亚烷基，其中一个碳原子可被选自硫、氧和氮的杂原子取代；或R1和R2与和它们相接的碳原子一起是具有5-6个碳原子的芳环或具有5-6个原子的杂芳环，其中R1或R2中的一个原子为选自氧、氮和硫的杂原子，且R1和R2的剩余原子都是碳。
当R1和R2一起为C3-C13亚烷基时，它们优选地为C3-C6亚烷基，尤其为C6-亚烷基。当R1和R2与和它们相接的碳原子一起为芳环时，则优选的芳环为噻吩、苯和吡啶。R1和R2卤素可以是Cl、Br、F或I，Br和I是优选的。R1和R2低级烷基为C1-4烷基，它们可以是直链的或支链的。优选的低级烷基是甲基。
本发明优选的化合物是式I的化合物，以及其可药用盐、酯和酰胺，式中C7-C8键为双键，R1和R2独立地为卤素或低级烷基，或R1和R2一起为C3-13亚烷基，其中一个碳原子可被选自硫、氧和氮的杂原子取代，或R1和R2与和它们相接的碳原子一起是具有5-6个碳原子的芳环或具有5-6个原子的杂芳环，其中R1或R2中的一个原子是选自氧、氮和硫的杂原子，并且R1和R2的剩余原子都是碳。
本发明的另一方面涉及式I的化合物，其可药用盐、酯和酰胺，式中C7-C8键为叁键，R1和R2独立地为低级烷基，或R1和R2一起为C3-13亚烷基，其中一个碳原子可被选自硫、氧和氮的杂原子取代，或R1和R2与和它们相接的碳原子一起是具有5-6个碳原子的芳环或具有5-6个原子的杂芳环，其中R1和R2的一个原子是选自氧、氮和硫的杂原子，并且R1和R2的剩余原子都是碳。
人们已知通过连接到蛋白质族上的视黄酸功能是作为核视黄酸受体(“RAR”)。该族的三个成员称为RATα、RARβ和RARγ。连接到受体基团上的9-顺式视黄酸已知为视黄酸X受体(“RXR”)(Lev-in等人，Nature，355359-361(1992)； Heyman等人，Cell，68397-406(1992))，而连接到RARα的全-反式和13-顺式视黄酸则不是。但是，9-顺式视黄酸也起受体的RAR基团的配位体的作用，因此可呈现出不希望的全-反式和13-顺式视黄酸的副作用。已知RAR和RXR受体都形成传递其生物功能的杂二聚物(Leid等人，Cell，68377-395(1992)；Yu等人，Cell，671251-1266(1991)；Zhang等人，Nature，355441-446(1992))。
本发明的化合物对受体的RXR族显示出高度的选择性，并可用作抗增生制剂和对皮肤病和肿瘤适应症具有实用性。尤其是，本发明的化合物抑制皮脂(sebocytes)的增生。已知皮脂的增生会引起痤疮。因此，抑制了皮脂的增生是治疗痤疮的已知方法，这样，本发明的化合物可用于治疗痤疮。
另外，本发明的RXR选择性化合物在本身失活的剂量下增加了类视黄酸的活性，类视黄酸可用于治疗癌症，尤其是白血病和硬性肿瘤，在硬性肿瘤中，尤其是头，颈和胸部的瘤，特别是胸瘤，其本身也可用于治疗皮肤病，尤其是痤疮和太阳损伤的皮肤，与9-顺式或13-顺式视黄酸相比它降低了毒性作用。具有RARα活性如全-反式视黄酸和13-顺式视黄酸的类视黄酸是具有生物活性的化合物，而这种生物活性是基于其结合到RARα受体和转移活化RARα受体。因此，本发明的化合物在治疗这种类视黄酸已知有用的适应征中可作为具有RARα活性的活性类视黄酸的增效剂。与具有RARα活性的类视黄酸一起施用本发明的化合物则可使用更低剂量的类视黄酸，或在常规剂量下增加类视黄酸的效力可用于任何其中具有RARα活性的这类类视黄酸已知是有用的这类适应征。
因此，本发明还包括增效具有RARα活性的类视黄酸活性的方法，其中与有效量的具有RARα活性的化合物一起，向病人给药一定量(优选地为具有RARα活性的化合物重量的1-10倍量)的本发明化合物，它对增效具有RARα活性的化合物的活性是有效的。“与......一起”是指本发明的RXR-选择性化合物与具有RARα活性的化合物一起可作为系列施用，或基本上是同时的，优选地，但不是必须的，以单独的、口服单位剂形一起给药，或在给药具有RARα活性的化合物前或后给药，以使RXR-选择性化合物和具有RARα活性的化合物同时存在于病人的血流中，以使本发明的RXR-选择性化合物是以将增效具有RARα活性的化合物活性的浓度存在。优选地，本发明的RXR-选择性活性化合物和具有RARα活性的化合物的给药间隔不多于4小时，更优选地不多于1小时，最优选地基本上是同时的。
按照本发明，已经发现本发明的化合物在标准细胞培养测试中，在产生人体白血病细胞的区别中增效具有RARα活性的类视黄酸的活性。因此，本发明的化合物在引起消退或减轻血液瘤，尤其是与急性前髓细胞白血病有关的那些瘤中具有活性，该活性将增效具有RARα活性的类视黄酸的已知活性。白血病的治疗是通过与具有RARα活性的类视黄酸一起向病人全身给药本发明的化合物来实现的，众所周知，具有RARα活性的类视黄酸是用于阻止血液瘤发展或引起血液瘤消退。用量将取决于肿瘤的数量和大小以及病人的需要。
按照本发明，还发现本发明的化合物在引起消退或减轻硬性肿瘤，尤其是与头和颈、和与胸癌有关的那些瘤中，增效具有RARα活性的类视黄酸的活性。因此，本发明的化合物在引起消退或减轻硬性肿瘤，尤其是与头和颈癌以及与胸癌有关的那些瘤中具有活性，这种活性将增效具有RARα活性的类视黄酸的已知活性。肿瘤的这种治疗是通过与具有活性的RARα活性的类视黄酸一起向病人全身给药本发明的化合物以引起消退或减轻肿瘤，尤其是头、颈和胸瘤。其用量将取决于瘤的数量和大小以及病人的需要。
为了治疗上述疾病，将本发明的化合物作为含本发明化合物的组合物，任选地与具有RARα活性的化合物，以及与所述化合物相容的可药用载体一起进行全身给药。在制备这类组合物时，可使用任何常规的可药用载体。当口服给药药物时，通常是以规定的间隔，方便地是每天进餐时间或每天一次给药。
可药用盐包括在视黄酸技术中化学允许的并且在可药用制剂中适用于病人的任何盐。可使用本发明化合物的任何这类常规可药用盐。在可使用的常规盐中，有碱性盐，包括例如碱金属盐如钠或钾，碱土金属盐如钙或镁，和铵或烷基铵盐。
按照本发明，本发明的化合物可以其可药用水解酯的形式给药。在本发明的组合物和方法中可使用任何可药用水解酯。在酯中有芳香酯例如苄基(OBzl)或用低级烷基、卤素、硝基、硫基取代的苄基，或取代的硫，即低级烷基、叔丁基、环戊基、环己基、环庚基、和9-芴基甲基。
可将药物组合物制成任何常规形式，包括(a)用于口服给药的固体形式例如片剂、胶囊、丸剂、粉末、颗粒等；和(b)用于局部给药的制剂例如溶液、悬浮液、软膏、乳膏、凝胶、微粉化的粉末、气溶胶等。药物组合物可被消毒和/或可包含辅助剂例如防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、用于改变渗透压的盐，和/或缓冲剂。
按照本发明，上述的本发明化合物以可药用口服方式使用。本发明的这些药物组合物包含本发明的所述化合物或其可药用盐和与相容的可药用载体物质相结合的其可药用水解的酯。可使用任何常规载体物质。载体物质可以是适于口服给药的有机或无机惰性载体物质。合适的载体包括水、明胶、阿拉伯树胶、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、滑石、植物油、聚(亚烷基)二醇、凡士林等。此外，药物制剂可包含其它药用活性制剂，优选为具有RARα活性的类视黄酸。按照药物复合的可接受的实践，可加入的其它添加剂例如香味剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂和缓冲剂等。
可将药物制剂制成任何常规的口服剂量形式，包括用于口服给药的固体形式例如片剂，胶囊，丸剂，粉剂，颗粒等。优选的口服剂量形式包括片剂，硬明胶或软明胶，甲基纤维素或其它易于溶解在消化道中的合适物质的胶囊。本发明的口服剂量将按处方医师确诊的个别病人的需要而改变。
在向病人口服给药以增效具有RARα活性的类视黄酸(用于治疗急性前髓细胞白血病，或头，颈或胸瘤)的不同活性时，通常向成人每天施用的本发明的化合物的用量为具有RARα活性的类视黄酸量的1-10倍。具有RARα活性的类视黄酸的给药量为约20-约300mg/m2天，优选地为约50-100mg/m2/天，实际药量将根据病人的年龄和体重而改变。通常结合治疗约进行3个月。
本发明的化合物或其可药用盐或水解酯以及具有RARα活性的类视黄酸可按本发明公开给药。但优选地是作为包含本发明化合物，其可药用盐或酯的口服组合物与具有RARα活性的类视黄酸一起给药，其用量要足以结合治疗急性前髓细胞白血病或头、颈或胸瘤。
一般优选的单位口服剂形为片剂或胶囊，它含有10-50mg具有RARα活性的类视黄酸和其用量为具有RARα活性的类视黄酸用量1-10倍的本发明化合物，其可药用盐或其可药用水解酯。因此，在每个片剂或胶囊中，本发明化合物的量为10-50mg。根据病人的体重和年龄每天可给药这些片剂或胶囊一次或两次。
按照本发明，局部和口服给药本发明的化合物，其可药用盐和其可药用水解酯对治疗各种形式的痤疮例如炎症和非炎症的都是有效的。
对于局部给药皮肤时，优选地将在可药用载体中包含本发明化合物的组合物制成软膏、酊剂、乳膏、凝胶、溶液、洗液、喷雾剂、悬浮液、香波、发皂等。事实上，按照本发明，可使用用于应用到皮肤或头皮上的任何常规组合物。在施加含本发明活性组分的组合物的方法中，优选地是以凝胶、洗液或乳膏的形式施加本发明的活性组分。局部给药到皮肤上的药物制剂可通过将上述的本发明的活性组分与这类制剂中通常使用的无毒的、治疗惰性的、固体或液体载体混合而制备。这类制剂应包含基于组合物总重量至少约0.05％(重量)的本发明活性组分。由于本发明的活性组分相对来说是无毒的和非刺激的，因此，在局部组合物中可使用超过3％的量。优选地是这些制剂包含基于组合物总重量约1-2％(重量)的本发明活性组分。优选地是将这些制剂每天施加到皮肤上一次或两次。这些制剂可按病人的需要使用。在实施本发明时，也可将本发明活性组分加入到水溶液或醇溶液例如乙醇中。
在制备上述局部用制剂时，可使用的添加剂例如防腐剂、增稠剂、香料等以及在局部制剂的药物混合技术中通用的那些。另外，可将常规的抗氧化剂加入到包含本发明上述活性组分的局部制剂中。在这些制剂中可使用的常规抗氧化剂包括N-甲基-α-生育酸胺、生育酚、丁基化的羟基苯甲醚，丁基化的羟基甲苯，乙氧基喹(ethoxy quin)等。
按本发明，可使用在头发用的局部制剂中通常使用的常规香料和洗液。此外，必要时，在本发明的局部制剂中可使用常规的乳化剂。
包含本发明活性组分的软膏配方可包含半固态石油烃与分散本发明活性组分的溶剂的混合物。
包含本发明活性组分的乳剂优选地包含由致湿物，粘度稳定剂和水的水相，脂肪酸醇，半固态石油烃和乳化剂的油相以及包含已分散在水性稳定剂-缓冲溶液中的本发明活性组分的相所形成的乳化液。可将稳定剂加入到局部制剂中。本发明可使用任何常规的稳定剂。在油相中，脂肪酸醇组分起稳定剂作用。这些脂肪酸醇组分优选地是从还原至少14个碳原子的长链饱和脂肪酸而衍生的。包含本发明活性组分的乳剂基药物配方可由例如含脂肪酸醇的乳化液、半固态石油烃、1，2-乙二醇和乳化剂所组成的。
通常，治疗痤疮，无论是炎性还是非炎性，可通过向病人每天口服给药0.1-10mg/kg本发明的化合物一次或两次来实施。治疗痤疮可通过局部施加含本发明化合物的局部用组合物来实施，其用量为约0.05-3％(重量)，优选地约1-2％(重量)，每天一次或两次。
用于治疗的剂量通常取决于给药途径，各个病人的年龄、体重、大小和疾病情况。
本发明优选的化合物是(2E，4E，6Z，8E)-3，6，7-三甲基-9-(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)-2，4，6，8-壬四烯酸(nonatetraenoic cid)；(2E，4E)-3-甲基-5-(2-(2-((E)-2-(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)乙烯基)-1-环己烯-1-基)-2，4-戊二烯酸；(全-E)-6-溴-3，7-二甲基-9-(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)-2，4，6，8-壬四烯酸；(全-E)-6-碘代-3，7-二甲基-9-(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)-2，4，6，8-壬四烯酸；
(全-E)-6-氯代-3，7-二甲基-9(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)-2，4，6，8-壬四烯酸；(2E，4E)-3-甲基-5-(2-((E)-2(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)乙烯基)-1-环戊烯-1-基)-2，4-戊二烯酸；(2E，4E)-3-甲基-5-(2-((E)-2(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)乙烯基)-1-环庚烯-1-基)-2，4-戊二烯酸；(2E，4E)-3-甲基-5-(2-((E)-2(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)乙烯基)-1-环辛烯-1-基)-2，4-戊二烯酸；(2E，4E)-3-甲基-5-(2-(2-((E)-2-(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)乙烯基)-1-苯基)-2，4-戊二烯酸；(2E，4E)-3-甲基-5-(3-((E)-2-(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)乙烯基)-2-噻吩基)-2，4-戊二烯酸；(2E，4E)-3-甲基-5-(2-((E)-2-(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)乙烯基)-3-噻吩基)-2，4-戊二烯酸；(2E，4E)-3-甲基-5-(4-((E)-2-(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)乙烯基)-3-噻吩基)-2，4-戊二烯酸；(2E，4E)-3-甲基-5-[2-(2，6，6-三甲基-环己-1-烯基乙炔基)-环戊-1-烯基]-戊-2，4-二烯酸；(2E，4E)-3-甲基-5-[2-(2，6，6-三甲基-环己-1-烯基乙炔基)-环庚-1-烯基]-戊-2，4-二烯酸；和(2E，4E)-3-甲基-5-[2-(2，6，6-三甲基-环己-1-烯基乙炔基)-苯基]-戊-2，4-二烯酸。
测定与RAR受体和RXR受体有关的类视黄酸结合和转移活化(tr-ansactivation)特性的方法在现有技术中是已知的，例如Levin等人，Nature，355359-361(1992年1月23日)；Allenby等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9030-34(1993年1月)；Allenby等人，J.Biol.Chem.，26916689-16695(1994年6月17日)。在那些公开刊物中所描述的方法主要用于测定本发明实施例中所报导的类视黄酸的结合和转移活化的特性。
用于治疗痤疮的本发明化合物的活性可按任何常规方法测定。例如，本发明化合物抑制皮脂增生的能力是治疗痤疮的标准模式。本发明化合物的皮脂抗增生活性可按实施例20(1)的步骤测定。
另外，本发明化合物降低Rhino小鼠小囊(utricle)大小的能力是治疗痤疮的另一种标准模式。该活性可按实施例20(2)的步骤测定。
此外，本发明化合物降低Syrian Golden大田鼠皮脂腺大小的能力是治疗痤疮的另一种标准模式。该活性可按实施例20(3)的步骤测定。
本发明化合物增效类视黄酸RARα活性的能力可按任何常规方法测定。因此，可通过在标准筛选测定中测量本发明化合物与具有RARα活性的类视黄酸的结合活性而测定本发明化合物增效类视黄酸RARα活性的能力，已知标准筛选测定是与熟知的用类视黄酸治疗的疾病状态有关。所需降低具有RARα活性的类视黄酸浓度以获得特定的活性量或在恒定浓度下增加类视黄酸的活性将表明本发明化合物的增效活性，在这种情况下，本发明化合物的浓度是一种在该浓度下本发明化合物本身活性很少或没有活性。
例如，如下所示的在分化HL-60细胞(人体白血病的标准模式)中本发明化合物增效类视黄酸活性的能力的结果表明了本发明化合物的增效活性。本发明化合物在分化HL-60细胞中增效具有RARα活性的类视黄酸活性的能力可按实施例18进行。
此外，如下所示的本发明化合物在抑制小鼠B细胞活化(免疫抑制的标准模式)中增效具有RARα活性的类视黄酸活性的结果表明了本发明化合物的活性。本发明化合物在抑制小鼠B细胞活化中增效类视黄酸活性的能力可按实施例19进行。
此外，如下所示的本发明化合物在抑制胸癌细胞系(硬肿瘤的模式)的生长中增效具有RARα活性的类视黄酸活性的结果表明了本发明化合物的增效活性。本发明化合物在抑制胸癌细胞系的生长中增效类视黄酸活性的能力可按实施例21进行。
本发明化合物可按任何常规方法制备。下列方法说明了优选的方法。
方法1a(R10和R20＝低级烷基) 方法1b(R11＝低级烷基；R21＝卤素) 方法1c(R12＝低级烷基或卤素；R22＝低级烷基，F or Cl) 方法1d(R13＝低级烷基或卤素；R23＝Br)
方法2 方法3
方法4
方法5
方法6
方法7
方法8
方法9 方法1a-1d表明用于制得式I化合物的中间酯的优选的制备方法，式中R1和R2不一起形成环。方法1a是其中R1和R2独立地为低级烷基的式I化合物的制备途径。方法1b是其中R1为低级烷基而R2为卤素或低级烷基的式I化合物的制备途径。方法1c是其中R1为低级烷基或卤素而R2为低级烷基，氟或氯的式I化合物的制备途径。方法1d是其中R1为低级烷基或卤素而R2为溴的式I化合物的另一种制备途径。但是，当R1为烷基时，R2为溴的式I化合物最好通过方法1b的途径制备。
在方法1a中，将1置于强碱(例如，二异丙基酰胺锂)中，用烷基卤化物烷基化烯醇化物，形成酯3，在平衡条件下(例如，在回流乙醇中的乙醇钠)置于碱中后获得主要作为一种异构体(Z)的酯3。
方法1b优选地用于制得R2为卤素的式I化合物。但是，方法1b也可用于制备R2为低级烷基的式I化合物。将铜酸盐(R1)2LiCu加入到乙炔7(Carotenoids，Otto Isled，ed.(Birkhauser Verlage，Basel，1971))中，由顺式添加物得到新的铜酸盐，在用合适的卤物化(例如二噁烷中的碘)抑制(quenching)获得3′；R2＝I。用烷基卤化物抑制铜酸盐将得到酯3′，其中，R2为烷基。铜酸盐化学的优点是在大多数情况下形成单一的异构体。
方法1c优选地用于制得R2为低级烷基的式I化合物。将市售的原料(例如，β-芷香酮)(R2＝CH3)与合适的膦酸酯15(Caroteno-ids，同上)偶合获得所需的酯3″。
方法1d可用于形成R2为溴的式I化合物(G.Kobrich等人，Lleb-igs Ann.Chem.，51704(1967))。按参考方法使酮14转化成烯烃16。使已知的溴代酸16的混合物转变成酯3的混合物(例如，R1＝Me；R2＝Br)，然后经HPLC分离，接着转变成上述的最终产物。
在处理最终产物时，用酯3，3′，3″或3通过标准步骤(Carote-noids，同上)制备。例如，反应可按方法2所示进行。在方法2中，将任何酯3，3′，3″或3还原成醇，接着用二氧化锰再次氧化成醛4。然后将醛4与膦酸酯5偶合得到作为甲基酯6的最终产物。6的基本水解产物游离酸。
其中R1和R2一起为C3-13亚烷基的式I化合物如方法3所示易于制备(R.M.Caates等人，J.Org.Chem.，473597(1982))。因此，使环酮8(例如环戊酮或环己酮等)置于二甲基甲酰胺中的三溴化磷中，得到溴代醛9(Coates等人，同上)，然后与鏻盐101偶合，得到乙烯基溴11。随后通过金属转移作用和与二甲基甲酰胺反应，而使乙烯基溴转化成醛12。在处理新醛时，通过将12与膦酸酯5偶合而易于形成最终产物13。接着水解得到所需的酸。
方法7表示用于方法3的中间体12的优选的制备方法，其中R1和R2一起为C3-13亚烷基。因此，按已知方法(例如，Org.Synthesis，Coll Vol.5198(1973))将酮8转变成酯36，然后转化成烯醇磷酸酯37。用铜酸二甲酯置换磷酸酯基团(J.Org.Chem.，532984(1988))，然后得到酯38。使38置于二异丙基酰胺锂中，然后添加环柠檬醛39，得到内酯40(Tet.Letters，212509(1980))。用叔丁醇钾处理内酯40，接着用甲基碘抑制反应产物，获得酯41。用二异丁基氢化铝还原，接着用二氧化锰氧化，产生醛12。
方法4、5和6所示的途径可用于获得式I的化合物，式中R1和R2与和它们相接的碳原子一起是5-6节芳环(例如，噻吩，苯和吡啶等)。因此，在方法4中，表示含苯结构22的途径。用三苯膦氢溴化物处理2-苯并[C]呋喃酮，然后将产生的盐17与醛18偶合，获得所示的酸性酯19。通过酰基氯(未示出)还原酸性酯19，得到苄基醇20，然后将其转化成醛21，接着与环香叶基鏻内鎓盐10偶合，获得酯22，水解后产生酸。
如方法5和6所示，由合适的溴噻吩制备各种噻吩衍生物。例如，在方法5中，使2，3-二溴噻吩23选择性地金属化并置于二甲基甲酰胺中，获得醛24，然后用膦酰基乙酸三乙酯将醛24同系化成为酯25。还原酯基团得到醇26，经保护后得到乙缩醛27，现在再次使其金属化并用二甲基甲酰胺抑制，得到醛28。用环香叶基鏻内鎓盐缩合28，接着经酸处理获得醇29。然后用二氧化锰将醇29氧化成醛30，将它置于甲基锂中，再次用二氧化锰氧化获得甲基酮31。用膦酰基乙酸三乙酯使链延长获得所需的物质如酯32，经水解得到酸。按类似方法(参见实施倒)可制备其类似物。
在方法6中，使醛24与环香叶基鏻内鎓盐10偶合获得33，使33选择性地金属化并置于二甲基甲酰胺中，得到醛34。然后用膦酰基乙酸三乙酯使链延长，获得所需物质如酯36，经水解获得酸。
方法8和9表示其中C7-C8键为叁键的式I化合物的优选的制备方法。
在方法8中，醛42在碱例如NaOH的存在下，在Wittig-Horner反应中与4-(二乙氧基-膦酰基)-3-甲基-丁-2-烯酸乙酯偶合，获得酯43。
使用强碱例如丁基锂，使2，2，6-三甲基环己酮与三甲基硅乙炔(TMS-乙炔)反应。用Burgess试剂(甲氧基羰基氨磺酰-三乙铵氢氧化物，内盐)除去水，并用氟化四丁铵除去甲硅烷基保护基团，得到2-乙炔基-1，3，3-三甲基-1-环己烯。
采用Pd(Ph3P)4/CuI复合物作催化剂和哌啶作溶剂，将环己烯衍生物与酯43偶合。然后将所得的酯水解成酸III。
在方法9中，使2-乙炔-苄基醇(化合物44，其中R为H)与氯化三甲基硅烷反应。在用丁基锂脱质子化作用后，使保护醇(44，R＝SiMe13)与2，2，6-三甲基-环己酮反应，形成其中R′为SiMe3的加合物45。用碱例如氢氧化钾水溶液除去甲硅烷基保护基，接着用乙酰氯和三乙胺乙酰化，获得乙酸酯45(R′＝乙酰基)。
通过用Burgess试剂处理，从环己醇衍生物45中除去水，获得相应的环己烯衍生物。接着水解乙酰基并用MnO2氧化伯醇，获得醛46。在Wittig-Horner反应中，使醛46与4-(二乙氧基-膦酰基)-3-甲基-丁-2-烯酸乙酯反应，在水解其相应的酯后获得酸III。
下列实施例阐述本发明。在实施例中，浓度包括使用旋转式汽化器在40℃和20mmHg真空下蒸发溶剂。HPLC是指使用带有硅柱体的Walers Prep 500的高性能液相色谱。全部中间物和最终产物都经HNMR光谱学检定。
实施例1制备(2E，4E，6Z，8E)-3，6，7-三甲基-9-(2，6，6-三甲基-1-环已烯-1-基)-2，4，6，8-壬四烯酸将(全-E)-乙基-3-甲基-5-(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)-2，4-戊二烯酸酯(1；R1＝Me；13.1g)溶解在四氢呋喃(25ml)中，然后在-70℃下加入已溶解在四氢呋喃(100ml)中的新制备的二异丙基酰胺锂溶液(根据得自二异丙胺和正丁基锂的起始酯的1.2当量；1.6M于己烷中)中。使得到的溶液在该温度下再搅拌1小时，然后用甲基碘(10ml)处理，并加热至室温。加入饱和的氯化铵溶液，通过用己烷/乙酸乙酯混合物(4∶1)萃取分离有机物质。在真空中除去溶剂，获得油状烷基化产物(14g)。将该物质溶解在含甲醇钠(10ml；4.6M在甲醇中)的甲醇(100ml)中并回流加热2小时。在该时间后，将混合物冷却到室温，用水处理并如上所述用己烷/乙酸乙酯萃取。在真空中除去溶剂，获得粗制(2E，4E)-2，3-二甲基-5-(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)-2，4-戊二烯酸甲酯(13.2g)，它是约2、3双键，9∶1的异构体的混合物。将该物质溶解在已冷却至-70℃的己烷(150ml)中，然后用过量的氢化二异丁基铝(1M在己烷中)处理，并加热至0℃。随后加入二乙醚(200ml)，接着加入罗谢尔盐(Rochelle salt)的水溶液(20％，20ml)。当开始出现少量的放热反应时，将混合物小心地加热到室温。使混合物加热到35℃，然后冷却至室温。接着加入固态硫酸镁(50g)并过滤掉固体。
在真空中除去溶剂，获得油状粗醇。将该物质溶解在己烷(20ml)中并加入到在已冷至5℃的己烷-乙醚的混合物(1∶1；400ml)中的二氧化锰(102g)的浆料中，在该混合搅拌1.5小时，然后在室温下再搅拌1小时。然后过滤掉固体并在真空中浓缩该溶液。通过HPLC(5％乙醚-己烷溶剂体系)色谱纯化残余物，获得纯的(2E，4E)-2，3-二甲基-5-(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)-2，4-戊二烯醛(pentadienal)(6g；51％全部产自于乙酯)。
用己烷洗涤氢化钠(1.3g；64％在油中)，在真空中干燥，然后在5℃下悬浮在四氢呋喃(60ml)中。向上述悬浮液中加入3-甲基-4-二乙基膦酰基巴豆酸甲酯在四氢呋喃(8.6g在30ml中)中的溶液，获得纯净的钠盐溶液(注如果混浊，使混合物通过CELITE硅藻土过滤)。然后将透明溶液冷却至10℃，用已溶解在四氢呋喃(20ml)中的上述醛(6g)处理，然后在室温下搅拌30分钟。加入己烷，用水洗涤该混合物，干燥(硫酸镁)过滤掉固体并浓缩。从己烷中结晶残余物，得到纯的(2E，4E，6Z，8E)-3，6，7-三甲基-9-(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)-2，4，6，8-壬四烯酸甲酯是黄色结晶固体。将该物质溶解在含氢氧化钾(4g)的乙醇-水(100ml；9∶1)的混合物中，回流加热30分钟。使混合物冷却至室温，倒入冷的磷酸(2M)的水溶液中，将固体萃取到二氯甲烷中。在真空中除去溶剂，并从乙腈中结晶残余物，获得(2E，4E，6Z，8E)-3，6，7-三甲基-9-(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)-2，4，6，8-壬四烯酸(3.8g)呈淡黄色结晶固体。在质子磁共振谱中该物质表示有E，E，Z，E多烯体系的特征峰。
实施例2制备(全-E)-6-溴-3，7-二甲基-9-(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)-2，4，6，8-壬四烯酸将(2E，4E)和(2Z，4E)-2-溴-3-甲基-5-(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)-2，4-戊二烯酸(75g)的混合物溶解在二甲基甲酰胺(500ml)中，在10℃下，将其缓慢地加入到氢化钠(10.5g，65％在油中)在四氢呋喃(100ml)的悬浮液中，然后搅拌直到全部氢中止放出。然后加入甲基碘(50g)，并将得到的混合物在50-60℃下加热2小时，倒入冰水混合物中，并用己烷萃取。用水洗涤己烷萃取物，干燥(硫酸镁)并浓缩。然后通过HPLC(2.5％乙醚/己烷)分离甲酯的混合物，获得纯的(2E，4E)-2-溴-3-甲基-5-(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)-2，4-戊二烯酸甲酯(20g)和(2E，4E)-2-溴-3-甲基-5-(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)-2，4-戊二烯酸甲酯(37g)。
如实施例1，将(2E，4E)-2-溴-3-甲基-5-(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)-2，4-戊二烯酸酯还原成醇，然后立刻置于二氧化锰中，以获得不稳定的醛(15g)。然后如实施例1，将该物质转化成(全-E)-6-溴-3，7-二甲基-9-(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)-2，4，6，8-壬四烯酸乙酯，接着水解成(全-E)-6-溴-3，7-二甲基-9-(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)-2，4，6，8-壬四烯酸。
实施例3制备(全-E)-6-碘代-3，7-二甲基-9-(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)-2，4，6，8-壬四烯酸用甲基锂在乙醚中的溶液(1.4M，低溴化物)处理0℃下的溴化亚铜二甲硫配合物(10.3g)在四氢呋喃(500ml)中的浆料，再搅拌15分钟，然后冷却至-70℃。向该冷却透明的溶液中加入溶于四氢呋喃(50ml)中的(E)-5-(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)-4-戊烯-2-基酸乙酯(10g)，将混合物搅拌2小时，然后用碘化物在四氢呋喃中的溶液(13g在100ml)中处理0.5小时。在该处理期后，将混合物加热至-60℃并倒入氯化铵水溶液中，使有机物质萃取到己烷中。己烷萃取物用稀的硫代硫酸钠水溶液洗涤，干燥(硫酸钠)，在室温下浓缩，得到不稳定的碘代酯，经HPLC(2.5％乙醚/己烷)提纯，获得纯的(2E，4E)-2-碘代-3-甲基-5-(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)-2，4-戊二烯酸乙酯(5g)。将该酯转化成相应的醛，然后按上述实施例将其与膦酸酯偶合，将得到的视黄酸酯类似物水解，在从己烷/四氢呋喃混合物中结晶后，获得纯的淡黄色固体(全-E)-6-碘代-3，7-二甲基-9-(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)-2，4，6，8-壬四烯酸。
实施例4制备(2E，4E)-3-甲基-5-(2-((E)-2(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)乙烯基)-1-环己烯-1-基)-2，4-戊二烯酸将((2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)甲基)-三苯基鏻氯化物(18g)在四氢呋喃(300ml)中的悬浮液冷至-60℃，滴加正丁基锂(1.4M在己烷中；32ml)处理，然后再搅拌10分钟。向该冷却溶液中加入己溶解在四氢呋喃中的2-溴环己烯-1-羧基醛(8.5g，经HNMR分析75％纯)并在将其再搅拌2小时后，使该混合物加热至室温。然后在反应物中加入己烷，所得到的混合物用水、50％甲醇水溶液洗涤并干燥(硫酸镁)。除去溶剂，得到粗制(E)-1-溴-2-(2-(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)乙烯基)-环己烯(12.5g)，它是用于下一步的异构体的混合物。按实施例1用DMF进行标准金属转变作用和反应，获得粗制醛(4.5g)，将其溶解在四氢呋喃(100ml)中，并与过量的膦酸酯反应，在经HPLC(12.5％乙醚在己烷中)纯化后获得油状(2E，4E)-3-甲基-5-(2-((E)-2，(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)乙烯基)-1-环己烯-1-基-2，4-戊二烯酸甲酯。用氢氧化钾水溶液水解得到晶状(2E，4E)-3-甲基-5-(2-((E)-2(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)乙烯基)-1-环己烯-1-基)-2，4-戊二烯酸(1.6g，得自于己烷-四氢呋喃)。
实施例5制备(2E，4E)-3-甲基-5-(2-((E)-2(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)乙烯基)-1-环戊烯-1-基)-2，4-戊二烯酸如实施例4，将2-溴环戊烯-1-羧基醛转化成(2E，4E)-3-甲基-5-(2-((E)-2(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)乙烯基)-1-环戊烯-1-基)-2，4-戊二烯酸乙酯，用碱水解，获得(2E，4E)-3-甲基-5-(2-((E)-2(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)乙烯基-1-环戊烯-1-基)-2，4-戊二烯酸。
实施例6制备(2E，4E)-3-甲基-5-(2-((E)-2(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)乙烯基)-1-环庚烯-1-基)-2，4-戊二烯酸如实施例4和5，将1-溴环庚烯-2-羧基醛转化成(2E，4E)-3-甲基-5-(2-((E)-2(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)乙烯基)-1-环庚烯-1-基)-2，4-戊二烯酸乙酯，在用碱水解后，获得(2E，4E)-3-甲基-5-(2-((E)-2(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)乙烯基)-1-环庚烯-1-基)-2，4-戊二烯酸。
实施例7制备(2E，4E)-3-甲基-5-(2-((E)-2-(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)乙烯基)-1-环辛烯-1-基)-2，4-戊二烯酸如上述实施例，将1-溴环辛烯-2-羧基醛转化成(2E，4E)-3-甲基-5-(2-((E)-2(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)乙烯基)-1-环辛烯-1-基)-2，4-戊二烯酸乙酯，接着经碱水解而转化成(2E，4E)-3-甲基-5-(2-((E)-2(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)乙烯基)-1-环辛烯-1-基)-2，4-戊二烯酸。
实施例8制备(2E，4E)-3-甲基-5-(2-(2-((E)-2-(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)乙烯基)-2-苯基)-2，4-戊二烯酸如方法4所示，将2-苯并[C]呋喃酮(0.1mol)和三苯膦氢溴化物(0.1mol)在200℃下加热2小时，冷却至室温，用热乙腈消化，获得白色固体的盐17(39g)。将该盐(4.6g)在二甲基亚砜(DMSO；50ml)中的溶液在5℃下用DMSO的钠盐溶液(1M，20ml)处理，然后用醛18(1.5g)处理，获得淡黄色的反应混合物。然后加入水，将所得到的混合物用磷酸水溶液(2M)酸化，并通过乙酸乙酯萃取分离酸19。将粗产物(4.3g)溶解在苯中并置于草酰氯(3ml)和二甲基甲酰胺(3滴)中，然后在室温下保持30分钟。在真空中除去溶剂，接着将粗酰基氯溶解在四氢呋喃(100ml)中，在-20℃下加入硼氢化钠，并加热到室温后获得醇20。经HPLC提纯粗醇，接着从己烷/乙酸乙酯混合物中结晶，获得3-甲基-5-(2-羟甲基苯基)-2，4-戊二烯酸乙酯20，呈无色固体(1.1g)。使醇20(1.1g)于0℃下置于二氧化锰(1.1g)在己烷/二氯甲烷(5∶1；60ml)的浆料中，之后在室温下再搅拌2小时，得到醛21(1.1g)。然后用粗醛21(1.0g)处理由环香叶基鏻溴化物10(1.3g)在四呋喃(20ml)和正丁基锂中于10℃下得到的鏻内鎓盐溶液，并在15-30分钟内加热到室温。用水稀释，并将有机物质萃取到己烷/乙酸乙酯混合物(4∶1)中，获得油状粗制加成物22。使在己烷中的该物质通过硅胶塞，得到油状的酯(0.8g)。在用无机酸(2M，磷酸)酸化后，在回流的乙醇中用氢氧化钾水溶液水解得到酸。从己烷/乙酸乙酯混合物中结晶，获得白色固体的纯(2E，4E)-3-甲基-5-(2-(2-((E)-2-(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)乙烯基-1-苯基)-2，4-戊二烯酸。
实施例9制备(2E，4E)-3-甲基-5-(3-((E)-2-(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)乙烯基)-2-噻吩基)-2，4-戊二烯酸在-70℃下，用正丁基锂(1.6M在己烷中，1.1当量)处理2，3-二溴噻吩(0.1mol)在二乙醚中的溶液(约5％浓度)并搅拌30分钟。然后加入过量的二甲基甲酰胺，使混合物加热到室温，用水骤冷，然后用稀释的磷酸水溶液酸化。用己烷萃取，获得粗醛，然后经HPLC提纯。将该过程得到的全部醛加入到在四氢呋喃中过量的三乙基膦酰基乙酸钠中，使混合物在室温下搅拌1小时，然后用水和乙酸骤冷。接着于-40℃下，向过量的己烷中的氢化二异丁基铝中加入粗酯25，之后将混合物加热至0℃，并用罗谢尔盐(20％，10ml)的水溶液抑制，并将其加热到32℃。然后用己烷萃取，获得醇26，用2-甲氧基丙烯使其转化为乙缩醛27。经HPLC提纯乙缩醛后，将全部产物溶解在已冷至-70℃的四氢呋喃(约5％浓度)中，然后如前所述用正丁基锂处理。在该温度下再搅拌30分钟后，加入过量的二甲基甲酰胺，并使混合物加热至室温，用氯化铵水溶液(20％)抑制，在用己烷分离并用HPLC提纯后获得醛28。然后将该醛置于过量的内鎓盐(1.2M)中，该内鎓盐是在-70℃下由环香叶基鏻溴化物10和正丁基锂在四氢呋喃和己烷中形成的，然后在室温下再搅拌2小时。加入水和磷酸水溶液，在萃取到己烷中后获得醇29。将该物质溶解在二乙醚(最小体积)中，然后于0℃加入到在较多乙醚(300ml)中的二氧化锰(10倍)的浆料中，并加热到室温。在再搅拌1小时后，过滤掉固体，并除去溶剂，在经HPLC提纯后获得醛30。然后将该物质溶解到乙醚中，冷却至-10℃，并置于过量的乙醚中的甲基锂(1.4N)中，接着加热到室温。加入水并浓缩有机相获得粗制醇，如上所述，用二氧化锰氧化该粗制醇，获得酮31。在室温下，将该物质置于在四氢呋喃中的过量三乙基膦酰基乙酸的钠盐中，获得所需的酯32(R为乙基)呈具有主要的所需异构体的新形成的双键(≈4∶1)的异构体的混合物。经HPLC提纯该物质，并从己烷中结晶出主要的异构体，获得纯的(2E，4E)-3-甲基-5-(3-((E)-2-(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)乙烯基)-2-噻吩基)-2，4-戊二烯酸乙酯。按实施例8，在回流的乙醇中用氢氧化钾水溶液水解，并从四氢呋喃/己烷物中结晶后，获得纯(2E，4E)-3-甲基-5-(3-((E)-2-(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)乙烯基)-2-噻吩基)-2，4-戊二烯酸。
实施例10制备(2E，4E)-3-甲基-5-(2-((E)-2-(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)乙烯基)-3-噻吩基)-2，4-戊二烯酸如实施例9，将2，3-二溴噻吩转化成醛24，然后置于由环香叶基鏻溴化物10和正丁基锂制得的内鎓盐中，获得加成物33。按实施例9，用在己烷/四氢呋喃中的正丁基锂处理溴化合物33，接着用过量的二甲基甲酰胺处理，在用磷酸水溶液处理后，获得醛34。之后按实施例1将该物质与膦酸酯5偶合，获得(2E，4E)-3-甲基-5-(2-((E)-2-(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)乙烯基)-3-噻吩基)-2，4-戊二烯酸甲酯35(R＝甲基)，是末端为双键的异构体的混合物。经HPLC提纯，获得(2E，4E)-3-甲基-5-(2-((E)-2-(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)乙烯基)-3-噻吩基)-2，4-戊二烯酸甲酯，如上所述水解后，从四氢呋喃/己烷混合物中结晶得到纯的(2E，4E)-3-甲基-5-(2-((E)-2-(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)乙烯基)-3-噻吩基)-2，4-戊二烯酸。
实施例11制备(2E，4E)-3-甲基-5-(4-((E)-2-(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)乙烯基)-3-噻吩基)-2，4-戊二烯酸按实施例10处理3，4-二溴噻吩，获得(2E，4E)-3-甲基-5-(4-((E)-2-(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)乙烯基)-3-噻吩基-2，4-戊二烯酸。
实施例12制备(全-E)-6-氯-3，7-二甲基-9-(2，6，6-三甲基-环己烯-1-基)-2，4，6，8-壬四烯酸用氢化钠(64％油状悬浮液；0.12M)处理2-氯膦酰基乙酸三乙酯(J.Org.Chem.，515467(1986))(0.12M)在四氢呋喃中的溶液，并在室温下搅拌，获得透明的阴离子溶液。向该混合物中加入β-芷香酮(0.1M)并使反应在45℃下加热过夜。加入水，并使产物萃取到己烷/乙酸乙酯(4∶1)中。除去溶剂，将得到偶合产物，双键异构体的混合物(1∶1)，通过HPLC分离该混合物得到所要的异构体，(2E，4E)-2-氯-3-甲基-5-(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)-2，4-戊二烯酸乙酯。按实施例1，用氢化二异丁基铝氢化物还原该酯，接着如上所述用二氧化锰氧化，获得(2E，4E)-2-氯-3-甲基-5-(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)-2，4-戊二烯醛(2，4-pentadienal)。按实施例1，将该物质与3-甲基-4-二乙基膦酰基巴豆酸甲酯偶合，获得(全-E)-6-氯-3，7-二甲基-9-(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)-2，4，6，8-壬四烯酸甲酯。如上所述，水解酯，从四氢呋喃和己烷的混合物中结晶酸，获得纯的黄色固体的(全-E)-6-氯-3，7-二甲基-9-(2，6，6-三甲基-1-环己烯-基)-2，4，6，8-壬四烯酸。
实施例13制备全-E-3，7-二甲基-9-[(2-甲氧基-4-甲基-6-辛氧基)苯基]-2，4，6，8-壬四烯酸用甲基碘(100ml)和碳酸钾(124.2g)处理2，6-二羟基-4-甲基-苯甲酸在丙酮中的溶液(50.4g，750ml)，并在回流下加热18小时。然后将混合物冷至室温，过滤掉固体。浓缩该溶液，获得粗产物，将该产物溶解在乙酸乙酯中，并用氢氧化钠水溶液(1N；冷的)洗涤。之后在真空中除去溶剂，获得2，6-二甲氧基-4-甲基-苯甲酸甲酯(54g)。将该物质(52.5g)溶解在已冷至-70℃的二氯甲烷(1000ml)中，用三氯化硼在相同溶剂中的溶液(29.3g/100ml；180ml)处理。然后将该混合物加热到室温并再搅拌45分钟，随后倒入冰中。分离有机层，用较多的水洗涤，干燥(硫酸镁)，过滤并浓缩。
残余物采用Water制备500色谱方法(7％乙酸乙酯/己烷洗脱液)经高效制备液相色谱提纯，获得固体的2-羟基-6-甲氧基-4-甲基苯甲酸甲酯(28.3g)，用1-辛基碘(34.2g)处理该物质(35g)在含有碳酸钾(27.1g)的甲乙基酮(700ml)中的溶液，并在回流下加热20小时。冷却该反应混合物，过滤掉固体，浓缩滤液，然后再溶解在己烷和乙酸乙酯的混合物中。用碱水(1N氢氧化钠)，水洗涤该溶液，干燥(硫酸镁)并浓缩至干。如上所述，经HPLC提纯，获得纯2-甲氧基-6-辛氧基-4-甲基-苯甲酸甲酯(51.8g)。
使该物质(51.8g)在甲苯(500ml)中的溶液冷至-60℃并用二异丁基铝氢化物的溶液(25％在己烷；281ml)处理，然后加热至室温。然后用冷的甲醇水溶液(100ml；1∶1)小心地处理该反应混合物，以使温度保持在20℃，接着加入己烷(500ml)和硫酸镁。过滤掉固体，在真空中除去溶剂，获得粗醇。将该物质(47g)溶解在含有三苯基鏻氢溴化物(54.9g)的乙腈(500ml)中，回流加热22小时。真空下除去溶剂，在室温，0.1mm压力下干燥该粗盐(该物质可从四氢呋喃中结晶，获得纯[(2-甲氧基-6-辛氧基-4-甲基)苯基]甲基-三苯基鏻溴化物)。然后按USP 4894480，实施例5中描述的，将该盐转化成全-E-3，7-二甲基-9-[(2-甲氧基-4-甲基-6-辛氧基)苯基]-2，4，6，8-壬四烯酸。
实施例14制备(E)-2-(2-(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)乙烯基)-环庚烯羧甲醛如方法7所示，将环庚酮(152g)转化成酯(Org.Syn.Coll.，5198(1973)；232g)，转化成烯醇磷酸酯37(274g)，随后用二甲基酮酸锂处理，得到2-甲基-环庚-1-烯酸乙酯38(119g)。然后将2-甲基-环庚-1-烯酸乙酯(91g)在四氢呋喃中的溶液加入到二异丙基酰胺锂的溶液(0.53mol)中，之后用环柠檬醛39(76g)中止，在用酸处理后获得内酯40(113g)。使40置于四氢呋喃中的叔丁醇钾中，接着置于过量的甲基碘中，获得甲酯41(111g)。用二异丁基铝氢化物还原上述酯，随后按实施例1用二氧化锰氧化，得到醛12(n＝3)(98g)。
实施例15A制备(2E，4E)-3-甲基-5-(2，6，6-三甲基-环己-1-烯基乙炔基)-环戊-1-烯基]-戊-2，4-二烯酸乙酯将(2E，4E)-5-(2-溴-环戊-1-烯基)-3-甲基-戊-2，4-二烯酸乙酯(1.43g)溶解在5ml苯中。在环境温度下依次加入293mg Pd(Ph3P)4，95mg CuI，147mg(Ph)3P和8ml哌啶。通过滴液漏斗，在1小时内向该混合物中加入已溶解在5ml苯中的2-乙烯基-1，3，3-三甲基-1-环己烯(745g)。4.5小时后，加入另外的乙炔(350mg)，继续搅拌30分钟。然后将该混合物倒入碎冰/HCl中，用EtOEt萃取，用水洗涤两次，在Na2SO4上干燥，并蒸发至干。经中压色谱(SiO2，己烷/AcOEt＝98/2)，获得1.478g黄色油状(2E，4E)-3-甲基-5-(2，6，6-三甲基-环己-1-烯基乙炔基)-环戊-1-烯基]-戊-2，4-二烯酸乙酯。
按下面合成预先必要的(2E，4E)-5-(2-溴-环戊-1-烯基)-3-甲基-戊-2，4-二烯酸乙酯将2.03g NaH(50％在矿物油中)悬浮在120ml的DMF中，于0℃下加入4-(二乙氧基-氧膦基-3-甲基-丁-2-烯酸乙酯(12.9g)。将混合物在0℃下搅拌15分钟，在RT下搅拌30分钟。再冷却到0℃后，按滴加入溶于11ml DMF中的2-溴-环戊-1-烯-碳化甲醛(carbaldehyde)(5.72g)，使之在0℃下反应10分钟，在RT下反应2小时。然后将混合物倒入碎冰中，用EtOEt萃取，用饱和氯化钠溶液洗涤，在Na2SO4上干燥，并蒸发至干。经闪式色谱(flashchromatography)(硅胶，己烷/AcOEt＝97/13)提纯残余物，并从己烷/痕量AcOEt中结晶，最后得到3.408g纯的淡黄色结晶(2E，4E)-5-(2-溴-环戊-1-烯基)-3-甲基-戊-2，4-二烯酸乙酯，mp.85-86℃。
预先必要的2-乙炔基-1，3，3-三甲基-1-环己烯的合成是按标准方法，通过向2，2，6-三甲基环己酮中加入TMS-乙炔的Li衍生物，用Burgess试剂(甲氧基-羰基氨磺酰-三乙基铵氢氧化物，内盐)处理使之脱水，最后用四丁铵氟化物脱甲硅基化。由于其不稳定性，必须立即使用。B.制备(2E，4E)-3-甲基-5-[2-(2，6，6-三甲基-环己-1-烯基乙炔基)-环戊-1-烯基]-戊-2，4-二烯酸。
将(2E，4E)-3-甲基-5-[2-(2，6，6-三甲基-环己-1-烯基乙炔基)-环戊-1-烯基]-戊-2，4-二烯酸乙酯(1.47g)溶解在14ml THF/EtOH＝1/1中。加入3N NaOH水溶液(7.0ml)，使反应瓶保持在暗处。在环境温度下搅拌16小时后，将混合物倒入碎冰/HCl中，用EtOEt萃取两次，用水洗涤，在Na2SO4上干燥，并蒸发至干。从EtOEt/戊烷中结晶，获得1.31g黄色晶体(2E，4E)-3-甲基-5-[2-(2，6，6-三甲基-环己-1-烯基乙烯基)-环戊-1-烯基]-戊-2，4-二烯酸，mp.173-174℃。
实施例16类似于实施例15制备。(2E，4E)-3-甲基-5-[2-(2，6，6-三甲基-环己-1-烯基乙炔基)-环庚-1-烯基]-戊-2，4-二烯酸，呈黄色晶体，mp.166-167℃。
实施例17制备(2E，4E)-3-甲基-5-[2-(2，6，6-三甲基-环己-1-烯基乙炔基)-苯基]-戊-2，4-二烯酸将229mg(2E，4E)-3-甲基-5-[2-2，6，6-三甲基-环己-1-烯基乙炔基)-苯基]-戊-2，4-二烯酸乙酯溶解在8ml乙醇中。在加入411mg氢氧化钾在2.5ml水中的溶液后，使反应混合物在50℃下搅拌2小时。然后将混合物倒入冰/水中，用2N盐酸酸化，并用乙酸乙酯萃取。用水洗涤有机相，在硫酸钠上干燥并蒸发得到淡黄色晶体，从乙酸乙酯/己烷中再结晶该晶体，得到93mg(2E，4E)-3-甲基-5-[2-(2，6，6-三甲基-环己-1-烯基乙炔基)-苯基]-戊-2，4-二烯酸，m.p.194-196℃。
下面制备在该实施例中使用的起始原料将970mg 2-乙炔基-苄醇溶解在50ml二乙醚中。加入1.9ml三乙胺，接着滴加0.9ml三甲基硅烷氯。将反应混合物在室温下搅拌4小时，倒入冰/5％碳酸氢钠水溶液中并用醚萃取。蒸馏经干燥蒸发掉溶剂后的油状残余物，获得1.3g无色油状的2-乙炔基苄基三甲基硅烷基醚，b.P.85-89℃/0.8mm。
将无色油溶解在5ml四氢呋喃中。在-78℃下滴加3.9ml丁基锂(1.6mol在己烷中)后，使该反应混合物在该温度下搅拌30分钟。滴加0.59g 2，2，6-三甲基环己酮在4ml四氢呋喃中的溶液，并使该反应混合物在室温下搅拌5小时，得到黄色溶液。将该黄色溶液倒入冰水/10％氯化铵水溶液中，用己烷萃取，在硫酸钠上干燥并蒸发。黄色油状残余物经闪式色谱(SiO2，己烷/5％乙酸乙酯)提纯，获得1.7g黄色油。
将黄色油溶解在90ml四氢呋喃中，在室温下与28.8ml 0.5的氢氧化钾标准水溶液一起搅拌6小时。将反应混合物倒入冰/水中，用乙醚萃取，用水洗涤，干燥并蒸发。经闪式色谱(SiO2，己烷/乙酸乙酯＝7.3)提纯该残余物，从乙酸乙酯/己烷中结晶，获得1.1g白色晶体，m.p.120-121℃。
将白色晶体溶解在10ml四氢呋喃中，随后用679mg三乙胺和400mg乙酰氯处理。在室温下搅拌4小时后，将反应混合物倒入冰/1N盐酸中，用乙醚萃取，在硫酸钠上干燥并蒸发。经闪式色谱(SiO2，己烷/乙酸乙酯-4∶1)，获得0.8g无色油。
将该无色油溶解在13ml苯中，并加到1.3g Burgess试剂(甲氧基羰基氨磺酰-三乙铵氢氧化物，内盐)在40ml苯中的溶液中。使反应混合物在3小时内加热至60℃。蒸馏掉大部分溶剂后，将残余物溶解在冰水中并用乙醚萃取。经干燥和蒸发掉溶剂后获得的残余物经闪式色谱(SiO2，己烷/乙酸乙酯＝9∶1)提纯，获得0.7g淡黄色油。
将该黄色油溶解在18ml乙醇中，在45℃下，用0.78g氢氧化钾在4ml水中的溶液处理2.5小时。将反应混合物倒入冰/饱和的氯化铵溶液中，用乙醚萃取，干燥并蒸发。用中压液相色谱(SiO2，己烷/乙酸乙酯＝9∶1)提纯该残余物，获得0.46g淡黄色油。将该油溶解在20ml二氯甲烷中，在室温剧烈搅拌下，用1.6g二氧化锰处理15小时。过滤掉二氧化锰，蒸发滤液，用中压色谱(SiO2，己烷/2％乙酸乙酯)提纯该残余物，获得黄色油状22.5mg 2-(2，6，6-三甲基-环己-1-烯基乙炔基)-苯甲醛，在冷却下该黄色油固化。
用戊烷洗涤85mg氢化钠(50％在矿物油中)并悬浮在4ml四氢呋喃中。在0℃下滴加470mg溶于4ml四氢呋喃中的4-(二乙氧基膦酰基)-3-甲基-丁-2-烯酸乙酯，使反应混合物在室温下搅拌1小时。再冷却至0℃后，滴加入225mg由前一步骤中所得的黄色醛在3ml四氢呋喃中的溶液。使反应混合物在室温下搅拌3小时，倒入冰/饱和的氯化铵溶液中，用乙醚萃取，用水洗涤，干燥并蒸发。首先用闪式色谱(SiO2，己烷/5％乙酸乙酯)提纯残余物，然后用中压液相色谱(SiO2，己烷/2％乙酸乙酯)提纯，获得229mg无色油状(2E，4E)-3-甲基-5-[2-(2，6，6-三甲基-环己-1-烯基乙炔基)苯基]-戊-2，4-二烯酸乙酯。
实施例18在类视黄酸的作用下，将HL-60细胞(人体骨髓白血病细胞系)分化为粒细胞。HL-60细胞分化为粒细胞是通过RARα作为媒介的，这样提出了使用类视黄酸治疗白血病的基础，该实验结果表明本发明RXR选择性化合物在它们本身失活的剂量下，能增效全反式视黄酸和具有下式的其它RARα选择性类视黄酸的原分化效果高达数量级大小 (化合物A)测试化合物转移活化类视黄酸受体的能力如下
表1活性(ED50，nM)RARα RXRα全-反式视黄酸 6.741化合物A 3＞10000例4的化合物 ＞1000 1.7HL-60分化类视黄酸诱导分化HL-60细胞是通过还原NBT(氮蓝四唑)(Nit-roblueterstazolium)而测量它们的氧化的突发电位(burstpotent-ial)而测定的[pick等人，J.Reticuloendothelial Soc.，30581-593(1981)]。
将HL-60细胞保持在加有10％FCS，2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、1％非主要的氨基酸，50U/ml青霉素和50μg/ml链霉素(＝RPMI/FCS)的RPMI 1640介质中。发现该细胞没有支原体。
将30000细胞/100μl的RPMI/FCS移植入平底微滴井中。同时加入稀释在完全培养基中的10μl类视黄酸，以获得最终浓度为10-11-10-6M(将10-2M在乙醇中的储液保持在-20℃下并避光放置)。3天后，用多道吸移管取出培养基，用100μl NBT溶液(1mg/ml在具有200nM佛波醇肉豆蔻酸盐乙酸酯(PMA)的PBS中)代替。在37℃下，再培养1小时后，除去NBT溶液，加入100μl的在0.01N HCl中的10％SDS。采用自动化平板读数计在540nm处光度法定量测定诱导的NBT的量。计算3个井的平均值。S.E.M为5-10％。结果RXR选择性类视黄酸对HL-60分化的影响作为RARα活化剂与其弱效能相符，实施例4 RXR选择性类视黄酸作为HL-60分化诱导剂的活性明显地低于全-反式视黄酸(图1)。实际上，实施例4在与其转移活化特性一致中，甚至在1×10-6M下实际上是失活的。HL-60细胞对类视黄酸呈现的敏感性比反式活化系统高出10倍(比较表1，RARα和图1)。
但是，正如从图2和3中看到的，实施例4 RXR选择性类视黄酸在其本身不具活性的浓度下，能增效全-反式视黄酸和化合物A的作用。增效的范围为3X-10X，即比需要获得可比较量的HL-60分化的单独全-反式视黄酸或化合物A的浓度高出3-10倍。
从获得的结果可看出，RXR选择性配位体对HL-60分化的影响比其它的高，因此，无须通过残余的RAR活化影响来解释。所观察到的效果多少也更明确优先使用RARα配位体(化合物A)而不用较低选择性的全-反式RA(RAR与RXR比较)。增效结果也与体外试验数据一致，该数据表明，RXR与RAR形成杂二聚物，它导致增强在RAR特效促进顺序上的转录活性。不清楚的是，为什么为观察到任何效果需要相当高的RXR选择性类视黄酸的浓度(10-7M)。该浓度在RXR转录活化测定中要比EC50高出两个数量级，但还不知道RXR的类视黄酸结合的亲和力的改变是否取决于杂二聚物的形成。因此，表中所示的ED50值不能完全代表通过包含RXR的杂二聚物传递的效果。
实施例19测试实施例4的化合物在与全-反式RA相组合时抑制小鼠B细胞增殖的能力。本发明的RXR选择性配合物增效了全-反式RA对小鼠B细胞增殖的抑制活性。原料和方法类视黄酸在该研究中所使用的类视黄酸的结合和转移活化特性示于下列表中表2RARα结合 RARα活化 RXRα结合RXRα活化类视黄酸 IC50(nM) ED50(nM) IC50(nM)ED50(nM)全-反式RA 14 6.7＞10000 41例4的化合物 ＞10000＞10000921.7细胞测定将小鼠脾的单个细胞的悬浮液安置在平底96孔微滴盘中，每孔0.2ml在加有10％胎牛血清，HEPES，抗菌素和50μM 2-巯基乙醇的IMDM中的2×105/ml细胞悬浮液。加入50μg/ml的特异B细胞的促细胞分裂剂E.coli脂多糖(DIFCO)(LPS)。将培养基于37℃下，在增湿的气氛下和5％CO2中保温。
首先将待测试的类视黄酸以10nM-10μM一式三份滴定，并在整个培养周期中保存。接着进一步滴定，以达到IC50值。将圆孢A(Cyclosporin A)(Sandoz AG)用作参考化合物(从1nM-1μM)。
培养2、3和4天后，将细胞用[3H]胸苷加以脉冲，4小时1μCi/孔。然后将培养基收集在玻璃纤维过滤器中，并将结合到DNA的放射性在β-液体闪烁计数器(Betaplate，Wallac Oy，Turku，Fin-land)中测量。
将结果以未处理的培养基的应答％来表示。在培养24、48和72小时后，按结合的3H胸苷测定促细胞分裂剂诱导的增殖。在培养期开始时，向培养基中加入类视黄酸。结果1、RXR选择性配位体对小鼠B细胞增殖的影响首先测试实施例4的RXR选择性配位体的直接干扰用LPS诱导的小鼠B细胞的增殖。结果示于图4中，表明实施例4类视黄酸具有抑制性，其IC50为100nM。全-反式RA(IC50＝1nM)的能力为1/100。在第4天时，低剂量(≈IC50，在3天时)的实施例4类视黄酸稍微增强了应答，这与该体系中全部类视黄酸活性的结果一致。2、RXR选择性配位体对小鼠B细胞增殖的增效全-反式视黄酸的抑制效果全-反式RA抑制LPS诱导的小鼠B细胞增殖的IC50为1nM。10-30nM时获得最大抑制，并且从不超出75-80％。将本发明的实施例4 RXR选择性配位体配入到LPS刺激的置于1nM全-反式RA的培养基中，置于10nM全-反式RA中的培养基是平行的。在各种情况下，本身几乎没有抑制性的本发明实施例4 RXR配位体的浓度诱导增效了1nM RA到10nM RA的观察到的水平。在培养的第2和3天获得了类似的结果。第3天的数据示于图5中。
由于实施例4化合物的活性，可以加和或增强效果。但是，在培养基中后一点所获得的结果表明效果不是简单的加和，而是增强。
在第4天时，1nM RA的抑制没有任何增加，实际上，引起了应答的稍微增强，而10nM RA的抑制仅为约30％。该现象的原因尚不清楚，但化合物的半衰期可能在其中起了作用。RXR选择性配位体也具有类似的影响(参见图4的曲线)。但是，1nM RA和本发明实施例4 RXR配位体的结合仍然产物抑制，它相当于由10nM RA引起的量级。结果示于图6。
结果表明在其中类视黄酸的作用是通过RARα传递的作用体系中，RXR选择性类视黄酸(实施例4)增效了全-反式RA的作用。获得的增效超过RXR配位体在全-反式RA中的10-30倍。增效量大约为10倍用1nM RA与本发明RXR配位体组合时可获得通常由10nMRA诱导的抑制量。
实施例20下面采用常规抗痤疮活性测试法的测定表明本发明化合物的抗痤疮活性。(1)对人皮脂的抗增生活性方法通过酶和机械方法的结合，从成年人皮脂腺中分离出皮脂细胞(Doran等人，1991)。将细胞培养在生长停止的3T3小鼠成纤维细胞层上的含10％胎牛血清和4μg/ml地塞米松的Iscove的培养基中。将细胞涂覆在没有测试化合物的培养基中。然后在涂覆开始后24-48小时给以新鲜培养基中的测试化合物。将含有测试化合物的新鲜培养基每48小时提供给培养基。在收集的时间里，用PBS中的0.03％EDTA冲洗培养基，仅除去3T3成纤维细胞，接着在0.05％胰蛋白酶/0.03％EDTA中培养。将细胞悬浮并剧烈混合，以制备单一细胞悬浮体并用血球计计数。
将化合物的储液制成在100％DMSO中的10-2M溶液并贮存在-20℃下暗处。使溶液中的化合物升至室温，经稀释直接用于完全培养基中以达到合适的浓度。
以10-6和10-7M的化合物体外测试皮脂细胞生长增殖的抑制。
对实施例12、实施例2和实施例4的化合物测试接触药10天后体外第一通道人体皮脂细胞的增殖的抑制的影响。结果以抑制50％(IC50)生长所必需的浓度(nM)表示。
表3体外人体皮脂细胞增殖的抑制化合物 IC50(nM)实施例4＞1000(测试两次)实施例2 100和10000(测试两次)实施例12 100(测试两次)13-顺式-视黄酸 1009-顺式-视黄酸100实施例4化合物表示差的剂量应答，其生长抑制达30-40％。尽管这比13-顺式视黄酸弱得多但仍显示体外的生物活性。实施例2化合物尽管在该试验中1000nM剂量时的生长抑制仅为70％，但是对于第一次试验来说，IC50为100nM。(2)Rhino小鼠小囊降低活性在本实验中检测化合物降低预先存在的小囊，角质化的毛囊皮脂腺结构，类似于人体粉刺(Mezich等人，1985)大小的能力。方法使用6组从Jackson实验室获得的6-8周龄期的雌性Rhino小鼠(hrrhhrrh)。将化合物溶解在100％丙酮中，于4℃、氮气下贮存用于持久的实验。每天将测试化合物提供给小鼠的背部5天，持续3周。在最后给剂量的那一天，通过CO2吸入杀死小鼠。从背部切下皮片，并将其在2M溴化钠中于室温下培养2-3小时。然后从真皮上分离出表皮。
表皮通过70％、80％、95％、100％乙醇和二甲苯脱水。将样品保持在上述溶液的每一份中2小时。从二甲苯中取出皮肤样品，并置于玻璃显微镜载片上。采用Ultimage像分析软件进行像分析，用以确定小囊的平均直径和面积。每个试样约检测5个区域，每个待测小鼠平均150个小囊。结果在rhino小鼠中测试本发明的几个化合物(实施例12、实施例2和实施例4)。
向小鼠局部给药剂量为100μl的在丙酮中的13-顺式视黄酸，9-顺式视黄酸，和实施例12、实施例2和实施例4的化合物。结果示于如下表4中
表4
ns＝由对照物没有统计意义，所有其它p值＜0.05。注释在该实验期间，没有观察到一些副作用。给药100μg 13-顺式视黄酸的动物在第5天显示出表皮脱落和红斑。给药9-顺式-视黄酸的动物在相同的剂量下，在较早的时间里显示出这些效果。
在第7天给药时，对于100μg的实施例12观察到红斑。在相同的天数里，在给药100μg的实施例2的动物上观察到一些红斑。但是，该红斑没有实施例2强。在这同一时点，可比较剂量的实施例4没有显示出可以看到的红斑。
在第14天给药时，在所有给药100μg的实施例12的动物上观察到表皮脱落，这在该日之前未观察到。如果将这些化合物在100μg浓度下对表皮脱落/红斑从最严重到最不严重排序的话，则顺序为9-顺式-RA，13-顺式-RA，实施例12，实施例2和实施例4。
因此，本发明的化合物与9-顺式-RA、13-顺式-RA比较，产生降低的刺激作用。(3)在体内化合物对金色叙利亚大田鼠(Golden Syrian Hemster)皮脂腺大小的影响方法向Charles River金色叙利亚雄性大田鼠给药在丙酮中的所需剂量。将化合物在避光的4℃下贮存，每周制备新溶液。
每天向大田鼠给药达5天，休息2天，再给药5天直到达20次剂量。溶液的体积为50ml/耳。
大田鼠通过CO2吸入杀死，切去耳朵用于组织测量。切去一个耳朵并从余下的一个耳朵上分离出前侧表面。从耳端的5mm处移出2mm的穿孔物并在溶于100％丙二醇中的0.1％苏丹黑B(Sudan Bla-ck B)中染色过夜。脱色后，用Donsanto像分析系统定量皮脂腺的大小。
数据以每剂80-120皮脂腺的平均面积，对照(溶剂处理的)切片的百分率表示。
表54周局部剂量的实施例4化合物和13-顺式-视黄酸对大田鼠耳皮脂腺大小的影响
ns＝从对照物中没有统计意义。所有其它有意义的值是从赋形剂对照物中得出的。参考文献Doran等人，“Characterization of hrman sebeceous cellin vitro.，J.Invest.Dermatol.，96341-348(1991)。
Mezick等人，“Topical and systemic effects of retinoi-ds on horn-filled utriculus size in the rhino mouse.A mod-el to quantify‘antikeratinizing’effects of retinoids.”，J.Invest.Dermatol，83110-113(1985)。
实施例21对实施例6的化合物测试其与具有RARα活性的类视黄酸，下面所示的全E-3，7-二甲基-9-[(2-甲氧基-4-甲基-6-辛氧基)苯基]-2，4，6，8-壬四烯酸(化合物B)，组合时抑制人体胸癌细胞系的能力 化合物B结果表明本发明的RXR选择性配位体增效了化合物B的硬性肿瘤抑制活性。1、合成化合物B按下列步骤制备化合物B 化合物B用甲基碘(100ml)和碳酸钾(124.2g)处理2，6-二羟基-4-甲基-苯甲酸1在丙酮中的溶液(50.4g，750ml)，回流加热18小时。然后将混合物冷至室温，过滤掉固体。浓缩溶液，获得粗产物，将粗产物溶解在乙酸乙酯中，用氢氧化钠水溶液(1N，冷的)洗涤。在真空中除去溶剂，获得2，6-二甲氧基-4-甲基-苯甲酸甲酯2(54g)。将该物质(52.5g)溶解在已冷至-70℃的二氯甲烷(1000ml)中，并用三氯化硼在相同溶剂中的溶液(29.3g/100ml；180ml)处理。然后将该混合物加热至室温并再搅拌45分钟，然后倒入冰中。分离出有机层，用较多的水洗涤，干燥(硫酸镁)，过滤并浓缩。然后将残余物采用Waters制备500色谱法(7％乙酸乙酯/己烷洗脱液)通过高性能制备液体色谱(HPLC)提纯，获得纯的固体2-羟基-6-甲氧基-4-甲基苯甲酸甲酯3(28.3g)。用1-辛基碘(34.2g)处理该物质(35g)在含有碳酸钾(27.1g)的甲乙基酮(700ml)中的溶液，并在回流下加热20小时。冷却反应混合物，过滤掉固体并浓缩滤液，然后再溶解在己烷和乙酸乙酯的混合物中。随后用碱水溶液(1N，氢氧化钠)。水洗涤该溶液，干燥(硫酸镁)并浓缩至干。如上所述，经HPLC提纯，获得纯的2-甲氧基-6-辛氧基-4-甲基-苯甲酸甲酯4(51.8g)。将该物质(51.8g)在甲苯(500ml)中的溶液冷却至-60℃，用二异丁基铝氢化物的溶液(25％在己烷中；281ml)处理，并加热到室温。然后用冷却的甲醇水溶液(100ml；1∶1)小心地处理该反应混合物，以使温度保持在20℃，接着加入己烷(500ml)和硫酸镁。之后，过滤掉固体，在真空中除去溶剂，得到粗醇5。将该物质(47g)溶解在含有三苯基 氢溴化物(54.9g)的乙腈(500ml)中，并回流加热22小时。然后，在真空下除去溶剂，在室温，0.1mmHg压力下干燥粗盐6(该物质可从四氢呋喃中结晶，获得纯的[(2-甲氧基-6-辛氧基-4-甲基)苯基]甲基三苯基溴化物)。之后，按USP 4894480(实施例5)中描述的将该盐6转化成化合物B，全-E-3，7-二甲基-9-[(2-甲氧基-4-甲基-6-辛氧基)苯基]-2，4，6，8-壬四烯酸。2、试验如上所述，对化合物B和实施例6进行类视黄酸受体结合和转移活性的测试。结果如下表6
由ATCC[Accession No.HTB 133]获得的胸癌细胞系，T47-D，在加有10 FBS，10μg/ml胰岛素和13ng/ml庆大霉素的RPMI 1640介质中生长，并在37℃，4.5％CO2和95.5％湿化空气下培养。在达到70-80％融合时收集细胞并沉淀。将该细胞再悬浮在培养基中，并在七天测定期间允许线性生长的密度下移植(150μ/l孔)到96-孔板(Coring)中(即，移入的T47-D为4×103细胞/l孔)。将板放置在37℃的保温箱中过夜。
在移植后18-24小时，加入药物(在100％DMSO中的1mM储备液)。在96-孔微滴板中制备药物组合物，并手工加入到测定板中。在加入药物后3-7天内进行MTT测定。MTT测定是基于四唑鎓的测量该方法测量培养基中的细胞生活力。向测定板(500μl/孔)中加入MTT(3-[4，5-二甲基噻唑-2-基-2，5-二苯基四唑鎓溴化物)储液(5mg/ml在1×PBS中)，并在37℃下培养2.5小时。
通过抽吸除去液体，加入50μl 95％的乙醇，摇动(Mini-Orb-ital Shaker，Bellco)板15分钟，以溶解甲产物。采用自动板读数计(Microplate EL 320 Reader，Bio-Tek Instruments)测定每孔中的任选密度，测试的波长为570nm，参考波长为660nm。按下列方程确定由各种浓度的化合物B与恒定浓度的实施例6的化合物组合而引起的细胞量生长的抑制。 结果图解地于图7中。结果表明本发明的RXR选择性化合物在抑制硬性肿瘤细胞系生长中增效具有RARα活性的类视黄酸的活性。
实施例A含20mg活性物质的硬明胶胶囊组合物每明胶包含式I 20mgRARα类视黄酸20mg明胶霜(Gelafine Bloom)30 70.0mg麦芽糊精MD 05108.0mgdl-α-生育酚 2.0mg抗坏血酸钠 10.0mg微晶纤维素 48.0mg硬脂酸镁 2.0mg(胶囊内含物重) 280.0mg步骤
在明胶，麦芽糊粗，dl-α-生育酚和抗坏血酸钠的溶液中湿磨活性物质。
喷雾干燥湿磨的悬浮液。
将喷雾干燥的粉末与微结晶纤维素和硬脂酸镁混合。
将每280mg的该混合物装入合适大小和颜色的硬明胶胶囊中。
图1用全-反式视黄酸(RA)，另一种RARα选择性类视黄酸(化合物A，本文)，和RXR选择性类视黄酸(实施例4，本文)诱导HL-60细胞分化。OD540与分化折HL-60细胞数成正比。图2用全-反式视黄酸(RA)和实施例4的组合物诱导HL-60细胞的分化。图3用化合物A和实施例4的组合物诱导HL-60细胞的分化。图4胸苷通过置于全-反式RA或实施例4中的B细胞培养基而掺入，该值与未处理的培养基有关。图5在培养3天后，通过全-反式RA和实施例4的RXR选择性类视黄酸，单独或组合以抑制LPS诱导的B细胞增殖。图6在培养4天后，通过全-反式RA和实施例4的RXR选择性类视黄酸，单独或组合以抑制LPS诱导的B细胞增殖。图7在胸癌细胞系中，具有RARα活性的化合物(化合物B)和RXR选择性化合物(实施例6)的增强抗增殖活性。
权利要求
1.式I的化合物和可药用盐、酯和酰胺， 式中C7-C8键为双键或叁键；当C7-C8键为双键时，R1和R2独立地为卤互或低级烷基，或当C7-C8键为叁键时，R1和R2独立地为低级烷基，或R1和R2一起为C3-13亚烷基，其中一个碳原子可被选自硫、氧和氮的杂原子取代；或R1和R2与和它们相接的碳原子一起是具有5-6个碳原子的芳环或具有5-6个原子的杂芳环，其中R1或R2的一个原子为选自氧、氮和硫的杂原子，且R1和R2和剩余原子都是碳。
2.权利要求1的化合物，其中C7-C8键是双键。
3.权利要求2的化合物，其中R1和R2一起为C3-6亚烷基，其中一个碳原子可被选自硫、氧和氮的杂原子取代。
4.权利要求3的化合物，其中R1和R2一起是C3-6亚烷基。
5.权利要求4的化合物，(2E，4E)-3-甲基-5-(2-((E)-2-(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)乙烯基)-1-环戊烯-1-基)-2，4-戊二烯酸，(2E，4E)-3-甲基-5-(2-(2-((E)-2-(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)乙烯基)-1-环己烯)-1-基)-2，4-戊二烯酸，(2E，4E)-3-甲基-5-(2-((E)-2-(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)乙烯基)-1-环庚烯-1-基)-2，4-戊二烯酸，(2E，4E)-3-甲基-5-(2-((E)-2-(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)乙烯基)-1-环辛烯-1-基)-2，4-戊二烯酸。
6.如权利要求2的化合物，其中R1和R2与和它们相接的碳原子一起是具有5-6个碳原子的芳环或具有5-6个原子的杂芳环，其中R1或R2的一个原子是选自氧、氮和硫的杂原子，并且R1和R2的剩余原子都是碳。
7.权利要求6的化合物，(2E，4E)-3-甲基-5-(2-(2-((E)-2-(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)乙烯基)-1-苯基)-2，4-戊二烯酸，(2E，4E)-3-甲基-5-(2-((E)-2-(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)乙烯基)-3-噻吩基)-2，4-戊二烯酸，(2E，4E)-3-甲基-5-(3-((E)-2-(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)乙烯基)-2-噻吩基)-2，4-戊二烯酸和(2E，4E)-3-甲基-5-(4-((E)-2-(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)乙烯基)-3-噻吩基)-2，4-戊二烯酸。
8.权利要求2的化合物，其中R1和R2为低级烷基，它们可相同或不同。
9.权利要求8的化合物，(2E，4E，6Z，8E)-3，6，7-三甲基-9-(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)-2，4，6，8-壬四烯酸。
10.权利要求2的化合物，其中R1和R2中的一个是低级烷基，而另一个是卤素。
11.权利要求10的化合物，(全-E)-6-溴-3，7-二甲基-9-(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)-2，4，6，8-壬四烯酸，(全-E)-6-氯-3，7-二甲基-9-(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)-2，4，6，8-壬四烯酸，(全-E)-6-碘-3，7-二甲基-9-(2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基)-2，4，6，8-壬四烯酸。
12.权利要求1的化合物，其中C7-C8键为叁键。
13.权利要求12的化合物，其中R1和R2一起为C3-13亚烷基，其中的一个碳原子可被选自硫、氧和氮的杂原子取代，或R1和R2与和它们相接的碳原子一起是具有5-6个碳原子的芳杂或具有5-6个原子的杂芳环，其中R1或R2的一个原子为选自氧、氮和硫的杂原子并且R1和R2的剩余原子都是碳。
14.权利要求13的化合物，其中R1和R2一起为C3-6亚烷基。
15.权利要求14的化合物，(2E，4E)-3-甲基-5-[2-(2，6，6-三甲基-环己-1-烯基乙炔基)-环戊-1-烯基]-戊-2，4-二烯酸和(2E，4E)-3-甲基-5-[2-(2，6，6-三甲基-环己-1-烯基乙炔基)-环庚-1-烯基]-戊-2，4-二烯酸。
16.权利要求12的化合物，其中R1和R2与和它们相接的碳原子一起是具有5-6个碳原子的芳环或具有5-6个原子的杂芳环，其中R1或R2的一个原子为选自氧、氮和硫的杂原子并且R1和R2的剩余原子为碳。
17.权利要求16的化合物，其中所述的环选自噻吩、苯和吡啶。
18.权利要求17的化合物，(2E，4E)-3-甲基-5-[2-(2，6，6-三甲基-环己-1-烯基乙炔基)-苯基]-戊-2，4-二烯酸。
19.下式的一种化合物
20.药物组合物，它包含权利要求1的式I化合物或其可药用盐，酯或酰胺，和可药用惰性载体。
21.权利要求21的组合物，它用于局部给药，其中在所述组合物中的所述化合物的含量为组合物总重量的约0.05-约3％。
22.以单位剂量形式用于口服给药的组合物，它包含具有RARα活性的类视黄酸的第一化合物；权利要求1中的式I的第二化合物或其可药用盐、酯或酰胺，其中在所述单位剂形中的第一化合物的含量为10-50mg，在所述单位剂形中的所述第二化合物的含量为所述第一化合物量的1-10倍。
23.如权利要求1中要求的化合物可用于药剂，尤其用于治疗硬性肿瘤，白血病或痤疮。
24.按权利要求1中要求的化合物的用途，它用于制造用于治疗硬性肿瘤，白血病或痤疮的药物组合物。
25.如本文描述的本发明，尤其涉及实施例。
全文摘要
式I的新型壬四烯酸衍生物，其中虚线键是任选的，R
文档编号C07C63/00GK1136557SQ9610202
公开日1996年11月27日 申请日期1996年2月15日 优先权日1995年2月24日
发明者迈克尔·克劳斯, 艾伦·J·洛维, 彼得·莫尔, 迈克尔·罗森伯格 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司