专利名称：具有生物学活性的新肽的制作方法
技术领域：
本发明的肽具有比常规的抗微生物肽更强的活性，其在高盐浓度下具有这种活性。
背景技术：
本发明涉及生物学活性肽。地球上的每个动物均具有生物防御系统以防御或保护其不受病毒或细菌的感染。这种系统之一是利用抗微生物肽的非特异性免疫。
由于下述杰出的性质，抗微生物肽被认为是一类新的药物。首先，抗微生物肽显示出比常规抗生素更强的抗广谱微生物的活性。第二，抗微生物肽具有有益于人体的高度工业实用性，因为抗微生物肽显示抗外来病原体而不破坏宿主细胞的抗微生物活性。第三，产生微生物抗性的可能性较小，因为抗微生物肽的活性机制与产生严重抗药性的常规抗生素的活性机制完全不同。对抗微生物肽的研究最初是在具有发育不全的免疫系统的一种昆虫中分离了杀菌肽。在首次发现杀菌肽之后，从两栖动物中发现了爪蟾抗菌肽和铃蟾抗菌肽，从哺乳动物中分离了防卫素。对抗微生物肽的研究很活跃，目前已鉴定和报道了来自从微生物到人的各种物种的约2000种抗微生物肽。
但是，开发作为药物的上述抗微生物肽有若干障碍。首先，常规抗微生物肽在相对较高浓度起作用。例如，从两栖动物表皮分离的抗微生物肽爪蟾抗菌肽虽然有效抗革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌及真菌，但其活性浓度为50-200μg／ml(Zasloff M．(1987)美国科学院院刊845449-5453)。相对于常规抗生素在0．1-1μg／ml范围抗特异微生物，上述浓度范围非常高。第二，抗微生物肽的抗微生物活性对盐浓度敏感。在侵袭人肺部的囊性纤维化中，例如，抗微生物肽无效，因为在侵袭部位盐浓度异常增高(Goldman，M．J．等(1997)细胞，88553-560)。本发明人在生物化学生物物理研究通讯218，408-413(1996)中报道了分离自韩国蟾蜍的抗微生物肽。这些已知称为buforin Ⅰ和buforin Ⅱ的抗微生物肽显示抗广谱微生物包括革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌和真菌的强抗微生物活性。Buforin Ⅰ和buforinⅡ在1-4μg／ml浓度也有抗微生物活性，其比常规抗微生物肽的活性强。但是这些抗微生物肽也对盐浓度敏感。因此，仍需要开发具有增强的抗微生物活性并对盐浓度不敏感的在体内具有抗微生物活性的抗微生物肽。
本发明的另一个目的是提供具有较强的抗微生物活性的抗广谱微生物的肽。
本发明的再一目的是提供对增强抗微生物活性的盐浓度不敏感的肽。
本发明的又一目的在于提供对增强抗微生物活性的盐浓度不敏感的肽的二级结构。
本发明的再一目的在于提供可以制备生物学活性肽的前体肽。
本发明的再一目的在于提供可编码生物学活性肽的cDNA。
图2是显示作为盐浓度的函数的最小抑制浓度的曲线。
发明详述本发明的肽包括具有两亲性α-螺旋结构的肽。
本发明的肽还包括具有改变的buforin Ⅱ(生物化学生物物理研究通讯218，408-413(1996))二级结构的肽。
本发明人已示出buforin Ⅱ的二级结构从N-末端开始包括一随机卷曲(1-4个残基)，延伸螺旋(5-10个残基)和正常α-螺旋(11-21个残基)结构。
在buforin Ⅱ的结构中，具有正常α-螺旋结构(11-21个残基)的肽序列，即PVGRVHRLLRK具有强的抗微生物活性。本发明人已发现一种肽、特别是至少除去形成随机卷曲结构(1-4个残基)的序列的肽具有非常强的抗微生物活性。因此，本发明的一组肽由含有buforin Ⅱ的α-螺旋结构的肽、特别是具有PVGRVHRLLRK序列的肽组成。这些形成α-螺旋的序列，例如序列PVGRVHRLLRK还可另外含有C-末端或N-末端额外氨基酸，优选在N-末端具有形成延伸螺旋或正常螺旋的氨基酸，在C-末端为酰胺化肽。
本发明的另一组肽包括具有重复单位[RLLR]n(n是1-6之间的整数)的肽(RLLR是在buforin Ⅱ的氨基酸序列中发现的特异重复形式)，并优选n=2-5的肽。
所述的肽还可包括C-末端或N-末端额外氨基酸，N-末端氨基酸可包括不形成随机卷曲的氨基酸，优选形成延伸螺旋的氨基酸。例如，这一组氨基酸序列包括RAGLQFPVG[RLLR]1、RAGLQFPVG[RLLR]2、RAGLQFPVG[RLLR]3、[RLLR]3、[RLLR]4、[RLLR]5等。
本发明的肽可用本领域熟知的技术合成，例如，用自动化肽合成仪或用遗传工程技术。例如，肽的产生可通过构建由融合配偶体和肽基因组成的融合基因，将其转化宿主微生物，在宿主中表达融合蛋白，用蛋白酶和化学制剂切割融合蛋白，并纯化抗微生物肽而进行。为此，例如，可将一DNA序列插入融合配偶体和肽基因之间以引入编码可被蛋白酶如因子Xa和肠激酶或被化学制剂如CNBr和羟胺切割的加工位点的序列。
为引入编码CNBr切割位点的DNA序列，例如，通过将在3′-末端消化的融合配偶体基因与识别序列含有Met密码子(ATG)的限制性内切酶连接，所述的酶如AflⅢ，BsmⅠ，BspHⅠ，BspLU11Ⅰ，NcoⅠ，NdeⅠ，NsiⅠ，Ppu10Ⅰ，SphⅠ，StyⅠ或其同切点酶，以及将在其5′-末端消化的肽基因与具有与融合配偶体的切割位点相容的切割位点的限制性内切酶连接，而将融合配偶体和抗微生物肽基因框内融合。对于另一个例子，即引入编码羟胺切割位点的DNA序列，编码Asn-Gly的DNA序列可被引入融合配偶体和肽基因之间。例如，通过将在3′-末端用识别序列中含有Asn密码子的限制性内切酶或其同切点酶消化的融合配偶体基因与在其5′-末端用识别序列中含有Gly密码子的限制性内切酶或其同切点酶消化的肽基因经相容的粘端或钝端连接而框内融合。
本发明的基因结构可通过克隆入表达载体如质粒、病毒或可插入或掺入基因的群体常规载体而导入宿主细胞。
本发明的肽含有C-末端酰胺化的形式。
本发明的肽显示出对各种微生物包括革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌、真菌和原生动物的强抗微生物活性。
本发明的肽可与其它生物学活性药物制剂如生物学活性化学品、其它肽等一起给药。
本发明的氨基酸缩写依如下IUPAC_IUB命名规则缩写。
氧基酸 缩写丙氨酸 A精氨酸 R
天冬酰胺N天冬氨酸E半胱氨酸C谷氨酸 D谷氨酰胺Q甘氨酸 G组氨酸 H异亮氨酸I亮氨酸 L赖氨酸 K甲硫氨酸M苯丙氨酸F脯氨酸 P丝氨酸 S苏氨酸 T色氨酸 W酪氨酸 Y缬氨酸 V本发明将通过如下实施例详细描述。本领域技术人员应理解的是所述实施例仅为更清楚地描述本发明而给出，而不是限制本发明。
实施例1肽的制备构建表1所述序列，用自动肽合成仪合成各种肽，并用C18反相高效液相层析法(Waters Associates，USA)纯化。
表1 buforin Ⅱ及其衍生物的氨基酸序列
实施例2抗微生物活性的检测测定实施例1的肽抗各种微生物的最小抑制浓度。分别在37℃和30℃在Mller-Hinton和Saboraud培养基中过夜培养细菌和真菌，并接种培养基培养2小时至中对数期。将细菌和真菌稀释至104-105／ml之后，用其接种含有连续稀释的肽的96孔平板，并再保温18小时。最小抑制浓度是通过测定光吸收而确定的抑制微生物生长的浓度。结果示于表2。
表2 肽的抗微生物活性
表2(续)
在(RLLR)3的N-末端融合有形成延伸α-螺旋的氨基酸序列的肽RAGLQFPVG(RLLR)3显示具有特别强的抗微生物活性，分别具有4个和5个RLLR重复的肽(RLLR)4和(RLLR)5也显示强抗微生物活性。
缺失了buforin Ⅱ的形成随机卷曲结构的序列的肽也显示强抗微生物活性，并且在N-末端酰胺化的肽显示更强的抗微生物活性。
实施例3抗微生物活性作为盐浓度的函数的测定以作为盐浓度的函数测定肽的最小抑制浓度，从而确定抗微生物活性是否依赖于盐浓度。测定最小抑制浓度的方法同实施例2，除了改变氯化钠的浓度。结果示于图2。本发明的肽的抗微生物活性不作为盐浓度的函数变化，而buforin和爪蟾抗菌肽的抗微生物活性作为盐浓度的函数而敏感地变化。<110> 株式会社三养吉尼克斯，金善昌<120> 生物学活性肽<130> PA／SYG99049<150> KR1998-1797<151> 1998-01-22<160> 20<170> KOPATIN1．5<210> 1<211> 17<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 肽<400> 1Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His Arg Leu Leu Arg1 5 10 15Lys<210> 2<211> 16<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 肽<400> 2Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His Arg Leu Leu Arg Lys1 5 10 15<210> 3<211> 15<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 肽<400> 3Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His Arg Leu Leu Arg Lys1 5 10 15<210> 4<211> 14<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 肽<400> 4Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His Arg Leu Leu Arg Lys1 5 10<210> 5<211> 13<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 肽<400> 5Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His Arg Leu Leu Arg Lys1 5 10<210> 6<211> 12<212> PRT<203> 人工序列<220><223> 肽<400> 6Phe Pro Val Gly Arg Val His Arg Leu Leu Arg Lys1 5 10<210> 7<211> 11<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 肽<400> 7Pro Val Gly Arg Val His Arg Leu Leu Arg Lys1 5 10<210> 8<211> 17<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 肽<400> 8Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His1 5 10 15Arg<210> 9<211> 16<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 肽<400> 9Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His Arg Leu Leu Arg1 5 10 15<210> 10<211> 15<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 肽<400> 10Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His Arg Leu Leu1 5 10 15<210> 11<211> 14<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 肽<400> 11Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His Arg Leu1 5 10<210> 12<211> 17<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 肽<400> 12Arg Lys Gly Leu Gln Lys Leu Val Gly Arg Val His Arg Leu Leu Arg1 5 10 15Lys<210> 13<211> 20<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 肽<400> 13Arg Leu Leu Arg Arg Leu Leu Arg Arg Leu Leu Arg Arg Leu Leu Arg1 5 10 15Arg Leu Leu Arg20<210> 14<211> 21<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 肽<400> 14Arg Val His Arg Leu Leu Arg Arg Val His Arg Leu Leu Arg Arg Val1 5 10 15His Arg Leu Leu Arg20<210> 15<211> 21<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 肽<400> 15Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Leu Leu Arg Arg Leu Leu1 5 10 15Arg Arg Leu Leu Arg20<210> 16<211> 18<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 肽，酰胺化<400> 16Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His Arg Leu Leu Arg1 5 10 15Arg Lys<210> 17<211> 13<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 肽<400> 17Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Leu Leu Arg1 5 10<210> 18<211> 17<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 肽<400> 18Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Leu Leu Arg Arg Leu Leu1 5 10 15Arg<210> 19<211> 12<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 肽<400> 19Arg Leu Leu Arg Arg Leu Leu Arg Arg Leu Leu Arg1 5 10<210> 20<211> 16<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 肽<400> 20Arg Leu Leu Arg Arg Leu Leu Arg Arg Leu Leu Arg Arg Leu Leu Arg1 5 10 1权利要求
1.包括序列[RLLR]n的肽(n是1-6之间的整数)。
2.权利要求1的肽，其中在该肽的N-末端融合一延伸螺旋形成序列。
3.权利要求1的肽，其中在该肽的N-末端融合一额外的Gly残基。
4.权利要求1的肽，其中该肽是C-末端酰胺化形式。
5.含有PVGRVHRLLRK的肽或具有PVGRVHRLLRK序列的等价功能并形成-α-螺旋的肽。
6.权利要求5的肽，其中在其N-末端融合形成延伸螺旋或正常螺旋结构的氨基酸。
7.权利要求5的肽，其中该肽的C-末端酰胺化。
8.权利要求5的肽，其中该肽包括选自如下一组的氨基酸序列，所述的组为RAGLQFPVGRVHRLLRK，RAGLQFPVGRVHRLLRK-酰胺，RKGLQKLVGRVHRLLRK，RLLRRLLRRLLRRLLRRLLR，RAGLQFPVGRLLRRLLRRLLR以及所述肽的N-末端融合Gly残基的肽。
全文摘要
本发明涉及比常规的抗微生物肽活性更强或活性相同的肽,其在高盐浓度下具有强抗微生物活性。
文档编号C07K14/00GK1291991SQ99803504
公开日2001年4月18日 申请日期1999年1月22日 优先权日1998年1月22日
发明者金善昌, 朴灿培, 李在铉, 洪承绪, 李贤秀 申请人:株式会社三养吉尼克斯, 金善昌