用以改善新生内膜增生的类视黄醇的受控和局部释放的制作方法

专利名称：用以改善新生内膜增生的类视黄醇的受控和局部释放的制作方法
技术领域：
本公开涉及包含全反式视黄酸或其衍生物的血管植入物减少手术植入后血栓和/ 或新生内膜增生。
背景技术：
动脉粥样硬化在所有发达国家都是流行病并且是美国死亡和残疾的主要成因。动 脉粥样硬化的令人衰弱和伤残的后遗症是外周动脉疾病(PAD)。不管症状如何，患有PAD的 人常常具有受损的功能和生活质量。对于患有严重PAD的那些人，往往下肢旁路移植是仅 有的救治四肢的选择。用于腹股沟下旁路移植的黄金标准导管是自体静脉。虽然下腹股沟静脉移植物的 通畅性在5年时维持在约70%，但约三分之一的患者中的静脉由于本身的静脉疾病或此前 的静脉采集而无法利用。在这些情况下，膨化聚四氟乙烯(ePTFE)移植物是最常用的替代 性旁路导管。然而，膝弯下ePTFE旁路移植物的原发性通畅率很不理想。动脉粥样硬化性 疾病的进展、血栓或新生内膜增生的发展会使假体旁路移植物故障继发性发生。与使用假体移植物相关的问题非常严重，以致心脏外科医生不会将其用于冠状动 脉旁路移植术(CABG)。需要CABG的患者会显著受益于现成假体移植物，因为很多时候他们 没有健康的静脉或动脉以进行手术。虽然ePTFE移植物是假体腹股沟下旁路移植术的当前 标准，但它们可能形成血栓，尤其是在用在小直径的膝下血运重建术中时。因新生内膜增生 引起的狭窄仍然是对其长期效力的挑战。已将几类表面修饰策略用于改变血液与假体移植物之间的相互作用的性质。这 些策略大多数集中于永久性固定抗血栓形成化合物或创建蛋白抗性表面，并具有不同的结 果。例如，肝素已被广泛用作抗血栓和抗增殖剂以修饰血管移植物的表面，从而减少血栓形 成和新生内膜增生。在动物模型中，经肝素修饰的ePTFE移植物显著减少了急性血栓和吻 合口新生内膜增生。然而，可能的抗血小板抗体形成和相关的肝素诱导的血小板减少可能 导致致命的后果。因此，存在着对使得能够进行对新生内膜增生的治疗或抑制同时避免系统性或毒 性副作用的改进的移植物修饰技术的需要。

发明内容
包含生物相容性聚合物和全反式视黄酸(ATRA)或其衍生物的受控释放血管植入 物(如血管移植物、支架、凝胶和包裹物)可以用于治疗、预防或抑制可能会由假体植入诱 导的血栓和新生内膜增生。特别地，本文所述的植入物可以抑制平滑肌细胞增殖、新生内膜增生和上调血管中的抗血栓基因和一氧化氮生成。此外，植入物能够输送受控的和可预测 的局部浓度的ATRA。在一方面，本公开提供了用于减少或预防血管植入物的植入后的新生内膜增生和 /或血栓的出现的方法，所述方法包括使血管植入物与全反式视黄酸(ATRA)接触；和将所 述血管植入物植入需要其的患者中，其中所述血管植入物包含生物相容性聚合物基质；且 所述血管植入物释放足以在植入患者时抑制或避免新生内膜增生的治疗有效量的ATRA。在第二方面，本公开提供了制备修饰的血管植入物的方法，所述方法包括提供血 管植入物；和使所述血管植入物与全反式视黄酸(ATRA)接触以产生修饰的血管植入物，其 中所述修饰的血管植入物包含生物相容性聚合物基质；且所述修饰的血管植入物释放足以 在植入患者时抑制或避免新生内膜增生和/或血栓的治疗有效量的ATRA。
具体实施例方式在第一方面，本公开提供了用于减少和避免血管植入物植入后新生内膜增生的出 现的方法，所述方法包括使血管植入物与全反式视黄酸(ATRA)接触；和将所述血管植入物 植入需要其的患者。如本文所用，短语“治疗有效量”是指引起由研究人员、兽医、医生或其它临床医务 人员在组织、系统、动物、个体或人中所寻求的生物或医学响应的活性化合物或药剂的量， 所述生物或医学响应包括以下的一个或多个(1)预防所述疾病；例如，预防个体中的疾病、病况或病症，所述个体可能易患所 述疾病、病况或病症但尚未经历或展现出所述疾病的病理学或症状学；(2)抑制所述疾病；例如，抑制个体中的疾病、病况或病症，所述个体可能正在经 历或展现出所述疾病、病况或病症的病理学或症状学；和(3)减轻所述疾病；例如，减轻个体中的疾病、病况或病症，所述个体可能正在经 历或展现出所述疾病、病况或病症的病理学或症状学(即，逆转所述病理学和/或症状学)， 例如，降低所述疾病的严重性。本文所用的术语“生物相容性”旨在描述不会引发体内显著的有害响应的材料。如本文所用，“生物可降解”聚合物是在生理学或内体条件下完全降解的聚合物。 在优选实施方式中，所述聚合物和聚合物生物降解副产物是生物相容性的。生物可降解聚 合物并非必须为可水解性降解，且可以需要酶促作用以完全降解。如本文所用，短语“内体条件”涉及在内体囊泡内可能遭遇的化学(例如，pH、离子 强度)和生化(例如，酶浓度)条件。对于大多数内体囊泡，内体PH范围为约5.0 6. 5。本文所用短语“生理学条件”涉及在组织的细胞内液和细胞外液中可能遭遇的化 学(例如，PH、离子强度)和生化(例如，酶浓度)条件。对于大多数组织，生理学pH范围 为约7. 0 7. 4。 如本文所用，术语“患者”是指包括哺乳动物的动物，优选人类。
在某些实施方式中，如上所述的血管植入物是血管移植物、血管支架、包裹物或凝 胶。在一个具体实施方式
中，所述血管植入物是血管移植物。在另一个具体实施方式
中，所 述血管植入物是血管支架。在另一个具体实施方式
中，所述血管植入物是包裹物，例如，吻 合口包裹物。在另一个具体实施方式
中，所述血管植入物是凝胶。此类包裹物和凝胶可以被置于植入用血管移植物或支架的至少一部分的周围。由此，血管植入物可以包含如下的 包裹物或凝胶所述包裹物或凝胶包含生物相容性聚合物基质和ATRA以及血管支架或移 植物，其中，所述包裹物或凝胶被置于所述血管支架或移植物的至少一部分的周围。在另一个实施方式中，可以根据本领域技术人员已知的方法将血管移植物植入需 要其的患者中，然后将包含生物相容性聚合物基质和ATRA的包裹物或凝胶置于所植入的 血管移植物的至少一部分和其中已植入有所述移植物的血管的至少一部分的周围。如此， ATRA能够扩散透过血管移植物和其中已植入所述移植物的血管，以便预防和/或抑制新生 内膜增生。在另一个实施方式中，可以根据本领域技术人员已知的方法将在其外表面的至少 一部分上已涂布有包含生物相容性聚合物基质和ATRA的包裹物或凝胶的血管移植物植入 需要其的患者中。在另一个实施方式中，可以根据本领域技术人员已知的方法将血管支架植入需要 其的患者中，然后将包含生物相容性聚合物基质和ATRA的包裹物或凝胶置于所植入的支 架的内表面的至少一部分上。在另一个实施方式中，可以根据本领域技术人员已知的方法将在其外表面的至少 一部分上已涂布有包含生物相容性聚合物基质和ATRA的包裹物或凝胶的血管支架植入需 要其的患者中。如此，可以将所述包裹物或凝胶留存在所述血管支架的外表面与其中植入 有所述支架的血管的内表面之间。血管植入物通常包含生物相容性聚合物基质。例如，所述生物相容性聚合物基质 可以包含聚酯、聚氨酯、聚碳酸酯、聚酸酐、聚磷酸酯或其混合物。所述生物相容性聚合物基 质可以是弹性体性的；或所述生物相容性聚合物基质可以为凝胶。如本文所用，弹性体是能快速回复到其受到弱应力而被显著变形所脱离的大致形 状的大分子材料。例如，橡胶是常见弹性体。本文所用术语“凝胶”针对将液体整合至网状物的间隙的连续三维交联聚合网状 物。所述交联聚合网状物提供凝胶结构。根据其结构的程度，凝胶可以具有广谱性质，从比 水稍更粘稠的流动性凝胶到非常刚性的非流动性凝胶。本文所用术语“流动性凝胶”是指 在环境大气条件下不受限制时在重力驱使下流动的凝胶。“非流动性凝胶”在这些条件下不 流动。在某些实施方式中，生物相容性聚合物基质是聚酯，例如，聚(柠檬酸-二醇)或 聚(甘油-二酸)。本文所用聚(柠檬酸-二醇)是根据本领域技术人员所熟悉的方法从柠檬酸(三 元羧酸单体)和包含两个醇官能团的第二单体(“二醇”)制备的聚酯。例如，合适的聚 (柠檬酸二醇)可以如美国专利申请公开第2005/0063939号和第2007/0208420号所述来 制备，本文通过援引并入其全部内容。二醇的实例包括但不限于芳香性二醇(例如，对苯 二酚、邻苯二酚、间苯二酚)、C2 C2tl烷基二醇、C2 C2tl烯基二醇(例如，十四-2，12-二 烯-1，14-二醇)及其混合物。所述二醇还可包含取代基。如氨基和羧基等反应性基团会 增加可用于交联的位点数。氨基酸和其它生物分子会修饰聚合物的生物性质。芳基、脂族 基和氯原子会修饰聚合物内的链间相互作用。二醇还包括大分子二醇，如聚氧乙烯和N-甲 基二乙醇胺(MDEA)。
在某些实施方式中，二醇包括C2 C2tl烷基二醇、C2 C2tl烯基二醇中的一种或多 种或其混合物。在某些其它实施方式中，二醇包括一种或多种C2 C2tl烷基二醇，例如，C6 C20烷基二醇、C6 C14烷基二醇或C6 C12烷基二醇。例如，二醇可以包括α，ω -C2 C2tl 烷基二醇，例如，1，12-十二醇、1，10-癸二醇、1，8-辛二醇或其混合物。在另一个实例中， 二醇可以包括1，10_癸二醇、1，8_辛二醇或其混合物。在另一个实例中，二醇可以包括1， 8-辛二醇(例如，所述聚酯为聚(1，8_辛二醇-柠檬酸酯))。为了控制其降解，例如可以通过可选地包含一种或多种高支化单体(例如，包含 三个醇官能团的单体(“三醇”))使聚(柠檬酸-二醇)交联。例如，除柠檬酸和二醇单体 外可以添加甘油(0 3mol%，条件是这三种单体的羧基和羟基的摩尔比保持在1/1)。甘 油是亲水性组分，且其添加可促进水透入网状物膜，这导致更快的降解速率。甘油量的增加 能增加所得聚酯的断裂强度和杨氏模量。例如，杨氏模量可以为IMI^a 16MPa，而断裂时 的强度和应变分别为至多IOMI^a和500%。根据合成条件，总降解时间可能为数月至数年。 优选在6 12个月内降解。本文所用的聚(甘油-二酸)是根据本领域技术人员所熟悉的方法从三醇单体甘 油和包含两个羧酸官能团的第二单体(“二酸”)制备的聚酯。例如，合适的聚(甘油-二 酸)可以如美国专利申请公开第2003/0118692号所述来制备，本文通过援引并入其全部内 容。二酸的实例包括但不限于芳香二酸(例如，对苯二甲酸和羧基苯氧基丙烷)、c2 c2(l 烷基二酸、C2 C2tl烯基二酸及其混合物。二酸也可以包含取代基。如氨基和羧基等反应 性基团会增加可用于交联的位点数。氨基酸和其它生物分子会修饰聚合物的生物性质。芳 基、脂族基和氯原子会修饰聚合物内的链间相互作用。在某些实施方式中，二酸包括C2 C2tl烷基二酸、C2 C2tl烯基二酸中的一种或多 种或其混合物。在某些其它实施方式中，二酸包括一种或多种C2 C2tl烷基二酸。例如，二 酸可以包含α，ω-C2 C2tl烷基二酸，例如，癸二酸、丙二酸、丁二酸、戊二酸、己二酸、庚二 酸、辛二酸、壬二酸或其混合物。在另一个实例中，二酸可以包含癸二酸(例如，所述聚酯为 聚(甘油-癸二酸酯))。为了控制其降解，例如可以通过可选地包含一种或多种高支化单体(例如，包含 三个羧基官能团的单体(“三酸”))使聚(甘油-二酸)交联。例如，除甘油和二酸单体外 可以添加柠檬酸(0 3mol%，条件是这三种单体的羧基和羟基的摩尔比保持在1/1)。通过交联密度可以容易地调节所述聚合物的弹性模量和降解速率。在某些实施 方式中，根据本发明所产生的弹性体聚合物的交联密度可以为40%以下、小于30%、小于 20 %、小于10 %或小于5 %。所述聚合物的交联密度可以为40 %以下、小于30 %、小于20 %、 小于20%、小于5%、小于1%、小于0. 5%或小于0. 05%。在一个实施方式中，本发明的甘油-二酸共聚物的拉伸弹性模量为5MPa以下。本 领域技术人员可以认识到，可以根据应用来调节所述聚合物的模量。例如，所述聚合物的模 量可以为小于3MPa、小于IMPa、小于0. 5MPa、小于0. 3MPa或小于0. IMPa0所述聚合的最大 延伸率可以大于250%。为制备上述聚合物，可以使用催化剂来降低反应温度、缩短反应时间和增加个体 链长。然而，催化剂应为生物相容性的且易于除去。示例性的FDA认可催化剂是辛酸亚锡 (二 O-乙基己酸)锡(II))。
可以将ATRA例如作为可以嵌入生物相容性聚合物基质内的包含ATRA的微粒或纳 米颗粒并入所述生物相容性聚合物基质内。在另一个实施方式中，可以将ATRA作为ATRA 微粒和/或纳米颗粒并入生物相容性聚合物基质中。替代性地，可以通过封装在胶束或脂质体中来将ATRA并入生物相容性聚合物基 质，其中所述胶束或脂质体嵌入所述生物相容性聚合物基质内。在另一个替代方式中，可以 将ATRA吸附、悬浮或溶解于生物相容性聚合物基质内。在某些实施方式中，将ATRA悬浮或 溶解于生物相容性聚合物基质内。在某些其它实施方式中，将ATRA吸附于生物相容性聚合 物基质内。如前述实施方式中的任一个所述的血管植入物可以释放足以在植入患者时抑制 或预防新生内膜增生和/或血栓的治疗有效量的ATRA。在一个实施方式中，ATRA能以约0. OOlmg/克聚合物/日 5mg/克聚合物/日(根 据高效液相色谱测定(体外))的速率从血管植入物释放。在某些实施方式中，ATRA以约 0. OOlmg/克聚合物/日 1. 2mg/克聚合物/日、约0. OOlmg/克聚合物/日 1. 2mg/克聚 合物/日或约0. OOlmg/克聚合物/日 0. 58mg/克聚合物/日的速率从血管植入物释放。 在一个具体实施方式
中，ATRA以约0. OOlmg/克聚合物/日 0. 39mg/克聚合物/日的速 率从血管植入物释放。在另一个实施方式中，如前述实施方式的任一个所限定的血管植入物可以包含相 对于生物相容性聚合物基质约0. 001重量％ 15重量％的ATRA。在某些实施方式中，血管 植入物包含相对于生物相容性聚合物基质约0. 001重量％ 10重量％、约0. 001重量％ 7. 5重量％或约0. 001重量％ 5重量％的ATRA。在一个具体实施方式
中，血管植入物包 含相对于生物相容性聚合物基质约0. 001重量％ 3重量％的ATRA。在再一个实施方式中，可以由前述实施方式的任一个所限定的血管植入物在约1 天 约12周的时期中释放治疗有效量的ATRA。特别地，可以由前述实施方式的任一个所 限定的血管植入物在约1天 10周、约1天 8周或约1天 6周的时期中释放治疗有效 量的ATRA。在某些实施方式中，可以由前述实施方式的任一个所限定的血管植入物在约1 天 4周的时期中释放治疗有效量的ATRA。此外，包含任何前述实施方式的ATRA的生物相容性聚合物基质涂层的厚度可以 为约0. Olmm 3mm或约0. Imm 3mm。在某些实施方式中，包含任何前述实施方式的ATRA 的生物相容性聚合物基质涂层的厚度可以为约1 μ m 10 μ m或约2 μ m 5 μ m。在第一方面的一个实施方式中，本公开提供了用于减少或避免在植入前述实施方 式的任一个所述的血管植入物后的新生内膜增生的方法。ATRA全反式视黄酸(ATRA)是疏水性、脂溶性和醇溶性混合物，其在体外已展示出多 种血管保护性质，包括对血管平滑肌细胞(VSMC)迁移、VSMC增殖和细胞外基质生成的抑 制(参见例如，Miano 等，Circulationl996 年 5 月 15 日；93 (10) 1886-1895 ；和 Johst U 等，J CardiovascPharmacol 2003 年 4 月；41 (4) :526-535)。ATRA 刺激 VSMC 凋亡(参见 例如，Orlandi，A.等，Arterioscler Thromb Vasc Biol 2005 年 5 月；25(2) :348-353 ；和 0rlandi,A.等，Arterioscler Thromb Vasc Biol 2001 年 7 月；21 (7) :1118-1123)。对于 内皮细胞而言，已据显示ATRA可调节内皮细胞生长和表型(参见例如，Braunhut，S. J.等，Microvasc Res 1991年 1 月；41 (1) :47-62 ；和 Gaetano，C.等，Circ Res 2001 年 3 月 2 日； 88(4) :E38-E47)。此外，已据显示ATRA可增加一氧化氮合成和血栓调节蛋白从内皮细胞的 释放(参见例如，Achan，V 等，Circ Res 2002 年4 月 19 日；90(7) 764-9 ； and Horie,S.等， Biochem J 1992年1月1日；281(Ptl) 149- )。ATRA的其它血管保护效应包括对内皮素1 的抑制、对纤溶酶原激活物合成的刺激和增加的β 1整合素表达(参见例如，Yokota，J.等， Atherosclerosis 2001 $ 12 月；159(2) 491-6 ；Kooistra,Τ. φ,ThrombHaemost 1991 ^Ξ 5 月 6 日；65 (5) :565-72 ；和 Medhora，Μ. Μ.，Am J PhysiolHeart Circ Physiol 2000 年 7月；279(1) :H382-H387)。当在体内对球囊损伤的啮齿类动物和兔系统性或局部提供时， ATRA已据显示可影响血管结构，包括抑制新生内膜增生、抑制血管重建、加速再内皮化和避 免动脉粥样硬化的兔中的再狭窄(参见例如，Miano, J. M.等，Circulationl998年9月22 日；98 (12) :1219-27 ；DeRose, Jr.，J. J.等，Cardiovasc Surgl999 年 10 月；7 (6) :633-9 ； Lee, C. W.等，J Korean Med Sci 2000 年 2 月；15(1) 31-6 ；ffiegman, PJ.等，Arterioscler Thromb Vasc Biol 2000 年 1 月；20(1) :89-95 ；Herdeg, C.等，Cardiovasc Res 2003 年 2 月；57 (2) :544-53 ；Leville, C. D.等，J Surg Res 2000 年 5 月 15 日；90 (2) :183-90 ；和 Leville, C. D.等，Surgery 2000年8月；128 (2) :178-84)。虽然令人鼓舞，但是在这些研 究中的ATRA体内输送未得到局部化或持续。更重要的是，没有进行任何在抑制假体移植物 中的新生内膜增生的背景下的对ATRA的研究。植入物制备前述血管植入物可以根据如下方法制备，所述方法包括提供血管植入物；将所 述血管植入物与全反式视黄酸(ATRA)接触以产生修饰的血管植入物。通常，修饰的血管植 入物包含如上所述的生物相容性聚合物基质并且释放足以在被植入患者时抑制新生内膜 增生的治疗有效量的ATRA。在某些实施方式中，血管植入物是血管移植物、血管支架、包裹物或凝胶。在一个具体实施方式
中，血管植入物是血管移植物。在另一个具体实施方式
中，血管植入物是血管 支架。在另一个具体实施方式
中，血管植入物是包裹物。在另一个具体实施方式
中，血管植 入物是凝胶。血管植入物自身可以由本领域技术人员已知的生物相容性材料形成。例如，血管 移植物可以由聚(对苯二甲酸乙二酯)(PETE，DaCr0nTM)或聚(四氟乙烯)(如膨体聚(四 氟乙烯)(ePTFE))形成。血管支架可以由不锈钢或钴-铬合金合金或镍钛合金(nitinol) 形成。在一个实施方式中，血管植入物与全反式视黄酸(ATRA)的接触可以包括使血管 植入物与包含生物相容性聚合物预聚物和包含ATRA的纳米颗粒、微粒、胶束或脂质体的混 合物接触。使用本领域技术人员已知的标准技术可以容易地将ATRA加入微粒和纳米颗粒、 胶束和/或脂质体中。然后可以如上所述将所述纳米颗粒、微粒、胶束和/或脂质体嵌入经 涂布的血管植入物的生物相容性基质内。在某些实施方式中，例如通过在真空下加热以在 包含生物相容性聚合物和包含ATRA的纳米颗粒、微粒、胶束或脂质体的植入物的表面上形 成连贯膜来使植入物固化。在加热植入物时，温度应维持在不会导致嵌入其中的ATRA降解 的合适温度。例如，可以在40°C 60°C的温度将植入物加热约4天。本文所用的术语“预聚物”是指可以经处理而形成通常具有比该预聚物更高的分子量或更高交联密度的连贯聚合物膜或基质的材料。例如可以将预聚物作为液体、油、糖浆 或从溶液涂布至物体上，并进而例如通过加热或将涂布的物体与聚合催化剂接触而经处理 以形成连贯的聚合物膜或基质。例如，可以将聚酯预聚物涂布于物体上兵通过加热固化以 形成具有比该预聚物更高的分子量或更高交联密度的连贯聚合物膜或基质。在另一个实施方式中，血管植入物与全反式视黄酸(ATRA)的接触可以包括将血 管植入物浸入包含ATRA的溶液中。虽然ATRA不易溶于水，但其部分溶于乙醇(3mg/ml)，并 且溶于二甲亚砜(DMSO)。它也溶于氯仿和二氯甲烷，这些溶剂常用于处理用于生物医学应 用的生物可降解聚酯热塑体。在另一个实施方式中，血管植入物与全反式视黄酸(ATRA)的接触可以包括用生 物相容性聚合物预聚物涂布血管植入物；使经涂布的血管植入物固化；和将经涂布的血管 植入物侵入包含ATRA的溶液中。使经涂布的血管植入物固化可以包括可选地在静态或动 态真空下加热血管植入物，以促使膜交联或转化为基本涂布血管植入物的所需部分的连贯 膜。在某些实施方式中，当将经涂布的血管植入物侵入包含ATRA的溶液中时，溶液使得生 物相容性聚合物基质溶胀。在另一个实施方式中，血管植入物与全反式视黄酸(ATRA)的接触可以包括用包 含ATRA和生物相容性聚合物基质的混合物涂布血管植入物，其中所述生物相容性聚合物 基质是生物相容性热塑性聚合物。在另一个实施方式中，可以将包含ATRA和生物相容性聚合物的包裹物或凝胶如 上所述置于用于植入需要其的患者的标准血管移植物或支架的至少一部分的附近。例如， 可以使上述预聚物聚合以提供包含包裹物或凝胶的ATRA。替代性地，可以将包含ATRA的预 聚物聚合以提供包含包裹物或凝胶的ATRA。可以在将所述包裹物或凝胶置于血管移植物或 支架的至少一部分的附近之前将该包裹物或凝胶与包含ATRA的溶液接触；替代性地，可以 将所述包裹物或凝胶置于血管移植物或支架的至少一部分的附近，然后可以使经涂布的移 植物或支架与包含ATRA的溶液接触。实施例实施例1.聚(1，8_辛二醇共柠檬酸酯)(POC)预聚物的合成将等摩尔量的柠檬酸和1，8_辛二醇在160°C共同熔融，同时搅拌15分钟。随后可 将温度降至140°C并将混合物搅拌1小时。然后，可以通过溶解于乙醇并随即在水中沉淀并 冻干来将所述预聚物纯化。未进行ePTFE移植物的表面修饰，将POC预聚物溶解于乙醇或 1，3_ 二氧戊环至浓度为10% (重量/体积)。参见例如，Yang Jjebb AR,Pickerill SJ, Hageman G,Ameer GA. Synthesis and evaluation of poly(diol citrate)biodegradable elastomers. Biomaterials, 2006 ^3^ ；27 (9) :1889-1898 ；and Yang J, Webb AR, Ameer GA. Novel citric acid-based biodegradableelastomers for tissue engineering. Adv Mater 2004 ； 16 (6) :511_516，本文通过参考并入其全部内容。前述弹性体的机械性质可以通过控制诸如交联温度和时间、真空、二醇的选择和 初始单体摩尔比等合成条件来调节。杨氏模量可以为IMI^a 16MPa，而断裂时强度和应力 分别为至多IOMPa和500%。根据合成条件，总降解时间可以为数月至数年。增加柠檬酸的摩尔比会增加共聚物的降解速率而不会损失其初始拉伸强度。同样 地，可以通过包含甘油O. 5摩尔％ )来调节降解。该含甘油弹性体在37°C的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的降解在温育4个月后提高了几乎2倍。实施例2. POC的凝血和炎性性质的体外评估进行复钙凝血测试以评估POC相对于组织培养物聚苯乙烯和PLGA的凝血动力学。 简言之，将96孔板中的测试和对照聚合物样品在酸性柠檬酸盐右旋糖(ACD)抗凝结人或猪 贫血小板血浆(PPP)中温育。在进行吸光度测试前，将CaCl2(0.025M)立即添加至各孔以 启动凝血。与其它材料相比，对于暴露于POC的血浆，血块形成速率一致性地更低(对于 TCP、PLGA 禾口 P0C，线性区的斜率分别为 0. 088士0. 027A. U. / 分钟、0. 089士0. 013A. U. / 分钟 和0. 025士0. 019A. U. /分钟)。这一发现可以由POC内羟基、羧基和潜在的螯合性柠檬酸官 能团的存在来解释。为评估炎性可能性，将人单核细胞THP-I细胞悬浮液暴露于POC、TCP、PLGA和 ePTFE膜。其后，通过ELISA测定组织因子、IL_6*TNF_a的表达。将脂多糖(LPQ添加 至细胞用作阳性对照。结果如表1所示。
表1TCPePTFEPLGAPOCLPS组织因子208 + 2696±27114±129±2 *幻6±81TNF-a12±221±315±517±5874±531IL-61. 4±0. 0532±58±42. 8±2 * 相对于其它材料，POC并未引起这些标记物的显著上调。事实上，就组织因子和 IL-6表达而言，POC比ePTFE的反应性更低。实施例3.具有POC的ePTFE移植物的修饰在修饰前，通过将标准壁非拉伸ePTFE移植物首先在超声下浸入纯乙醇、丙酮并 真空干燥来将其清洁。通过用旋转剪切法机械涂布POC层可以对ePTFE移植物的腔体进行 修饰。简言之，将5mm直径玻璃棒浸于10% POC预聚物(pre-POC，实施例1)的1，4_ 二氧 六环溶液内并水平插入机械搅拌器的转子内。将经pre-POC涂布的玻璃棒以300rpm顺时 针旋转2分钟并将6cm长的ePTFE移植物件同心地置于旋转棒之上。通过手动将移植物逆 时针旋转来使移植物的腔体与旋转棒剪切2分钟。上述步骤视为一次涂布。为改变沉积于 移植物上的POC量(并因此改变涂布厚度)，将上述步骤重复3 6次(定义为3 6次涂 布)，以评估随聚合物含量增加的POC覆盖率和对移植物顺应性的影响。空气干燥后，将经 pre-POC涂布的ePTFE移植物置于80°C的烘箱中2天以获得P0C_ePTFE移植物。为进行表征，将样品切割为Icm2件。通过SEM、气水接触角测定、傅里叶转换红外 (FTIR)分析和X射线光电子谱(XPQ分析来评估POC修饰的ePTFE样品的表面性质的变 化。同时也测定了修饰的移植物的顺应性。从移植物的数个部分的采样证实PTFE纤维和 节点的涂布均勻。POC涂层的厚度约为2 5微米。POC-ePTFE相对未经修饰的ePTFE的 平衡气水接触角分别为36°和120°。FIlR和XPS证实移植物腔体内羧基和羟基的存在。 采用POC的三次涂布或处理未对原位移植物的顺应性产生影响。采用6次涂布的顺应性的 较小降低可以由对移植物的纤维-节点微结构的严重破坏来解释。
实施例4.具有POC的ePTFE移植物的表面修饰和药物加载在修饰前，通过将标准壁非拉伸ePTFE移植物首先在超声下浸入纯乙醇并真空干 燥来将其清洁。使用POC灌注法以便确保可将大量POC用于药物加载。通过将移植物的一 端夹住并将POC预聚物溶液(实施例1)泵入该移植物并经过管壁来经由管壁灌注P0C。在 经移植物壁灌注聚合物并干燥后，通过用旋转剪切法机械涂布POC层对ePTFE移植物的腔 体进行修饰。将5mm直径玻璃棒浸于10% POC预聚物的1，3_ 二氧戊环溶液内并水平插入机械 搅拌器的转子内。将经pre-POC涂布的玻璃棒以300rpm顺时针旋转2分钟并将8cm长的 ePTFE移植物件同心地置于旋转棒之上。通过手动将移植物逆时针旋转来使移植物的腔体 与旋转棒剪切2分钟。上述步骤视为一次涂布。可以对移植物进行总共3次涂布，因为据 显示可以施加至多3次涂布而不会显著影响顺应性。涂层均勻且能在体内植入1个月后保 持无损。空气干燥后，将经pre-POC涂布的ePTFE移植物置于烘箱中进行后聚合。通过药物释放速率来控制视黄酸(ATRA)的给药，而药物释放速率通过改变POC 聚合条件以改变水性介质中的溶胀度来控制。对于较快的释放速率，将经涂布的移植物在 80°C聚合2天。释放更慢的移植物在80°C额外聚合2天。替代性地，可以添加1，12-十二碳 二醇以为涂层赋予疏水性。通过将经涂布的移植物在室温黑暗中在视黄酸乙醇溶液CBmg/ ml)中浸渍M小时来加载ATRA并同时消毒。除去ATRA溶液后，将移植物在无菌容器中冻 干，以使聚合物坍塌和捕获ATRA。通过测定浸渍后乙醇溶液中残余的ATRA的浓度可以间接 确定加载于聚合物膜中的ATRA的量。溶液中的ATRA浓度可以在350nm经分光光谱确定并 与标准曲线进行比较。实施例5. ATRA释放动力学和POC稳定性为测定从POC的视黄酸的释放、异构化和降解，可以将圆盘(IOmm直径，Imm厚)和 加载有ATRA的POC-ePTFE移植物(1cm长，6mm直径)的小片段置于培养基中并在6个月 的时期内监测药物释放和POC降解。POC降解可以通过质量损失和SEM来评估。可将上清 液从所述圆盘或移植物片段除去并代以新鲜培养基。简言之，可在不同时间点从培养基取 走350 μ L并可以添加50 μ L的IM乙酸钠和600 μ L乙腈。涡旋离心后，将720 μ L上清液 与240 μ L水置于2mL玻璃自动采样器管中。翻转混合后，可以将所述管置于4°C的自动进 样器中并使用带紫外可见检测器的反相HPLC在340nm处确定药物含量。可以使用4-氧代反式视黄酸、4-氧代顺式视黄酸、1，3_顺式视黄酸和ATRA的外 标来鉴定类视黄醇。也可以评估上清液的ATRA活性。未加载药物的POC-ePTFE移植物和 未经涂布的ePTFE移植物可以用作对照。此外，可将加载有ATRA的POC-ePTFE移植物(9cm 长，6mm直径)置于脉动流电流(IHz)中以模拟见于体内的动态条件。可以将细胞培养基 以200mL/分钟和300mL/分钟(颈动脉和中等尺寸动脉的典型流速)单程灌注，并可从移 植物的下游收集样品。可以评估样品的ATRA浓度和活性(以及POC断裂)。这些实验可以 提供对远端吻合术的主体流中的ATRA浓度和其对内皮及平滑肌细胞的影响的了解。实施例6.释放的ATRA的细胞响应可以如前所述使用猪和人主动脉平滑肌和内皮细胞来评估释放的ATRA的活 性。人主动脉平滑肌(HASMC)和内皮细胞(HAEC)可以购自Lonza(Lonza，Allendale, NJ)。猪主动脉平滑肌(PASMC)和内皮细胞(PAEC)可购自Cell Applications Inc. (Cell
12Applications, Inc.，San Diego, CA)。可以将收集自静态和流动药物释放研究的样品直接 添加至板孔，以评估释放的ATRA对细胞的影响(即ATRA活性)。阳性对照可以经添加溶于 DMSO或乙醇的ATRA至细胞而构成。这些实验也可采用直接置于板孔中的加载有ATRA的 POC-ePTFE片段(1cm长，6mm直径)进行。细胞增殖可将HASMC、PASMC、HAEC和PAEC以5000细胞/cm2的密度接种至6 孔板上。次日，可以在将细胞经胰蛋白酶水解并沉淀后使用Picogreen DNA测试试剂盒 (Invitrogen, Carlsbad, CA)确定无损细胞的基线数目。然后，可将移植物片段置于穿孔 (transwell)插入物的细胞之上，并可在不同时间点使用Picogreen DNA测试确定细胞数。细胞迁移平滑肌细胞的建议可以单独进行检测或在存在内皮细胞时进行检测。 为测试没有内皮细胞时的迁移，可将平滑肌细胞以5000细胞/cm2的密度接种至6孔板中。 在细胞达到汇流后，可以用硅涂布棒将培养物刮起以获得0. 8mm宽的体外创面并用配备有 光度仪 CoolSNAP HQ (SiIver Spring, MD)的 Nikon 显微镜(Nikon Eclipse, TE2000-U)照 相。M小时后，可移除移植物并用碘化丙啶对细胞染色以便对侵入空白空间的迁移细胞进 行计数。可使用至少6次来自空白空间的成像，且结果计为迁移细胞总数/场。为检验存在 内皮细胞时的平滑肌细胞迁移，可以如前所述准备转移过滤器(transfilter)体系。简言 之，可将Nucleopore聚碳酸酯过滤器(5 μ m孔径)插入内层和外层聚碳酸酯框架之间。如 此，创建了两个分离的腔室，其中可接种内皮细胞核平滑肌细胞。孔径使得平滑肌细胞能够 从上室迁移至下室，如前所示。内皮细胞可以以5000细胞/cm2的密度接种至下过滤器侧。 M小时后，可将平滑肌细胞接种至上过滤器侧并将移植物片段添加至下室。培养14天后， 可在用胰蛋白酶/EDTA解聚后使用Picogreen DNA测试来确定过滤器两侧的细胞总数。可 在所有实验组之间比较细胞增殖和迁移。如前述实验所示，内皮细胞应在一旦达到汇流时 即停止增殖，因此细胞数的任何增加都应归因于平滑肌细胞增殖和迁移。一氧化氮释放可以检验内皮细胞响应于ATRA的一氧化氮释放。可使用一氧 化氮合成酶检测试剂盒根据制造商手册(Cell Technologylnc, Mountain View, CA)来 检测细胞内的一氧化氮。可通过测定在495nm激发和在510nm发射的荧光强度来确定 一氧化氮的产生。细胞外一氧化氮的产生可使用一氧化氮分析仪(Apollo 4000，World PrecisionInstruments, Sarasota, FL)来评估。蛋白表达和合成蛋白表达和合成可以与细胞增殖同时测定。可通过免疫组织化 学和蛋白印迹来检测平滑肌细胞的平滑肌α-肌动蛋白和重链肌凝蛋白来评估分化。细 胞重建细胞外基质的能力可通过对基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9进行染色来评 估。然后，可以使用辣根过氧化物酶联二抗和化学发光检测通过UVP生化凝胶记录系统 (UVP, Inc, Upland, CA)来进行检测。胶原蛋白和弹性蛋白的合成可使用Sircol胶原蛋白 和 Fastin 弹性蛋白测试试剂盒(Accurate Chemical Co. , ffestbury, NY)来确定。实施例7.外科手术植入和体内移植物评估移植物可通过浸入视黄酸乙醇溶液并置于无菌容器中冷冻干燥来在加载步骤期 间消毒。在手术日前可使常规猪禁食过夜，并允许其随意饮水。所述动物接受丁丙诺啡 (0. 01mg/kg IM)的术前镇痛，并用乙酰丙嗪(0. 15mg/kg IM)和克他命(20mg/kg IM)镇静。 插管后，可以用以100%氧气输送的异氟醚(0.5% 2%)来维持麻醉。1号手术(颈动脉旁路移植)雄性猪(30kg 35kg)可进行颈动脉中血管移植物CN 102143768 A
说明书
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植入。可通过中线颈切口将两侧颈总动脉(CCA)暴露。CCA闭合前5分钟，可以静脉内施用 肝素(150U/kg)。可使用6-0聚丙烯缝合线将6cm长的移植物片段(6mm薄壁非拉伸性非环 状ePTFE，经POC涂布且加载有药物或未经处理)以标准端-侧(end-to-side)配置吻合 至近端和远端CCA。可将颈动脉联接以模拟动脉闭合。在吻合术完成之前，可将血管背刺 放血(back-bled)并以肝素化盐水冲洗。吻合术完成后，恢复血流并手动触诊确认。可用 吸收性缝合线闭合颈部切口。术后不能施用肝素。可在48小时中每12小时给予丁丙诺啡 (0. 005mg/kgIM 0. 01mg/kg IM)来提供术后镇痛。该手术可在左CCA和右CCA上进行，因 为可对每只动物植入两段移植物。可在术前和术后给予阿司匹林(325mg/日)作为抗血小 板治疗。2号手术(二维对比血管造影术)可通过在荧光显微镜制导下经皮插入右股主动 脉并进入近端CCA的6F鞘进行血管造影。可使用IOcc非碘化造影剂(威视派克或欧乃派 克)获得两个颈动脉旁路移植物的选择性血管造影。血管造影完成后，将导丝和导管移除。3号手术(MRA)代替对照血管造影术的是，可使用磁共振成像分析(MRA)评估移 植物的通畅性和流动性。动物可如前所述接受普通麻醉，并在静脉内接受钆基造影剂以便 获得MRA图像。4号手术(超声显像)也可在收集前通过双功能超声显像来评估移植物以评估通 畅性，并获得整个移植物的速度测定[收缩期峰值流速(PSV)和舒张末期流速(EDV)]以评 估狭窄面积。显著狭窄可以定义为PSV大于正常流入动脉速度的两倍。收集移植物后，可 通过戊巴比妥过量给药和双侧胸廓切开术对动物施安乐死。实施例8.移植物处理和分析可将每个吻合的移植物和相邻的3cm原生血管片段收集并从中部切为两部分(远 端和近端样本)。在选定的动物中，可将一个移植物片段纵向打开、照相并评估无血栓表面 积百分比。可将0. 5cm长的来自远端和近端样本的移植物片段固定于2. 5%戊二醛溶液中 用于通过SEM的形态学评估。可将剩余样本固定于10%中性缓冲福尔马林中、嵌入石蜡并 切为5微米切片。可对所有移植物进行如下评估a)新生内膜增生(H&E)，b)细胞增殖(H&E染色， 抗Ki67)和分化(α肌动蛋白和重链肌球蛋白)；b)胶原蛋白和弹性蛋白(分别为Masson 三色染色和修饰的弹性蛋白vanGieson染色)；c)内皮细胞的存在(von Willebrand和 VE-钙粘蛋白)；和d)炎症(巨噬细胞用MAC387抗体，白细胞用抗CD45抗体)。也可对所 有移植物的片段进行SEM以便对任何血小板或白细胞附着/激活和内皮细胞及POC的存在 /缺失进行形态学评估。组织形态测定分析为对新生内膜增生进行定量，可将每个吻合术产物整体切片 并可对整个吻合术产物的5个等距切片进行评估以定量新生内膜增生。可对每个切片进行 成像，并使用ImageJ软件(NIH)测定新生内膜面积、中层面积、腔面积和周长。为定量细胞 增生、炎症和内皮化，可以在每个切片的4个不同高能场中对正染色细胞的核进行计数。由 于巨噬细胞大多数出现在腔/移植物界面处，该界面可以被当作参照点。界面外加深入腔 250 μ m和深入移植物壁250 μ m可限定所关注区域。所有评估可以以盲化方式进行以维持 对结果的客观解读。可以将从置于每只猪中的POC基移植物和对照ePTFE移植物获得的数 据进行相互对比。可使用学生T测试进行统计对比。
通畅性可在施安乐死和移植物收集前通过MRA或对比血管造影术和双功能超声 显像来非侵入性评估移植物的通畅性和狭窄程度。
权利要求
1.一种用于减少或预防血管植入物的植入后的新生内膜增生和/或血栓的出现的方 法，所述方法包括，使血管植入物与全反式视黄酸(ATRA)接触；和将所述血管植入物植入需要其的患者中，其中所述血管植入物包含生物相容性聚合物基质；且所述血管植入物释放足以在植入患者时抑制或避免新生内膜增生的治疗有效量的 ATRA。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述血管植入物是血管移植物、血管支架、或包裹物 或凝胶。
3.如权利要求1所述的方法，所述血管植入物包含血管支架或移植物和包裹物或凝 胶，其中所述包裹物或凝胶包含生物相容性聚合物基质和ATRA，且其中所述包裹物或凝胶 被置于所述血管支架或移植物的至少一部分的附近。
4.如权利要求1 3中任一项所述的方法，其中所述血管植入物以约0.001mg/g生物 相容性聚合物基质/日 5mg/g生物相容性聚合物基质/日的量释放ATRA。
5.如权利要求1 4中任一项所述的方法，其中相对于所述生物相容性聚合物基质，所 述血管植入物包含0. 001重量％ 15重量％ WATRA。
6.如权利要求1 5中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量的ATRA的释放时期为 约1天 约12周。
7.如权利要求1 6中任一项所述的方法，其中所述生物相容性聚合物基质是聚酯、聚 氨酯、聚碳酸酯、聚酸酐、聚磷酯或其混合物。
8.如权利要求1 7中任一项所述的方法，其中所述生物相容性聚合物基质是聚(柠 檬酸-二醇)或聚(甘油-二酸)。
9.如权利要求1 8中任一项所述的方法，其中所述生物相容性聚合物基质是弹性体 或凝胶。
10.如权利要求1 9中任一项所述的方法，其中微粒或纳米颗粒包含ATRA，其中所述 微粒或纳米颗粒嵌入所述生物相容性聚合物基质中。
11.如权利要求1 9中任一项所述的方法，其中将ATRA包封于胶束或脂质体中，其中 所述胶束或脂质体嵌入所述生物相容性聚合物基质中。
12.如权利要求1 9中任一项所述的方法，其中将ATRA吸附于所述生物相容性聚合 物基质内。
13.如权利要求1 9中任一项所述的方法，其中将ATRA悬浮于所述生物相容性聚合 物基质内或溶解于所述生物相容性聚合物基质内。
14.一种制备修饰的血管植入物的方法，所述方法包括提供血管植入物；和使所述血管植入物与全反式视黄酸(ATRA)接触以产生修饰的血管植入物，其中所述修饰的血管植入物包含生物相容性聚合物基质；且所述修饰的血管植入物释放足以在植入患者时抑制或避免新生内膜增生和/或血栓 的治疗有效量的ATRA。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述接触包括用混合物涂布所述血管植入物，所述混合物含有生物相容性聚合物预聚物以及包含ATRA的纳米颗粒、微粒、胶束或脂质体。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述生物相容性聚合物预聚物是聚酯预聚物。
17.如权利要求14所述的方法，其中所述接触包括将所述血管植入物浸入包含ATRA的 溶液中。
18.如权利要求14所述的方法，其中所述接触包括用生物相容性聚合物预聚物涂 布所述血管植入物；使经涂布的血管植入物固化；和将所述经涂布的血管植入物浸入包含 ATRA的溶液中。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述溶液使得所述生物相容性聚合物基质溶胀。
20.如权利要求14所述的方法，其中所述接触包括用包含ATRA和所述生物相容性聚合 物基质的混合物涂布所述血管植入物，其中所述生物相容性聚合物基质是生物相容性热塑 性聚合物。
全文摘要
包含生物相容性聚合物和全反式视黄酸(ATRA)或其衍生物的受控释放的血管移植物如血管移植物、支架、包裹物和凝胶等可以用于治疗、预防或抑制可能会由假体植入引起的血栓和/或新生内膜增生。特别地，本文的植入物能抑制平滑肌细胞增殖、新生内膜增生并上调血管结构中的抗血栓基因和一氧化氮生成。此外，所述植入物能够输送受控的且可预测地局部浓度的ATRA。
文档编号A61L31/16GK102143768SQ200980134330
公开日2011年8月3日 申请日期2009年7月2日 优先权日2008年7月3日
发明者吉列尔莫·A·埃米尔, 安东尼奥·韦布, 梅林纳·基布 申请人:维塞尔泰克生物医学有限责任公司