专利名称：一种高纯度紫菜多糖的酶辅助提取方法
技术领域：
本发明涉及一种紫菜粗多糖的制备方法，属于生物医药领域，产品可广泛应用于保健品、功能食品、生物医药等领域。
背景技术：
紫菜是一种营养、保健价值极高的海藻。作为人类食用及药用已有上千年历史。迄今为止，我们已从紫菜中分离得到多种化合物，可分为多糖类、氨基酸、蛋白质类、胶质类、 甘露醇、维生素等物质，其中多糖具有抗肿瘤生长，抗病毒，镇静安神，免疫调节，强心，降血脂血压，保护肝脏，降血糖，抗凝血，抗氧化及抗衰老等作用，同时对正常细胞无任何毒副作用。大量研究报告显示紫菜多糖是紫菜主要生物活性成分，紫菜的各种药效与紫菜多糖的活性和含量密切相关，而且紫菜多糖已经成为衡量紫菜产品质量的最重要指标之一。紫菜多糖(porphyran)属于半乳聚糖硫酸酯，主要由半乳糖、3，6_内醚半乳糖和硫酸基等组成，占紫菜干重的20-40%，是紫菜中的主要有效成分。现代医学研究表明紫菜多糖有许多重要的生理功能⑴抗肿瘤作用；⑵抗病毒；⑶免疫调节功能；⑷抗氧化防止衰老；(5)降低血糖、血脂作用；(6)抗血凝作用；(7)消除自由基等，在医药保健品开发等许多领域都具有广阔的开发前景，而且紫菜多糖的保健功能已经成为目前保健食品及药品的研究焦点。在紫菜多糖的开发应用中，分离提取是关键的步骤之一，它不仅影响着产品的得率，直接关系经济效益，还与产品的活性价值密切相关。紫菜多糖传统提取方法主要有热水浸提法、碱法和酸法。紫菜多糖存在于子实体的细胞壁中，传统的水、碱、酸浸提法紫菜多糖的提取时间长，能耗大，提取温度高，而且长时间高温，过酸或过碱有可能使紫菜多糖发生降解，使紫菜多糖的提取很难达到理想效果，这些都大大限制了紫菜多糖的开发和利用。研究表明，蛋白酶对紫菜中的游离蛋白具有水解作用，是使紫菜结构变的松散，同时还会使糖蛋白和白聚糖中游离的蛋白质水解，降低了它们与原料的结合力，有利于多糖的浸出。采用酶法提取紫菜多糖不仅具有条件温和、不引入杂质、无污染、产品质量好等优点，而且不易破坏紫菜多糖的立体结构和生物活性，更重要的是利用蛋白酶结合高温去除蛋白质的这种提取方法多糖的损失率低，有利于后续纯化。随着生物技术的提高，酶制剂来源的广泛，酶活性也将不断提高，价效比不断降低，为其在工业化生产中的应用提供了极大的空间，更适合工业化生产。利用酶法提取紫菜多糖，研究其适宜的提取条件，提高紫菜多糖得率，是提高紫菜附加值的重要途径。
发明内容
技术问题本发明的目的是提供一种高纯度紫菜多糖的酶辅助提取方法，该方法克服了传统提取技术生产周期长，多糖纯度低、提取得率低的缺点。同时该方法简便，易得，制得的紫菜多糖无毒、安全和高活性。所提取的紫菜多糖得率、纯度较高，可广泛应用于保健品、功能食品、生物医药等领域。技术方案紫菜多糖的制备方法，步骤如下①对紫菜原料进行干燥，超微粉碎；②用超临界CO2萃取的方法对原料进行脱脂预处理，萃取条件萃取压力为 31MPa，温度50°C，萃取3小时，分离压力5. 6MPa，温度55°C ；③称取脱脂紫菜粉末，加入20-60倍重量纯水混勻，木瓜蛋白酶加酶量为 0. 2% -2%温度为50-80°C下提取2-4h后于105°C水浴锅内水浴IOmin灭酶，5000r/min下离心15min去除紫菜残渣；④使用旋转蒸发仪将滤液浓缩至原体积的1/4 ；⑤加入80%三氯乙酸至浓缩液终体积的2%，70°C下静置20min，5000r/min下离心30min，去除沉淀，去离子水中透析48h除去三氯乙酸；⑥边搅拌边缓缓向透析液中加入4倍体积95%的乙醇，4°C下醇沉12h，5000r/min 下离心lOmin，弃去上清液，沉淀分别用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤三次后，在55°C烘箱中烘干得紫菜粗多糖粉末，即紫菜粗多糖产品。多糖含量的测定方法采用硫酸苯酚法，精密称取紫菜粉末5g，分别采用热水浸提和木瓜蛋白酶法提取工艺，离心去除滤渣，将滤液定容到250ml容量瓶中，摇勻。精密吸取样液0. 5ml，置15ml试管中，并用蒸馏水补至anl，分别加入Iml 6%苯酚和5ml浓硫酸，摇勻，沸水中水浴20min， 自然冷却后在490nm处测定吸光值A。以D-半乳糖为标准品，制作标准曲线。多糖得率的测定方法粗多糖得率(％ )=[粗多糖质量(g)/紫菜粉末质量(g)]X100%有益效果本发明与传统的热水浸提方法相比提取紫菜多糖得率高、时间短。在紫菜多糖的开发应用中，分离提取是关键的步骤之一，它不仅影响着产品的得率，直接关系经济效益，还与产品的活性价值有着密切的相关性。紫菜子实体木栓质化、结构紧密，具有较好的维持力，存在于细胞壁内的紫菜多糖较难渗出，传统的水提法较难达到理想的效果，而超声萃取、微波萃取、酸提或碱提等方法一定程度上会破坏多糖的立体结构和生物活性。针对这种情况，本发明采用了酶法提取技术，在单因素试验的基础上以温度、 提取时间和加酶量为考察因素，紫菜多糖得率为响应值，采用响应曲面设计方法(表2)，确定了紫菜多糖酶法提取的最佳工艺参数为提取时间3.证，温度为70°C，加酶量为0.5%。结果显示按照本发明工艺参数，紫菜多糖得率可达到26. 07mg/g，纯度达到84. 32%。本发明与传统的热水浸提相比，时间缩短了 50%，得率提高了 46%。本发明采用木瓜蛋白酶法提取紫菜多糖，利用木瓜蛋白酶水解紫菜中的游离蛋白质，使紫菜结构变得松散，促进细胞中有效物质溶出，显著缩短紫菜多糖的提取时间，节省能耗，并大大提高提取得率，同时降低紫菜多糖粗提物中蛋白的含量，有利于紫菜多糖的纯化。因此，该技术适合植物多糖的提取分离。具体实施例方式(一 )试验设计1.热水浸提方法(对照)选择液料比、浸提温度与浸提时间做单因素试验；正交实验选择浸提温度、液料比和浸提时间为考查因素，以多糖得率为测定指标，L9 (34)正交试验方法(表1)，确定紫菜多糖热水浸提的最佳工艺参数。2.酶法提取方法(本发明方案)选择水浴温度、提取作用时间与加酶量做单因素试验；Box-Benhnken设计选择水浴温度、提取作用时间与加酶量为考查因素，以多糖得率为测定指标，采用响应曲面设计方法(表幻，确定紫菜多糖酶法提取的最佳工艺参数。( 二)实施例紫菜粉末新鲜紫菜购于南通天福海苔有限公司。原料经清洗、干燥后超微粉碎获得紫菜粉末备用。1.热水浸提紫菜粗多糖(对照)①称取5克脱脂紫菜粉末，加入250ML纯水混勻，在90°C水浴中浸提7h，冷却后离心，去除紫菜残渣；②使用旋转蒸发仪将滤液浓缩至100ML ；加入80%三氯乙酸至浓缩液终体积的 2%, 70°C下静置20min，5000r/min下离心30min，去除沉淀，去离子水中透析48h除去三氯乙酸；③边搅拌边缓缓向透析液中加入4倍体积的95%乙醇，4°C下醇沉12h，5000rpm/ min下离心15min，弃去上清液，沉淀分别用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤三次后，在55°C烘箱中烘干即可获得热水浸提的紫菜粗多糖粉末。粗多糖得率为17.71士0.25!^/^，纯度为 69. 7%，所用时间为420min。2.酶法提取紫菜粗多糖(本发明)①称取5克脱脂紫菜粉末，加入250ML纯水混勻，水浴锅内预热至70°C，木瓜蛋白酶加酶量为0. 5%，于70°C下提取3. 5个小时，105°C下水浴IOmin灭酶，冷却后离心去除紫
菜残渣；②使用旋转蒸发仪将滤液浓缩至100ML ；加入80%三氯乙酸至浓缩液终体积的 2%, 70°C下静置20min，5000r/min下离心30min，去除沉淀，去离子水中透析48h除去三氯乙酸；③边搅拌边缓缓向透析液中加入4倍体积的95%乙醇，4°C下醇沉12h，5000rpm/ min下离心15min，弃去上清液，沉淀分别用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤三次后，在55°C烘箱中烘干即可获得酶法提取的紫菜粗多糖粉末。粗多糖得率为26.07士0.37!^/^，纯度为 84. 32%，所用时间为2IOmin。如表3所示，采用本发明与传统热水提取方法相比，紫菜多糖的得率提高46 %，纯度提高21%，时间缩短50%。表1热水浸提正交实验结果
权利要求
1.一种高纯度紫菜多糖的酶辅助提取方法，包括①对紫菜原料进行干燥，超微粉碎；②用超临界(X)2萃取的方法对原料进行脱脂预处理，萃取条件萃取压力为31MPa，温度50°C，萃取3小时，分离压力5. 6MPa，温度55°C ；③称取脱脂紫菜粉末，加入20-60倍重量纯水混勻，木瓜蛋白酶加酶量为0.2% -2%温度为50-80°C下提取2-4h后于105°C水浴锅内水浴IOmin灭酶，5000r/min下离心15min去除紫菜残渣；④使用旋转蒸发仪将滤液浓缩至原体积的1/4；⑤加入80%三氯乙酸至浓缩液终体积的2 %，70°C下静置20min，5000r/min下离心 30min，去除沉淀，去离子水中透析48h除去三氯乙酸；⑥边搅拌边缓缓向透析液中加入4倍体积的95%乙醇，4°C下醇沉12h，5000r/min下离心lOmin，弃去上清液，沉淀分别用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤三次后，在55°C烘箱中烘干得紫菜粗多糖粉末，即紫菜多糖产品。
2.根据权利要求1所述的紫菜多糖的制备方法，其特征在于木瓜蛋白酶加酶量为 0. 5%，酶解时间为3.证，温度为70°C，所得紫菜粗多糖得率达到26. 07mg/g，紫菜粗多糖纯度达到84. 32%。
3.根据权利要求1所述制备方法所获得的紫菜多糖产品。
全文摘要
本发明公开了一种高纯度紫菜多糖的酶辅助提取方法，属于生物医药领域。将紫菜烘干、超微粉碎后得紫菜粉末，将粉碎后的紫菜粉末进行超临界CO2萃取(萃取压力为31MPa，温度50℃，萃取3小时，分离压力5.6MPa，温度55℃)脱脂，然后脱脂后的紫菜粉末用50倍的纯水混匀，加入0.5％木瓜蛋白酶于70℃下提取3.5h，5000rpm离心15min弃滤渣，提取液旋转蒸发浓缩至原体积的1/4，加入80％的三氯乙酸(TCA)至溶液总体积的2％混匀之后置溶液于70℃水浴锅中反应20min除蛋白，5000rpm离心30min除去沉淀，去离子水中透析48h除去三氯乙酸，收集透析液，然后缓缓加入4倍体积的95％乙醇，4℃下醇沉12h，5000rpm离心10min，弃去上清液，沉淀分别用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤三次后，55℃烘箱中烘干即得紫菜粗多糖。采用木瓜蛋白酶法提取技术得率为26.07％，纯度达到了84.32％，与热水浸提相比，时间缩短了50％，得率提高了46％。所得的紫菜多糖可广泛用做药品和保健食品的基料。
文档编号C08B37/00GK102268101SQ201110253449
公开日2011年12月7日 申请日期2011年8月31日 优先权日2011年8月31日
发明者安辛欣, 方勇, 施瑛, 杨方美, 王林, 胡秋辉, 赵清秋, 辛志宏, 顾俊, 顾卫明, 马宁 申请人:南京农业大学, 南京财经大学