基于编辑的可筛选质体标记基因的制作方法

专利名称：基于编辑的可筛选质体标记基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物分子生物学领域。具体地讲，提供了便于在多细胞植物(所编码的RNA在转录后修饰)中筛选稳定转化质体的DNA构建物。
背景技术：
为了更充分描述与本发明相关的技术状况，本申请以在括号中注明作者姓名和发表年代的方式引用一些参考文献。这些文献的完整引述列于说明书之后。这些文献的公开内容通过引用结合到本文中。
植物遗传工程包括通过导入新DNA对植物基因组和植物基因表达进行直接操作的遗传转化技术的发展和应用。一种转化方法是用来自细菌根癌农杆菌的肿瘤诱导(Ti)质粒的衍生物。其它方法采用生物发射(biolistics)、电穿孔、聚二乙醇处理将基因直接转入原生质体。
虽然对那些本技术领域的专业人士来说，将转化DNA加入植物细胞核中早已熟知，但是对于排除其它遗传阻隔而有所选择地鉴别转化质体DNA的转化方案尚未有所描述。采用以上所述的方法，如果希望只转化质体，核转化子可能表达编码选择标记的基因并导致假阳性的产生。
对于质体特异性标记基因的需要基于以下观察。在早期工作中，对受轰击的pTNH32烟草叶片进行卡那霉素抗性筛选时产生了大量核转化子(Carrer等，1993)。事实上，其它质体kan基因(Comelissen和Vandewiele,1989)及无启动子kan构建物(Koncz等，1989)的核基因转化子得率证实，卡那霉素抗性克隆可通过用未设计用于核中表达的构建物进行转化而轻易获得。另外，烟草中的核基因转化子也可通过筛选设计用于在质体中表达的壮观霉素抗性基因而回收。
已知植物细胞中有大量质体基因组，则在培养物中筛选转化基因组的能力是获得成功转化的关键因素。已经通过从所培养的植物细胞中筛选各种底物(如抗生素类和除草剂)的抗性突变体来鉴别选择标记。这些抗生素和除草剂列于以下表Ⅰ中。但是，迄今为止，还没有开发出一种方法能够在促进质体转化的同时排除对核转化子的筛选。这种系统的开发减少发生核转化而导致的假阳性。
RNA编辑是在转录后改变RNA序列的过程。直至最近，人们认为叶绿体(与线粒体相对)不利用RNA编辑，并且从相应的基因序列预期的氨基酸序列通常都正确。虽然大多数叶绿体基因始于标准的ATG起始密码子，但已经鉴别出在相应于其它物种中同源基因的5’端ATG的位置处编码ACG基因。最近的研究表明，该ACG密码子在mRNA水平上并不保守。通过C变U的编辑，它转化成功能性AUG密码子(Hoch等，1991)。至今所发现的大多数被编辑密码子，恢复了在其它物种叶绿体的相应多肽中保守的氨基酸。这种编辑过程是质体所特有的。在质体中所编辑的基因在植物的核中或其它细胞器中并不被编辑。
基于仅仅发生于质体的转化构建物中的RNA编辑的要求，本发明提供有助于筛选稳定转化质体的DNA构建物和方法。质体基因组定向操作现在可以更容易地进行。这些操作包括质体中基因置换、基因缺失、外源基因插入以及重组蛋白表达。
发明概述本发明提供筛选多细胞植物中稳定转化质体的DNA构建物和方法。本发明的DNA构建物可用来仅仅筛选质体转化子。核转化子用本发明构建物将得不到筛选。
根据本发明的一个方面，将嵌合DNA构建物描述为含有与选择标记基因在转录水平相融合的编辑基因片段。在质体中发生RNA水平编辑之后，表达选择标记基因。细胞或组织维持于选择培养基上直至它们达到同质状态，这时基本上所有细胞或组织的质体都已被转化。
在本发明的一个优选实施方案中，将以上所描述的嵌合构建物加入一个载体中，该载体含有定向整合进质体基因组所必需的同源序列。该导向区段具有足够大小，以便促进与预定质体基因组序列同源重组，并由此在转化质体的基因组中置换该序列。该载体还可以另外含有目的性外源基因来有益地增强植物的表型。在本发明的再一实施方案中，嵌合DNA构建物可以含有指导目的性外源基因的组织特异性调控序列。
本发明方法一般在双子叶植物和单子叶植物中均可用于稳定转化质体的筛选。经过筛选之后，将表达选择性表型的细胞或组织再生成多细胞植物。
附图简述

图1是烟草质体的psbE操纵子和psbF DNA及psbL DNA以及氨基酸序列的图解。下边划线的是所编辑的psbL起始密码子(从ACG变至AUG)。用虚线框起来的是ΔpsbF/ΔpsbL区。标明了寡核苷酸01、06、07、015及016的位置。按照Shinozaki等(1986)对所述DNA序列编号。
图2是物理图谱和部分DNA序列图2A显示质粒pJLM20中的EaadA基因，图2B显示质粒pJLM18中的Ekan基因。Prrn序列中的下划线部分是保守的-10/-35启动子元件和核糖件结合位点(RBS)。用虚线框注的是ΔpsbF/ΔpsbL区来源的DNA序列，实心框中的是在构建过程中导入的新序列。在所编辑的psbL起始密码子(从ACG变为AUG)下划线。Trps16是质体rps16核糖体蛋白基因的3’-端非翻译区。标明了EaadA中寡核苷酸01、02和03以及Ekan中寡核苷酸01、04和05的位置。限制性酶切位点的缩写为B,BspHⅠ；H,HindⅢ；N,NcoⅠ；S,SacⅠ；X,XbaⅠ。
图3是凝胶图和放射自显影图，表明在Nt-pHC94-1植物中EaadAmRNA的编辑以及在Nt-pJLM23-2植物中Ekan mRNA的编辑。图3A表明用引物01和02对EaadA模板，以及用引物01和04对Ekan模板从DNA(泳道1、5)和cDNA(泳道2、6)进行PCR扩增的产物。引物的位置示于图2A和图2B。对照物是以相同引物用DNaseⅠ处理的RNA(泳道3、7)和只用缓冲液(泳道4、8)所进行的扩增反应。图3B表示Nt-pHC94-1植物中EaadA的DNA序列和cDNA序列，图3C表示Nt-pJLM23-2植物中的Ekan。扩增产物直接用引物03(EaadA)和05(Ekan)进行测序。由于引物的方向性，所示的序列与所述mRNA互补。所述序列中的编辑位点同箭头标明。请注意在cDNA样本中编辑位点处混合的核苷酸A和核苷酸G表示部分编辑。
图4是表明转基因植物中psbL mRNA编辑的凝胶图和放射自显影图。图4A表明用引物01和06从野生型植物Nt-pHC94-1(EaadA)及Nt-pJLM23-2(Ekan)的DNA(泳道1、5、9)和cDNA(泳道2、6、10)所得到的PCR扩增产物。对照物是用DNaseⅠ处理的RNA(泳道3、7、11)和只用缓冲液(泳道4、8、12)所进行的扩增反应。野生型中psbL的DNA序列和cDNA序列示于图4B。图4C表明Nt-pHC94-1(EaadA)中的序列。图4D表示Nt-pJLM23-2(Ekan)植物中的序列。扩增产物用引物07直接测序。由于引物07的方向性，所示序列与mRNA序列互补。编辑位点用箭头标明。注意在野生型植物中几乎完全编辑(G*符号)，在转基因植物中部分编辑。
图5显示质体基因组的部分DNA图谱以及表明psbL mRNA和嵌合mRNA稳定状态水平的放射自显影图。图5A表明质体基因组的部分图谱，其中EaadA基因和Ekan基因通过用pHC94质粒或pJLM23质粒进行转化而获得。标明了16SrRNA基因和trnⅤ基因以及rps12/7操纵子。水平箭头表示用寡核苷酸针014探测到的mRNA。图5B中上面一组放射自显影结果表明，寡核苷酸014探测到相似大小(1.1kb)的psbE、EaadA和Ekan转录物以及2.2kb的Ekan-aadA转录物。另外，还可见到少量未特征鉴定的RNA片段，它们不包括在定量范围内。上样的细胞总RNA(每泳道2μg)来自野生型植物(Wt)、质粒pHC94转化植物(Nt-pHC94-1)、Nt-pHC94-11、Nt-pHC94-21)以及质粒pJLM23转化植物(Nt-pJLM23-2、Nt-pJLM23-14、Nt-pJLM23-18)。图5B中下面一组结果表明用探针psbJ探测到psbE mRNA的累积和作为对照16SrRNA的累积。洗去滤膜上的标记寡核苷酸014，并用psbJ探针和16SrDNA探针的混合物进行探测。探针psbE通过用图1所示的引物015和016对psbJ区进行pCR扩增而获得。16SrDNA探针是以质体基因组中核苷酸138448/141847处的限制性酶切位点限定的2.4kb的EcoRⅠ/EcoRⅤ ptDNA片段(Shinozaki等，1986)。
图6是表明野生型植物和转基因Nt-pHC94-1植物中rpoB转录物和ndhB转录物编辑的一系列放射自显影图。运用以下引物对于rpoB为08和09；对于ndhB为010和011,pCR扩增与每个基因相对应的DNA序列和cDNA序列。rpoB的测序引物为08,ndhB的是01。所述序列中的编辑位点用箭头表示。DNA中箭头所指向的C在rpoB转录物和ndhB转录物的位点Ⅰ和位点Ⅱ处被编辑成T。
图7是描述用来定义psbL编辑所需区方法的部分图谱和一系列放射自显影图。图7A表示嵌合基因ΔpsbL/kan的图谱，图顶部是放大的98nt ΔpsbF/Δpsb片段。标出了引物04、05和017的位置。66,780和66,638是烟草质体基因组中98nt ΔpsbF/ΔpsbL片段末端的核苷酸(Shinozaki等，1986)。图7A的下面部分是一系列载有嵌合基因ΔpsbL/kan的pPRV111A质粒衍生物。给出相应于已编辑C的ΔpsbF/ΔpsbL缺失衍生物末端的核苷酸位置(位置O；如箭头所指)。列出嵌合ΔpsbL/kan mRNA的编辑效率(％)、以及转基因植物的卡那霉素抗性表型，图7B是证明所述嵌合mRNA中psbL位点编辑的放射自显影图。用引物017和04PCR扩增cDNA，并用引物05直接测序。由于05的方向性，所述序列与mRNA互补。相应地，编辑位点的A表明C转变为C事件，G表明未编辑的核苷酸C。
图8是表明转基因植物中psbL编辑的部分DNA图谱和一系列放射自显影图，所述转基因植物含有与编辑位点相邻的突变。图8的上面部分表明被编辑C的位置(箭头所指)以及98nt ΔpsbF/ΔpsbL片段中的侧翼序列。下面部分是质粒pSC14和pSC15中的突变。通过对嵌合cDNA(底部)测序检测编辑情况。列出所计算的嵌合mRNA编辑效率(％)。实验的细节可参见图7的说明。
图9显示部分DNA图谱和一系列入射自显影图，说明转基因植物中存在psbL特异性反式因子(psbL-SEF)的竞争。图9A显示含有psbL基因的psbE操纵子的图谱，标明用于PCR扩增和测序的寡核苷酸01、06及07的位置。显示编辑所需的22nt(-16/+5)序列。被编辑的C用箭头标出。竞争psbL-SEF的16nt片段用方框标出。列出了用于获得转基因植物的质粒，如在图7和图8中鉴别的。与未转化的野生型植物相比，psbL mRNA编辑效率降低表明了竞争(+)。图9B是表明psbLmRNA编辑的放射自显影图。用引物01和16进行PCR扩增cDNA并用引物07直接测序。由于07的方向性，所示序列与mRNA互补。相应地，编辑位置处的A表示由C向U的转变事件，G表示位置上未编辑的核苷酸C。A+G*表示在野生型植物中几乎完全编辑(＞99％)。A+G表示具有大约10％未编辑psbL转录物的部分编辑。
图10是部分DNA图谱和一系列放射自显影图，说明含有ndhD编辑位点的嵌合mRNA不竞争psbL-SEF。图10A显示包含ndhD、PsaC和ndhE基因以及具有被编辑ndhD翻译起始密码子(下划线)的DNA序列的烟草质体基因组的部分图谱。根据Shinozaki等(1986)的方法标记基因并对DNA序列编号。虚线框内的ΔndhD区段与kan基因在翻译水平上相融合，如图10B所示。指出了引物018、019和020的位置。编辑位点(下划线)上游26bp处的核苷酸A在该嵌合基因构建过程中转变成C。图10B表明在质粒pSC23中的嵌合基因ΔndhD/kan在Prrn/Trps16盒中表达。标明了引物04、05和017的位置。图10C描绘表明野生型植物(Nt-wt)、Nt-pSC23及Nt-pSC2植物中ndhD位点和psbC位点编辑状况的放射自显影图。在内源ndhD及嵌合ΔndhD/kan的mRNA中研究ndhD位点的编辑。在内源psbL及嵌合ΔpsbL/kan的mRNA中研究psbL位点的编辑。用引物018和019扩增ndhD cDNA并用引物020进行测序。用引物01和06PCR扩增psbL cDNA并用引物07直接测序。用引物017和04扩增ΔndhD/kan和ΔpsbL/kan的cDNA，并用引物05进行测序。由于测序引物的方向性，所示序列与所述mRNA互补。相应地，编辑位置的A表示C向U的转变事件，G表示未编辑的核苷酸C。
图11是Δrpl2/kan基因的示意图。图11A显示包含基因trnⅠ、rpl23、rpl2和trnH、以及具有被编辑rpl2翻译起始密码子(下划线)的DNA序列的玉米质体基因组的部分图谱。按照Maier等(1995)的方法标记基因并将该DNA序列编号。如图11B所示，虚线框内的Δrpl2区段与基因kan在翻译水平上相融合。图11B证明质粒pSC22中的嵌合基因Δrpl2D/kan在Prrn/Trps16盒中表达。标明了引物04、05和017的位置。
图12是用于检测ndhE和rpoBRNA的区段中编辑状况的小基因的示意图。图12的上面部分是nhdB质体基因及其小基因，也显示了rpoB质体基因及其相应的小基因(图12的下面部分)。图中标明编辑位点。小基因的RNA在下述盒中表达，该盒包含rRNA操纵子启动子(Prrn)及mRN稳定性所需的rps16核糖体蛋白基因(Trps16)的3’端非翻译区(Zoubenko等，1994)。表Ⅳ中列有编辑位点和参考文献。
发明详述按照本发明，提供促进转化基因送递后筛选转化质体的方法和DNA构建物。本发明的构建物只有当它们在质体中在RNA水平上被正确编辑时才表达。就目前所知，这里所描述的方法和DNA构建物迄今还未应用于多细胞植物中。
以下的定义将有助于理解本发明要点异质的(heteroplasmic)指在单个质体中或在植物细胞或组织中含有的质体群体中存在不同质体基因组的混合群体。
同质的(homoplasmic)指或者在一个质体中或者在植物细胞或组织中含有的群体中质体基因组的纯群体。同质的质体、细胞或组织在遗传上是稳定的，因为它们只含有一种类型的质体基因组。因此，甚至在除去选择压力之后它们仍保持同质性，并且自交后代也是同质的。本着本发明目的，功能上同质的异质基因组群体(例如，仅含有少量野生型DNA或具有序列变异的转化基因组的群体)在此可称为“功能同质的”或“基本同质的”。通过在非致死选择培养基上连续筛选，这些类型的细胞或组织可轻易纯化成同型异源性(homoplasmy)。由于质体基因组的随机分选，大多数这种植物的种子后代在无选择压力下是同质性。
质体基因组(plastome)质体的基因组。
转质体基因组(transplastome)转化的质体基因组。
质体转化转化DNA在质体基因组中的稳定整合，它可传递至含有所述转化质体的植物的种子后代中。
选择标记名词“选择标记”指一种表型，当用于转化的外源DNA中包含编码该选择标记的基因或等位基因时，该表型鉴别成功转化的细胞器、细胞或组织。
转化DNA指同源DNA或以侧翼为同源DNA的异源DNA，当导入质体中时，它通过同源重组成为质体基因组的部分。
编辑基因区段指编码转录后改变的RNA的DNA区。
翻译水平融合指两个独立基因的两个编码区剪接在一个结构中，使得这两个基因在蛋白质水平上都表达。按照本发明，嵌合蛋白的翻译依赖于mRNA水平上适合的上游编码区的编辑。
在以下详述中提供产生和运用本发明DNA构建物的优选方法和实践本发明方法的实施例。任何未作具体叙述的分子克隆和重组DNA技术均按照标准方法进行，这些方法一般在如Sambrook等的“DNA克隆，实验室手册”，冷泉巷实验室，1989中提出。
在详述中和以下所列举的实施例中，优选实施方案包括编码编辑RNA区段的DNA区段，该编辑RNA区段与编码选择标记的第二DNA片段操作性连接。在以下实施例中列举了烟草叶绿体。含有这些组合的转化载体在帮助质体特异性转化中有用。烟草叶绿体基因组上的位置和序列参考文献取自Shinozaki等，EMBOJ.,5:2043-49(1986)，该文献公开了烟草叶绿体基因组的全部核苷酸序列。虽然将烟草作为范例，但那些本领域技术人员会认识到，可以将本发明的DNA构建物和方法运用到其它植物物种的质体中。
质体转化需要(1)穿过质体双层膜送递DNA的方法；(2)异源DNA整合，而不干扰质体基因组正常功能；以及(3)转化质体基因组的有效筛选。进行多细胞植物质体有效转化的方法学在1995年9月19日颁发的美国专利5,451,513号中提出，该专利的全部内容通过引用结合到本文中。
根据本发明，已经发现用于鉴别转质体基因组的选择标准对于高等植物中质体稳定转化的成功至关重要。因此，本发明选择技术在转化DNA中运用了编码选择性表型(“选择标记”)的DNA。在一定程度上由于每个植物细胞中存在大量相一致的质体基因组拷贝(与衣藻属中单个质体上所载有的80个拷贝相比，3000-12000个拷贝位于烟草中大约100个质体上)，筛选过程十分有利于获得转质体基因组品系。选择性表型可包括抗生素抗性、除草剂抗性、药物抗性或针对代谢产物毒性类似物的抗性。
本发明提供需要RNA编辑过程的选择标记基因，所述RNA编辑过程只在质体中发生，不在核中或线粒体中发生。这种质体特异性标记基因将大大增强在多细胞植物中获得稳定转化质体的能力。控制选择标记表达的质体特异性编辑位点的新组合将在下文中有所描述。
某些mRNA序列可通过称作RNA编码的过程在转录后得到改变，因此它们最终的核苷酸序列与DNA序列所编码的不同。在包括锥虫、Physarum polycephalum、哺乳类、病毒以及涉及广泛不同分子机制的高等植物在内的不同生物体中已经检测到该过程(综述Benne,1994；Chan,1993；Gray和Covello,1993；Innerarity等，1996；Simpson和Thiemann,1995)。
在高等植物中，质体和线粒体RNA的编辑包括C向U转变，而在线粒体中甚少有U变为C的情况。据估计质体中的编辑位点数大约为25个(Maier等，1995)，而在植物线粒体中约有1000个或更多(Schuster和Brennicke,1994)。对编辑位点周围序列的比较并未鉴定出能够指导位点筛选过程的任何保守的一级序列和/或结构基元。最近开发的体外编辑系统应该导致加快植物线粒体中RNA编辑的分析进程(Araya等，1992；Yu和Schuster,1995)。虽然仍然缺乏体外进行质体编辑的系统，但质体转化的可用性提供研究质体编辑的体内途径(Bock等，1994；Bock和Maliga,1995；Sutton等，1995)。
已经报道RNA编辑发生在质体和线粒体中，而还未曾在核中观察到RNA编辑(Kossel等，1993；Hanson等，1995)。另外，线粒体转录物不在质体中编辑(Sutton等，1995)。对于RNA编辑以及用质体指导的构建物轰击植物细胞后回收大量核转化子这一问题的发现，导致本发明质体转基因的设计，该转基因在质体中表达，而在其它细胞的遗传区室中不表达。以下实施例描述本发明的转基因。
简略地说，基于编辑的选择标记基因的第一个实施例采用与抗生素抗性基因编码区在翻译水平融合的编辑质体基因的N-端区段。该抗生素抗性基因的表达依赖于该构建物的RNA编辑。在一个具体实施例中，psbL的N-端区段与aadA基因的编码区相融合。aadA基因的翻译依赖于编辑，并通过直接筛选用于回收质体转化子(Chaudhuri等，1995)。另外，基于psbL的编辑选择标记可包含相似的ΔpsbL/kan嵌合基因(Chaudhuri和Maliga,1996)，其中卡那霉素抗性是翻译起始密码子编辑的可靠测量手段(Chaudhuri等，1995；Chaudhuri和Maliga,1996)。虽然当这些基因存在于细胞中每个质体基因组拷贝中时赋予植物细胞的卡那霉素抗性，但它们并不能用于直接筛选。这大概是因为只有当嵌合基因高水平表达时，质体转化子才能够通过卡那霉素抗性直接筛选。通过适当工程改造提高Ekan基因的表达水平，该基因的直接筛选应当是可行的。
基于编辑的选择标记基因的第二个创新实施例采用编辑的ndhD区段。这种ΔndhD/kan构建物由ndhD的N-端区段与kan的编码区相融合而获得(Chaudhuri和Maliga,1996)。以上所描述的选择标记基因将有助于某些双子叶物种中筛选转化子。
第三种基于编辑的标记基因Δrpl2/kan通过编辑的rpl2区段与卡那霉素编码区相融合而产生。这种嵌合选择标记基因将有益于在单子叶物种进行质体转化子的筛选。
在烟草质体中，有功能的psbL mRNA和ndhD mRNA通过将ACG密码子编辑成ACG翻译起始密码子而产生。为了确定编辑是否在嵌合mRNA中发生，如以下实施例中所述将含有该编辑位点的psbLN-端部分与aadA和kan的细菌基因在翻译水平上相融合。通过定向基因插入将所述嵌合构建物导入烟草质体基因组。98nt片段的缺失衍生物作为嵌合转录物的部分表达，界定了psbL编辑所需的顺式序列。根据本发明，已发现22nt片段足以指导psbL编辑。虽然编辑需要该22个核苷酸，但只有16个核苷酸竞争psbL-特异性编辑因子。
嵌合基因转录物的表达导致内源psbL mRNA的编辑效率明显下降。但是，在转质体基因组系中位于rpoB mRNA和ndhB mRNA中的四个位点的编辑效率未改变。这种在转质体基因组系中psbL编辑效率下降，而其它四个位点未下降，表明psbL-特异性编辑因子耗尽。这个发现意味着在高等植物的质体mRNA编辑中涉及位点特异性因子。
除psbL外，还表明烟草中的编辑产生了ndhD的翻译起始密码子AUG(Neckermann等，1994)。为了检测起始密码子的编辑是否涉及普通的可耗尽反式因子，在烟草质体中表达了含ndhD编辑位点的嵌合基因。数据表明，对于psbL,ndhD位点的编辑需要可耗尽的反式因子。但是，该反式因子与psbL编辑所需要的有所不同。
在玉米质体中，rpl2的翻译起始密码子通过编辑产生(Hoch等，1991)。为了检测玉米rpl2前后序列中的ACG密码子是否在烟草质体中编辑，通过将rpl2的N-端片段与kan编码区在翻译水平上相融合构建了Δrpl2/kan基因。该嵌合mRNA在烟草中不编辑，但却为如玉米和水稻这样的禾谷类提供了有用的选择标记。
提供以下实施例仅仅说明实施本发明的典型方法。其目的决不在于限制本发明范围。
实施例1基于编辑的Ekan和EaadA选择标记基因A．所述嵌合基因的构建psbL基因编码光合系统Ⅱ的多肽，并且是psbE操纵子的部分(Carillo等，1986；见以上图1)。将包括psbL编辑位点ΔpsbF/ΔpsbL在内的98个核苷酸的片段克隆在壮观霉素抗性基因(aadA)编码序列的上游，这样就使psbL的N-端与aadA在翻译水平上相融合。该ΔpsbF/ΔpsbL片段含有psbF C-端的40个核苷酸、位于psbF和psbL之间的基因间隔区的22个核苷酸以及psbL N-端的36个核苷酸。将该构建物克隆在Prrn/Trps16质体表达盒中(图2A)。Prrn含有质体rRNA操纵子的启动子、一个核糖体结合位点以及一个翻译起始密码子(ATG)。在该嵌合构建物中，截短的psbF编码区与Prrn起始密码子(ATG)形成可读框，而EaadA读框的翻译(psbL-aadA融合肽)依赖于通过编辑psbL位点而产生的翻译起始密码子(ACG变为AUG)。请注意，在EaadA mRNA中这两个编码区处于不同的读框中。参见图2A。
用示于图2B的相同的ΔpsbF/ΔpsbL片段，通过psbL与kan在翻译水平上融合，获得Ekan基因，kan为编码新霉素磷酸转移酶的卡那霉素抗性基因。Ekan具有psbL N-端的39个核苷酸而非36个核苷酸，除此之外Ekan与EaadA基因类似。以下提出详细的该基因构建技术说明。
质粒pJLM18中的Ekan基因(示于图2B)在pBluescript KS+质粒(Stratagene)中构建。pJLM18中的Ekan编码区在Prrn/Trps16盒中表达。Prrn的5’调控区由质体rRNA操纵子启动子和核糖体结合位点组成，并位于EcoRⅠ/NcoⅠ片段上。Prrn来源于质粒pZS197(Svab和Maliga,1993)的祖先质粒pZS195，其中翻译起始密码子(ATG)包括在NcoⅠ位点中。将Prrn的NcoⅠ位点与BspHⅠ/XbaⅠ片段的BspHⅠ位点相连接；该NcoⅠ/BspHⅠ融合体消除了这两个限制性位点。通过将重叠的5’CATTCATGACTTTGGGATCAATATCAGCATATGCAGTTCATCCAACGATAAACTTAATCCGAATTATAGAGC-3’和5’CGGTCTGAATTCAATTCAACATTTTGTTCGTTCGGGTTTGATTGTGTCGTAGCTCTATAATTCGGATTAAG-3’单链寡核苷酸一起退火，并用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段进行延伸，获得BspHⅠ/XbaⅠ寡核苷酸。该BspHⅠ/XbaⅠ片段含有图2B框中的序列，包括编码psbF C-末端的ΔpsbF/ΔpsbL序列、所述基因间隔区以及psbL的N-端部分。NcoⅠ/BspHⅠ融合的结果是，psbF的C-末端从Prrn翻译起始密码子(ATG)处翻译。为了从翻译水平将psbL的14个N-端密码子与kan编码区融合，通过绿豆核酸酶处理除去了BspHⅠ/XbaⅠ片段的XbaⅠ单链突出部分和kan NcoⅠ位点的单链突出部分(包括翻译起始密码子)，随后将它们连接在一起。该kan编码区作为NcoⅠ/XbaⅠ片段来自质粒pTNH4(Carrer等，1993)。Trps16片段包含在一个XbaⅠ/HindⅢ片段中，并通过该XbaⅠ位点与Ekan编码区相连。该Trps16片段含有ptDNA中位于核苷酸5,087至4,939之间的rps16基因3’调控区(Shinozaki等，1986)。该片段5’末端的XbaⅠ位点通过寡核苷酸定点诱变而产生；该片段的3’末端是从质体基因组中位于核苷酸4,938处的EcoRⅠ位点切下的(Staub和Maliga,1994)。然后将EcoRⅠ位点通过与接头连接转换为HindⅢ位点。为了导入质体基因组中，将该Ekan构建物作为EcoRⅠ/HindⅢ片段克隆在质体载体pPRV111B的多克隆位点中(Zoubenko等，1994；基因库登记号U12813)，并与aadA选择性基因相邻。
图2A所示的质粒pJLM20中的EaadA基因如对于Ekan基因所述一样，构建在pBluescript KS+质粒中。含有aadA编码区的NcoⅠ/XbaⅠ片段来自质粒PHC1(Carrer等，1991)，该aadA编码区与烟草psbL基因的12个N-端密码子在翻译水平上相融合。为了导入质体基因组中，将EaadA基因克隆在质体插入载体pPRV100B中(Zoubenko等，1994，基因库登记号U12811)。载体pPRV100B上有一个侧翼为ptDNA序列的多克隆位点，但无选择性质体标记基因。
虽然本文以卡那霉素、壮观霉素和/或链霉素抗性为例，但设想了其它选择性标记基因的应用。这些基因列于以下的表Ⅰ中(Potrykus等，(1995)引自Gene Transfer to Plants,Springer Verlag)。
表Ⅰ植物转化的选择性标记基因筛选剂标记基因基因产物卡那霉素，G418nptⅡ 新霉素磷酸转移酶Ⅱ庆大霉素 aacC3 庆大霉素-N-乙酰转移酶aacC4潮霉素hph,hpt 潮霉素磷酸转移酶甲氨蝶呤 dhfr二氢叶酸还原酶壮观霉素 16SrDNTA16SrRNAaadA氨基糖苷-3’-腺苷酰转移酶链霉素SPT 链霉素磷酸转移酶16SrDNA 16SrRNAaadA氨基糖苷-3’-腺苷酰转移酶博菜霉素 ble腐草霉素杀稻瘟素 bsr 杀稻瘟素S脱氨酶磺胺 sul 二氢蝶酸合酶膦丝菌素 bar 膦丝菌素乙酰转移酶氯磺隆als 乙酰乳酸合酶csr-1溴苯腈bxn 溴苯腈腈水解酶草甘膦EPSPS 5-烯醇丙酮酰-莽草酸盐-3-磷酸合酶2,4-D tfdA2,4-二氯苯氧乙酸单加氧酶莠去津psbAQ蛋白2,2-DCPA 脱卤素酶4-甲基-色氨酸 tdc 色氨酸脱羧酶硝酸盐NR 硝酸还原酶S-氨乙基-L-半胱氨酸 DHPS二氢吡啶甲酸合成酶赖氨酸/苏氨酸 AK 精氨酸激酶氨乙基-半胱氨酸 OSC 章鱼碱合酶
B．抗生素抗性转质体基因组系的转化和筛选将EaadA基因克隆进质体转化载体pPRV100B(Zoubenko等，1994)中产生了质粒pHC94，通过生物发射方法将pHC94导入烟草叶绿体。该嵌合基因在trnⅤ-tps7/12基因间隔区中经过两次同源重组整合进质体基因组。在经过轰击的50个叶片的一个样本中，通过壮观霉素抗性选择导致分离到43个壮观霉素抗性克隆。其中有34个克隆经DNA凝胶印迹分析证实载有EaadA基因(数据未示)。抗生素抗性的表达说明了嵌合EaadA的编辑。EaadA基因的选择效率与其表达不依赖于编辑的aadA基因(Svab和Maliga,1993)的选择效率相当，大约为每个轰击叶片样本中有一个质体转化子。对三个独立的转化系Nt-pHC94-1、Nt-pHC94-10和Nt-pHC94-11做了进一步研究。由于卡那霉素抗性的直接筛选效率不高(Carrier等，1993)，将Ekan基因与转化载体pPRV111B中的壮观霉素抗性基因相连产生质粒pJLM23。用pJLM23质粒包裹的钨粒轰击之后，尝试进行质体转化子的直接筛选。在200个受轰击叶片的一个样本中(100个，每个在50μg/ml和100μg/ml硫酸卡那霉素上筛选)未获得卡那霉素抗性克隆。但是，通过筛选与之相连的壮观霉素抗性基因，获得了含有Ekan基因的转基因植株。对三个独立的转化系Nt-pJLM23-2、Nt-pJLM23-14和Nt-pJLM23-18做了进一步研究。每个克隆的叶段在卡那霉素培养基(50μg/ml)上均增殖，表明Ekan基因的表型表达。用于质体转化的方法详述于下文。
将烟草(Nicotiana tabacum cv.Petit Havana)植株无菌生长于含有MS盐(Muvashige和Skoog,1962)和蔗糖(30g/L)的琼脂固化培养基上。将叶片的背轴面朝上置于RMOP培养基上准备轰击。RMOP培养基含有MS盐、N6-苯甲基腺嘌呤(1mg/L)、1-萘乙酸(0.1mg/L)、硫胺(1mg/L)、肌醇(100mg/L)、琼脂(6g/L)，pH为5.8，并加蔗糖(30g/L)。采用杜邦PDS1000He型基因枪，将1μm钨粒表面的DNA导入叶绿体中(Maliga,1995)。在含有500μg/ml壮观霉素二盐酸盐的RMOP培养基上筛选壮观霉素抗性克隆。抗性苗在相同的选择培养基上再生，并在MS琼脂培养基上生根(Svab和Maliga,1993)。在含有50或100μg/ml硫酸卡那霉素的RMOP培养基上筛选卡那霉素抗性克隆(Carrier等，1993)。C．EaadA、Ekan和psbL转录物的编辑EaadA植物和Ekan植物抗生素抗性表型的表达表明嵌合基因被编辑，因为它们的翻译依赖于将ACG密码子编辑为AUG起始密码子。为了直接检测EaadA mRNA和Ekan mRNA的编辑，用位于psbF编码区中的引物01以及分别位于EaadA中和Ekan编码序列的引物02和04PCR扩增cDNA。这些引物的位置示于图2。PCR扩增产物示于图3A。对三个独立转化EaadA系的PCR产物进行的直接测序和phosphorimager分析，表明大约70％的EaadA转录物被编辑。参见图3B和表Ⅱ。
表Ⅱ野生型叶片和转基因叶片中未编辑mRNA(％)
图3中相应于核苷酸的条带放射性通过phosphorimager分析测定。将DNA上样量和标记效率的数值对相同泳道中6条其它条带的数值归一化。未编辑mRNA的百分比=[正确的(corrected)未编辑信号/(正确编辑信号+正确未编辑信号)]×100如图3C和表Ⅱ所示，发现Ekan mRNA的编辑程度相似。由于从非反转录DNaseⅠ处理的RNA样本中未获得PCR扩增产物，所以部分编辑不能归因于RNA样本中出现了污染DNA。参见图3A；泳道3和泳道7。所述嵌合转录物中的psbL位点仅仅是部分编辑(大约70％)，而在野生型植物叶片中99％以上的psbL mRNA被编辑(Kudla等，1992；Bock等，1993)。因此很有兴趣确定psbL mRNA的编辑在转基因植物中是否受影响。用图1A所示的psbF和psbJ编码区中的引物01和引物06，从野生型植物和转基因植物中PCR扩增psbL的cDNA。对PCR产物的直接测序表明，转基因植物含有约10％未编辑的psbLmRNA。这说明未编辑的psbL mRNA水平在转基因植物中增加了10倍以上。参见图4和表Ⅱ。由于在非反转录DNAaseⅠ处理的RNA样本缺乏PCR产物，所以排除对RNA样本造成DNA污染的人为因素。参见图4A泳道3、7和11。用表研究质体mRNA编辑的方法描述于下文。
按照Mettler(1987)法分离细胞总DNA。用TRIzol(Gibco BRL)提取细胞总RNA。按Kudla等(1992)的描述对用蛋白酶K和DNAseⅠ处理的RNA样本进行反转录。用标准方法PCR扩增DNA和cDNA:92℃ 1min,55℃ 2min,72℃ 1.5min，共30个循环。
在1.5％琼脂糖凝胶上分离PCR扩增产物，并用GenecleanⅡ试剂盒(BIO 101 Inc.)将其纯化。用测序试剂盒(USB)和去垢剂Nonidet P-40，如(Bachmann等，1990)所述方法对DNA进行直接测序。
以下是用于PCR的引物一览表015’-CAATATCAGCAATGCAGTTCATCC-3’025’-CCAAGCGATCTTCTTCTTGTCCAA-3’035’-GCGCTCGATGACGCCAAC-3’045’-CACGACGAGATCCTCGCCG-3’05 5’-GAATAGCCTCTCCACCCA-3’06 5’-GGAATCCTTCCAGTAGTATCGGCC-3’07 5’-GGAAAATAAAACAGCAAGTAC-3’08 5’-CAAATATTGCAAAGTCCCGG-3’09 5’-CCGGATCGCCACCTACAC-3’0105’-TGGCTATAACAGAGTTTCTC-3’0115’-GGATTTCCAGAAGAAGATGCC-3’0145’-GTTCGTTCGGGTTTGATTGTG-3’0155’-GAACTCAACGGGCCCTTCCCC-3’0165’-GGAGGGAAGTGGAGTAAATGGCCG-3’D．psbL、EaadA以及Ekan mRNA的相对丰度转基因系中部分编辑psbL mRNA的累积原因可归结为它与嵌合EaadA mRNA或Ekan nRNA竞争编辑所需的限制性普通因子。因此，测定psbL转录物及嵌合物转录物的相对丰度。值得注意的是，多顺反子的psbE(Carillo等，1986)mRNA及EaadA和Ekan mRNA大小均为约1.1-kb。为了对这些转录物的累积进行定量，运用了Northern印迹上的DNA示差探针(differential probe)。参见图5。用psbJ编码序列片段探测，表明含有psbJ和psbL读框的1.1kb psbE操纵子mRNA在野生型植物和转化植物中有相似程度的累积。参见图5B下面一组。014寡核苷酸探针与psbE操纵子以及嵌合EaadA和Ekan转录物中存在的含有ΔpsbF/ΔpsbL区的mRNA均杂交。014探针在转基因植物中探测到4倍以上的RNA，这表明多顺反子psbE mRNA与嵌合mRNA的比率为1∶3。参见图5B上面一组。用于RNA凝胶分析方法讨论如下。
用TRIzol(Gigoco BRL)提取总RNA。在含有1％琼脂糖的甲酰胺凝胶上进行RNA电泳，并将其转到尼龙膜(Amersham)上。于45℃在6×SSPE、0.5％SDS、10×Dendardt氏试剂、100mg/ml tRNA、0.1％焦磷酸钠中与32P末端标记的寡核苷酸探针014杂交。随机引物法(Boehringer Mannheim)32P标记DNA片段探针的杂交于65℃在快速杂交缓冲液(Amersham)中进行。通过PhosphorImager分析(MolecularDynamics)法定量测定样本中与所述探针杂交的RNA水平。E．其它mRNA的编辑在转基因植物中不受影响转基因植物对psbL编辑需求的增加导致其编辑效率下降。为了证实是否其它mRNA的编辑在转基因植物中受影响，进行了实验。在rpoB转录物中检测了两个位点，并在ndhB转录物中也检测了两个位点。参见表Ⅲ。
表Ⅲ在野生型和转基因植物中所检测的编辑位点一览表
>a参考文献Zeltz等，1993b参考文献Maier等，1992c在烟草中，TCA密码子被编辑成TTA密码子。
rpoB编辑位点和ndhB编辑位点最早报道在玉米中发现，本项研究证实它们在烟草中也存在。在野生型烟草中，如图6所示，rpoB的编辑位点Ⅰ和Ⅱ几乎完全被编辑，这与在玉米和大麦(Zeltz等，1993)中所观察到的一样。类似地，与在玉米中所报道的(Maier等，1992)一样，在野生型烟草中ndhB转录物的位点Ⅰ和位点Ⅱ也完全被编辑，如图6所示。在表达EaadA和表达Ekan的各自的三个品系植物中检测相同位点的编辑效率。在野生型和转化植物之间未发现四个位点中任何一个的编辑效率有明显的不同。图6中的数据说明了表达EaadA的其中一个品系Nt-pHC94-1植物的情况。除psbL位点外的任何位点的编辑效率无变化，这表明嵌合基因的表特异性地损害psbL位点的编辑效率。讨论以上所述的实施例是质体中有关嵌合mRNA编辑的首次证明。EaadA和Ekan两者转录物的编辑表明，ΔpsbF/ΔpsbL片段的98个核苷酸和101个核苷酸分别足以指导psbL位点的编辑。EaadA mRNA或Ekan mRNA比含有psbL读框的psbE多顺反子信息的累积水平高出大约3倍，导致未编辑psbL转录物的水平明显增高(＞10倍)。未编辑psbL mRNA水平从＜1％增高至大约10％并不具有能在表型水平上检测出有害后果。所述嵌合nRNA在转基因植物中也是部分被编辑。
psbL mRNA和嵌合mRNA均为部分编辑，这暗示着共享位点编辑所需的限制性反式作用因子的缺乏。但是，其它四个位点的编辑效率未受影响，这提示所缺乏的因子是psbL转录物的编辑所特异性需要的，而非普通编辑机构的组分。因此可以设想叶绿体基因组中的每个编辑位点需要一些它们特有的编辑因子。98个核苷酸ΔpsbF/ΔpsbL片段和其它四个所检测编辑位点周围序列所共有的任何明显序列基元的缺乏支持这个结论。因此，似乎这些位点的编辑可能由它们各自特有的序列和因子来指导。
关于替代缺乏位点特异性因子的另一种可能，还考虑到存在“强”编辑位点和“弱”编辑位点。因此，psbL位点可能是弱位点，且其编辑效率会由于存在过量的嵌合RNA竞争限制性的但为共有的编辑因子而降低；而其它位点可能是未受影响的强位点。根据文献中与质体中存在位点特异性编辑因子一致的数据，这种解释被认为似乎是不可能的。在菠菜质体中psbF mRNA通过将C转变为U进行编辑，将丝氨酸密码子变成保守的苯丙氨酸密码子。在烟草的该位置中，在DNA水平已存在苯丙氨酸密码子。当烟草的psbF基因被修饰成匹配菠菜序列时，虽然相邻的psbL位点在两个物种中均被编辑，但异源编辑位点未被编辑(Bock等，1994)。因此似乎烟草缺乏编辑菠菜psbFmRNA的能力，而保留对于两个物种共有的psbL位点的编辑能力。与位点特异性编辑相一致的另一种情况是rpoB mRNA的位点Ⅳ，虽然该位点附近的序列高度保守，但它在玉米中被编辑，而在大麦中不编辑。有趣的是，同一转录物中其它三个位点的编辑在这两个物种之间是保守的(Zeltz等，1993)。这些观察结果提示，可能缺乏一个单独位点的编辑能力，却不会影响其它位点的编辑能力，这支持质体中的位点特异性编辑。
实施例Ⅱ基于编辑的ΔpsbL/kan和ΔndhD/kan选择标记基因在质体中，烟草中ACG密码子编辑为AUG密码子为psbL转录物及ndhD转录物创造了翻译起始密码子。为鉴别psbL编辑所需的RNA区段，构建含有psbL缺失衍生物的嵌合卡那霉素抗性基因，并在体内体检测转基因植物中的编辑。所得数据表明，22个核苷酸的区段足以指导psbL有效编辑，并包括该编辑位点上游的16个核苷酸和下游的5个核苷酸。该编辑位点上游由核苷酸A向核苷酸C的突变完全取消了编辑，而下游由G向C的突变仅仅是降低了编辑效率。在22nt编辑靶序列中，发现上游的16个核苷酸与内源psbL转录物竞争可耗尽的反式因子。为了检测起始密码子的编辑是否涉及一个共同反式因子，在烟草质体中表达了含有ndhD编辑位点的嵌合基因。象psbL一样，ndhD位点的编辑需要一个可耗尽的反式因子。但是，ndhD的反式因子与psbL编辑所需的反式因子不同。psbL编辑位点和ndhD编辑位点需要不同的顺式序列和反式因子，这表明了质体起始密码子编辑的单独识别机制。A．详细说明顺式序列指导的psbL编辑如上文所提到的，psbL基因是psbE操纵子的一部分，psbE操纵子含有psbE、psbF、psbL及psbJ的读框(Carillo等，1986)。在较早的实施例中(Chaudhuri等，1995)，描述了含有一个98nt ΔpsbF/ΔpsbL片段的嵌合mRNA中psbL翻译起始密码子位点的编辑(图7A，质粒pSC2中-63/+34)。在图7A的嵌合构建物中，第一个可读框是含有C端40nt的截短psbF(ΔpsbF)基因。第二个可读框含有与细菌卡那霉素抗性(kan)基因在翻译水平相融合的psbLN-端36nt(ΔpsbL)，产生ΔpsbL/kan融合蛋白。这两个可读框被22nt的基因间隔区所分开，参见图7A。
为了鉴别psbL编辑所需的序列，检测了98nt ΔpsbF/ΔpsbL片段的缺失衍生物的体外编辑。象前面一样，将psbL缺失衍生物的N-端与细菌卡那霉素抗性基因(kan)相融合，并克隆进质体Prrn/Trps16表达盒中产生嵌合基因。参见图7A。这样，对于所有的构建物，ΔpsbL/kan的翻译就依赖于psbL的ACG密码子编辑为AUG密码子。因此可通过卡那霉素抗性表型检测编辑情况。唯一例外是含有-2/+34片段(在质粒pSC10中)的嵌合基因，其中ΔpsbL/kan读框的翻译起始密码子由Prrn提供。将psbL缺失衍生物通过与壮观霉素抗性选择基因相连接导入烟草质体基因组中(Chaudhuri等，1995)。
上游缺失系列包括相对于编辑位点(位置0)其5’-末端在核苷酸位置-63、-51、-39、-27、-16、-10及-2处的构建物。下游缺失系列包括相对于编辑位点，其3’-末端在核苷酸位置+34、+22、+10、+5及+1处的构建物。嵌合mRNA的编辑效率通过直接测序及对PCR扩增cDNA的phosphorimager分析测定。只要所述构建物含有7A和图B所示的相对于编辑位点的16nt上游序列和5nt下游序列，则维持缺失衍生物的编辑。有趣的是，在所述缺失系列中，被编辑的嵌合mRNA的百分比(编辑效率)不是与98nt全长ΔpsbF/ApsbL片段的(约50％-70％)相似，就是几乎检测不到(～0％)。卡那霉素抗性的表达也是所有其嵌合mRNA的翻译依赖于编辑的转化子中编辑的可靠定性标志。参见图7A。例外是用质粒pSC10转化所获得的植物，在它们中卡那霉素抗性由包含于Prrn启动子片段中的翻译起始密码子开始表达。缺失衍生物的构建描述于下。
通过用烟草(栽培品种Petif Havana)的细胞总DNA进行PCR扩增，产生psbL缺失衍生物和ndhD基因片段，5’端引物载有NcoⅠ限制性位点，3’端引物载有NheⅠ限制性位点。使用了以下引物对质粒pSC2,023和029；质粒pSC3,023和030；质粒pSC4,023和031；质粒pSC5,023和032；质粒pSC6,024和029；质粒pSC7,25和029；质粒pSC8,026和029；质粒pSC9,027和029；质粒pSC10,028和029；质粒pSC18,027和031；质粒pSC19,027和034；质粒pSC20,033和031；质粒pSC23,037和038。PCR产物用NcoⅠ和NheⅠ限制性酶消化。
为了在kan编码区的5’端引入合适的限制性位点，从pTNH32(Carrer等，1993)PCR扩增kan，所用的5’端引物(021)载有串联的NcoⅠ和NheⅠ限制性位点，而3’端引物(022)载有XbaⅠ限制性位点。将PCR产物克隆进用NcoⅠ/XbaⅠ消化的pUC120中产生了质粒pSC1。
嵌合基因的构建过程是将来自烟草psbL基因和ndhD基因(NcoⅠ/NheⅠ片段)的PCR扩增序列在N-端与缺乏起始密码子的细菌kan基因(NheⅠ/XbaⅠ片段)相融合。然后将嵌合基因克隆到用NcoⅠ/XbaⅠ消化的质粒pLAA24A中(Zoubenko等，1994)。质粒pLAA24A是质体转化载体pPRV111A的衍生物(基因库登记号U12812)，具有一个选择性壮观霉素抗性基因以及Prrn/Trps16表达盒中的一个uidA报告基因(Zoubenko等，1994)。Prrn的5’-调控区由质体rRNA操纵子启动子和一个核糖体结合位点组成，并位于SacⅠ/NcoⅠ片段上。Trps16片段包括位于ptDNA中核苷酸5,087至4,939之间的rps16基因3’-调控区(Shinozaki等，1986)，并包含在XbaⅠ/HindⅢ片段中。用NcoⅠ/XbaⅠ限制性酶消化质粒pLAA24A可从表达盒中除去uidA编码区，然后用嵌合构建物(也是一个NcoⅠ/XbaⅠ片段)取代之。
为了构建以下实施例中的嵌合基因，采用了以下方法。按实施例Ⅰ的描述进行质体转化和植株再生。也按以上实施例Ⅰ的描述进行PCR扩增和DNA测序。对测序凝胶进行phosphorimager分析(MolecularDynasmics)以定量测定编辑效率。测定了与核苷酸相应的条带的放射性。相对于相同泳道中其它条带的样本，将上样样品及标记效率的数值归一化。mRNA编辑效率(％)=[正确的编辑信号/(正确编辑信号+正确的未编辑信号)]×100。所采用的引物列于如下01: 5’-CAATATCAGCAATGCAGTTCATCC-3’04: 5’-CACGACGAGATCCTCGCCG-3’05: 5’-GAATAGCCTCTCCACCCA-3’06: 5’-GGAATCCTTCCAGTAGTATCGGCC-3’07: 5’-GGAAAATAAAACAGCAAGTAC-3’017: 5’-AATTCGAAGCGCTTGGATACAGTTGTAGGGA-3’018: 5’-GTAAGAGATGTGAATCCGCCTGT-3’019: 5’-GCATAAGTCGTTAGAAGGAG-3’020: 5’-GAAGAAAGAAAATTAAGGAACC-3’021: 5’-CATGCCATGGCTAGCATTGAACAAGATGGATTGCACG-3’022: 5’-GTACTCTAGACCCGCTCAGAAGAACTCG-3’023: 5’-CTAGCCATGGCTTTGGGATCAATATCAGCAATG-3’024: 5’-CTAGCCATGGCATCAGCAATGCAGTTCATCC-3’025: 5’-CTAGCCATGGCGTTCATCCAACGATAAACTTAA-3’026: 5’-CTAGCCATGGCATAAACTTAATCCGAATTATAGAG-3’027: 5’-CTAGCCATGGCCGAATTATAGAGCTACGACAC-3’028: 5’-CTAGCCATGGCTACGACACAATCAAACCCGA-3’029: 5’-CTAGCTAGCTTCAACATTTTGTTCGTTCGG-3’030: 5’-CTAGCTAGCTTCGTTCGGGTTTGATTGTG-3’031: 5’-CTAGCTAGCTGATTGTGTCGTAGCTCTATA-3’032: 5’-CTAGCTAGCCGTAGCTCTATAATTCGGATT-3’033: 5’-CTAGCCATGGTATAGAGCTACGACAC-3’034: 5’-CTAGCTAGCAAGTGTCGTAGCTCTATA-3’035: 5’-AATTATAGAGCTCCGACACAATC-3’036: 5’-AATTATAGAGCTACCACACAATC-3’037: 5’-CTAGCCATGGTATTTTGAGCACGGGTTTTTCTGGTCC-3’038: 5’-CTAGCTAGCTGGAAAAACTACAATTATTGTTAACC-3’B．psbl编辑位点侧翼核苷酸的突变将充分编辑的98nt ΔpsbF/ΔpsbL片段中的被编辑密码子ACG变为CCG和ACC，以便论述以下问题(1)侧翼核苷酸对于编辑是否很重要；(2)当其中一个侧翼核苷酸变为C时，是否还保持编辑正确C的保真度；(3)在此位点起始翻译是否是编辑所需要的，因为将密码子ACG变为CCG和ACC会消除在被编辑密码子处起始翻译的可能性。
上游核苷酸的突变(ACG变为CCG；NtpSC14系)导致编辑的丧失(～0％)。参见图8。下游核苷酸的突变(ACG变为ACC；Nt-pSC15系)允许在正确C处的编辑，但编辑效率明显下降，为～20％，参见图8。因此突变分析表明，直接位于被编辑C上游的残基A看起来对于编辑是必需的，而下游残基G向C的突变与编辑相容，但却为最佳编辑效率所需的。另外，在突变密码子ACC中正确C的编辑指出在编辑位点的选择中的编辑器的高度保真机制。还有，ACC密码子的编辑提示在此密码子处的翻译起始不是编辑所需要的。按照A部分中对ΔpsbL/kan衍生物的描述进行嵌合基因的构建并导入植物。
有一个点突变的psbL衍生物通过大引物PCR方法获得(Sarker和Sommer,1990)，所用模板为质粒pSC2。也将它们设计为NcoⅠ和NheⅠ片段。所用引物如下对于质粒pSC14，第一步骤为035和029，第二步骤为023；对于质粒pSC15，步骤Ⅰ为036和029，步骤Ⅱ为023。C．与psbL特异性编辑因子(psbL-SEF)相互作用的psbL mRND序列的鉴定在前面的实施例中已阐明，内源psbL转录物的编辑效率在表达嵌合psbL mRNA的质体中有所下降。编辑效率的下降可归咎于98ntΔpsbF/ΔpsbL片段与内源psbL mRNA对存在量有限的位点特异性编辑因子(psbL-SEF)的竞争(Chaudhuri等，1995)。
测定表达嵌合ΔpsbF/ΔpsbL缺失衍生物的质体中psbL的编辑效率(示于图7)，用来进一步限定与psbL-SEF相互作用的psbL序列。在编辑最低限度所需的22个核苷酸中，只有编辑位点的上游区段能够与内源psbL竞争psbL-SEF。22nt psbL编辑识别序列中的16nt psbL-SEF结合位点(框注)在图9A显示。位于核苷酸-16/-10之间的序列对于竞争很重要，因为含缺乏这段序列的pSC20构建物的质体中，竞争被消除了，参见图9B。有趣的是，表达于位置-1A突变为C的pSC14构建物的植物仍保留竞争，虽然这种突变完全消除了编辑。重要构建物的psbL编辑效率数据示于图9A和9B。虽然在野生型植物中99％以上的psbL mRNA被编辑，但转基因系中的竞争导致未编辑的psbL转录物明显累积。
D．嵌合mRNA中ndhD起始密码子的编辑Neckermann等(1994)已经确定了对ndhD和相应cDNA的序列分析，在烟草、菠菜和金鱼草中，ndhD的翻译起始密码子通过将密码子ACG编辑为AUG而形成。设计以下实验的目的在于检测ndhD的编辑是否象psbL一样，需要一个可耗尽的反式因子，并检测这个反式因子是否被用于两个起始密码子位点的编辑。为达到目的，将包括ndhD编辑位点在内的89个核苷酸的片段(-48/+40)与kan编辑区在翻译水平相融合，并将其克隆进Prrn/Trps16表达盒中，参见图10A和10B。通过把从烟草ndhD基因(NcoⅠ/NheⅠ片段)PCR扩增的序列在N-端与缺少起始密码子的细菌kan基因(NheⅠ/XbaⅠ片段)相融合，构建嵌合基因。关于该嵌合基因构建过程的详细描述参见实施例Ⅱ的A部分。将该嵌合基因通过与壮观霉素抗性基因相连接导入烟草质体基因组。在该嵌合基因中，ΔndhD/kan融合蛋白的表达依赖于ndhD位点的编辑。为防止从上游的AUG处翻译，在该编辑位点上游26nt处引入由A变为C的点突变，如图10A中下划线部分所示。
表达ΔndhD/kan蛋白的Nt-pSC23植物对卡那霉素有抗性，这表明ndhD位点被编辑。对ndhD/kan的PCR扩增产物进行的直接测序结果发现编辑效率很低(～7％)，如图10C所示。野生型植物中的ndhD转录物以明显较高的效率(～45％)被编辑，而在Nt-pSC23植物中编辑效率降至～20％，参见图10C。转基因植物中内源ndhD转录物编辑效率的下降表明，提高对ndhD编辑的需求导致存在数量有限的编辑因子的耗尽。但是，转基因Nt-pSC23植物中psbL转录物的编辑效率可与野生型的水平相当，为＞99％，如图10C所示。由于Nt-pSC23植物中psbL的编辑未受影响，所耗尽的编辑因子是ndhD特异性的，并且不是psbL编辑所需要的。
还检查了表达与98nt ΔpsbF/ΔpsbL片段Nt-pSC2融合的嵌合kan基因的植物中ndhD的编辑，参见图7。已表明在这种植物中，内源psbL mRNA编辑的下降归因于psbL-SEF的竞争(Chaudhuri等，1995；图10C)。但是，在相同植物中内源ndhD的编辑未受影响，参见图10C，这表明ndhD位点的编辑不涉及psbL-SEF。讨论以上实施例描述对质体中mRNA编辑的顺式元件需求的分析。数据表明psbL mRNA中C向U的转变由一个22个核苷酸的序列指导，该序列包括在位置0处被编辑C上游的16nt和下游5nt)。这22nt序列在烟草、菠菜(Kudla等，1992)和钟形辣椒(bell pepper)(Kuntz等，1992)中是保守的，已有关于这些物种中psbL翻译起始密码子编辑的报道。
直接在该编辑位点两侧的核苷酸的作用通过在有效编辑的98ntΔpsbF/ΔpsbL片段中使它们发生突变来进行检测。使在-1位置处上游的A变为C完全消除了正确C的编辑。但是，在位置+Ⅰ使G变为C却允许正确C的编辑，尽管效率降低。突变ACC密码子中正确C的编辑说明编辑的核苷酸选择的高度保真性。这与所观察到的特异性核苷酸C在C侧翼序列中被编辑的情况相一致(Kossel等，1993；Maier等，1995)。另外，ACC密码子的编辑提示，编辑的发生并不需要翻译起始，从而为在翻译和编辑之间缺乏联系提供了直接证据。这个发现与缺少核糖体的质体中的mRNA编辑(Zeltz等，1993)以及不能翻译的未剪接质体mRNA的编辑(Freyer等，1993)的情况相一致。
psbL翻译起始密码子仅仅是在高等植物质体中所发现的大约25个编辑位点之一(Maier等，1995)。需要进行进一步研究以确定顺式序列的密切接近对于在质体中所发现的psbL编辑位点有多么典型。在这方面，ndhD起始密码子似乎是类似的，因为编辑所需要的全部信息都包括在一个相对小(98nt)的RNA区段中。但是，烟草ndhB基因中位点Ⅱ和位点Ⅲ的编辑(Maier等，1992)需要的序列比150核苷酸更远(S.C.和P.M.，尚未发表)。因此，顺式序列编辑的定位并非一致，与提议的大约25个质体编辑位点中每个均有单独的识别机制一致。
编辑位点的单独识别与这种发现相一致即psbL和ndhD靶RNA的过度表达耗尽位点特异性反式因子。尽管两种转录物中ACG编辑为AUG均产生翻译起始密码子，但其中一个靶RNA的过度表达只影向到源mRNA的编辑效率。
如植物线粒体所显示的(Yu和Schuster,1995)，似乎质体中C向U的编辑涉及到胞苷脱氨作用。因此编辑最低限度地涉及或者是含有位点特异性识别域和脱氨酶域的单个多肽，或者是含有至少两种组分的复合物，一种组分提供位点特异性识别，而另一种具有胞苷脱氨酶活性。这种由胞苷脱氨酶(APOBEC-1)和辅助蛋白组成的多组分复合物已被阐明参与哺乳类核中载脂蛋白BmRNA的C向U的编辑。除普遍发生的C向U编辑外，编辑位点附近顺式序列的紧密群集是质粒psbL和哺乳类核中载脂蛋白B编辑系统所共享的又一特征。载脂蛋白B的编辑由位于编辑位点下游4个核苷酸处的11个核苷酸识别序列指导。另外，上游序列是有效编辑所需的(Innerarity等的综述，1996)。但是，与psbL的编辑相反，载脂蛋白B编辑过程的识别特异性较松，因为导入到被编辑核苷酸邻侧的胞嘧啶也可以被修饰(Chen等，1990)。
实施例Ⅲ基于编辑的ΔrpL2/kan选择标记基因通过把从玉米rpl2基因的PCR扩增序列(NcoⅠ/NheⅠ片段；5’引物为CTAGCCATGGAAACGAACTAAAGGAGAATAC-3’；3’引物为5’-CTAGCTAGCCGGGATAGGTGTTTTGTATAAA-3’)在N-端与缺乏起始密码子的细菌kan基因(NheⅠ/XbaⅠ片段)融合，构建嵌合Δrpl2/kan基因。参见图11A和11B。然后按ΔpsbL/kan基因的构建所述，将嵌合基因克隆进用NcoⅠ/XbaⅠ消化的质粒pLAA24A(Zoukenko等，1994)中，并将其导入烟草质体基因组中(Chaudhuri和Maliga,1996)。嵌合mRNA在烟草质体中转录。在烟草中，未发现玉米rpl2翻译起始密码子的编辑。同时转化植物对卡那霉素也敏感。但是，这种嵌合基因的编辑将会在水稻、玉米以及其它禾谷类中发生，在这些禾谷类中rpl2翻译起始密码子通过编辑而产生。
实施例Ⅳ内部编辑位点向编辑的翻译起始密码子的转变在psbL、ndhD和rpl2质体mRNA中，翻译起始密码子通过由密码子ACG转变为AUG而产生。psbL(Kudla等，1992)及ndhD(Neckermann等，1994)编辑位点存在于少数双子叶植物种中，而非存在于所有双子叶植物种中，而rpl2位点却在大多数但不是所有禾谷类中被编辑(Hoch等，1991)。玉米的rpl2位点在烟草中不被编辑(Chauduri和Maliga，参见实施例Ⅲ)。因此，psbL和ndhD编辑位点对于在一些双子叶植物中产生基于编辑的标记基因有用，而基于rpl2的嵌合基因在大多数单子叶植物中有用。
对于内部密码子的编辑有着比翻译起始密码子的编辑更多的例子。但是，在psbL序列的邻近序列中密码子的编辑不需要翻译起始(Chaudhuri和Maliga,1996)。基于这些结果，只要编辑产生可翻译的mRNA，内部密码子也可以用作翻译起始密码子。Ser变为Phe、Ser变为Leu和Pro变为Leu的频率高，而Thr变为(F)Met的程度较低。假定在第一个核苷酸位置处U和A相对频繁，那么既使第一个核苷酸变为A，在大多数编辑邻近序列中还会保持UCG密码子的编辑，产生的密码子可通过C向U转变而被编辑成翻译起始密码子。这种诱变的好的候选者是rpoB mRNA的编辑位点Ⅰ和Ⅱ，在双子叶和单子叶植物中这两个位点被广泛编辑(Zeltz等，1993)。
指导编辑所需的RNA序列可以象psbL基因的情况一样，包含在与编辑位点相邻的短区段之中，或象ndhB基因的位点Ⅱ和位点Ⅲ的情况一样位于较远的位置(Chaudhuri和Maliga,1996)。在ndhB以及rpoB小基因中已经检测了编辑情况，以便鉴别对嵌合基因的构建有用的编辑位点。
已鉴别了ndhB和rpoB的编辑位点，与它们相关的顺式序列位于一个短区段中。这些短基因区段已被包括在嵌合基因中，在烟草质体中表达，并通过对PCR扩增的转基因cDNA直接测序来测定编辑。源基因中的编辑位点列于表Ⅳ。ndhB和rpoB小基因衍生物的图谱示于图12。
表ⅣndhB和rpoB小基因中的RNA编辑编辑位点密码编号 密码子(氨基酸)参考文献未编辑/已编辑rpoB位点Ⅰ 158aTCG(Ser)变为TTG(Leu) Zeltz等，1993rpoB位点Ⅱ 184 TCA(Ser)变为TTA(Leu) Zeltz等，1993ndhB位点Ⅰ 156 CCA(Pro)变为CTA(Leu) Maier等，1992ndhB位点Ⅱ 196 CAT(His)变为TAT(Tyr) Maier等，1992ndhB位点Ⅲ 204 TCA(Ser)变为TTA(Leu) Maier等，1992ndhB位点Ⅳ 246 CCA(Pro)变为CTA(Leu) Maier等，1992ndhB位点Ⅹ 249 TCT(Ser)变为TTT(Phe) Kossel.H(私人通讯)a在烟草中，TCA密码子被编辑成TTA密码子(Chaudhuri等，1995)。
ndhB小基因含有大小为369个核苷酸的ndhB片段(位于质体基因组的核苷酸143,174和144,042之间，Shinozaki等，1986)。它含有一些包括五个编辑位点在内的第一外显子序列，所述编辑位点命名为位点Ⅰ、位点Ⅱ、位点Ⅲ、位点Ⅳ和位点Ⅹ。位点Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ在玉米、水稻和烟草中被编辑(Maier等，1992)。因此，基于这些位点编辑的标记基因在包括单子叶和双子叶植物在内的广范围作物中将会有用。位点Ⅹ只在烟草中被编辑(Kossel.H.，私人通讯)，因此这个位点对于嵌合标记基因构建的用处较小。
在ndhB小基因中，截短的编码区在位于Prrn-Trps16盒中的原始读框中表达。方法是在截短读框的5’末端引入一个NcoⅠ位点，它包括翻译起始密码子(CCATGG)，由此小基因的RNA能够从包含在表达盒中的翻译信号开始翻译。该小基因含有翻译起始密码子下游的DNA序列ATGGCAGCTACT；位于位置5的核苷酸C对应于质体基因组中的核苷酸143,674。另外，在PCR扩增过程中，在截短编码区的3’末端引入了一个框内终止密码子。(5’端PCR引物为5’-CTAGCCATGGCAGCTACTCTAGGGGGAATG-3’；3’端PCR引物为5’-CTAGTCTAGACGTATACGTCAGGAGTCCA-3’)。用物理方法将小基因与适合的质体导向载体中的选择性壮观霉素抗性基因(aadA)连接，并通过生物发射过程将载体DNA导入烟草叶片叶绿体中。通过在壮观霉素培养基上培养受轰击的叶片片段，有所选择地扩增具有整合连接转基因的转质体基因组，转基因苗可在壮观霉素培养基上直接再生。质体转化方案在Svab和Maliga,1993以及Zoubenko等，1994的文章中已有所描述。
在五个位点之中，位点Ⅰ、Ⅳ和Ⅹ在小基因中高度编辑。这个发现表明，编辑所需的顺式序列位于与编辑位点相对较近的位置，这就象所描述的psbL翻译起始密码子的情况一样(Chaudhuri和Maliga,1996)。另外，位点Ⅰ和位点Ⅳ的顺式序列适合于包含在标记基因中用于双子叶和单子叶植物，因为这些广泛分化的分类群体中存在着编辑能力。有趣的是，ndhB的位点Ⅰ和位点Ⅲ未在小基因中编辑，这表明编辑所需的顺式序列距该编辑位点+/-150核苷酸以上。因此，编辑所需的顺式序列相对于编辑位点的定位并不是一致的。
rpoB小基因含有rpoB基因的一个281核苷酸片段，编码RNA聚合酶的β-亚基。该片段含有两个编辑位点(位点Ⅰ和位点Ⅱ，参见表Ⅳ和图12；基于Zeltz等，1993)。两个位点均存在于玉米、水稻、大麦、菠菜和烟草中(Maier等，1992)。按所描述用于ndhB小基因的方法构建rpoB小基因并将其导入质体中。该小基因含有位于翻译起始密码子下游的DNA序列ATGGTCCCGGT；位置4的核苷酸G对应于质体基因组中核苷酸27120的互补物(Zhinozaki等，1986)。构建小基因的rpoB片段通过PCR扩增获得(5’端PCR引物为5’-CTAGCCATGGGTCCCGGTATTTATTACCG-3’；3’端PCR引物为5’-CTAGGTCGACTTAGGCATTTTCTTTTGACCCAAT-3’)。获得了代表几个独立转化系的转基因植物并分析其编辑情况。通过对PCR扩增的CDNA测序，发现在小基因中两个位点被完全编辑。已知这些位点在单子叶和双子叶植物中都存在，以这些位点中任何一个的编辑为基础的标记基因应该能够应用于种类繁多的作物中。
实施例Ⅴ用于外源基因表达的组织特异性调节的RNA编辑讨论了质体中RNA编辑，假定编辑是组成型的，并且在所有组织类型中均促进标记基因的表达。但是，人们已知环境和发育条件明显影响编辑效率(Bock等，1993；Hirose等，1996)。编辑效率的组织特异性差异有利于嵌合基因的设计，嵌合基因的翻译依赖于组织类型，因为ACG密码子转变为翻译起始密码子是组织特异性的。当希望一个有经济价值的蛋白(例如杀昆虫内毒素)仅仅在特定的组织类型(如叶片、根毛、根皮或表皮细胞)中累积时，这样的嵌合基因有用途。
或者，所期望的有经济价值基因的组织特异性表达可以在组织特异性编辑产生一个翻译终止密码子时获得。通过编辑形成终止密码子的简易方法是质体中的工程化操作。例如，在改变psbL编辑位点的读框时在质体中产生终止密码子。通常，psbL翻译起始密码子可通过将ACGA序列中的C转变为U而产生。将读框移动一个核苷酸，通过编辑就可以产生TGA终止密码子。密码子中第一个核苷酸C的编辑也有所知，如ndhB转录物的位点Ⅱ(Maier等，1992)。因此，CAA密码子中C向U的编辑将产生TAA翻译终止密码子。
大多数质体基因以多顺反子转录单位构成。因此，可建立多顺反子转录单位用于多个蛋白的同时表达。一个双顺反子转录单位(由此同时表达两种蛋白质)的例子是通过工程化操作质体基因组而获得(Staub和Maliga,1995)。可通过使翻译依赖于RNA编辑、或者产生翻译起始密码子，或者终止翻译的途径，获得这种多顺反子mRNA的组织特异性表达。参考文献1．Araya,A.,Domec,C,Begu,D和Litvak,J.(1992)用小麦线粒体提取物进行ATP合酶亚基mRNA编辑的体外系统。Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89,1040-1044。
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虽然以上描述并具体列举了一些本发明的优选实施方案，但目的并不在于将本发明局限在这些实施方案上。可进行各种修改，而不偏离如以下权利要求中所提出本发明范围和精神。
权利要求
1．适用于筛选质体转化子的重组嵌合DNA构建物，它含有与选择标记基因的编辑区在翻译水平相融合的被编辑的质体基因区段，所述选择标记基因在所述质体基因区段的RNA编辑之后可表达。
2．包含权利要求1的构建物的载体，它含有质体定向转化所必需的同源DNA序列。
3．权利要求1的DNA构建物，其中所述的被编辑质体基因区段选自psbL、ndhD、rpoB、ndhB或rpl2。
4．权利要求1中的DNA构建物，其中所述的选择标记基因选自kan基因、aaaD基因或任何其它如表Ⅰ所列的选择标记基因。
5．权利要求1的嵌合DNA构建物，包括ΔpsbL/kan。
6．权利要求1的嵌合DNA构建物，包括ΔpsbL/aadA。
7．权利要求1的嵌合DNA构建物，包括ΔndhD/kan。
8．权利要求1的嵌合DNA构建物，包括Δrpl2/kan。
9．嵌合DNA构建物，包含在选择标记基因上游克隆的、选自ndhB位点Ⅰ、Ⅳ或Ⅴ的编辑区段。
10．嵌合DNA构建物，包含在选择标记基因上游克隆的、选自rpoB位点Ⅰ或Ⅱ的编辑区段。
11．筛选转质体基因组系的方法，包括a)用含有与选择标记基因编码区在翻译水平融合的被编辑基因区段的DNA构建物在样品中转化质体，所述选择标记基因在所述基因区段的RNA编辑之后可表达；b)在含有可促进转化质体鉴别的筛选剂的培养基中培养所述样品；c)筛选并繁殖表达所述选择标记的细胞；并d)从表达所述选择标记的所述细胞再生植株。
12．权利要求11的方法，其中将所述嵌合DNA构建物加入含有质体定向转化所必需的同源DNA序列的载体中。
13．权利要求12的方法，其中所述载体还包括有益增强所述再生植物表型的外源目的基因。
14．权利要求13的方法，其中所述编辑区段以组织特异性方式被编辑，使得所述外源目的基因以组织特异性方式表达。
15．权利要求13的方法，应用于双子叶或单子叶植物。
全文摘要
公开了在高等植物中筛选质体转化子的DNA构建物。也公开了基于编辑的选择标记基因,它们需要在转录水平上进行编辑以表达选择标记基因。包含这种与选择标记基因操作性相连的被编辑上游序列,促进高等植物中质体转化子的分离而非核转化子的分离。
文档编号C07K14/415GK1231702SQ97197144
公开日1999年10月13日 申请日期1997年6月13日 优先权日1996年6月14日
发明者P·马利加, H·卡雷尔, S·肖杜里 申请人:新泽西州州立大学(拉特格斯)