转录沉默元件及其结合因子的制作方法

专利名称：转录沉默元件及其结合因子的制作方法
根据联邦赞助研究的陈述本发明部分由政府基金支持进行，因此政府对所述发明具有一定的权利。
背景技术：
本申请涉及核苷酸调节序列及其结合因子。
植物进化出一系列各异的保护机制以抵御各种各样的致病生物。引起一系列保守防御反应的受体识别病原体衍生的信号，诸如诱出物(elicitins)、harpins、真菌细胞壁片段、无毒(avr)基因产物及avr基因产物特化的代谢物。这些信号的感受诱导蛋白质磷酸化变化，人们认为这影响了各种各样的防御反应。这样的防御反应包括细胞壁木质化、诱导诸如那些编码壳多糖酶和葡聚糖酶的致病相关(PR)基因、产生抗微生物植物病毒素、诱导系统获得抗病性以及产生参与细胞壁蛋白交联的活性氧类和诱导编程性细胞死亡。这些反应有助于抑制所述植物宿主中病原体的生长和扩散。
这些防御反应中的许多依赖于对合适信号反应的特定基因的转录诱导。例如，当病原体攻击或不同的病原体因子诱导(elicit)诸如烟草和土豆的茄科植物时，发生主要的代谢转变，其中抑制固醇产生和诱导倍半萜植物抗毒素合成。倍半萜植物抗毒素生物合成特有的第一步是借助于酶环化类异戊二烯中间体FPP，所述酶从种属上称为倍半萜环化酶。在烟草中，所述倍半萜环化酶5-表-马兜铃烯(aristolochene)合酶(EAS)产生5-表-马兜铃烯，接着加入两个羟基产生壳体二醇(capsidiol)。所述类异戊二烯生物合成途径的固醇特异支路也从中间体FPP延伸出来。固醇生物合成的衰变与角鲨烯合酶活性的抑制和倍半萜环化酶活性诱导的倍半萜生物合成诱导有关。因为这两种酶处于所述途径中一般认定的分支点的位置上，所以认为所述一种酶的诱导和所述另一种酶的抑制是控制碳流动的一种重要机制，并因此形成最终产物。
发明概述概括而言，本发明描述了包括类异戊二烯合酶基因沉默调节元件的分离核酸序列的特征。最好是，这个分离核酸序列包括序列5′NTACNNTACN3′(其中N为A、T、G或C)(SEQ ID NO:1)；例如，5′CTACAGTACT3′(SEQ ID NO:2)。在最佳实施方案中，本发明的核酸包括5′TCTACAGTACT3′(SEQ ID NO:3)或5′ACTCTACAGTACTC3′(SEQ IDNO:4)序列。在其它最佳方案中，所述类异戊二烯合酶是倍半萜合酶(例如，表-5-马兜铃烯合酶(EAS))。
在最佳实施方案中，所述核酸序列来自双子叶植物(例如一种所述茄科植物，诸如烟草)。在其它最佳实施方案中，所述核酸序列来自单子叶植物、裸子植物或松柏类植物。
在相关方面，本发明描述了包含类异戊二烯合酶基因沉默调节元件的载体或转基因植物(或其种子或其植物细胞)的特征。一般而言，包含本发明沉默元件的载体降低或消除了操作性地连接的核苷酸序列在含有载体的细胞(例如，转基因植物细胞)内的表达。
在另一方面，本发明描述了减少转基因植物中DNA序列转录的方法。这个方法包括下述步骤(a)提供包含所述类异戊二烯合酶基因沉默调节元件的核酸的转基因植物细胞，所述调节元件处于减少DNA序列转录的位置并整合到转基因植物细胞的基因组中；及(b)由所述转基因植物细胞培养所述转基因植物。
在另一方面，本发明描述了与类异戊二烯合酶基因沉默调节元件结合的因子，例如多肽。
所述“基因沉默调节元件”是指能够负调节基因产物表达的核酸序列。这种沉默元件起降低或消除所述基因表达的作用。基因沉默调节元件的抑制作用引起所述基因表达的激活，例如本文所述的EAS4基因启动子的转录。一般来说，基因沉默调节元件位于基因的5′区，例如位于所述启动子区。多拷贝的这种基因沉默元件也可以用来降低或消除基因表达。
所述“处于减少DNA序列转录的位置”是指沉默调节元件位于减少或消除基因表达的位置，所述基因表达是处于这种调节元件的控制之下。一般来说，这种沉默元件足以赋子细胞或组织特异性基因表达或由外部信号或介质诱导的基因表达的依赖于启动子的可控基因表达；这种元件可能位于基因的5′或3′区。另外，减少或抑制转录的沉默元件的位置与其方向和距转录起始位点的距离都无关。一般来说，本发明的沉默元件至少减少基因表达转录10％。与不包含沉默元件的转录调节区相比，优选至少减少所述转录20％，更优选至少减少40％，而最优选至少减少90％。
所述“从基因获得”是指调节元件的核苷酸序列是以序列信息为基础，所述序列信息包括天然存在的植物基因(例如烟草的EAS4启动子区)。一旦鉴定出所述沉默调节元件，就可以从自然资源中获得根据本发明的沉默调节元件，或者可以按照任何标准方法(例如，通过重组方法或化学合成)制备。
所述“类异戊二烯合酶基因”是指编码下述多肽的基因，所述多肽能够催化涉及形成二磷酸烯丙酯底物(例如，二磷酸C10、C15或C20烯丙酯底物)分子内的C-C键产生类异戊二烯产物(例如，单萜、双萜、倍半萜或固醇产物)的反应。这种类异戊二烯合酶基因的例子包括但不限于单萜合酶(例如柠檬烯合酶)、双萜合酶(例如，casbene合酶)及倍半萜合酶(例如，5-表-马兜铃烯合酶、vetispiradiene合酶及杜松烯合酶)，它们分别引起二磷酸香叶酯(GPP)、二磷酸香叶基香叶酯(GGPP)、二磷酸金合欢酯(FPP)的环化。
所述“表-5-马兜铃烯合酶”或“EAS”是指能够催化二磷酸反，反-金合欢酯环化形成双环中间体表-5-马兜铃烯的酶。
所述“操作性地连接”是指类异戊二烯合酶基因沉默调节元件和植物转录调节区以这样一种方式连接，以便当合适的分子(例如转录蛋白)和所述沉默调节序列结合在一起时，降低或消除基因表达。
所述“多肽”是指任何氨基酸链，与长度或翻译后修饰(例如糖基化或磷酸化)无关。
所述“转化植物细胞”是指利用重组DNA技术(例如本文所述的那些技术)引入重组核苷酸序列(例如所述EAS4启动子)的细胞(或其祖先)。
所述“植物细胞”是指由半透膜定界的并含有质体的任何自身繁殖细胞。如果需要进一步的增殖，这个细胞也需要细胞壁。本文所用的植物细胞包括但不限于藻类、蓝细菌、种子、悬浮培养物、胚、分生组织区、愈伤组织、叶、根、苗、配子体、孢子体、花粉和小孢子。
所述“转基因的”是指包含DNA序列的任何细胞，所述DNA序列由人工插入细胞并成为由该细胞发育的生物基因组的一部分。本文所用的转基因生物一般是转基因植物，并且所述DNA由人工插入到所述生物的基因组中。
所述“分离的DNA”是指无下述序列的DNA，所述序列在衍生本发明DNA的生物天然存在的基因组中位于所述DNA的侧翼。因此所述术语包括诸如掺入到载体、自主复制型质粒或病毒、或者原核或真核生物基因组DNA中的重组DNA沉默调节元件；或作为独立于其它序列的分离分子(例如在启动子区内)存在的重组DNA沉默调节元件。它也包括作为编码多肽序列的杂种基因部分的重组DNA调节元件。
从下述的其最佳实施方案的描述及权利要求书中可明显地看出本发明其它的特点和优点。
详细描述首先解释附图。附1A是一示意图，显示了所述EAS4启动子区图谱。用小箭头和具有A-E字母符号的线段表示用于克隆和产生不同探针和竞争者的聚合酶链式反应(PCR)引物的位置。在图右侧的大箭头代表所述EAS4的开放读框。带有+1符号的弯曲箭头表示所述EAS4转录起始位点(如SEQ ID NO:5中描述的位置1299(5′GTA+1G3′))；及在C片段内包围的实心垂直的矩形表示所述TAC框的位置。


图1B是一组照片，显示在由对照细胞和诱出剂(elicitor)处理细胞制备的细胞核和全细胞提取物存在的情况下，使用A、E和B片段的电泳迁移率变动分析(EMSA)的结果。结合试样包括1微克dI-dC、1毫微克放射性标记的DNA探针和2毫微克蛋白提取物。由对照细胞(标明C)或用纤维素酶诱导3小时的细胞(标明E)制备细胞核(标明nuc)和全细胞(标明wce)提取物。
图1C是一张照片，显示在由对照细胞和诱出剂处理细胞制备的细胞核(标明nuc)和全细胞(标明wce)提取物存在的情况下温育的D片段的电泳迁移率变动分析的结果。接图1B所述进行测定，除了在这些测定中包括超出50倍摩尔浓度的野生型D片段或包含突变M2(见图2B中图解说明)的D片段作为特异竞争者的片段。
图2A是一组照片，说明了在所述EAS4启动子中主要蛋白结合位点的鉴定。用在编码或非编码链的5′末端标记的C片段进行甲基化干扰(M.I.)和DNaseⅠ(DNase)足迹法分析。星号表示干扰蛋白提取物结合的鸟嘌呤碱基甲基化的位置。实线确定了免受DNaseⅠ切割的局部受保护的区域。泳道标记符号说明如下G指鸟嘌呤特异性切割反应；F指电泳迁移率变动分析(EMSA)后游离的(未结合的)DNA；C指与对照细胞核提取物结合的DNA；和E指与来自诱出剂处理细胞的细胞核提取物中的蛋白结合的DNA。
图2B说明了WT-TAC框和M2-TAC框的核苷酸序列。在WT-TAC框中有下划线的序列表示重复TAC框，而星号表示干扰蛋白结合的鸟嘌呤甲基化的位置，在M2-TAC框中的方框内的核苷酸表示用定点诱变突变的核苷酸。
图3A是EMSA的照片，所述EMSA是用由对照细胞(泳道2、6和7)或用诱出剂处理1.5小时(泳道3、8和9)、3小时(泳道4、10和11)或12小时(泳道5、12和13)的细胞制备的提取物进行的。用碱性磷酸酶测定缓冲液稀释蛋白至1微克/微升，然后立即加入到结合反应复合物中(泳道2-6)；或在没有(泳道6、8、10和12)或有(泳道7、9、11和13)碱性磷酸酶的情况下，于37℃温育45分钟后加入。在总体积为10微升的EMSA结合反应物中含有0.5皮摩尔TAC框双链寡核苷酸探针、2皮克聚dI-dC和2微克蛋白提取物。在图3A-3C中只显示了包含所述蛋白质-DNA复合物的部分凝胶。
图3B是一组照片，显示了使用由对照全细胞提取物制备的蛋白提取物的EMSA，用补加了MgCl2或EDTA的结合缓冲液将所述对照全细胞提取物稀释至1微克/微升，并立即加入到结合试样中(泳道1-4)；或于37℃温育45分钟后加入到所述结合试样中(泳道5-8)。
图3C是一张照片，显示了使用全细胞提取物的EMSA，制备所述全细胞提取物的细胞是在加入(泳道8)或不加入MgCl2(泳道1-7、9-11)或EDTA(泳道10、11)的情况下诱出剂处理3小时，并在加入结合反应之前于37℃温育不同的时间。用于泳道9的提取物首先不加入MgCl2温育30分钟。
图4A是一张照片，说明了从DNA亲和层析组分获得的不同组分的EMSA。在每一泳道上加入10微升结合试样，所述10微升结合试样包括1毫微克C片段探针(图1A)和2微克蛋白样品。标记“E-3 hr”的泳道指由诱出剂处理3小时的细胞制备的上柱蛋白样品；第1批和第2批指顺序加工的两个相同的样品；而第3批指流通液(flow through)(FT1和FT2)和低盐(0.1M KCl)流洗液合并并再次上柱，以提取另外的结合活性的组合物。在所述最后3条泳道中，将蛋白样品稀释10倍(0.1X)或蛋白样品中有加入到结合试样中的0.5微克dI-dC。星号指混合并透析产生E-DAC标记的制品的组分，然后超滤所述E-DAC标记的制品产生标记E-DAC-UF的制品。
图4B是一张照片，说明了在Mono-S快速蛋白液相层析(FPLC)过程中获得的不同组分的EMSA分析。除了使用两微升每一组分的10倍稀释液，如上所述进行结合测定。E-DAC-UF指上凝胶的样品，而数字对应于从所述柱子获得1毫升组分。星号指混合并透析产生标记E-FPLC的制品的组分，然后超滤标记E-FPLC的制品产生E-FPLC-UF制品。
图5是一张不同TBBF制品的SDS-PAGE分析照片。泳道1，对照全细胞提取物；泳道2,C-DAC-UF；泳道3,C-FPLC-UF；泳道4,C-核酸酶；泳道5,E-全细胞提取物；泳道6,E-DAC-US；泳道7,E-FPLC-UF；及泳道8,E-nuc。
图6A是一张使用纯化的TBBF制品的DNaseⅠ足迹法分析照片。
图6B是一幅图，表示在不同非特异性DNA存在的情况下，与TAC框探针结合的TBBF的量。
图7A是一示意图，显示了在EAS4启动子GUS基因融合物中野生型TAC框元件(WT-TAC框)和突变TAC框元件(M2-TAC框)的位置。
图7B是一幅图，显示了转基因植物中的GUS活性的对比，所述转基因植物包含用诱导物处理的所述野生型TAC框元件(WT-TAC框)和所述突变TAC框元件(M2-TAC框)。用包含或者所述野生型或者突变TAC框的EAS4-266至+73区控制下的GUS基因转化烟草植物。用水或所述诱出剂隐配基(cryptogein)(1μg/ml)浸润F1子代叶，从所述浸润区域提取蛋白质，并测定GUS活性。每对条块(对照和诱出剂)代表独立转基因系。每一条块的高度代表至少3株植株的平均体积。
现有下述分析的描述，所述分析分析识别标记EAS4的5-表-马兜铃烯合酶基因启动子区特定序列的DNA结合活性。通过足迹法鉴定一个活性结合位点，然后突变以证明其对蛋白结合和启动子活性的影响。所述DNA结合活性在生物化学上进行特征鉴定，且负责这种活性的蛋白质是纯化的。另外，通过将一系列启动子构建物转化入烟草中，证实在所述EAS4启动子区中的这种顺式元件的功能鉴定，所述启动子构建物包含融合GUS报道基因的所述沉默元件。
提供这些实施例的目的是为了说明本发明，不应解释为是限制性的。鉴定EAS4启动子区结合活性为了解调节EAS4基因的机制，将EAS4启动子区(SEQ ID NO:5)划分为5个重叠的核苷酸片段，用片段A-E代表(图1A)，且检验了每一个片段结合蛋白的能力，所述蛋白由烟草细胞悬浮培养物的细胞核或全细胞提取物制备。用电泳迁移率变动分析(EMSA)(未列出数据)检测时，这些实验显示未在细胞核提取物中检测出对A或E片段特异性的DNA结合活性。因为在制备分离的细胞核时蛋白质可能会丢失，所以也检测了全细胞提取物结合A-E片段的活性。
这些实验的结果表明，在全细胞提取物中存在一些与A-E片段弱结合的活性(图1B，泳道1-6)，而在细胞核和全细胞提取物中发现结合B片段(图1B，泳道7-11)和D片段(图1C，泳道1-5)的主要DNA结合活性。限制酶分析表明，所述主要DNA结合活性识别这两个片段重叠的区内的序列(未列出数据)。如图1C所示，在使用D片段和不同的提取物制备的结合反应中发现三种迁移复合物(用F、I和S代表，分别指快速、中速和慢速迁移复合物)。来自对照细胞(C-nuc)和诱出剂处理(E-nuc)的细胞的细胞核提取物均形成所述快速迁移复合物，并且由诱出剂处理细胞制备的细胞核提取物中的这种DNA结合活性较少。
对照全细胞提取物形成所有三种复合物，其中复合物I(中速)是最多的。诱出剂处理3小时后制备的全细胞提取物主要形成复合物S(慢速)。加入超出50倍的未标记的D片段(图1C，泳道6-9)减少了标记D片段的结合量，因此证明了序列专一性。鉴定蛋白结合位点为鉴定包含上述鉴定活性的结合位点的特定核苷酸碱基，进行了甲基化干扰(M.I.)和DNaseⅠ足迹实验(图2A)。将EAS4启动子区的C片段在鸟嘌呤上部分甲基化，同来自对照细胞或诱出剂处理细胞的核蛋白混合，并用EMSA分析以分离结合和未结合的DNA。凝胶纯化后，在所述甲基化位点切割所述DNA，并将得到的片段在6％变性聚丙烯酰胺测序凝胶上分离(图2A)。在结合DNA组分中(图2A，泳道C和E)在非编码链-239和-234(图2A-星号标记)位置鸟嘌呤甲基化的DNA片段的代表性不足，这表明在这些位置的甲基化作用干扰了蛋白结合。在编码链-237位置的鸟嘌呤甲基化不影响DNA结合。
DNaseⅠ足迹分析也暗示了在C片段内的所述同一区为所述蛋白结合位点。在由或者对照细胞或者诱出剂处理细胞制备的细胞核提取物存在的情况下，编码链的-237至-242区域和非编码链的-236至-242区域受到局部保护，免遭DNaseⅠ酶解(图2A，实线)。这些发现提供了另外的证据，证明在B和D片段存在的情况下形成所述DNA-蛋白质复合物是由于结合在这两个片段重叠的位置(即在C片段内)造成的。综合从甲基化干扰和DNaseⅠ足迹法得到的结果，表明实际上是在细胞核提取物中发现的DNA结合活性识别这种核苷酸序列，所述细胞核提取物是由对照细胞和诱出剂处理细胞制备的。如标明TAC框的序列5′CTACAGTAC3′(SEQ ID NO:6)，是由于存在重复的“TAC”基元造成的。
为了确认所述TAC框负责通过EMSA观察到的所述结合活性，通过寡核苷酸介导的定点诱变(图2B,M2-TAC框)改变所述TAC框中的两个核苷酸。来自对照细胞和诱出剂处理细胞(未列出数据)的细胞核和全细胞提取物与包含所述突变TAC框的DNA片段的结合最小，且不竞争结合野生型D片段探针(图1C，泳道10-13)。这个结果提供了进一步的证据，表明蛋白结合需要所述TAC框元件。TAC框结合活性的特征鉴定来自对照细胞和诱出剂处理细胞的全细胞提取物之间在所述TAC框-蛋白复合物迁移上的不同表明，在由诱出剂处理引起的细胞应答过程中所述TAC框结合因子可能受到修饰。为检查这种可能性，由诱出剂处理不同时间的细胞制备全细胞提取物(图3A，泳道1-5)。先前的研究表明诱出剂处理后2-6小时EAS mRNA的累积是最快的。过了这个时间mRNA水平开始下降并回到24小时前的对照水平。而由对照细胞制备的全细胞提取物主要产生复合物I；虽然由形成复合物S的EAS转录高峰期(即诱出剂处理后3小时)的细胞制备的全细胞提取物中也鉴定出复合物I，但是诱出剂处理30分钟的细胞制备的全细胞提取物导致复合物S的形成；并且由诱出剂处理后12小时的细胞制备的全细胞提取物形成复合物I。这些结果显示，所述TAC框-蛋白质复合物的改变和EAS基因转录的诱导模式有关。
为了检查复合物迁移差异的性质，检测了脱磷酸作用对结合活性的影响(图3A，泳道6-13)。在碱性磷酸酶缓冲液(20mMTris-HCl,pH8.5)中将全细胞提取物大约稀释10倍，并在EMSA分析之前于37℃将所述提取物温育45分钟。令人惊讶的是，在没有碱性磷酸酶的情况下(对比图3A的泳道2和6；3和8；4和10；及5和12)于37℃温育所述提取物时，发现所述蛋白质-DNA复合物从较慢速向较快速迁移形式变动。所以用碱性磷酸酶温育减少了结合活性的总量，并且也部分抑制了复合物迁移变动。在单独的实验中，用或不用碱性磷酸酶于37℃温育30分钟不影响所述细胞核提取物的结合活性(未列出数据)。
为了确定在这些条件下复合物迁移没有变动，将对照细胞制备的全细胞提取物稀释并补加MgCl2或EDTA，然后立即把这个复合物加入到结合试样中，或用另一种方法，在加入MgCl2±EDTA之前于37℃温育45分钟(图3B)。EMSA显示，MgCl2或EDTA的存在不影响所述TAC框-蛋白复合物的迁移(图3B，泳道1-4)。45分钟后，仅含有4mM Mg2+的样品主要产生复合物F；用9mM Mg2+温育产生等量的复合物F和I；而24mM Mg2+不影响复合物的迁移率。另外，同EDTA温育的样品的EMSA(图3B，泳道8)表明抑制了结合活性，这说明TAC框蛋白结合需要二价阳离子。我们的结果也显示，用不含有Mg2+的缓冲液制备的细胞提取物不含有TAC框结合活性(未列出数据)。
在低浓度Mg2+存在的情况下，于37℃温育由诱出剂处理细胞制备的全细胞提取物，在其后的60分钟温育过程中(图3C，泳道1-7)也监测了复合物迁移率的变动。在这个阶段，观察到复合物S减少的同时，复合物I增加。另外，观察到TAC框结合活性的总量减少。当此提取物同高浓度Mg2+温育时，观察到复合物迁移没有变化。在总共60分钟温育过程中的30分钟后加入Mg2+，防止所述结合活性的改变超出在前30分钟内发生的结合活性。再者，在EDTA存在的情况下于这些条件下温育，发现抑制TAC框结合活性。纯化TAC框结合因子用蛋白粗提物，如Miskimins等(Proc.Natl.Acad Sci.82:6741-6744,1985)所述，通过DNA-蛋白质印迹法鉴定TAC框结合因子(TBBF)的几次尝试是不成功的。为进一步鉴定此结合活性的特征，我们用DNA亲和层析纯化TBBF。由诱出剂处理3小时的细胞制备的全细胞粗提物同ZNG缓中液中的鱼精DNA混合，以结合非特异性DNA结合蛋白。将该复合物分为两批并分别通过床体积为5ml的TAC框琼脂糖凝胶柱。然后用含有0.1M KCl的ZNG缓中液流洗所述柱，以洗脱弱结合蛋白，并用含有0.5M KCl的ZNG缓冲液从所述固定化DNA亲和柱上洗脱TBBF。将最初两次流通液(称之为FT1和FT2)和低盐流洗液混合，并再次通过该柱以提取剩余的结合活性(图4A)。使用(FT1)的EMSA表现出的TAC框结合活性比上该柱的粗样品(E-3小时)少，这表明大百分率的所述DNA结合活性保留在柱上。在低盐流洗过程中从该柱洗脱下的TBBF最少；然而，在0.5M KCl存在的情况下洗脱下了蛋白质结合活性(图5,1-3、7-8、12组分)。请注意，除了在层析前加入到所述提取物中的结合试样，这些结合试样不包含非特异性DNA。因此，鱼精DNA存在于原始样品、流通洗脱液(FT1和FT2)和低盐流洗液中，但不存在于高盐组分中。
初步实验表明，甚至在所述高亲和性结合位点被占用以后，所述亲和纯化的TBBF也能够非特异性地结合DNA。所以，当存在的TBBF超过探针的量时，观察到多种蛋白结合单一DNA片段。这导致形成阶梯，每一梯级都比其低一梯级多含有一个结合蛋白。另外，通过对比不同量的高活性蛋白组分或通过加入非特异性DNA可目测该结果。因此，发现过量500倍的非特异性DNA(组分2+dI-dC)的存在减少了较高梯级(higher-order)复合物的数目，以致仅一个或两个TAC框结合因子结合所述大部分探针。将加入所述结合试样的TBBF的量减少90％(0.1X组分2)，与加入非特异性DNA有同样的作用。最后，当用双链寡核苷酸做探针时，发现甚至当存在过量的结合活性时也形成一个复合物(未列出数据)。
混合含有所述结合活性的高盐组分(～30ml)，并对没有KCl的ZNG缓冲液透析，再超滤至大约5ml。通过SDS-PAGE和银染这些加工的DNA亲和层析组分和来自对照细胞的相似制品进行分析，显示了5至7个多肽主带(图5，泳道2和6)。因为DNA-蛋白质印迹分析不能鉴定作为TAC框结合蛋白的特定条带，所以通过快速蛋白质液相层析(FPLC)进一步分级分离了所述部分纯化的蛋白制品。
为确定用于此纯化步骤的合适的离子交换柱，将等份的所述部分纯化的TBBF与阳离子交换树脂Q-琼脂糖或阳离子交换树脂S-琼脂糖混合。离心并除去含有未结合蛋白的上清液后，用ZNG缓中液和含有1.0M KCl的ZNG缓冲液连续洗涤所述琼脂糖。通过EMSA分析每一部分的所述结合活性，显示TBBF结合S-琼脂糖，而不结合Q-琼脂糖(未列出数据)。
然后将DNA亲和层析纯化的TBBF制品上Mono-S柱，并用线性KCl梯度的Z缓中液洗脱所述结合蛋白。如图4B所示，同上该柱的(E-DAC-UF)样品相比，相当于所述柱最初流通液的1至8组分仅含有少量的TAC框结合活性。虽然在低浓度KCl存在的情况下洗脱下的结合活性几乎没有，但当KCl水平达到大约150mM时，蛋白质结合活性被快速洗脱下来(图4B,22至24组分)。混合这些组分，脱盐并通过超滤浓缩。然后将所述组分用甘油稳定化并保存在-80℃。
用SDS-PAGE定性估价TBBF的纯化，然后用银染法目测所述分离的蛋白质(图5A)。来自对照细胞的FPLC纯化样品在17和19kD显示了两个大约等量的主带。在16和20kD检测出小多肽条带(图5A，泳道3)。来自诱出剂处理细胞的相似制品含有污染蛋白，但可以看见所述17和19kD多肽，这表明这些多肽是所述TBBF的主要组分。在使用由对照细胞和诱出剂处理细胞(图5，对比泳道2和6)制备的提取物的DNA亲和层析过程中，均发现23、31和37kD的多肽与TBBF共纯化。在对照细胞制品中所述37kD条带的减少量同诱出剂处理细胞的相比可能不重要，因为来自对照细胞的不同制品显示存在较高量的这个条带。来自对照细胞和诱出剂处理细胞的细胞核提取物也含有和纯化TBBF的17kD条带共迁移的强条带，而和所述19kD多肽共迁移的细胞核提取物条带相对较弱。
为了确定每步纯化步骤之后回收的DNA结合活性的量，在过量浓度的含有所述TAC框DNA元件的双链寡核苷酸存在下进行EMSA。尽管在纯化过程中用来监测结合活性的较大C片段探针对目测鉴定具有高水平结合活性的组分很有价值，但定量分析需要利用结合一种因子的探针。在这些定量分析中不存在非特异性竞争者DNA。因此，形成相似迁移复合物的非特异性DNA结合蛋白可能会引起粗提取物活性检测稍微过高，但对所述纯化制品则不会。考虑到这些，分别将对照细胞和诱出剂处理3小时细胞中的TBBF至少纯化750倍和461倍(表Ⅰ)。
所述纯化蛋白的特征鉴定在定量足迹分析中也用FPLC纯化的诱出剂处理3小时细胞的TBBF制品，以检测所述结合活性的相对特异性，或所述TAC框对于非特异性DNA的优先性。在每个实验中，在编码链上标记C片段(8.8费摩尔)，并与增加量的TBBF温育标记片段，而在实验之间改变聚dI-dC和鱼精DNA的量。DNaseⅠ处理并沉淀后，在测序凝胶上分离所述DNA并分析。
在图6A中显示了一系列增加TBBF量的代表性实验，并通过实心方括号代表原足迹。我们观察到由全细胞提取物纯化的所述蛋白的足迹比细胞核粗提物的足迹大(图2A)。此足迹清晰地从-232强条带向下延伸到相当于-245的条带，细胞核粗提物没有保护二者中的任何一个。这个延伸的足迹包括恰好间隔10bp并因此位于螺旋同一面的两个ACTC基元。我们也观察到在很大量TBBF(短划方括号)存在的情况下，在大约-275处的DNaes Ⅰ敏感模式有轻微的变化。这个区域有核苷酸序列TAaAGTAaT(小写字母指非配对核苷酸)，该序列在9个位置中的7个配对所述核心TAC框序列。
定量分析显示，随着所述蛋白浓度的增加，结合探针的百分率增至100％(图6B)。鱼精DNA(fs DNA)抑制所述探针结合，并发现其分解常数(Kd)的增加程度超过dI-dC，可推测是由于鱼精子DNA中随机出现的所述TAC框元件。在所有检测条件下，所述Kd范围从1.5×10-10M至1.5×10-9M。TAC框元件作为沉默子起作用构建含有启动子融合物的转基因烟草植物，所述启动子与β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)编码区融合，以评价所述TAC框的功能(图7A)。所述嵌入基因融合物由EAS4 5′-非翻译区和EAS4转录起始位点的上游266核苷酸构成，并包括或者野生型或者突变的TAC框。将F1植物培养至10至12片叶的阶段，用水(对照)和1μg/ml隐配基溶液浸润两片完全伸展的叶片的中脉的背面，所述隐配基为烟草中防御反应诱出剂。12小时后，从浸润区切下直径为2.5厘米的叶圆盘，用研钵和研杵将其在GUS分析缓中液中匀浆，并测定蛋白提取物的GUS活性。
如表Ⅱ和图7B所示，当用水浸润时，用野生型启动子转化的植物品系的叶含有的GUS活性最小，而诱出剂处理后水平大约高出11倍。除了比包含野生型启动子的转基因植物中的绝对活性水平高出2到3倍外，包含GUS基因上游突变启动子的植物品系表现出相似的表达模式。在对对照和诱出剂处理的应答中都注意到这种GUS活性的增加。这些结果表明，在所述截短的启动子的前后序列内，所述TAC框元件起抑制基因表达的作用。
表Ⅱ
上述实验是用下述技术进行的。寡核苷酸和探针按照标准方法合成寡核苷酸，并用在所述EAS4启动子中的位置(数字)和编码链(c)或非编码链(n)代表(参见以下和图1A)。小写字母表示的碱基相应于用来加入限制位点或加入的突变的非同源碱基(n是A、T、G或C)。-740c gggctgcAGGCGTAAAGATACATTATACC(SEQ ID NO:7)-571c gggctgcAGGTGAATGTCAGGGCTTATGC(SEQ ID NO:8)-526n CTGGCAGGGCATAAGTATCG(SEQ ID NO:9)-349c GggcTgcAGTTCATCAAAGTGGACTCTGC(SEQ ID NO:10)-266c GggcTgcagATTTGATAGTTCCAGGAAAC(SEQ ID NO:11)-233n AGTAGTGTAGAnTTGTTTCC(SEQ ID NO:12)-160c GgnnnnnnGATCAATAGACC(SEQ ID NO:13)-147n gGGCtgCaGGGGTCTATTGATCCAGTTTCC(SEQ ID NO:14)+76n GgGGatccTGCTAATTAAAGATGAGTG(SEQ ID NO:15)TAC-M2n CAAAATAAGGGAGTACacTAGAGTTGTTTCC(SEQ ID NO:16)dsTACcagctACTCTACAGTACTC(SEQ ID NO:17)dsTACnagctGAGTACTGTAGAGT(SEQ ID NO:18)
用γ-32p-ATP末端标记寡核苷酸引物，并用下述末端标记引物通过标准聚合酶链式反应(PCR)流程合成放射性标记DNA片段。总体积为10微升的标记引物反应包含25皮摩尔寡核苷酸、1μl 10×T4激酶缓冲液(0.5M Tris-HCl pH7.60、1M MgCl2、50mM DTT、1mM亚精胺HCl、1mM EDTA)、25μCiγ-32P-ATP(3000Ci/毫摩尔)和10单位T4激酶。于37℃温育30分钟后，在所述PCR反应中加入下述组分至最终体积为50微升5μl dNTPs(2.5mM)、5μl 10x激酶-PCR过渡缓中液(transition buffer)(20mM Tris pH9.5、0.5M KCl、0.1％吐温-20、0.1％明胶、0.1％乙基苯基聚乙二醇)、1至10毫微克模板DNA(克隆于pBluescript的EAS4启动子)，1单位Taq聚合酶(Gibco-BRL)、50皮摩尔第二寡核苷酸(未标记)和水。于50℃退火温度进行32个热循环。在非变性12％(80∶1)聚丙烯酰胺凝胶中分离PCR产物，然后将其在Kodak X-Omat AR胶片上曝光30秒至2分钟，检查所述探针在所述凝胶中的位置。从所述凝胶上切下放射性标记片段，包埋在1％琼脂中，然后将所述放射性标记片段电泳到DE-81纸(Whatman)或NA-45滤膜(Schleicher和Schuell)上。下一步，在洗脱液(20mM TrispH8.0、2mM EDTA、1.5M NaCl)中于60℃从所述纸或膜上洗脱所述放射性标记探针2小时，并用2体积95％乙醇沉淀。制备提取物如Vogeli和Chappell(Plant physiol.94:1860-1866,1990)所述，用诱出剂(0.1μg/ml纤维素酶)处理烟草细胞悬浮培养物，并如Watson和Thompson(Meth.Enzymol.118:57-75,1986)所述从这些培养物中分离细胞核，并按照Dignam等(Nucl.AcidsRes.11:1475,1983)提取。按照Arias等(Plant cell 5:485-496,1994)所述用玻珠打浆机(bead beater)制备纯化TBBF的提取物。用Bio-Rad蛋白分析染料(Bio-Rad)通过Bradford方法检测蛋白。
按Arias等(Plant cell 5:485-496,1994)所述方法修改方法如下制备全细胞提取物。用一大孔径(～0.5mm)尼龙网过滤大约300毫升已培养2天的烟草细胞悬浮培养物，用200毫升冰冷的水洗涤所述细胞，称重(大约75至100克)，并转移到一冷冻的研钵中。将大约3克聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)喷到所述细胞上，然后用研杵将所述细胞磨碎。向所述细胞加入少量(～10毫升)冷匀浆缓冲液并继续研磨。匀浆缓中液包含0.2M Tris、0.39M(NH4)2SO4、10mM MgSO4、20％甘油、2mM EDTA、5mM EGTA和2.5％葡聚糖硫酸酯，并用冰醋酸将pH值调至7.9。使用前立即将5mM DTT、1mM PMSF、2.5μg/ml抗蛋白酶、0.35μg/ml苯丁抑制素和0.4μg/ml胃蛋白酶抑制剂A加入到所述缓冲液中。将所述磨碎的细胞转移到一大离心瓶中，随后加入190毫升用来冲洗研钵和研杵的冷匀浆缓中液，并加入15滴辛醇以防止匀浆过程中起泡。用polytron以一分钟8次的设定匀浆3次，在匀浆之间用冰冷却。然后通过上述的大孔径尼龙网过滤所述匀浆，并将滤液在10K(Sorvall SS34)离心7分钟。在30至60分钟内，通过滴加4M(NH4)2SO4(pH7.0)使上清液成为0.9M(NH4)2SO4。搅拌30分钟后，在(Sorvall SS34)中以15K将所述提取物离心30分钟，并将上清液倒入一预冷烧杯中。在1小时内，边搅拌边缓慢加入固体(NH4)2SO4(0.35g/ml匀浆液)和1M KOH(10μl/g(NH4)2SO4)，再搅拌所述匀浆液30分钟，然后以15K(Sorvall SS34)离心45分钟。在全细胞提取物透析缓冲液(50mm HEPES-KOH pH7.9、10mM EGTA、10mM MgSO4、20％甘油、5mM DTT、0.5mM PMSF)中再悬浮所述蛋白沉淀(以1克细胞45微升的比率)，所述透析缓中液包含4μg/ml胃蛋白酶抑制剂A、5μg/ml亮抑蛋白酶肽、25μg/ml抗蛋白酶和35μg/ml苯丁抑制素，然后对透析缓中液过夜透析并更换两次缓中液。电泳迁移率变动分析电泳迁移率变动分析(EMSA)包含总体积为10微升的10mM Tris(pH7.9)、80mm NaCl、1mM EDTA、1mm DTT、5％甘油、5至25费摩尔探针(10,000-50,000dpm)。在相应图示说明中显示了蛋白和非特异性竞争者DNA的量。于室温温育样品5至10分钟，然后上12％丙烯酰胺∶bis(80∶1)非变性凝胶。所述凝胶于4℃在0.5X TBE缓冲液中电泳。足迹法如Baldwin所述(载于Ausubel等，分子生物学现行方案，JohnWiley & Sons，纽约，1994)用细胞核提取物进行甲基化干扰实验。
用于DNaseⅠ足迹法的细胞核粗提物使用用于甲基化干扰的类似方法。向50微升结合样品缓中液中加入MgCl2(至5mM)和2微克DNaseⅠ，于室温温育所述反应物2分钟，并通过加入2微升0.5M EDTA终止反应。通过EMSA分离结合和游离的DNA，如上述分离，并在6％聚丙烯酰胺测序凝胶上电泳。用Brenowitz等(载于Short Protocols inBiology,Ausubel等，编辑，John Wiley & Sons，纽约，1992)所述步骤完成使用纯化的TBBF的足迹定量分析。定点诱变依据Kunkel等(Meth.Enzymol.154:367,1987)所述方法进行定点诱变。设计诱变寡核苷酸，以使成功突变的质粒失去TAC框内的ScaⅠ限制性酶识别位点(5′AGTACT3′)。纯化TAC框结合因子DNA亲和层析基本按照Kadonaga和Tjian所述(Proc.Natl.Acad.Sci.83:5889-5893,1986)制备TAC框DNA-琼脂糖。凝胶纯化寡核苷酸(dsTAC和dsTACn)，退火，将其连接为多聚体，并偶联至5毫升(床体积)溴化氰-活化琼脂糖(Sigma)。得到的亲和基质包含大约400μg DNA/5ml琼脂糖。
用冷ZNG缓冲液稀释包含50至200毫克蛋白的全细胞粗提物，并以0.3-0.5毫克“鱼精子”DNA(Amersham)/毫克蛋白在冰上培育30分钟。除了省略甘油以加速所述层析和超滤步骤外，ZNG缓冲液(25mMHEPES-KOH pH7.8、12.5mM MgCl2、1mM DTT、0.1％乙基苯基聚乙二醇)同Kadonaga和Tjian所述(Proc.Natl.Acad.Sci.83:5889-5893,1986)Z缓冲液是一样的。使蛋白-鱼精子DNA复合物通过TAC框琼脂糖柱，并且作为单一组分收集流通液(FT1和FT2代表)。然后用25ml补加0.1M KCl的ZNG缓冲液(低盐洗液)，接着用25ml含有0.5M KCL的ZNG缓中液高盐洗液流洗所述柱。收集所有组分并测定DNA结合活性。重复此步骤直至从全细胞粗提物中提取出所述大部分结合活性。将在EMSA中证实有DNA结合活性的组分混合，对ZNG缓中液透析，并通过超滤浓缩。
快速蛋白质液相层析(FPLC)将从DNA亲和层析(上文)获得的具有DNA结合活性的组分混合，上Mono-S柱(Pharmacia)，并用离子强度增加梯度的缓中液洗脱。缓冲液A同ZNG缓中液是一样的；B缓中液还含有0.75M KCl。用下列梯度以0.5毫升/分钟的流速洗脱蛋白4分钟0％B；40分钟0-33％B；20分钟33-100％B；4分钟100％B。收集1ml组分，并在EMSA分析前将等份试样稀释10倍。将在EMSA中证实有DNA活性的组分混合，对ZNG缓中液透析，并通过超滤浓缩。通过SDS-PAGE(Laemmli,Nature 227:680-685,1970)用Duracryl高拉伸强度丙烯酰胺(Millipore)从这些组分中分离蛋白，并用SilverStain Plus(Bio-Rad)银染。转基因植物和β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)分析按照标准方法生产包含嵌合基因融合物的转基因植物，所述嵌合基因融合物由EAS4 5′-非翻译区和EAS4转录起始部位上游266个核苷酸构成，包括或者野生型(5′CAACTCTACAGTACTCCC3′；SEQ ID NO:19)或者突变TAC框(5′CAACTCTAGTGTACTCCC3′；SEQ ID NO:20)，所述标准方法例如为Chappell等(转录控制序列及其应用，分别于1995年5月18日、1995年6月6日和1995年12月22日申请的USSN08/443,639、08/471,983和08/577,483)和Chappell等(WO97/012076)描述的方法。用途本文所述核苷酸沉默元件及其结合因子可用于本领域技术人员已知的多种农业用途。本文所述元件和结合因子提供了一个负调节基因产物基因表达水平的方法。例如，可以将类异戊二烯合酶基因沉默元件(例如所述TAC框元件)克隆到任何启动子区，作为减少或抑制植物基因表达的工具。沉默元件也可以用来调节与其转录方向和距其起始部位的距离无关的基因转录。如果需要，这种沉默元件的重复拷贝也可用于一个给定基因的转录调节。因此，本发明的沉默元件可以位于将要转录的基因的5′或3′转录调节区(例如Chappell等USSN08/443,639、08/471,983、08/577,483和WO97/012076中的EAS4:ParAl构建物)。可以按照常规方法(例如本文所述的那些方法)监测沉默元件减少或消除基因表达的效率。如果需要，也可以将编码TBBF的基因引入到合适的宿主植物中，以调节与本发明沉默元件操作性地连接的基因的表达。按照本领域熟知的常规方法进行用于本发明的TBBF的分离和克隆。
如同具体并单独指明通过引用结合到本文中一样，将本说明书中提及的所有出版物和专利通过引用结合到本文中。
其它实施方案根据前述，显然可以对本文所述的这项发明进行改变和修改，以适于不同的用途和条件。这样的实施方案也在下述的权利要求书的范围内。
序列表(1)一般资料(ⅰ)申请人Board of Trustees of the University of Kentucky(ⅱ)发明名称转录沉默元件及其结合因子(ⅲ)序列数20(ⅳ)通信地址(A)收信人Clark & Elbing LLP(B)街道176 Federal street(C)城市波士顿(D)州马萨诸塞(E)国家美国(F)邮政编码02110(ⅴ)计算机可读形式(A)媒体类型软盘(B)计算机IBM兼容机(C)操作系统DOS(D)软件FastSEQ for windows，版本2.0(ⅵ)当前申请数据(A)申请号(B)提交日期(C)分类(ⅶ)在先申请数据(A)申请号60/020,087(B)提交日期1996年6月13日(ⅷ)代理律师/代理人资料(A)姓名Paul T.Clark,Esq.
(B)注册号30,162(C)参考/档案号07678/008W01
(ⅸ)电讯资料(A)电话617-428-0200(B)传真617-428-7045(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)长度10个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型基因组DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:NTACNNTACN 10(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)长度10个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型基因组DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:CTACAGTACT 10(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)长度11个碱基对(B)类型核酸
(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型基因组DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:TCTACAGTAC T 11(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)长度14个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型基因组DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:ACTCTACAGT ACTC 14(2)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征(A)长度1368个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型基因组DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:AAGCTTTACG AATTAGATGT AAAAAGACAC AAACTACTTA TATATATTAC CAAAGTAACT 60TGAAAGTTTA AAATTTCAAT TAGAACTATA GTAGGGTAAA ACTGTCTATT TAAAATCAGT120ATTTAAAAAG GCATGAGCGA AAGATGAGGC GTTTTATCTA ACACGAAGCG AGGTGTAAGC180CCCATGGTGT TTTATTTTTA TATTTTATAA ATTTATAAAA TCATTATATA AATCAGAAAA240ATACACTAAA ATTGTGAAAA GTTAAAGAAA ATTATAGAAT TAATATATAT ATATATATAT300ATATATATAT ATATATATAT ATATATATAT ATATATATAA ATGTATGTGT GTGTGTGTGT360GTATCGCATG CGCGCGACCA TGCAACTTTT TTTTCTTGAA AAAATAAAAG GCGTAAAGAT420ACATTATACC TATGTCATCA AAACAATATA ATATATATAT ATATATATAT ATATATATAT480ATATATATAA ATGTATGTGT GTGTGTGTGT GTATCGCATG CGCGCGACCA TGCAACTTTT540TTTTCTTGAA AAAATAAAAG GCGTAAAGAT ACATTATACC TATGTCATCA AAACAATATA600AAAACTAGAG CGATACCAAA GGAAATTTTA AATTCAAAAA CTAACTTGAA ATTAATATAT660TTAAAATTTC ATTTTTTTTT GTGTGGAGAA AACAAAGCAT AACACTTTGC TTTGTAACAC720TTTGCCTAGG TGAATGTCAG GGCTTATGCT CCACGATACT TATGCCCTGC CAGTACACCT780CGCAGTGGGA CTCGCTGAAA AAACGTCTTT GTTGTGAGAA ATTGCAATTT TGAACCTCTA840CAATTTCGAC AAAACCTTGG TTCGTGAAAA CTGTTTGATT AACTTTTAGA CCATCCAGTC900AATTTAACTC TAAACTGACC TAAATAAATA CTACGTACAC TAGTCTTTAA GTTCATCAAA960GTGGACTCTG CATTAATAAT TGAAATTTAT GCCGCAACAA TGACATTAGG TTTTATAAAT 1020AAAGTAATAG GAATTTGATA GTTCCAGGAA ACAACTCTAC AGTACTCCCT TATTTTGTGC 1080CTTTTTAAAT AATATTATTC AGTTGACGAA ACAAATAAAT AAAATATTTG GGAAACTGGA 1140TCAATAGACC CCAGACGCCA ACAATGAATC AAAAGGCTGC TAGCTAGTGT AAAGTCTAGT 1200AAGGCAACTG GGAAATTAAA TGATTAGGTG CTTTTGATCA ATTACATTAA CTAGTCTCTC 1260ACCACTATAT ATACTTGTCC CTTCTCTTCC ATTTAAGTAG AGTTCCTTTC TTTCTTCCTT 1320AAAACTTAAA AGAACAAGTA AAAATACACT CATCTTTAAT TAGCAATG1368(2)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)长度9个碱基对(B)类型核酸(C)链型both(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型基因组DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:CTACAGTAC9(2)SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)序列特征
(A)长度29个碱基对(B)类型核酸(C)链型both(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型基因组DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:GGGCTGCAGG CGTAAAGATA CATTATACC29(2)SEQ ID NO:8的信息(ⅰ)序列特征(A)长度29个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学两者(both)(ⅱ)分子类型基因组DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8:GGGCTGCAGG TGAATGTCAG GGCTTATGC29(2)SEQ ID NO:9的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型基因组DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9:CTGGCAGGGC ATAAGTATCG 20(2)SEQ ID NO:10的信息(ⅰ)序列特征(A)长度29个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型基因组DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10:GGGCTGCAGT TCATCAAAGT GGACTCTGC29(2)SEQ ID NO:11的信息(ⅰ)序列特征(A)长度29个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型基因组DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQID NO:11:GGGCTGCAGA TTTGATAGTT CCAGGAAAC29(2)SEQ ID NO:12的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性
(ⅱ)分子类型基因组DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:12:AGTACTGTAG ANTTGTTTCC 20(2)SEQ ID NO:13的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型基因组DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:13:GGNNNNNNGA TCAATAGACC 20(2)SEQ ID NO:14的信息(ⅰ)序列特征(A)长度30个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型基因组DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:14:GGGCTGCAGG GGTCTATTGA TCCAGTTTCC 30(2)SEQ ID NO:15的信息
(ⅰ)序列特征(A)长度27个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型基因组DNA
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:15:GGGGATCCTG CTAATTAAAG ATGAGTG 27(2)SEQ ID NO:16的信息(ⅰ)序列特征(A)长度31个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型基因组DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:16:CAAAATAAGG GAGTACACTA GAGTTGTTTC C 31(2)SEQ ID NO:17的信息(ⅰ)序列特征(A)长度18个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型基因组DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:17:AGCTACTCTA CAGTACTC18(2)SEQ ID NO:18的信息(ⅰ)序列特征(A)长度18个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链
(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型基因组DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:18:AGCTGAGTAC TGTAGAGT18(2)SEQ ID NO:19的信息(ⅰ)序列特征(A)长度18个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型基因组DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:19:CAACTCTACA GTACTCCC18(2)SEQ ID NO:20的信息(ⅰ)序列特征(A)长度18个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型基因组DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:20:CAACTCTAGT GTACTCCC18
权利要求
1．包括类异戊二烯合酶基因沉默调节元件的分离核酸序列。
2．权利要求1的分离核酸序列，其中所述分离核酸序列包含序列5′NTACNNTACN3′(SEQ ID NO:1)。
3．权利要求2的分离核酸序列，其中所述核苷酸序列包含5′CTACAGTACT3′(SEQ ID NO:2)。
4．权利要求2的分离核酸序列，其中所述序列包含5′TCTACAGTACT3′(SEQ ID NO:3)。
5．权利要求2的分离核酸序列，其中所述序列包含5′ACTCTACAGTACTC3′(SEQ ID NO:4)。
6．权利要求1的分离核酸序列，其中所述类异戊二烯合酶是倍半帖合酶。
7．权利要求6的分离核酸序列，其中所述倍半萜合酶是表-5-马兜铃烯合酶。
8．权利要求1的分离核酸序列，其中所述核酸序列是来自双子叶植物。
9．权利要求8的分离核酸序列，其中所述双子叶植物是茄科植物的一种。
10．权利要求9的分离核酸序列，其中所述茄科植物是烟草属的一种。
11．权利要求1的分离核酸序列，其中所述核酸序列是来自单子叶植物。
12．权利要求1的分离核酸序列，其中所述核酸序列是来自裸子植物。
13．权利要求1的分离核酸序列，其中所述核酸序列是来自松柏类植物。
14．包含权利要求1的核酸序列的载体。
15．权利要求15的载体，所述载体能够在包含载体的细胞中使操作性地连接的核酸序列的表达沉默。
16．转基因植物细胞，包含整合到所述植物基因组中权利要求1的分离核酸序列或权利要求14所述载体。
17．来自权利要求16的转基因植物的种子。
18．来自权利要求16的转基因植物的细胞。
19．降低DNA序列在转基因植物中转录的方法，所述方法包括下述步骤(a)提供包括权利要求1或权利要求14的核酸序列的转基因植物细胞，所述核酸序列位于降低DNA序列转录的位置并整合到所述转基因植物细胞的基因组中；和(b)由所述转基因植物细胞培养所述转基因植物。
全文摘要
本发明涉及核苷酸调节序列及其结合因子。
文档编号C07H21/00GK1227608SQ97197140
公开日1999年9月1日 申请日期1997年6月13日 优先权日1996年6月13日
发明者J·查普尔, J·D·纽曼, S·－H·殷 申请人:肯塔基州州立大学托管委员会