专利名称：一种聚乙烯亚胺衍生物及其作为基因传递的载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种阳离子聚合物，具体地说，涉及一种聚乙烯亚胺衍生物及其作为基因传递的载体。
背景技术：
基因治疗是指通过适当的载体将目的遗传物质导入特定组织细胞(靶细胞)内进行适当的表达，替代或纠正自身基因结构或功能上的错乱，杀死病变细胞或增强机体清除病变细胞的能力等，从而达到治疗目的。现代基因技术和人类基因组工程图谱的完成为采用基因分子生物学方法治疗各类疾病提供了广阔的前景。基因治疗的研究已经深入医学研究的各个领域，成为当今最活跃的生物高技术领域之一。由于核酸物质易被核酸酶水解且带大量负电荷而不利于细胞吞噬，因此，基因治疗的关键是载体材料的选择。研究和开发具有高效安全和组织特异性的基因传递体系成为制约基因治疗发展的瓶颈问题之一。目前研究的基因载体可以分为两大类病毒载体和非病毒载体。病毒载体包括反转录病毒、腺病毒、腺相关病毒和单纯疱疹病毒等。在多数情况下，病毒载体的转染效率高， 但存在毒性、免疫原性及严重的安全性等问题，限制了其在临床治疗中的应用。而非病毒载体由于容易制备、运输、储藏，且安全、有效、无免疫原性等优点，已引起越来越多专家学者的注意。将目的基因连接在表达的质粒或噬菌体中直接注射而不依赖其它物质的介导，是最简单的非病毒载体系统。电穿孔(electroporation)技术和微粒子轰击法 (microparticle bombardment，此法也称作基因枪)的出现，大大提高了裸DNA的转染效率，而且避免了各种酶对DNA的降解，但是对于解剖学上不能进入的部位如器官里的实体瘤，给予裸DNA是无效的。因而出现了更多的非病毒类载体，主要分为阳离子脂质体和阳离子聚合物。(1)阳离子脂质体阳离子脂质体是一种人工制备的携有双层膜的磷脂质小囊，自从!Signer等科学家于1987年首次发现脂质体具有转移基因的作用后，大量的阳离子脂质体被改良后用于基因的转移。这些脂质体主要区别在于它们所带电荷及细微结构的不同。当把目的DNA与这种脂质体混合后，DNA就会浓缩并与之形成较稳定的脂质体DNA复合物(lipoplex)。由于脂质体具有类似生物膜的性质，因此当脂质体DNA复合物与细胞膜接触后，通过胞吞作用而进入胞内。除了较高的转染效率，脂质体没有免疫原性，细胞毒性小，也易于制备，因此阳离子脂质体已成为现今用于基因转移的最常用载体之一。(2)阳离子聚合物人工合成或者天然形成的阳离子聚合物是另外一种已经被广泛用于基因转移的物质。阳离子聚合物是一种新型的非病毒类基因传递系统，在基因治疗领域中有广阔的应用前景。多聚赖氨酸(PLL)是第一个被用于体内基因转移的阳离子聚合物，此后越来越多的线型或树型的阳离子聚合物被用于体内外的基因转移。其中主要包括人工合成的如聚乙烯亚胺(polyethyleneimine，PEI)，树型聚酰胺，以及天然高分子壳聚糖等。阳离子聚合物与DNA形成的复合物(polyplexes)是借助于简单的静电作用，而阳离子脂质体与DNA形成的复合物(lipoplexe)除静电作用外，还包括磷脂分子间的疏水作用以及其它的引力和斥力。因此polyplexes比lipoplexes具有更大的可变性，表现在可以通过对阳离子聚合物的结构修饰来改变它的理化性质、提高转染效率、增加稳定性和靶向性。在聚阳离子非病毒基因载体中，PEI由于具有较高的转染效率，一直都是研究热点之一。PEI分子中每两个碳原子就相应有一个可以质子化的氮原子，由于这些氮原子构成的伯胺、仲胺和叔胺基团的PKa值不同，使PEI具有好的吸收质子的能力，产生所谓的质子海绵效应。这一特性使PEI能在内涵体的酸性环境中吸收H+和反离子，使内涵体内的渗透压增高，导致膜不稳定甚至破裂，从而使被吞噬的复合物逃逸出来，避免DNA降解，实现较好的转染效率。但是一般来讲，PEI的转染效率与其分子量有关，有研究表明当其分子量小于 2000时，就几乎没有转染效果，随分子量的增大，PEI的转染效率会显著增强，但是其毒性也会显著增加。以商品化的PEI2^(M = 25000Da)为例，PEI2^是高效的转染试剂，经常用于转染实验的阳性对照，但是其毒性也非常大，只能低N/P下使用，限制了它们的应用。 一般认为，PEI较高的毒性是由于其分子中高密度的胺基含量所导致的。并且，PEI不具有生物降解性，也不具有靶向性，这些缺陷制约了 PEI的应用。为此，许多研究者对PEI进行结构修饰，开发了各种衍生物，取得了良好的效果。一般认为，PEI的基因转染效率随其相对分子质量的增大而提高，目前较常用的为分子量在20000 25000的PEI。但分子量的增大也伴随细胞毒性的增强，与PEI 800相比，PEI 25000使细胞的正常贴壁率下降50% 90%。利用化学方法将低分子量(一般分子量2000以下)的PEI进行修饰，有希望在保留PEI较高转染活性的同时降低其细胞毒性。目前，很多研究者利用这一概念制备了一系列以多糖为主链，侧链接枝低分子量PEI的聚合物，其研究结果表明这类聚合物虽然采用的是低分子量的PEI，但是其依然表现出很高的转染效率，优势还要高于PEI2^ ；而与低分子量PEI相比，这类材料还表现出较小的细胞毒性，从而得到同时具有较高转染效率和较低毒性的载体。另外一种修饰PEI的策略就是利用小分子化合物修饰PEI得到其衍生物。 Klibanov AM研究组在2002年发表在PNAS的文章就研究了 PEI经过各种小分子化合物修饰之后，其转染效率和毒性与小分子的结构以及亲疏水性的关系，发现经过丙酰胺和十二烷修饰的PEI表现出显著增强的转染效率和低的细胞毒性。Putnam D研究组也详细研究了利用小分子羧酸酰胺化PEI胺基后所得到的PEI衍生物转染效率，细胞毒性与小分子结构之间的关系。研究表明，与未修饰的PEI比较，胺基被部分取代后的衍生物一般表现出相对较高的转染能力和较低的毒性，但是当取代比例超过25%以后，其转染效率就会下降。另外，增加碳链的长度一般也会降低转染效率，而转染效率与复合物的粒径与电势的关系不大。Pack DW研究组利用乙酸酐与PEI反应制备PEI的衍生物，他们发现载体的缓冲能力以及其与DNA的复合物的表面电势会随着乙酰化程度的增加而降低，但是其转染能力却比未修饰的PEI增加21倍。最近，Wagner E课题组还将小分子修饰的PEI衍生物拓展到小干扰RNA(SiRNA)的运输，并且比未修饰的PEI表现出更好的沉默效果。综上所述，利用小分子修饰的PEI衍生物作为基因治疗的载体材料可以表现出更为优异的转染效率和较低的细胞毒性，这也为后期的研究工作提供了依据。
发明内容
本发明的目的在于提供一种聚乙烯亚胺衍生物。本发明的另一目的在于提供该聚乙烯亚胺衍生物的制备方法。本发明的再一目的在于提供该聚乙烯亚胺衍生物用于作为基因运输的载体。为了实现本发明目的，本发明的一种聚乙烯亚胺衍生物，由聚乙烯亚胺与环状磷
酸酯单体反应生成，其结构式为
权利要求
1. 一种聚乙烯亚胺衍生物，由聚乙烯亚胺与环状磷酸酯单体反应生成，其特征在于，其结构式如下所示，其中聚乙烯亚胺分子量为1800-25000g/mol，聚乙烯亚胺与环状磷酸酯单体的接枝比为1 (5-50)(摩尔比)，
2.根据权利要求1所述的聚乙烯亚胺衍生物，其特征在于，所述聚乙烯亚胺的分子量为25000g/mol，聚乙烯亚胺与环状磷酸酯单体的接枝比为1 32。
3.权利要求1或2所述聚乙烯亚胺衍生物的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤1)先将聚乙烯亚胺溶于干燥DMSO中，在40-60°C下搅拌溶解，然后加入环状磷酸酯单体，反应2- ，所述聚乙烯亚胺与环状磷酸酯单体的重量比为0-5) 1 ；2)再用醇类溶剂稀释，将体系沉淀到过量乙醚中，搅拌2-4h后，收集沉淀后干燥；3)重新用去离子水溶解步骤幻所得的聚合物，选择截留分子量为2000-14000Da的透析袋进行透析。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，制备过程在无水环境下进行。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述聚乙烯亚胺为分子量 1800-25000g/mol的支化聚合物。
6.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述透析时间为36-7池。
7.权利要求1或2所述聚乙烯亚胺衍生物在制备用于作为基因运输的载体中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种聚乙烯亚胺衍生物及其制备方法。聚乙烯亚胺衍生物为阳离子聚合物，可作为基因运输的载体。本发明提供的聚乙烯亚胺衍生物可以有效结合DNA，并得到粒径电势的纳米颗粒。此聚合物可以有效将绿色荧光蛋白和萤火虫荧光素酶蛋白的质粒DNA转染进入HEK293细胞，并表现出非常高的转染效率，甚至高于商品化的聚乙烯亚胺的转染效率。本发明的合成方法简单易行，可大批量生产。
文档编号C08G73/04GK102250348SQ201110144699
公开日2011年11月23日 申请日期2011年5月31日 优先权日2011年5月31日
发明者唐凌燕 申请人:蚌埠丰原涂山制药有限公司