专利名称：：一种胖大海多糖及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及中药提纯领域，特别涉及一种胖大海多糖及其制备方法和应用。
背景技术：
：胖大海(SemenSterculiaeLychnophera)为梧桐科苹婆属植物的干燥成熟种子，是传统的清咽润喉的中药材。中医认为它有清热润肺、利咽解毒、润肠通便之功效，临床上应用较普遍，主要用于治疗肺闭郁、肺热咳嗽、咽喉肿痛、慢性咽炎、头痛目赤、声嘶音哑及热结便秘等症。胖大海多糖是胖大海中的一种主要成分。陈建民等人(陈建民，曹培让，宋洪涛.胖大海多糖PPIII的纯化及性质的研究[J].中国中药杂志，1996，21(1):39-41)报道了采用沸水(10(TC)提取、丙酮沉淀多糖的方法，吴艳等(吴艳，顾小红，SteveW.Cui，汤坚.胖大海酸性多糖的分离纯化及初步结构研究[J].食品研究与开发，2006，27(7):95-98)公开了采用75。C热水提取、乙醇沉淀的方法，周郑坤等(周郑坤，周文明，贺明宇，吴小青.胖大海水溶性多糖的提取[J].西北林学院学报，2006，21(4):129-131)比较了90。C热水提取和超声波(250W、15min)提取对多糖含量的影响，发现超声波提取时间短且多糖得率高，但最佳多糖得率也仅为8.51%，最终产品中多糖含量为59.9%。而且，上述文献中均没有胖大海多糖的药效试验和数据。
发明内容本发明要解决的技术问题即是提供一种具有较高得率和纯度的胖大海多糖制备方法及其制得的胖大海多糖，该胖大海多糖具有较佳的抗炎活性。由于高温长时间的热水提取会造成胖大海多糖支链的部分水解，粘度下降；而超声波提取则是通过超声波振动产生并传递强大能量，引起媒质点以大的速度进入振动状态，使媒质结构发生变化，促使有效成分进入溶剂中，同时在液体中还会产生空化作用形成空化泡，空化泡在瞬间迅速涨大并破裂，破裂时把吸收的声场能量在极短的时间和极小的空间内释放出来，同时伴有强大的冲击波和微声流，从而破坏植物细胞壁结构，使其在瞬间破裂，植物细胞内的有效成分得以释放、直接进入溶剂并充分混合。然而本发明人经过研究发现，由于胖大海不溶性粘液质含量高，纯粹短时间的超声处理难以将其多糖充分溶出，而大功率或较长时间的超声处理溶液的温度上升很快、不易控制，以致会影响到支链的结构，并且耗能也大。故本发明把超声波处理和水浴提取相结合，先对按常规脱脂和乙醇预处理的胖大海原料进行小功率、短时间的超声处理破坏其细胞结构，然后在温度不高的热水中不断搅拌提取，再按常规将提取液浓縮、醇沉和纯化制备水溶性多糖，此法获得的多糖得率和纯度都比单独使用一种方法提取要高，且多糖具有较佳的抗炎活性。因此，本发明的技术方案为一种胖大海多糖的制备方法，其包括将经脱脂、乙醇预处理的胖大海原料加水先经超声波处理，再加热至5565'C进行提取，然后按常规将提取液浓缩、醇沉及纯化。较佳地，所加的水为经预处理的胖大海原料的7080重量倍。根据本发明，为达到超声处理破坏胖大海细胞壁结构的目的，同时不至于破坏多糖结构，当超声波功率较大时，要适当縮短处理时间，以免影响其结构。本发明优选的超声波的功率为5060W，处理的时间为10~15分钟。较佳地，本发明加水超声处理后提取的次数为23次，每次提取时间为1~2小时，每次提取完毕后将提取液离心过滤除去沉渣，并进一步将过滤液中悬浮的溶涨胶类物质去除，例如用200目左右的尼龙布抽滤。根据本发明，所述的预处理的胖大海原料是指可按常规方法，如上述文献公开的通过醚和醇除去脂类和小分子物质的胖大海原料。例如，所述的预处理可包括下列步骤胖大海粉在306(TC的石油醚中冷凝回流23小时，重复2次进行脱脂；然后将脱脂后的干燥物料在8085%(v/v)乙醇中冷凝回流23小时以除去单糖、多酚、低聚糖和甙类等小分子物质和钝化内源性酶等，重复2次，挥干原料上的溶剂。所述的按常规将提取液浓縮、醇沉及纯化的方法可参照上述文献公开的现有技术，较佳地可以包括下列步骤在5055'C将提取液减压浓縮至原体积的l/6;冷却后加入3~4倍体积的95%乙醇，48。C静置过夜充分沉淀，离心；取沉淀采用Sevag法去除蛋白质进行初步纯化。较佳地，该初步纯化后的物质再用95%乙醇沉淀，离心所得沉淀先后用无水乙醚、丙酮洗涤，然后干燥。更佳地，所述的干燥优选在5560。C下真空干燥或者进行冷冻干燥。本发明要提供的胖大海多糖，即由上述制备方法制得。本发明首先通过醚和醇除去脂类和小分子物质，通过超声波处理、较低温度(低于7(TC)水浴提取得到胖大海水溶性多糖，该法获得多糖的得率和多糖的纯度均高于单独使用一种方法提取胖大海多糖，并且相对粘度(相对水)为2.152.40，也高于高温热水提取的多糖，表明多糖的支链没有被水解。经检测，水溶性多糖的得率为18.020.0%，水分含量7.5~8.7%，灰分含量为7.07.8%，蛋白质含量8.5~10%，总碳水化合物(多糖)含量74.5~77.5%。另外，通过小鼠动物试验，显示了本发明胖大海多糖具有较佳的抗炎消肿活性，可以用于制备抗炎药物。具体实施例方式下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中所用的胖大海原料产于越南，购于无锡山禾药业股份有限公司；超声波仪器为SK5210HP超声波发生器，上海科导超声仪器有限公司。水溶性多糖的得率=多糖质量/胖大海质量;水分含量采用减压干燥方法检测(沈力匀等，食品分析[M]，北京中国轻工业出版社，1994);灰分含量采用马弗炉灰化方法检测(沈力匀等，食品分析[M]，北京中国轻工业出版社，1994);蛋白质含量采用凯氏定氮方法检测(沈力匀等，食品分析[M]，北京中国轻工业出版社，1994);相对粘度(相对水)采用乌氏粘度计方法检测(张惟杰，糖复合物生化研究技术(第二版)[M]，杭州浙江大学出版社，1999);总碳水化合物(多糖)含量采用苯酚一硫酸显色方法检测(董群，郑丽伊，方积年，改良的苯酚-硫酸法测定多糖和寡糖含量的研究m，中国药学杂志，1996，31(9):550-553)。实施例1将无霉变、干燥的胖大海破碎成4050目大小的粉末；在5(TC的石油醚中冷凝回流2.5h，重复2次进行脱脂，将物料晾干；将脱脂后的干燥物料在80X乙醇中冷凝回流2.5h，重复2次以除去单糖、多酚、低聚糖和甙类等小分子物质和钝化内源性酶，挥干原料上的溶剂；加入75倍重量的水浸泡预处理的原料，选取功率为60W超声波，对物料进行超声处理15min;将上述料液加热至65'C，不断搅拌提取1.5h，通过离心机在3500转/分的条件下离心10min，上清液中悬浮的溶涨胶类用200目的尼龙布抽滤，沉渣和不溶物再加入25倍原料重量的水，在65'C水浴中提取l.Oh，进行类似第一次的离心过滤和尼龙布抽滤，合并两次抽滤液；在55X:对收集的抽滤液进行减压浓縮，浓縮至体积的约1/6，倒入洁净容器中冷却至室温；在冷却后的浓縮液中加入4倍体积的95%乙醇，充分搅拌混合，在4。C静置过夜，由于多糖不溶于乙醇形成沉淀，离心15min，收集多糖沉淀；采用Sevag法除去蛋白质将多糖沉淀溶解于水配成1.5%(w/v)的溶液，加入l/4体积的氯仿和正丁醇(体积比4:1)的混合液，剧烈震摇30min，静置除去乳白色的蛋白层，重复操作5次；将除蛋白之后的溶液浓縮，95%乙醇沉淀，离心得多糖沉淀，先后用无水乙醚、丙酮洗涤沉淀，最后将沉淀放在真空干燥箱中，在6(TC下真空干燥，即得胖大海水溶性多糖。称重算得多糖得率为19.6%，水分含量7.7%，灰分含量为7.5%，蛋白质含量9.6%,总碳水化合物(多糖)含量75.2%，相对粘度(相对水)2.24。实施例2将胖大海粉末在6(TC的石油醚中冷凝回流2h，重复2次进行脱脂，将物料晾干；脱脂后的干燥物料在85X乙醇中冷凝回流2h，重复2次，挥干原料上的溶剂；加入70倍重量的水浸泡预处理的原料，选取功率为50W超声波，对物料进行超声处理15rnin;将上述料液加热至60°C，不断搅拌提取2.0h，通过离心机在3500转/分的条件下离心10min，上清液中悬浮的溶涨胶类用200目的尼龙布抽滤，沉渣和不溶物再加入25倍原料重量的水，在6(TC水浴中提取1.5h，进行类似第一次的离心过滤和尼龙布抽滤，合并两次抽滤液；在55"C对收集的抽滤液进行减压浓縮，浓縮至体积的约1/6，倒入洁净容器中冷却；在冷却后的浓縮液中加入3倍体积的95%乙醇，充分搅拌混合，在8。C静置过夜，由于多糖不溶于乙醇形成，离心10min，收集多糖沉淀；Sevag法除蛋白质将多糖沉淀溶解于水配成2.0%(w/v)的溶液，加入1/4体积的氯仿和正丁醇比例(体积比4:1)的混合液，剧烈震摇25min，静置除去乳白色的蛋白层，重复操作5次；余操作同实施例l，最后将沉淀放在真空干燥箱中，在55'C下真空干燥，即得胖大海水溶性多糖。称重算得多糖得率为18.5%，水分含量7.6%，灰分含量为7.3%，蛋白质含量8.6%，总碳水化合物(多糖)含量76.5%，相对粘度(相对水)2.35。实施例3将胖大海粉末在3(TC的石油醚中冷凝回流3h，重复2次进行脱脂，将物料晾干；脱脂后的干燥物料在80X乙醇中冷凝回流3h，重复2次，挥干原料上的溶剂；加入80倍重量的水浸泡预处理的原料，选取功率为60W超声波，对物料进行超声处理10min;将上述料液加热至55'C，不断搅拌提取2.0h，通过离心机在3500转/分的条件下离心10min，上清液中悬浮的溶涨胶类用200目的尼龙布抽滤，沉渣和不溶物再加入25倍原料重量的水，在55。C水浴中提取1.5h，进行类似第一次的离心过滤和尼龙布抽滤，合并两次抽滤液；在5(TC对收集的抽滤液进行减压浓縮，浓縮至体积的约1/6，倒入洁净容器中冷却；在冷却后的浓縮液中加入3倍体积的95%乙醇，充分搅拌混合，在4。C静置过夜，由于多糖不溶于乙醇形成，离心15iHin，收集多糖沉淀；余操作同实施例1，最后将沉淀复水进行冷冻干燥，即得胖大海水溶性多糖。称重算得多糖得率为18.9%，水分含量8.3%，灰分含量为7.2%，蛋白质含量8.9%，总碳水化合物(多糖)含量75.6%，相对粘度(相对水)2.37。上述实施例中乙醇浓度均为体积百分比。试验实施例1本发明胖大海多糖的抗炎活性试验采用急性炎症模型一一二甲苯致小鼠耳廓肿胀实验检测胖大海多糖的抗炎活性。昆明种雄性小鼠，体重(25土2)g，随机分成3组正常对照组、阳性阿司匹林对照组、本发明水溶性多糖试验组，每组8只，分别灌服生理盐水、阿司匹林混悬液(剂量为100mg/kg)和实施例1的胖大海水溶性多糖(200mg/kg)，灌胃量均为0.2mL/10g溶液。灌胃前充分混匀，每日灌胃给药一次，连续5d。末次给药后lh，均匀涂抹二甲苯30uL于各小鼠右耳廓两面以致炎。致炎后lh处死小鼠，沿耳廓基线剪下双耳耳片，对齐双耳用直径8mm的打孔器打下双耳耳片，迅速用分析天平称重，以右耳片重减去左耳片重之差值计算肿胀度(肿胀度=右耳质量一左耳质量)及肿胀率和抑制率，将给药组与对照组肿胀度进行统计学处理(t检验法)，比较组间显著性差异。结果如表l所示。表l胖大海多糖对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注与正常对照组相比，*P<0.05，**P<0.01。由表1可见，阿司匹林组和本发明胖大海多糖均能抑制二甲苯致小鼠耳廓肿胀，其抑制率分别为32.92%和17.84%。与正常对照组比，前者差异高度显著(PO.Ol)，后者差异显著(P0.05)。权利要求1.一种胖大海多糖的制备方法，其包括将经脱脂、乙醇预处理的胖大海原料加水先经超声波处理，再加热至55～65℃进行提取，然后按常规将提取液浓缩、醇沉及纯化。2、如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所加的水为经预处理的胖大海原料的7080重量倍。3、如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的超声波的功率为5060W，处理的时间为1015分钟。4、如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的提取次数为2~3次，每次提取时间为12小时，每次提取完毕后将提取液离心过滤，并进一步将过滤液中悬浮的溶涨胶类物质去除。5、如权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述的溶涨胶类物质用200目的尼龙布抽滤去除。6、如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的预处理的胖大海原料可由下列方法制得:胖大海粉在306(TC的石油醚中冷凝回流23小时，重复2次进行脱脂；然后将脱脂后的干燥物料在80~85%(v/v)乙醇中冷凝回流23小时，重复2次，挥干原料上的溶剂。7、如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的按常规将提取液浓縮、醇沉及纯化包括下列步骤在5055'C将提取液减压浓縮至原体积的1/6;冷却后加入3~4倍体积的95%乙醇，48。C静置过夜，离心；取沉淀采用Sevag法去除蛋白质进行初步纯化。8、如权利要求7所述的制备方法，其特征在于该初步纯化后的物质再用95%乙醇沉淀，离心所得沉淀先后用无水乙醚、丙酮洗涤，然后干燥。9、如权利要求18任一项所述的制备方法制得的胖大海多糖。10、如权利要求9所述的胖大海多糖在制备抗炎药物中的应用。全文摘要本发明公开了一种胖大海多糖及其制备方法。该制备方法包括将经脱脂、乙醇预处理的胖大海原料加水先经超声波处理，再加热至55～65℃进行提取，然后按常规将提取液浓缩、醇沉及纯化。本发明通过超声波处理及较低温度的水浴提取，得到的胖大海水溶性多糖具有较高的得率和纯度，并具有较佳的抗炎活性。文档编号C08B37/00GK101372514SQ20071004509公开日2009年2月25日申请日期2007年8月21日优先权日2007年8月21日发明者艳吴,吴正钧,王荫榆,艾连中,郭本恒申请人:光明乳业股份有限公司