纤溶酶原和纤溶酶变体的制作方法与工艺

本发明涉及在催化结构域中包括一个或多个点突变的纤溶酶原和纤溶酶的变体，这些点突变减少或防止纤溶酶的蛋白酶活性的自催化破坏。还披露了使用纤溶酶原和纤溶酶的所述变体的组合物、用途以及方法。

背景技术：
酶原纤溶酶原的激活导致溶解纤维蛋白/溶解血栓有活性的丝氨酸蛋白酶纤溶酶的形成。可以通过纤溶酶原激活剂（例如尿激酶、链激酶、葡激酶或tPA），或其任何变体的给予来触发或者增强内源性纤溶酶原的激活。一旦激活，纤溶酶原蛋白质就被蛋白水解地裂解成一条包括5个kringle结构域的重链和一条包括催化结构域的轻链。两条链经由2个二硫键结合在一起。激活以后，自溶裂解从重链去除一个N-末端区段（人类纤溶酶的78个氨基酸；牛纤溶酶的77个氨基酸），并且牛纤溶酶重链可以进一步在kringle3与kringle4之间被自催化裂解，因此产生牛的中纤溶酶（Christensen（克里斯坦森）等人1995，BiochemJ（《生物化学杂志》）305,97-102）。纤溶酶原到纤溶酶的激活（通过在人类纤溶酶原上的R561-V562肽键的裂解而触发）诱导轻链上的大的构象变化，所述变化导致在所述轻链内的催化三联体的引发、或激活。细菌纤溶酶原激活剂（例如链激酶和葡激酶）与纤溶酶原形成一种复合体，并且在纤溶酶原的R561-V562肽键没有裂解的情况下，由于在激活剂-纤溶酶原复合体的形成时的构象变化，纤溶酶原的催化位点得以激活（纤溶酶原激活机制总结于，例如，theIntroductionsectionofTerzyanetal.（Terzyan等人的引言部分）2004；Proteins（《蛋白质》）56:277-284）。鉴于纤溶酶原激活剂充当间接的血栓溶解剂，可替代地已经建议使用纤溶酶本身作为直接的纤维蛋白溶解/血栓溶解试剂。然而，这样的直接使用被以下事实妨碍：像许多蛋白酶，纤溶酶经受自催化的蛋白水解降解，这遵循经受产物抑制的二级动力学（Jespersen（叶斯柏森）等人1986，ThrombosisResearch（《血栓形成研究》）41,395-404）。在20世纪60年代早期，已经确定在酸性pH、或可替代地在中性pH下可以使纤溶酶稳定，其条件是存在一种氨基酸（例如赖氨酸）。尽管如此，即使在pH3.8储存纤溶酶时，报道出Lys104、Arg189以及Lys622（相对于Lys-纤溶酶编号）后的自溶裂解（WO01/36608）。当纤溶酶被储存于甚至更低的pH2.2时，在位置Asp62、Asp154以及Asp346处的Asp-Pro（D-P）之间发生非自溶的酸裂解（WO01/36608）。这说明可以将pH降低到明显的自催化降解不再发生的一个点，但是此时酸水解将变成不稳定的一个因子。在WO01/36608中不存在关于在中性pH下，纤溶酶中的哪个肽键易受（自催化）水解作用的攻击的信息。如由Jespersen（叶斯柏森）等人（1986,ThrombRes（《血栓形成研究》）41,395-404）披露的，已知的纤溶酶稳定剂包括甘油、足够高的离子强度、纤维蛋白原以及ε-氨基己酸（EACA）。赖氨酸和赖氨酸-衍生物（例如EACA和氨甲环酸）以及对氨甲基苯甲酸（PAMBA）是一些另外的已知的稳定剂（Uehsima（乌艾赫斯曼）等人1996，ClinChimActa（《临床化学学报》）245,7-18；Verstraete（佛斯特拉）1985,Drugs（《药物》）29,236-261）。US4,462,980报道尽管纤溶酶储存在酸性条件下，纤溶酶聚集体的形成有助于纤溶酶的降解。在US4,462,980中提供了通过添加一种多羟基化合物对于这个问题的解决方案。稳定纤溶酶的其他方式包括添加寡肽化合物（例如US5,879,923）。可替代地，纤溶酶的催化位点可以通过衍生化（例如酰化）而被可逆地阻断（EP0009879）。纤溶酶的聚乙二醇化作用也已被建议作为稳定该酶的一种手段（WO93/15189）。除了截断形式的纤溶酶，许多纤溶酶变体已经被进行描述并且包括嵌合的微纤溶酶（WO2004/045558）以及具有在二-链裂解位点处（US5,087,572）或在催化三联体氨基酸处的点突变的变体（Mhashilkar（莫哈史卡）等人1993,ProcNatlAcadSciUSA（《美国国家科学院院刊》）90,5374-5377；Wang（王）等人，2001,JMolBiol（《分子生物学杂志》）295,903-914）。Wang（王）等人（1995,ProteinScience（《蛋白质科学》）4,1758-1767和1768-1779）报道了在氨基酸位置545、548、550、555、556、558、560-564、585、740以及788处的广泛系列的微纤溶酶原突变体。Linde（林德）等人（1998,EurJBiochem（《欧洲生物化学杂志》）251,472-479）报道了一种双重突变体，其中在氨基酸位置558和566处的半胱氨酸被丝氨酸取代。Takeda-Shitaka（塔克达-史塔卡）等人（1999,ChemPharmBull（《化学与药学通报》）47,322-328）提及一种具有降低活性的纤溶酶变体，这种变异涉及在氨基酸位置601处的丙氨酸到苏氨酸的取代。以上提及的所有氨基酸位置是相对于起始于氨基酸位置1处的Glu的Glu-纤溶酶原的。在WO91/08297中描述了一种不可裂解的纤溶酶原变体（受损重链与轻链之间的裂解）。Dawson（道森）等人（1994,Biochemistry（生物化学）33,12042-12047）描述了在位置719处具有一个Glu而非Arg（R719E）的Glu-纤溶酶原变体与链激酶的降低的亲和力。在一个Ala（丙氨酸）-扫描中，Jespers（詹斯伯）等人（1998,Biochemistry（生物化学）37,6380-6386）生产了一系列噬菌体展示的微纤溶酶原单位点突变体H569A、R610A、K615A、D660A、Y672A、R712A、R719A、T782A、R789A，并且发现在位置719处的精氨酸对于与葡激酶的相互作用是关键的；D660A突变体由于非常低的表达而没有进一步被表征化；只有R719A突变体以可溶形式额外生产。这些突变体在蛋白水解活性上都没有显示出总的变化（底物S-2403）。Jespers（詹斯伯）等人（1998）在他们的分析中还包括了一种活性位点突变体S741A；此突变体的晶体结构披露于Wang（王）等人（2000,JMolBiol（《分子生物学杂志》）295,903-914）中。在为了阐明链激酶/纤溶酶原相互作用位点的进一步尝试中，Terzyan（特兹彦）等人（2004,Proteins（蛋白质）56,277-284）报道了在已经突变的背景下（R561A）的许多的微纤溶酶原突变体（K698M、D740N、S741A），后者禁止纤溶酶原的蛋白水解激活并且因此禁止有活性的微纤溶酶的形成（这将会使链激酶-微纤溶酶原复合体的接触激活机制的研究复杂化）。Terzyan（特兹彦）等人（2004）进一步提到一种“疏忽的”三重突变体R561A/H569Y/K698M，该三重突变体与双重突变体R561A/K698M相比明显在功能上是无关紧要的。在研究链激酶/纤溶酶（原）相互作用中，Wang（王）等人（2000,EurJBiochem（《欧洲生物化学杂志》）267,3994-4001）在Cys536Ala和Cys541Ser背景下生产了一组微纤溶酶原（Glu-纤溶酶原的氨基酸530-791）突变体。这些突变体包括如上所述的R561A突变体（Terzyan（特兹彦）等人（2004））连同R561A/K698G、R561A/K698A和R561A/K698Q双重突变体。在相同的C536A/C541S背景下，还介绍了单一K698G和K698A突变，其中K698G由于纯化困难而没有进一步被表征化。以上研究目的在于对纤溶酶原/纤溶酶分子的特征获得更好的理解，但是没有报道纤溶酶原/纤溶酶突变体的任何临床有用性或益处或公认的临床优势。Peisach（派萨克）等人（1999,Biochemistry（生物化学）38,11180-11188）成功地确定了包含M585Q、V673M以及M788L突变的微纤溶酶原的晶体结构。Nguyen（阮）&Chrambach（克瑞莫巴克）（1981,PreparativeBiochem（《制备生物化学期刊》）11,159-172）报道了基于尿激酶-激活的纤溶酶的粗制商业制剂（同族溶素）的还原性SDS-PAGE的10.0kDa的“一种小的并且未经鉴定的蛋白组分”的存在。取决于pH的人类纤溶酶的自溶差异已经由Shi（石）&Wu（吴）（1988,ThrombosisResearch（《血栓形成研究》）51,355-364）进行了详细描述。Ohyama（欧雅玛）等人（2004,EurJBiochem（《欧洲生物化学杂志》）271,809-820）提出了非赖氨酸类似物纤溶酶原调节剂在治疗癌症中的用途，该用途归功于通过此类化合物纤溶酶自溶的增强（这导致血管抑素的增强的形成）（在纤溶酶原激活剂尿激酶的存在下）。Ohyama（欧雅玛）等人（2004）的表3中列出了在经受增强自我蛋白水解的化合物的纤溶酶内的多达15个裂解位点。鉴于之前的调查，在讨论他们的观察结果时，似乎是增强自我蛋白水解的化合物或多或少地将选择性地增强B/轻链的蛋白水解；然而不存在增强自我蛋白水解的化合物时，发现了A/重链和B-链两者的最小量降解。清楚的是，以上的方法/变体都没有解决提供一种在分子水平稳定的纤溶酶的问题。具有内在抵抗自催化降解的催化结构域的纤溶酶变体（或可以从其衍生出纤溶酶的对应的纤溶酶原变体）的提供对于纤溶酶的有效并且安全的长期储存连同对于其有效并且安全的治疗用途（例如在溶栓治疗上或在诱导眼睛的玻璃体后脱离或玻璃体液化上）是显著的一大进步。

技术实现要素：
本发明涉及分离的纤溶酶原变体或从其获得的纤溶酶，或涉及分离的纤溶酶变体，或涉及任何的所述纤溶酶的蛋白水解活性的或可逆的无活性的衍生物，其特征在于：(i)在它们的催化结构域中，它们包括在位置P处的一个赖氨酸或精氨酸以及在位置[P+/-n]处的至少一个氨基酸的突变，其中n是1、2、3、4或5，并且其中在位置[P+/-n]处的氨基酸不是赖氨酸并且不是精氨酸；并且(ii)与野生型纤溶酶的自我蛋白水解降解程度相比，(i)的突变降低了所述纤溶酶的自我蛋白水解降解程度，例如用一种生色的或生物学的底物活性测定所确定的。本发明进一步涉及如上所述的纤溶酶原变体、纤溶酶变体、或纤溶酶衍生物，在它们的催化结构域中包括至少两个内部氨基酸的突变：-在位置[P+/-n]和[P+/-n’]处；其中n和n’是1、2、3、4或5；其中在位置[P+/-n]和[P+/-n’]处的氨基酸不是赖氨酸并且不是精氨酸；并且其中如果n和n’都被加到P亦或被从P减去，两者彼此不同；或者-在位置[P+/-n]和[P’+/-n]处；其中P’是P和P’中的更大值；其中在位置P’处的氨基酸是一个赖氨酸或精氨酸；其中n是1、2、3、4或5；其中在位置[P’+/-n]处的氨基酸不是赖氨酸并且不是精氨酸；并且其中，如果存在的话，[P+n]与[P’-n]之间的重叠位置是排除的；并且其中与野生型纤溶酶的自我蛋白水解降解程度相比，所述至少两个内部氨基酸的突变降低了所述纤溶酶变体的自我蛋白水解降解程度，例如可以用一种生色的或生物学的底物活性测定所确定的。任何以上的纤溶酶原变体、纤溶酶变体、或纤溶酶衍生物可以进一步包括该催化结构域的赖氨酸或精氨酸氨基酸中的任何一个或多个（包括在位置P和P’中的任一个处的赖氨酸或精氨酸氨基酸）向一种非赖氨酸、非精氨酸氨基酸的突变。在任何以上的纤溶酶原、纤溶酶、或纤溶酶衍生物中，在位置P或P’处的所述内部氨基酸可以特别选自：(i)在人类纤溶酶催化结构域的位置137处的赖氨酸，或一种非人类纤溶酶催化结构域的对应的赖氨酸或精氨酸；(ii)在人类纤溶酶催化结构域的位置147处的赖氨酸，或一种非人类纤溶酶催化结构域的对应的赖氨酸或精氨酸；或(iii)在人类纤溶酶催化结构域的位置158处的精氨酸，或一种非人类纤溶酶催化结构域的对应的精氨酸或赖氨酸；其中所述人类纤溶酶催化结构域起始于位置1处的氨基酸缬氨酸，该氨基酸缬氨酸是在人类Glu-纤溶酶原的位置562处出现的同一个缬氨酸氨基酸。具体而言，在根据本发明所述的纤溶酶原、纤溶酶、或纤溶酶衍生物中，在位置[P+/-n]处的所述氨基酸是在人类纤溶酶催化结构域的位置138处的氨基酸谷氨酸，或一种非人类纤溶酶催化结构域的对应的氨基酸残基。根据本发明所述的任何纤溶酶原变体、纤溶酶变体、或纤溶酶衍生物的特征可以进一步在于：它的自溶常数是野生型纤溶酶的自溶常数的最多95%。这个特征还可以作为与对应的野生型纤溶酶原或纤溶酶的自我蛋白水解降解相比如上所述的纤溶酶原变体或纤溶酶变体的减少的自我蛋白水解降解的定义。根据本发明所述的任何纤溶酶原变体、纤溶酶变体、或纤溶酶衍生物的特征可以进一步在于：该催化常数kcat在野生型纤溶酶的kcat的10%至200%的范围内。根据本发明所述的任何纤溶酶原变体、纤溶酶变体、或纤溶酶衍生物的特征可以进一步在于：它的自溶常数是野生型纤溶酶的自溶常数的最多95%，并且它的催化常数kcat在野生型纤溶酶的kcat的10%至200%的范围内。在没有强加任何限制的情况下，根据本发明所述的任何以上的纤溶酶原变体、纤溶酶变体、或纤溶酶衍生物可以是以下项中的一个：Glu-纤溶酶原或Glu-纤溶酶、Lys-纤溶酶原或Lys-纤溶酶、中纤溶酶原或中纤溶酶、小纤溶酶原或小纤溶酶、微纤溶酶原或微纤溶酶、δ纤溶酶原或δ纤溶酶。本发明进一步涉及用于作为一种药物使用的如上所述的分离的纤溶酶原变体、纤溶酶变体、或纤溶酶衍生物、或其任意组合。本发明还涉及以下组合物，这些组合物包括如上所述的分离的纤溶酶原变体、纤溶酶变体、或纤溶酶衍生物、或其任意组合、以及药学上可接受的稀释剂、载体或佐剂中的至少一种。这样的组合物可以可任选地进一步包括以下项中的至少一种：抗凝剂、血栓溶解剂、抗炎剂、抗病毒剂、抗细菌剂、抗真菌剂、抗血管生成剂、抗有丝分裂剂、抗组胺剂或麻醉剂。本发明还包括如上所述的分离的纤溶酶原变体、纤溶酶变体、或纤溶酶衍生物的任何有益的应用。在没有强加任何限制的情况下，这些包括：诱导或促进在受试者中病理性纤维蛋白沉积物的溶解，诱导眼睛上的玻璃体后脱离和/或用于诱导眼睛上的玻璃体的液化，协助受试者眼睛中的外科玻璃体切割术，受试者的受损组织的酶促清创，减少受试者的循环纤维蛋白原，减少受试者的α2-抗纤溶酶水平，降低病理性纤维蛋白沉积的风险。本发明进一步涉及用于筛选自我蛋白水解稳定的纤溶酶变体的方法，所述方法包括以下步骤：(i)将在位置[P+/-n]处的一个氨基酸进行突变，其中在位置P的该氨基酸是一个精氨酸或赖氨酸，并且其中n是1、2、3、4或5；(ii)确定从(i)获得的突变体的自我蛋白水解稳定性，例如用一种生色的或生物学的底物活性测定所确定的；(iii)将在(ii)中确定的突变体的自我蛋白水解稳定性与野生型纤溶酶的自我蛋白水解稳定性进行比较；并且(iv)从(iii)选择与野生型纤溶酶相比在自我蛋白水解上更稳定的一个突变体作为自我蛋白水解稳定的变体。在以上的方法中，在位置[P+/-n]处的氨基酸优选不是赖氨酸并且不是精氨酸。在用于筛选自我蛋白水解稳定的纤溶酶变体的一种替代方法中，所述方法包括以下步骤：(i)将在人类纤溶酶催化结构域的位置138处的谷氨酸氨基酸、或一种非人类纤溶酶的对应的氨基酸残基突变成一种与天然氨基酸不同的氨基酸，(ii)确定从(i)获得的该突变体的自我蛋白水解稳定性，例如用一种生色的或生物学的底物活性测定所确定的，并且(iii)从(ii)选择自我蛋白水解稳定的一个突变体作为自我蛋白水解稳定的纤溶酶变体；其中所述人类纤溶酶催化结构域起始于位置1处的氨基酸缬氨酸，该氨基酸缬氨酸是在人类Glu-纤溶酶原的位置562处出现的同一个缬氨酸氨基酸。任何以上的筛选方法可以任选地进一步包括确定该自我蛋白水解稳定的纤溶酶变体的蛋白水解活性的步骤。本发明进一步包括用于增强包括纤溶酶的组合物的长期储存稳定性的方法，所述方法包括以下步骤：鉴别自我蛋白水解稳定的、能够长期存储而没有蛋白水解活性显著丧失的纤溶酶变体。本发明进一步包括用于生产根据本发明所述的纤溶酶原变体的方法，所述方法包括以下步骤：(i)将一种对根据本发明所述的纤溶酶原进行编码的核酸引入到一个能够表达所述纤溶酶原的适合的宿主细胞中；(ii)使在(i)中获得的宿主细胞在用于在所述宿主细胞中表达所述纤溶酶原的条件下以及足够时间段内生长；并且(iii)收获在(ii)中表达的纤溶酶原。这样的方法可以可任选地进一步包括一个将在(iii)中收获的纤溶酶原进行纯化的步骤(iv)。本发明同样包括用于生产根据本发明所述的纤溶酶变体的方法，所述方法包括以下步骤：(i)将一种对根据本发明所述的纤溶酶原进行编码的核酸引入到一个能够表达所述纤溶酶原的适合的宿主细胞中；(ii)使在(i)中获得的该宿主细胞在用于在所述宿主细胞中表达所述纤溶酶原的条件下以及足够时间段内生长；(iii)收获在(ii)中表达的纤溶酶原；(iv)将(iii)的纤溶酶原激活成纤溶酶。这样的方法可以进一步可任选地包括将在(iii)中收获的纤溶酶原在(iv)中的激活前进行纯化的一个步骤。此外，在用于生产根据本发明所述的纤溶酶变体的任何方法中，可以可任选地将在(iv)中收获的激活的纤溶酶进行纯化。还此外，可以可任选地将根据本发明所述的方法生产的有活性的纤溶酶变体进行衍生化和/或可逆地灭活。任何根据本发明所述的纤溶酶原变体、纤溶酶变体、或纤溶酶衍生物优先地以游离的、或溶解的形式获得，例如不附着到宿主的表面（例如在噬菌体展示中）。本发明进一步涉及对根据本发明所述的纤溶酶原变体或纤溶酶变体进行编码的分离的核酸序列。包括此类核酸的重组载体、连同用这种核酸或重组载体转化的宿主细胞也是本发明的部分。附图说明图1具有对野生型人类Glu-纤溶酶原（1至791）以及纤溶酶催化结构域（1至230，粗体的氨基酸序列和编号）的氨基酸位置进行的双重编号的氨基酸序列。如用于证明本发明而使用的微纤溶酶原起始于在位置543处的氨基酸（相对于Glu-纤溶酶原编号）。对Kringle结构域（如来源于Genbank登录号AAA36451中包括的信息）进行了加框，并且它们的氨基酸序列交替地以正常字母和斜体字母打出。催化三联体氨基酸被圈出。图2检索自GenBank的哺乳动物纤溶酶原蛋白质的氨基酸序列比对。用COBALT软件（基于约束条件的多重比对工具（Constraint-basedMultipleAlignmentTool）；Papadopoulos（帕帕多鲍罗斯）&Agarwala（阿加尔瓦拉），Bioinformatics（《生物信息学》）23:1073-79,2007）运行序列比对，该软件通过具有默认设置的国家生物技术信息中心（theNationalCenterforBiotechnologyInformation）（NCBI）网站是可获得的。▼：Glu-纤溶酶原的起始指示。这个氨基酸编号是相对于人类纤溶酶原的。图3示例性的微纤溶酶变体E138Q的还原性SDS-PAGE分析。左泳道：分子量梯，指示分子量。泳道1：激活前的微纤溶酶原E138Q。泳道2：微纤溶酶E138Q，与泳道1相同的材料不过是激活以后的。将凝胶用考马斯亮蓝进行染色。具体实施方式发明详细说明本发明是基于潜藏于以下中的机制的研究结果：在中性pH下纤溶酶的蛋白水解活性的自然的自我灭活，本发明人选择这个研究来集中于主要由纤溶酶的催化结构域组成的微纤溶酶。对纤溶酶裂解敏感的肽键位于赖氨酸或精氨酸的C-末端（Weinstein（温斯坦）&Doolittle（杜利特尔），1972,BiochimBiophysActa（《生物化学与生物物理学报》）258,577-590）。纤溶酶催化结构域（起始于人类Glu-纤溶酶原的氨基酸位置562处的一个缬氨酸）的将近10%（22/230）的氨基酸是赖氨酸或精氨酸。理论上，独立于所述赖氨酸或精氨酸的氨基酸C-末端的结构，在一个纤溶酶分子中的这些赖氨酸和精氨酸的所有肽键的C-末端可以被另一个纤溶酶分子蛋白水解裂解。从理论上进一步来说，这些赖氨酸或精氨酸中的任何一个或多个向一个非赖氨酸、非精氨酸的氨基酸的突变将使得纤溶酶分子更耐受自我蛋白水解降解。如在国际专利申请号PCT/EP2010/059902（WO2011/004011）中描述的，这个理论被证明是正确的。本发明的基础是一个出人意料的观察结果：在纤溶酶催化结构域中的邻近赖氨酸或精氨酸的一个野生型氨基酸向一个非野生型氨基酸的突变（并且这没有必要非对所述赖氨酸或精氨酸进行突变）还大大地提高了生成的突变体纤溶酶对自我蛋白水解降解的耐受性。因此，本发明的一个方面涉及纤溶酶分子并且涉及纤溶酶原分子，特别是激活的/可以潜在地被激活成纤溶酶的纤溶酶原分子，在它们的催化结构域中包括一个或多个氨基酸的突变，这样使得在野生型纤溶酶或纤溶酶原中易受自我蛋白水解降解攻击的肽键在本发明的纤溶酶和纤溶酶原分子主题中少受或不受自我蛋白水解降解的攻击。换句话说，本发明涉及分离的纤溶酶原变体或从它获得的纤溶酶、或涉及分离的纤溶酶变体、或涉及任何所述纤溶酶的蛋白水解活性的或可逆的无活性的衍生物，其特征在于：(i)在它们的催化结构域中，它们包括在位置P处的一个赖氨酸或精氨酸以及在位置[P+n]或[P-n]（进一步注解为[P+/-n]）处的至少一个氨基酸向一个非野生型氨基酸（或向一个不同于天然氨基酸或天然存在的氨基酸的氨基酸）的突变，其中n是1、2、3、4或5，并且其中在位置[P+/-n]处的该氨基酸不是赖氨酸并且不是精氨酸；并且(ii)与野生型纤溶酶的自我蛋白水解降解程度相比，(i)的突变（的存在）降低了所述纤溶酶的自我蛋白水解降解程度（或敏感性、或易感性、或脆弱性），例如可以用例如一种生色的或生物学的底物活性测定所确定的（另外参见）。本发明的目的在于提供分离的纤溶酶变体（例如从纤溶酶原变体中获得的），或任何所述纤溶酶的一种蛋白水解活性的或可逆的无活性的衍生物，其特征在于：所述纤溶酶变体或其衍生物与野生型纤溶酶相比，对于自我蛋白水解具有一个更高的耐受性/更加耐受。关于自我蛋白水解耐受性/易感性的确定的一些考虑进一步随后所述。在给定位置处的一个氨基酸向一个“非野生型氨基酸”、或向一个“不同于天然氨基酸的氨基酸”的突变被认为是在一个野生型纤溶酶原或纤溶酶的所述给定位置处的氨基酸向在所述野生型纤溶酶原或纤溶酶的所述给定位置处的不同于野生型或天然氨基酸的任何氨基酸的变化。关于突变的选择的一些考虑进一步随后所述。具体而言，在位置P处的所述内部氨基酸是一个赖氨酸或精氨酸。作为在此使用的参考（除非另行说明），纤溶酶的催化结构域（在文献中还称为“轻链”或“B-链”）将相对于人类纤溶酶进行编号，人类纤溶酶起始于位置P=1处的缬氨酸，这与在人类Glu-纤溶酶原的位置562处的缬氨酸相同（参见图1）。在此还提到纤溶酶的催化结构域中的两个不同的氨基酸位置，然后它们分别称为[P+/-n]（在位置P处具有赖氨酸或精氨酸）和[P’+/-n]（在位置P’处具有赖氨酸或精氨酸）。为了清晰起见，位置P、P’、[P+/-n]、[P’+/-n]等是整数。位置[P+n]、[P’+n]等具有随着n（n是1、2、3、4、或5）的值增加的P、P’等的整数值；位置[P-n]、[P’-n]等具有随着n（n是1、2、3、4、或5）的值减少的P、P’等的整数值；位置[P+/-n]、[P’+/-n]等具有随着n（n是1、2、3、4、或5）的值增加（+）或减少（-）的P、P’等的整数值。因此，如果例如[P+1]=20，那么P=19，并且[P-2]=17；或者如果例如P’=49，那么[P’-5]=44，并且[P’+3]=52。在纤溶酶催化结构域中的两个不同的氨基酸位置还可以被定义为例如[P+/-n]和[P+/-n’]，其中n和n’两者都具有1、2、3、4、或5的值；并且其中假如n和n’两者都被加上（+）或被减去（-），n和n’彼此不同。在后一种情况下，如果P是例如19；如果n和n’两者都被加，例如n=1并且n’=3；那么[P+n]=20并且[P+n’]=22。或者如果n被减去而n’被加，例如n=n’=1，那么[P-n]=18并且[P+n’]=20。本发明进一步涉及如上所述的纤溶酶原变体、纤溶酶变体、或纤溶酶衍生物，在它们的催化结构域中包括至少两个内部氨基酸向非野生型氨基酸（或向不同于天然氨基酸或不同于天然存在的氨基酸的氨基酸）的突变。-在位置[P+/-n]和[P+/-n’]处；其中n和n’是1、2、3、4或5；其中在位置[P+/-n]和[P+/-n’]处的氨基酸不是赖氨酸并且不是精氨酸；并且其中如果n和n’都被加到P亦或被从P减去，两者彼此不同；或者-在位置[P+/-n]和[P’+/-n]处；其中P’是P以及P’中的更大值；其中在位置P’处的氨基酸是一个赖氨酸或精氨酸；其中n是1、2、3、4或5；其中在位置[P’+/-n]处的氨基酸不是赖氨酸并且不是精氨酸；并且其中，如果存在的话，[P+n]与[P’-n]之间的重叠位置是排除的；并且其中与野生型纤溶酶的自我蛋白水解降解程度相比，所述至少两个内部氨基酸的突变（的存在）降低了所述纤溶酶变体的自我蛋白水解降解程度，例如可以由一种生色的或生物学的底物活性测定来确定。可替代地，根据本发明所述的纤溶酶原变体、纤溶酶变体、或纤溶酶衍生物因此可以包括在它们的催化结构域中在任何位置处（包括在位置P、P’、P”等的一个或多个处）的任何赖氨酸或精氨酸向一个非赖氨酸、非精氨酸氨基酸的突变。本领域的普通技术人员将能够容易地决定一个野生型氨基酸可以突变成何种其他的氨基酸。这样的决定可以但是不一定必然隐含判断标准，例如氨基酸大小、氨基酸电荷、氨基酸极性、和/或氨基酸亲水指数为标准（参见表1）。此外，纤溶酶原和微纤溶酶的晶体结构的可获得性（MMDBID:12717;PDBID:1DDJ；Wang（王）等人，2001,JMolBiol（《分子生物学杂志》）295,903-914）在帮助鉴别突变的氨基酸以使得生成的突变体纤溶酶或纤溶酶原分子保留蛋白水解活性中具有很大价值。此外，可以预期：在给定位置[P+/-n]处的、以及可任选另外在给定位置P、P’、P”等的一个或多个处的野生型氨基酸向一个给定组的氨基酸中的任何一者的突变将会产生类似的结果。基于表1，所述给定组可以定义如下：-疏水性脂肪族氨基酸：Met、Ile、Leu以及Val-疏水性芳香族氨基酸：Phe-亲水性酸性氨基酸：Asp、Glu、Asn以及Gln-亲水性碱性氨基酸：Arg、Lys以及His-适度疏水性脂肪族氨基酸：Gly、Ala、Ser、Thr、Cys、Pro-适度疏水性芳香族氨基酸：Tyr和Trp。为了突变的目的，由于由Cys产生的可能的游离硫醇基、或由于由Pro产生的蛋白质结构的更广泛的干扰，这些中的Cys和Pro作为野生型纤溶酶或纤溶酶原的取代氨基酸可能是更不利的。其他的氨基酸取代包括在一个纤溶酶（原）催化结构域的位置[P+/-n]处的、以及任选地另外地在位置P、P’、P”等中的一个或多个处的向一个非天然或非典型氨基酸、或向氨基酸类似物（例如正亮氨酸、正缬氨酸、鸟氨酸或瓜氨酸）的突变（对于更广泛的列表参见，例如，Hendrickson（亨德里克森）等人2004,AnnuRevBiochem（《生物化学年鉴》）73,147-176）。表1.氨基酸的特征。在如描述于国际专利申请号PCT/EP2010/059902的测试条件（在中性pH下的自然的自我蛋白水解降解）下，在纤溶酶催化结构域内发生了有限数量的自我蛋白水解裂解。这些裂解发生在人类纤溶酶催化结构域的赖氨酸137处、在人类纤溶酶催化结构域的赖氨酸147处以及在人类纤溶酶催化结构域的精氨酸158处。然而，这不排除其他的自我蛋白水解易切割的肽键存在的可能性。因此，有关根据本发明所述的纤溶酶原变体、纤溶酶变体、或纤溶酶衍生物，在位置P或P’处的所述内部氨基酸可以选自：(i)在人类纤溶酶催化结构域的位置137处的赖氨酸，或一种非人类纤溶酶的对应的赖氨酸或精氨酸；(ii)在人类纤溶酶催化结构域的位置147处的赖氨酸，或一种非人类纤溶酶的对应的赖氨酸或精氨酸；和/或(iii)在人类纤溶酶催化结构域的位置158处的精氨酸，或一种非人类纤溶酶的对应的赖氨酸或精氨酸；其中所述人类纤溶酶催化结构域起始于位置1处的氨基酸缬氨酸，该氨基酸缬氨酸是在人类Glu-纤溶酶原的位置562处出现的同一个缬氨酸氨基酸。为了阐明在人类纤溶酶原和人类纤溶酶催化结构域中的氨基酸编号，在此参考图1。具体而言，在上文中，在位置P处的所述至少一个内部氨基酸是位于人类纤溶酶催化结构域的位置137处的赖氨酸，或一种非人类纤溶酶的对应的赖氨酸或精氨酸，并且在位置[P+/-n]处的所述内部氨基酸是在位置[P+1]处的氨基酸，即在人类纤溶酶催化结构域的位置138处的谷氨酸，或一种非人类纤溶酶的对应的氨基酸残基。更具体地，所述谷氨酸突变成另一个亲水性酸性氨基酸，例如，天冬氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺。对在“相对应”于人类纤溶酶（原）的氨基酸的非人类纤溶酶（原）序列中的氨基酸的鉴别（即一种“对应的氨基酸”的鉴别）首先隐含两种氨基酸序列的比对。这样的比对可能需要一些优化，例如在比对序列的一种或两种中引入小缺口以导致最高的同一性和同源性。其次，对与人类纤溶酶（原）中的氨基酸比对的非人类纤溶酶（原）中的氨基酸进行鉴别并且在此将其称为“对应的”氨基酸。图2在此描绘了这样一个公开地可供使用的哺乳动物纤溶酶原蛋白质序列的比对，并且突出了对于本发明有特别利益的人类纤溶酶原序列中的氨基酸（第1行）连同非人类纤溶酶原序列中的对应的氨基酸（第2-18行）。具有特别利益的氨基酸P、P’等是：在位置698处的Lys（在催化结构域中的位置137处，参见图1），在位置708处的Lys（在催化结构域中的位置147处，参见图1）以及在位置719处的Arg（在催化结构域中的位置158处，参见图1）。“纤溶酶”（“plasmin”），还称为溶纤维蛋白酶（fibrinolysin）或溶纤维蛋白（lysofibrin），是来自于酶原纤溶酶原的激活的一种丝氨酸类型蛋白酶。激活是在氨基酸561与562（相对于人类Glu-纤溶酶原编号）之间的自我蛋白水解裂解的结果。纤溶酶携带一条包括5个Kringle结构域的重链和一条包括催化结构域的轻链。纤溶酶原可以从血浆中富集，例如经由赖氨酸亲和层析（Deutsch（德阿特斯克）&Mertz（梅尔兹），1970,Science（《科学》）170,1095-1096）。只要催化结构域依然有功能的，纤溶酶分子（在纤溶酶催化结构域的外部和/或内部）的截断就是可能的，这样的截断因此导致一种纤溶酶的“蛋白水解活性的衍生物”的形成。像这样，5个kringle结构域中的一个或多个可以被全部或部分删除。因此本发明将缺乏一个或多个kringle结构域的和/或缺乏一个或多个kringle结构域的部分的截断的纤溶酶设想为纤溶酶的蛋白水解活性的衍生物的实例。纤溶酶的截断变体的实例包括，但不限于，“中纤溶酶”、“小纤溶酶”、“微纤溶酶”、以及“δ-纤溶酶’。中纤溶酶基本缺乏kringle结构域1至3（例如Christensen（克里斯坦森）等人，1995,BiochemJ（《生物化学杂志》）305,97-102）。小纤溶酶最初是通过用弹性蛋白酶对纤溶酶的限制性酶解来获得的并且基本缺乏kringle结构域1至4（例如Christensen（克里斯坦森）等人，1979,BiochimBiophysActa（《生物化学与生物物理学报》）567,472-481；Powell（鲍威尔）&Castellino（卡斯特里诺），1980,JBiolChem（《生物化学杂志》）255,5329）。后来小纤溶酶已经被重组生产（WO2002/050290）。微纤溶酶最初是在升高的pH下通过纤溶酶的培育来获得的并且基本缺乏所有的kringle结构域（例如WO89/01336）。然而在升高的pH下从纤溶酶的培育获得的微型纤溶酶将包含重链的30-31个羧基-末端氨基酸，重组生产的微型纤溶酶变体将包含重链的19个羧基-末端氨基酸（WO2002/050290）。这说明在一个给定的纤溶酶属，例如微型纤溶酶属内允许分子变异性（例如多个物种形成微型纤溶酶属）。δ-纤溶酶是纤溶酶的一个重组体形式，其中kringle结构域1或kringle结构域4与催化结构域直接连接（WO2005/105990）。上述纤溶酶的截断变体分别通过“中纤溶酶原”、“小纤溶酶原”、“微纤溶酶原”以及“δ纤溶酶原”的激活而获得。为了成为可被激活的，截断的纤溶酶原需要包括在kringle结构域（例如在小型纤溶酶中的kringle5）与催化结构域之间、或在更少kringle更少的截断纤溶酶的情况下与催化结构域的C-末端之间的最小数量的接头氨基酸（参见，例如，Wang（王）等人，1995,ProteinScience（《蛋白质科学》）4,1758-1767）。在本发明的背景下，可以希望的是纤溶酶原包括一个“完整的激活位点”，这隐含了至少氨基酸561和562（相对于人类Glu-纤溶酶原编号；或在非人类纤溶酶原中的对应的氨基酸）是存在的并且存在于分子背景下，这样使得尽管可能伴随不同的动力学但纤溶酶原向纤溶酶的激活/转化可以像在野生型纤溶酶中发生的一样而发生。作为纤溶酶或其有活性的截断变体的取代物，在本发明的背景下可以使用能被激活的纤溶酶原或其截断变体（参见，例如EP0480906；US5,304,383；EP0631786；US5,520,912；US5,597,800；US5,776,452）。“纤溶酶原”是指任何形式的纤溶酶原，例如Glu-纤溶酶原或Lys-纤溶酶原（起始于位置68处的Arg或位置77或78处的Lys）。当使用可激活的纤溶酶原或其可激活的截断变体时，到纤溶酶的激活可能被延迟并且将典型地出现在它与器官、组织或体液接触之后（即给予受试者之后）。在又另一个替代方案中，在本发明的背景下，纤溶酶或其有活性的截断变体可以被取代为可激活的纤溶酶原或其可激活的截断变体连同一种纤溶酶原激活剂（例如组织纤溶酶原激活剂（tPA）、尿激酶、链激酶或葡激酶、或其任何变体；参见，例如US6,733,750；US6,585,972；US6,899,877；WO03/33019）。在又一个另外的替代方案中，在本发明的背景下可以使用以下项中的任意混合物：(i)纤溶酶或其衍生物，(ii)可激活的纤溶酶原或其可激活的衍生物，以及，可任选地(iii)一种纤溶酶原激活剂（参见，例如US2004/0081643）。为了确保纤溶酶（或纤溶酶原）的稳定性，通常将它储存在降低的温度下（例如+4摄氏度或-20摄氏度）。该储存组合物可以是一种稳定化组合物，例如一种低pH组合物（pH4或更低；由例如1mM至250mM的酸（例如柠檬酸）获得，参见，例如Castellino（卡斯特里诺）&Sodetz（索德特兹），1976,MethodsEnzymol（《酶学方法》）45,273-286；WO01/36608；WO01/36609；WO01/36611）或一种高甘油含量组合物（30%-50%v/v，例如Castellino（卡斯特里诺）&Sodetz（索德特兹），1976,MethodsEnzymol（《酶学方法》）45,273-286），可替代地处于一种或多种另外的稳定剂组合物中或与该一种或多种另外的稳定剂组合物结合，这样的稳定剂组合物包括例如氨基酸（例如赖氨酸或其一种类似物，例如EACA或氨甲环酸）、糖（例如甘露醇）或任何在本领域已知的稳定剂（例如二肽，WO97/01631）。进一步包括在“纤溶酶”类别内的是其任何有活性的衍生物（或有活性的截断的纤溶酶变体）、或可激活的纤溶酶原的类似衍生物（或其可激活的截断的变体）。这样的衍生物包括例如标记的纤溶酶或纤溶酶原（或其截断的变体），例如Tc99-标记的纤溶酶（Deacon（迪肯）等人，1980,BrJRadiol（《英国放射学杂志》）53,673-677）或聚乙二醇化的或酰化的纤溶酶或纤溶酶原（或其截断的变体；EP9879，WO93/15189）。还可以使用任何其他的标记（放射性的、荧光的等）来生产纤溶酶或纤溶酶原衍生物。所述衍生物进一步包括杂交的或嵌合的纤溶酶或纤溶酶原分子，包括例如，与例如一种结合纤维蛋白的分子（例如tPA的kringle2、一种载脂蛋白kringle、tPA或纤维连接蛋白的手指结构域或结合纤维蛋白的抗体的Fab结构域）融合的根据本发明所述的截断的纤溶酶或纤溶酶原。能以一种与比较蛋白水解活性的类似的方式，例如，用基于例如纤维蛋白、纤维蛋白原、纤维连接蛋白、明胶、层粘连蛋白或胶原的生色活性测定或生物学的底物活性测定来完成对野生型纤溶酶和根据本发明所述的纤溶酶变体或纤溶酶衍生物的自我蛋白水解耐受性（即稳定性）的比较。为了确定自我蛋白水解耐受性，可以确定自溶速率常数。可以设想根据本发明所述的纤溶酶变体（包括从根据本发明所述的纤溶酶原获得的纤溶酶、或任何的根据本发明所述的纤溶酶衍生物），其特征可以在于这样一个自溶速率常数：比野生型纤溶酶的自溶速率常数低至少5%、或至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、75%、80%、90%、95%、99%或99.5%；或，可替代地，其特征在于这样一个自溶速率常数：是野生型纤溶酶的自溶速率常数的最多95%、或最多0.5%、1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、75%、80%、或90%。为了确定指示的百分比，可以基于绝对自溶速率常数数值进行计算。例如，为野生型微纤溶酶确定了123M-1s-1的自溶速率常数，而为微纤溶酶变体E138Q确定了4M-1s-1的自溶速率常数（参见实例1/表2）。因此，E138Q变体的自溶速率常数是野生型微型纤溶酶的自溶速率常数的3.25%。此外，根据本发明所述的任何的纤溶酶变体（包括从根据本发明所述的纤溶酶原变体获得的纤溶酶、或任何的所述纤溶酶的衍生物）可以保留与野生型纤溶酶的蛋白水解活性不同（更高或更低）的蛋白水解活性，例如用例如基于如纤维蛋白、纤维蛋白原、纤维连接蛋白、明胶、层粘连蛋白或胶原的生色活性测定或生物学的底物活性测定所确定的。根据本发明所述的纤溶酶变体（包括从根据本发明所述的纤溶酶原变体获得的纤溶酶、或根据本发明所述的任何的纤溶酶衍生物）的蛋白水解活性可以通过催化常数kcat来与野生型纤溶酶的蛋白水解活性进行比较，催化常数kcat是每单位时间每个酶位点将底物分子转化为产物的数量的量度。因此，根据本发明所述的任何的纤溶酶变体（包括从根据本发明所述的纤溶酶原获得的纤溶酶、或任何的根据本发明所述的纤溶酶衍生物），其特征可以在于kcat值，该kcat值是在野生型纤溶酶的kcat值的+100%至-90%、或+50%至-50%的范围内，即，其特征在于在野生型纤溶酶的kcat值的10%至200%、或50%至150%的范围内的kcat值。为了确定指示的百分比，可以基于绝对kcat数值进行计算。例如，野生型微纤溶酶具有一个46s-1的kcat，而微纤溶酶变体K137M具有一个36s-1的kcat（参见国际专利申请号PCT/EP2010/059902的实例4/表3）。因此，K137M的kcat是野生型微型纤溶酶的kcat的78.3%。对根据本发明所述的纤溶酶变体（包括从根据本发明所述的纤溶酶原获得的纤溶酶、或任何的根据本发明所述的纤溶酶衍生物）的蛋白水解活性与野生型纤溶酶的蛋白水解活性进行比较的另一个途径包括比较kcat/Km。尽管更高的、可比较的或稍微更低的kcat/Km值可以是优选的，但是比野生型纤溶酶的kcat/Km低达1,000倍或达500倍的根据本发明所述的纤溶酶变体（包括从根据本发明所述的纤溶酶原变体获得的纤溶酶、或任何的根据本发明所述的纤溶酶衍生物）的kcat/Km更低仍然是可接受的（另外参见）。作为举例，E138Q微型纤溶酶变体的kcat/Km被确定为9.5×105，而野生型纤溶酶的kcat/Km被确定为6.9×105（参见实例1/表2），即E138Q微型纤溶酶的kcat/Km值比野生型纤溶酶的kcat/Km值高1.38倍。可替代地，根据本发明所述的任何的纤溶酶变体（包括从根据本发明所述的纤溶酶原获得的纤溶酶、或任何的根据本发明所述的纤溶酶衍生物）可以通过将自溶速率常数数据与kcat/Km数据进行组合来与野生型纤溶酶进行比较。例如，其自溶速率常数比野生型纤溶酶低20倍，并且其kcat/Km比野生型纤溶酶低10倍的纤溶酶变体将优于野生型纤溶酶2倍。显而易见地取决于最终的用途，例如，在低的但是延长的纤溶酶活性被希望或甚至被需要以达到预期临床效果的情况中，高度希望一种具有低蛋白水解活性的非常稳定的纤溶酶（即没有或几乎没有自我蛋白水解降解）。这样，此类具有低蛋白水解活性的高度稳定的纤溶酶变体几乎等同于对一种缓释载体或佐剂的实际使用没有真正需要的缓释配制品。用于比较根据本发明所述的任何的纤溶酶变体（包括从根据本发明所述的纤溶酶原获得的纤溶酶、或任何的根据本发明所述的纤溶酶衍生物）的又另一个替代方案可以通过将自溶速率常数数据与kcat数据进行组合来与野生型纤溶酶进行比较。此外，根据本发明所述的任何的纤溶酶变体（包括从根据本发明所述的纤溶酶原获得的纤溶酶、或任何的根据本发明所述的纤溶酶衍生物），其特征可以在于以上定义的自溶速率常数、催化常数kcat和/或kcat/Km的任意组合。显而易见地，对于例如上述的任何比较测量，令人希望的是将纤溶酶变体与它们的最接近的野生型纤溶酶进行比较，例如，将微纤溶酶变体与野生型微纤溶酶，或将小纤溶酶变体与野生型小纤溶酶进行比较。此外显而易见地，对于任何活性测量，根据本发明所述的纤溶酶变体的可逆灭活衍生物首先应通过去除可逆灭活的原因（例如，酰化或非最佳的pH）来激活。任何的根据本发明所述的纤溶酶变体或从其获得的纤溶酶、任何的根据本发明所述的纤溶酶衍生物可以是Glu-纤溶酶原或Glu-纤溶酶、Lys-纤溶酶原或Lys-纤溶酶、中纤溶酶原或中纤溶酶、小纤溶酶原或小纤溶酶、微纤溶酶原或微纤溶酶、δ纤溶酶原或δ纤溶酶。存在许多的测定来确定一个纤溶酶种类是否有蛋白水解活性。简单并且直接的测定是基于存在于一个样品中的纤溶酶对一种生色底物的酶解；生色底物包括S-2403（Glu-Phe-Lys-pNA）和S-2251（Val-Leu-Lys-pNA），它们在被蛋白水解裂解时释放对硝基苯胺（pNA）。形成的pNA的量可以通过在405nm处的光吸光度来测量。用于确定纤溶酶活性的一个替代测定是电位测定。比色（使用一种生色底物）和电位测定被描述于例如，Castellino（克里斯坦森）&Sodetz（索德特兹）（1976,MethodsEnzymol（《酶学方法》）45,273-286）中。用于确定纤溶酶活性的一个另外的替代测定是酪蛋白水解测定（例如，Robbins（罗宾斯）&Summaria（萨姆瑞），1970,MethodsEnzymol（《酶学方法》）19,184-199；Ruyssen（瑞森）&Lauwers（劳威尔），1978,ChapterIX–Plasmin（第九章–纤溶酶），In“PharmaceuticalEnzymes”（在“医药酶”中），Story-Scientia，Gent（根特）,Belgium（比利时），pp.123-131）。用于确定纤溶酶活性的又另一个取代测定是溶解纤维蛋白测定（例如，Astrup（阿斯楚普）&Mullertz（穆勒特兹），1952,ArchBiochemBiophys（《生物化学与生物物理学学报》）40,346-351）。使用其他的蛋白质底物可以容易地设计出另外的活性测定法。清楚地，此类测定还可以被用来跟踪随着时间的推移由于酶的自我蛋白水解降解，纤溶酶蛋白水解活性的消失。作为用于评估本发明的纤溶酶变体或其任何有活性的截断的变体或衍生物的稳定性的替代方案，可以将所述纤溶酶变体在野生型纤溶酶的存在下进行培育，并且可以对纤溶酶变体对野生型纤溶酶酶解的耐受性进行监测。纤溶酶在从病灶、伤口、溃疡伤口（例如溃疡缝合伤口）等去除坏死元件或碎片的用途已经被描述于例如US3,208,908中。类似地，用于治疗灼伤的包括纤溶酶的治疗制剂的局部应用已经披露于例如US4,122,158中。清创是指去除死的、被损坏的和/或感染的组织以改善或增加其余健康组织的愈合。这样的去除可以通过外科的、机械的或化学的手段，或借助于选择性地吃坏死组织的活蛆（蛆虫疗法）的某些物种来获得。清创还可以使用酶来进行或可以通过酶来辅助，这是一种被称为酶促清创的方法。清创在灼伤和其他的严重的伤口的愈合过程中是一个重要的方面并且它也用于一些类型的蛇咬的治疗中。纤溶酶（或其任何变体或衍生物或其如上所述的替代物）在酶促清创（单独地或与其他类型的清创组合）中的应用在促进或协助伤口愈合中以及作为在外科手术（例如皮肤移植）中的助剂是特别有用的。纤溶酶（或其任何变体或衍生物或其如上所述的取代物）的一个更为公知的用途概括而言涉及纤维蛋白的病理性沉积的治疗。纤维蛋白沉积可以由身体内的多种多样的病理情形造成。例如，在组织中的脉管中可以形成包含纤维蛋白的血凝块，导致深静脉、冠状动脉、大脑动脉或视网膜静脉闭塞或血栓形成。纤维蛋白的少量累积先于，并且可以提供即将发生的灾难性血栓形成的预警。实例包括不稳定心绞痛，它被认为是即将发生的冠状动脉血栓形成以及短暂性脑缺血发作的预警并且可以先于中风。此外，纤维蛋白频繁地沉积于与炎症相关联的组织中，该炎症与许多的疾病过程（包括感染、自身免疫病以及癌症）相关联。纤维蛋白沉积的另一种情形是在由微生物感染造成的脓肿周围。此外，频繁地发现纤维蛋白沉积与某些实体瘤有关。纤维蛋白沉积还可以发生在任何类型的伤口的愈合过程中，包括由外科介入（包括例如小梁切除术）造成的那些。纤维蛋白沉积的又另一种情形是在视网膜静脉中的纤维蛋白的累积，这可以导致视网膜变性、视力紊乱或甚至目盲。术语病理性纤维蛋白沉积物进一步涵盖如形成于或存在于以下项中的此类沉积物：人源以及动物源的并且被包括纤维蛋白的阻塞物有效阻断的导管、导管装置或其他的植入物（例如人造血管以及合成移植物）的尖端。术语“导管装置”是指任何可以进入身体的导管或管状装置，包括动脉导管、心导管、中心静脉导管、静脉内导管、经外周插管的中心导管、肺动脉导管、隧道式中心静脉导管以及动静脉短路。在激发血栓形成（即血栓或止血栓子的形成）的过程中的不同的因素是：(1)对受侵袭的血管的内皮细胞衬壁的损害，(2)血液凝固特性的增加，以及(3)在受侵袭的血管中的血瘀。血栓形成能以附着到血管衬壁的受损部分的非常小的肿块开始。它的存在进一步激发了血栓形成的发生，并且具有通过减小血管的内径而引起血流减速的作用。最初的小血栓的进一步生长经常导致受侵袭的血管全部的或几乎全部的阻断。如果血栓形成发生在动脉之一，由那个动脉供给的组织会失去氧气和营养，从而引起该组织的损害或坏死（坏疽）。损害的严重程度取决于：血栓形成的位置和大小，它生长的速度以及受侵袭的区域是否只有一个动脉或是否由旁系血管供给。如果通向生命器官（例如心脏或脑）的血管受到侵袭，那么这个人可能严重地残废或死亡。有时一个血栓可以包含感染性的有机体（例如细菌），并且伴随着脓的形成和周围组织的感染，可以发生败血性血栓形成。纤溶酶（或其任何变体或衍生物或其如上所述的取代物）的另外的用途包括循环纤维蛋白原水平的降低（例如WO93/07893）和它作为α2-抗纤溶酶抑制剂的用途（报道缺血性中风之后降低脑梗塞的大小；WO00/18436）。纤溶酶（或其任何变体或衍生物或其如上所述的取代物）的又另一个用途涉及作为机械玻璃体切割术的取代物或其助剂来诱导眼睛中的后玻璃体（PVD）脱离和/或玻璃体液化（WO2004/052228；US6,733,750；US6,585,972；US6,899,877；WO03/33019；WO2006/122249；WO2007/047874；US5,304,118；US2006/0024349；US2003/0147877）。玻璃体切割术和/或玻璃体液化对于许多眼睛疾病是有益处的，例如玻璃体飘浮物（可以损害视力的、在正常透明玻璃体液中的能动的碎片/沉积）、视网膜脱离（一种可能由玻璃体牵引造成的盲性疾病）、黄斑皱褶（在黄斑上的瘢痕组织；黄斑对于敏锐的、中央视力是必需的；黄斑皱褶还称为视网膜前膜（epi-或preretinalmembrane）、玻璃纸样黄斑病、视网膜褶皱、表面皱纹视网膜病、黄斑前纤维化、或内界膜疾病）、糖尿病性视网膜病（增生的或非增生的，这可以导致在视网膜上的玻璃体出血和/或纤维疤痕组织的形成（这可引起视网膜脱离））、黄斑裂孔（造成盲点并且由玻璃体牵引、损伤或创伤事件引起的在黄斑中的孔）、玻璃体出血（由糖尿病性视网膜病、损伤、视网膜脱离或视网膜撕裂、蛛网膜下出血（Terson综合征）或被阻断的脉管引起）、玻璃体下出血（在包络玻璃体的玻璃体膜下的出血）、黄斑水肿（在眼睛的黄斑上或下的液体和蛋白质的沉积）以及黄斑变性（起始于，玻璃膜疣的形成；以干形或湿形出现；假设与年龄造成的与年龄相关的黄斑变性相关）。纤溶酶的其他眼部应用包括在小梁切除术手术（被执行以减小眼内压）后的滤过泡的维护或救护，参见例如WO2011/023805。纤溶酶（或其任何变体或衍生物或其如上所述的取代物）的另一个进一步的用途存在于诊断中，更具体而言可以将适当标记的（例如Tc99-标记的，参见以上）纤溶酶（或如上所述的其任何变体或衍生物或其替代物）用于病理性纤维蛋白沉积物的检测。当在这样的诊断中应用根据本发明的截断的纤溶酶或纤溶酶原变体时，要特别注意所述变体仍然包括一个结合纤维蛋白的位点（无论是否来自于纤溶酶本身或将其例如通过创造一个杂交分子而被添加到纤溶酶催化结构域中）。根据本发明所述的纤溶酶或其任何变体或衍生物或其替代物可以被储存在一种药学上可接受的载体、稀释剂或佐剂中。这样的载体、稀释剂或佐剂可以由其组成或包括一种酸性的低缓冲剂，例如1mM-100mM的乙酸盐或柠檬酸盐。当是酸性的时，药学上可接受的载体、稀释剂或佐剂可以具有2.5至5.0的pH，例如在2.5至4.0的pH、或例如在3.0至3.5的pH，或例如在3.1或3.2或3.3或3.4的pH。有用的酸性化合物包括乙酸、柠檬酸、盐酸、乳酸、苹果酸、酒石酸或苯甲酸。可以使用甲酸但是应该注意这个化合物不诱导在Asp-残基的C-末端处的蛋白水解裂解。药学上可接受的载体、稀释剂或佐剂（当它们是酸性的、中性的亦或是碱性的时）可以包括一种或多种氨基酸，例如丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙胺酸、天冬氨酸、赖氨酸、组氨酸或其任何衍生物或类似物。药学上可接受的载体、稀释剂或佐剂可以包括一种碳水化合物,，例如单糖、二糖、多糖或多元醇。实例包括糖类（例如蔗糖、葡萄糖、果糖、乳糖、海藻糖、麦芽糖以及甘露糖），糖醇类（例如山梨醇和甘露醇）以及多糖类（例如糊精、葡聚糖、糖原、淀粉以及纤维素）。药学上可接受的载体、稀释剂或佐剂可以包括如下化合物，例如甘油、烟酰胺、氨基葡萄糖、硫胺素、瓜氨酸、无机盐（例如氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙）、苯甲醇或苯甲酸。药学上可接受的载体、稀释剂或佐剂可以包括如下化合物，例如ε-氨基己酸（EACA）和/或氨甲环酸（也参见以上&背景部分）。这些化合物中的一些可以作为如上所述的纤溶酶或其任何变体或衍生物或其替代物的稳定剂来使用。鉴于上文，本发明的另一个方面涉及作为一种药物使用的根据本发明的分离的纤溶酶原、纤溶酶、或其任何变体或衍生物或其替代物。本发明的一个另外的方面涉及如下组合物，包括根据本发明所述的分离的纤溶酶原、纤溶酶、或其任何变体或衍生物或其替代物，或其任意组合，以及药学上可接受的稀释剂、载体或佐剂中的至少一种。在一个进一步的实施例中，所述组合物可以另外地包括以下项中的至少一种：抗凝剂、另外的血栓溶解剂、抗炎剂、抗病毒剂、抗细菌剂、抗真菌剂、抗血管生成剂、抗有丝分裂剂、抗组胺剂或麻醉剂。在一个针对本发明的上述两个方面的实施例中，根据本发明的分离的纤溶酶原、纤溶酶、或其任何变体或衍生物或其替代物、或其任意组合、或根据本发明的组合物（或与小梁切除术结合）可以用于任何临床上相关的环境，例如用于治疗病理性纤维蛋白沉积、用于诱导眼睛中玻璃体后脱离、用于诱导眼睛中玻璃体的液化、作为眼睛中的玻璃体切割术的助剂并且协助眼睛中的玻璃体切割术、用于诱导玻璃体后脱离、用于溶解玻璃体黄斑粘附、用于闭合黄斑裂孔、用于酶促清创、用于减少循环纤维蛋白原、用于降低α2-抗纤溶酶水平。在针对本发明的上述两个方面的另一个实施例中，根据本发明的分离的纤溶酶原、纤溶酶、或其任何变体或衍生物或其替代物物、或其任意组合、或根据本发明所述的组合物可以用于预防目的或用于预防性治疗的方法中。预防用途包括降低一种哺乳动物中病理性纤维蛋白沉积的发展的风险，该哺乳动物具有发展该病的增加的风险（例如肥胖的哺乳动物、没有做足够的体育锻炼的哺乳动物或计划要经历大型外科事件或手术的哺乳动物）。其他的预防用途包括诱导哺乳动物的一只外观上健康的眼睛中的玻璃体后脱离和/或玻璃体液化，其中该哺乳动物的另一只眼睛被/已被诊断为需要玻璃体后脱离和/或玻璃体液化的诱导。可替代地，本发明涉及用于对受试者中的病理性纤维蛋白沉积物进行治疗、溶解（dissolving）、松散、浸软、溶解（lysing）、诱导或促进溶解的方法，所述方法包括使所述纤维蛋白沉积物与根据本发明的有效量的分离的纤溶酶原、纤溶酶、或其任何变体或衍生物或其替代物、或其任意组合进行接触，所述接触导致对所述病理性纤维蛋白沉积物进行的治疗、溶解（dissolution）、松散、浸软、溶解（lysis）、或诱导或促进溶解。本发明进一步涉及用于诱导眼睛中的玻璃体后脱离和/或诱导眼睛中的玻璃体的液化，或用于协助受试者眼睛中的外科玻璃体切割术的方法，所述方法包括使需要此种治疗的所述受试者的一只眼睛与根据本发明的有效量的分离的纤溶酶原、纤溶酶、或其任何变体或衍生物或其替代物或其任意组合进行接触，所述接触导致所述玻璃体后脱离和/或所述玻璃体的液化的诱导、或导致所述外科玻璃体切割术的简化。本发明还涉及用于一个受试者的损伤组织的酶促清创的方法，所述方法包括使所述损伤组织与根据本发明的有效量的分离的纤溶酶原、纤溶酶、或其任何变体或衍生物或其替代物、或其任意组合进行接触，所述接触导致所述损伤组织的所述酶促清创。本发明的其他方法是治疗或预防任何临床上相关的适应症（包括用于减少受试者中的循环纤维蛋白原、或用于降低α2-抗纤溶酶水平的方法），所述方法包括使需要此种治疗的受试者与根据本发明的有效量的分离的纤溶酶原、纤溶酶、或其任何变体或衍生物或其替代物或其任意组合进行接触，所述接触导致循环纤维蛋白原或所述α2-抗纤溶酶水平的所述降低。大体上，本发明的包括根据本发明所述的纤溶酶（或其任何变体或衍生物或其替代物）的药物或组合物（取决于它的最终用途和给予方式）可以包括一种或多种另外的活性成分，例如抗凝剂、另外的血栓溶解剂、抗炎剂、抗病毒剂、抗细菌剂、抗真菌剂、抗血管生成剂、抗有丝分裂剂、抗组胺剂或麻醉剂。“抗凝剂”包括水蛭素、肝素、香豆素、低分子量肝素、凝血酶抑制剂、血小板抑制剂、血小板聚集抑制剂、凝血因子抑制剂、抗纤维蛋白抗体以及因子VIII-抑制剂（例如描述于WO01/04269和WO2005/016455中的那些）。“血栓溶解剂”包括野生型纤溶酶、野生型纤溶酶原、尿激酶、链激酶、组织型纤溶酶原激活剂（tPA或阿替普酶）、尿激酶型纤溶酶原激活剂（(uPA）以及葡激酶或其任何变体或其任意衍生物（例如APSAC（茴酰化纤溶酶原链激酶激活剂复合物）、瑞替普酶、替奈普酶、scuPA（单链uPA））、或其任意组合。“抗炎剂”包括甾体（例如泼尼松龙、甲泼尼龙、可的松、氢化可的松、泼尼松、曲安西龙、地塞米松）和非甾体抗炎剂（NSAIDs；例如扑热息痛、布洛芬、阿司匹林）。“抗病毒剂“包括曲氟尿苷、阿糖腺苷、阿昔洛韦、伐昔洛韦、泛昔洛韦、以及去氧尿苷（doxuridine）。“抗细菌剂”或抗生素包括氨苄青霉素、青霉素、四环素、土霉素、新霉素b、加替沙星、庆大霉素、妥布霉素、杆菌肽、新霉素以及多粘菌素。“抗霉菌的/抑制真菌的/抗真菌剂”包括氟康唑、两性霉素、克霉唑、益康唑、伊曲康唑、咪康唑、5-氟胞嘧啶、酮康唑以及那他霉素。“抗血管生成剂”包括抗体（或其片段），例如抗-VEGF（血管内皮生长因子）或抗-PlGF（胎盘生长因子）抗体；和以下试剂，例如哌加他尼（哌加他尼钠），色氨酸-tRNA合成酶（TrpRS），阿奈可他乙酸盐，考布他汀A4药物前体，AdPEDF（能够表达色素上皮衍生因子的腺病毒载体（adenovector）），VEGF-抑制物（VEGF-trap），VEGF受体-2抑制剂，VEGF、PlGF或TGF-β抑制剂，西罗莫司（雷伯霉素）以及内皮他丁。“抗有丝分裂剂”包括丝裂霉素C和5-氟尿嘧啶。“抗组胺剂”包括富马酸酮替芬（ketotifen）和马来酸非尼拉敏。“麻醉剂”包括苯佐卡因、氨苯丁酯、狄布卡因、利多卡因、奥布卡因、丙吗卡因、丙美卡因（proparacaine）、丙美卡因（proxymetacaine）、丁卡因（tetracaine）以及丁卡因（amethocaine）。当在此使用时，“接触”是指导致在一种组合物（例如一种药物）与接触所述组合物的组织、体液、器官、有机体等之间的相互作用的任何给予方式。该组合物与该组织、体液、器官、有机体等之间相互作用可以随着该组合物的给予而立即或接近立即开始时发生，可以在一个延长的时期内发生（随着该组合物的给予而立即或接近立即开始），或可以相对于该组合物的给予时间而被延迟。接触病理性纤维蛋白沉积物并且向这样的纤维蛋白沉积物提供（立即、延迟亦或在一个延长时期内）有效量的纤溶酶（或其任何变体或衍生物或其替代物）的任何方法都是可以利用的。如果这样的纤维蛋白沉积与血凝块有关，那么可以将纤溶酶（或其任何变体或衍生物或其取代物）通过注射和/或输注和/或一个导管经动脉内、静脉内、或局部（在凝块的短距离之内或甚至在凝块内）递送。当纤溶酶（或其任何变体或衍生物或其取代物）用于酶促清创中时，它可以被包括在一个能够被局部应用的凝胶样组合物中，或能以液体形式被应用。可以利用向玻璃体和/或房水提供（或者立即、延迟或者在一个扩展时期内）有效量的纤溶酶（或其任何变体或衍生物或其取代物）的、接触该眼睛玻璃体和/或房水的任何方法。接触玻璃体和/或房水的一种方法是通过一种或多种眼内注射直接进入玻璃体和/或房水。可替代地，所述接触可以涉及结膜下的、肌内的或静脉内的注射。一个另外的替代的接触方法涉及放置一种玻璃体内的可植入装置，例如（AlzaCorp.（阿尔扎公司），PaloAlto（帕洛阿尔托），California（加利福尼亚州））或（Bausch&LombInc.（博士伦隐形眼镜公司），Rochester（罗契斯特市），NewYork（纽约州））。可以使用药性持久的、持续释放的配制品或任何可适合植入到其上的装置以一种连续方式使玻璃体和/或房水与有效量的纤溶酶（或其任何变体或衍生物或其取代物）进行接触。术语“有效量”是指根据本发明的药物的、特别是根据本发明的药物的活性成分（即纤溶酶或其有活性的截断的变体（或其任何如上所述的替代物））的给药方案。有效量通常取决于接触或给予的方式以及待治疗的病症，并且将需要针对这些进行调节。药物（更具体而言是它的活性成分）的有效量是在不引起显著的或不必要的毒性作用下，获得所希望的临床结果或或治疗或预防效果所需要的量。为了获得或维持该有效量，这种药物能以单剂量或以多剂量来给予。该有效量根据待治疗的疾病的严重程度或待预防的疾病的预期严重程度而可以进一步变化；这可以取决于患者的整体健康和身体状况，并且通常将需要治疗医生或医师的评估来确定有效量。该有效量可以进一步通过不同类型的给予的组合来获得。该药物可以作为一种溶液（液体或半液体，例如，凝胶样或以分散体或悬浮液、胶体的形式，或以乳液、纳米颗粒悬浮液的形式）或一种固体（例如片剂、迷你片剂、硬或软壳胶囊）来给予。出于溶解血栓的目的，纤溶酶剂量和纤溶酶治疗的持续时间典型地取决于血凝块的大小和位置连同患者的体型、重量和年龄。如果是静脉凝块，那么用纤溶酶的治疗可以持续数日，然而如果是动脉凝块只需要数小时的纤溶酶治疗。可以用短的单剂量疗法来治疗心肌梗塞，然而疾病（例如血栓性静脉炎和肺栓塞）可能需要更长的多剂量治疗。为了降低已知具有发展凝块形成的增加的风险的受试者中凝块形成的风险，可以应用延长的连续式和/或间歇式溶解血栓的纤溶酶疗法来治疗冠状动脉闭塞或将其应用于预防性治疗的情况中。影响纤溶酶剂量的一个另外的因素包括纤溶酶抑制剂例如α2-抗纤溶酶和/或α2-巨球蛋白的循环水平，其初始水平取决于病人。可取的是调节纤溶酶剂量使得全部的循环α2-抗纤溶酶的不多于15%剩余以完成有效的溶解血栓治疗。出于诱导血栓溶解的目的，由于减少了向血清抑制剂的暴露，将纤溶酶或其任何变体或衍生物或其替代物以靠近血栓的短距离进行递送的接触方法可以是有利的。这样的接触方法典型地涉及经由一个导管装置的递送。为了在溶解血栓中使用，作为单一大剂量、或被分为1个初始的大剂量注射随后是1个或多个重复大剂量注射来给予的典型的纤溶酶剂量范围是从500微克/体重至10毫克/kg体重。可替代地，可以经一个延长的时期，例如通过输注或通过药物递送微量泵来给予纤溶酶。用于连续给予的纤溶酶剂量的范围可以是从1mg/kg/小时到10mg/kg/小时。用于诱导玻璃体后脱离、玻璃体液化、玻璃体血液或出血的清理、或来自玻璃体腔的有毒材料或异物的清理的典型的纤溶酶剂量可以在每剂每只眼约0.1微克至约250微克的范围内，该纤溶酶剂量能以每剂每只眼约50微升至约300微升体积的稀释剂或载体来递送。该稀释剂或载体可以是，例如一种无菌的平衡盐溶液（BSS（必施）或BSSPlus（必施佳））、一种生理盐溶液或一种含有1mM-10mM的酸（例如柠檬酸）的溶液。在一个实施例中，纤溶酶以包含在0.1mL稀释剂或载体中的125微克的剂量被递送至眼睛。在计划的外科玻璃体切割术的情况下，可以在玻璃体切割术之前将所述纤溶酶向眼睛递送15分钟至300分钟，或15分钟至120分钟。可替代地，在眼睛中给予纤溶酶的目的是为了避免外科玻璃体切割术，或为了协助随后的外科玻璃体切割术（假如纤溶酶治疗本身不能够完成全部的玻璃体后脱离）。当使用纤溶酶原作为用于纤溶酶的替代来源时（参见“纤溶酶”定义），可以每只眼引入达250微克的纤溶酶原并且所述纤溶酶原可以伴随有高达2000IU的作为纤溶酶原激活剂的尿激酶或链激酶或者伴随有高达25微克的tPA。当在眼睛中使用时，纤溶酶或纤溶酶原给予可以进一步伴随有一种只要对眼睛是无毒的气态佐剂（例如空气、膨胀气体或可液化的气体）的给予。其他的适合的气态材料包括SF6（六氟化硫）和全氟化碳（例如C2F6（六氟乙烷）、C3F8（八氟丙烷）、C4F8（八氟环丁烷）），氧气，氮气，二氧化碳，氩气，以及其他的惰性气体。引入到眼睛中的气态材料的体积可以依赖于气态材料、患者、以及所希望的结果而变化。例如，注射进眼后房的空气的体积的范围可以是从约0.5mL至约0.9mL。其他的气态材料，例如SF6和全氟化碳气体的范围可以是从约0.3mL至0.5mL。优选地，将气态材料以足够将玻璃体压缩对着后玻璃体并且在玻璃体中形成一个腔而不会损害眼睛的量引入到眼后房中。在优选实施例中，将气态佐剂引入到玻璃体中以形成一个填充眼内腔的内体积的约40%至约60%的腔。以上列举的剂量是不意味着以任何方式限制的指示值。此外，所述剂量涉及野生型纤溶酶或纤溶酶原或其任何有活性的或能被活化的截断的变体。当使用根据本发明的具有增加的稳定性的纤溶酶（或其任何变体或衍生物或其取代物）时，并且取决于根据本发明的纤溶酶的最终稳定性和剩余活性，剂量可以是类似的、更高的或更低的以获得与用野生型纤溶酶获得的总体临床效果相同的或更好的总体临床效果。根据本发明的纤溶酶的剂量也可以取决于被内源性抑制剂（例如α2-抗纤溶酶）抑制的速率。与在此披露的工作一致，本发明进一步涉及用于筛选自我蛋白水解稳定的纤溶酶变体的方法，所述方法包括以下步骤：(i)将在位置[P+/-n]处的一个氨基酸突变成一个不同于位置[P+/-n]处的天然氨基酸的氨基酸，其中在位置P的该氨基酸是一个精氨酸或赖氨酸，并且其中n是1、2、3、4或5；(ii)确定从(i)获得的突变体的自我蛋白水解稳定性，这像如上所述来确定，例如借助于生色的或生物学的底物活性测定；(iii)将在(ii)中确定的突变体的自我蛋白水解稳定性与野生型纤溶酶的自我蛋白水解稳定性进行比较；并且(iv)从(iii)选择与野生型纤溶酶相比在自我蛋白水解上更稳定的一个突变体作为自我蛋白水解稳定的变体。其中所述人类纤溶酶催化结构域起始于位置1处的氨基酸缬氨酸，该氨基酸缬氨酸是在人类Glu-纤溶酶原的位置562处出现的同一个缬氨酸氨基酸。在以上的方法中，在位置[P+/-n]处的氨基酸优选地不是赖氨酸并且不是精氨酸。本发明同样涉及用于筛选自我蛋白水解稳定的纤溶酶变体的方法，所述方法包括：(i)将在人类纤溶酶催化结构域的位置138处的谷氨酸氨基酸、或一种非人类纤溶酶的对应的谷氨酸突变成一个不同于所述位置138处的天然氨基酸的氨基酸；(ii)确定从(i)获得的突变体的自我蛋白水解稳定性，这像如上所述来确定或分析，例如借助于一种生色的或生物学的底物活性测定；并且(iii)从(ii)选择自我蛋白水解稳定的一个突变体作为自我蛋白水解稳定的纤溶酶变体；其中所述人类纤溶酶催化结构域起始于位置1处的氨基酸缬氨酸，该氨基酸缬氨酸是在人类Glu-纤溶酶原的位置562处出现的同一个缬氨酸氨基酸。在以上的筛选方法中的任何一个中，所述催化结构域可以进一步包括在位置P、P’、P’’等中的一个或多个处的一个野生型赖氨酸或精氨酸向一个非赖氨酸、非精氨酸氨基酸的突变。以上的筛选方法可以进一步包括一个确定该自我蛋白水解稳定的纤溶酶变体的蛋白水解活性的步骤。通常，许多产品（包括药物（这里应被确切地理解为用户立即可得的活性成分，即处于用于向患者给予的最终的配制品）和这些药物的散装储存的活性成分）在使用之前要储存相当长的时间。尽可能地延长产品的保质期是有利益的。保质期意味着在此期间该产品可以安全地使用并且在此期间该产品保留它的有效效用（即在药物和/或它的活性成分的情况下的它的活性）的时间，。典型地，保质期在一个产品或它的包装上表明。一旦该保质期已过，就不再保证产品的安全和有效效用。在储存产品中的另外一个重要的方面是储存温度，在该储存温度下可以达到所希望的保质期。例如，存储在+4°C或平均冷藏室温度下的产品的保质期可以达到12个月，而存储在-20°C或平均冷冻库温度下的同样的产品的保质期可以达到36个月。然而，逻辑上讲，维持在冷冻温度（例如-20°C）的冷链比维持在+4°C的冷链要更加复杂、困难并且昂贵。因此，具有更短的、但是足够长的与在+4°C下存储产品的可能性结合的保质期仍可以是吸引人的。本发明提供了一种用于延长、增强或增加纤溶酶或其任何活性片段或衍生物或包括纤溶酶或其任何活性衍生物的组合物的保质期或长期储存稳定性的解决方案。该解决方案在于提供如在此所述的纤溶酶变体，所述变体具有增强的稳定性，该稳定性内在地增加、增强或延长了它们的保质期。本发明同样涉及用于增强包括纤溶酶的组合物的长期储存稳定性的方法，所述方法包括鉴别自我蛋白水解稳定的、能够长期存储而没有蛋白水解活性显著丧失的纤溶酶变体的步骤。为了确定长期稳定性，将根据本发明的纤溶酶制剂等分，并且在设想的储存期限内重复进行活性测量。如果设想的储存期限是，例如，24个月，那么可以例如每个月进行活性测量。在设想的储存期限结束时，蛋白水解活性的容许丧失将在很大程度上取决于设想的临床应用，但典型地不能大于例如10%至15%。此外，本发明涉及用于生产根据本发明的纤溶酶原变体，即用于生产这样一种纤溶酶原的方法：该纤溶酶原包括在它的催化结构域中在位置[P+/-n]（其中n是一个选自下组的整数，该组由1、2、3、4以及5组成）处的至少一个内部氨基酸（该氨基酸与在位置P处的内部氨基酸的肽键易于发生自我蛋白水解）向一个氨基酸（该氨基酸与在位置P处的内部氨基酸的肽键更少不太易于或不易于发生自我蛋白水解）的突变。这样的方法包括以下步骤：(i)将一种对根据本发明的纤溶酶原变体进行编码的核酸引入到一个能够表达所述纤溶酶原的适合的宿主细胞中；(ii)使在(i)中获得的该宿主细胞在用于在所述宿主细胞中表达所述纤溶酶原的条件下以及足够时间段内进行生长；并且(iii)收获在(ii)中表达的纤溶酶原。最终，可以向这样的方法中添加一个步骤(iv)，该步骤包括将在(iii)中收获的纤溶酶原进行纯化。用于表达以及生产的适合的宿主细胞和方法披露于例如WO90/13640（昆虫细胞）、WO2002/050290和WO03/066842（酵母细胞）、WO2008/054592（细菌细胞/重折叠过程）以及WO2005/078109（浮萍转基因植物或转基因植物细胞）中。本发明进一步涵盖用于生产根据本发明的纤溶酶变体，即用于生产这样一种纤溶酶的方法：该纤溶酶包括在它的催化结构域中在位置[P+/-n]（其中n是一个选自下组的整数，该组由1、2、3、4以及5组成）处的至少一个内部氨基酸（该氨基酸与在位置P处的内部氨基酸的肽键易于发生自我蛋白水解）向一个氨基酸（该氨基酸与在位置P处的内部氨基酸的肽键更少不太易于或不易于发生自我蛋白水解）的突变。通常，这样的方法包括生产如上所述的根据本发明的纤溶酶原的步骤并且进一步包括使用一种适合的纤溶酶原激活剂（例如tPA、uPA、尿激酶、链激酶、葡激酶或其任何变体）将根据本发明的纤溶酶原激活为根据本发明的纤溶酶的步骤。最终，可以添加一个或多个步骤，其中在激活之前将纤溶酶原进行纯化，将激活的纤溶酶进行纯化和/或像如上所述的将活性纤溶酶进行衍生化和/或可逆地灭活和/或可任选地将其带到适合的储存条件（例如稳定化溶液、冻干和/或低温）。在以上的生产方法中的任何一个中，所述催化结构域可以进一步包括在位置P、P’、P’’等中的一个或多个处的一个野生型赖氨酸或精氨酸向一个非赖氨酸、非精氨酸氨基酸的突变。如上所述的纤溶酶原变体、纤溶酶变体、或纤溶酶衍生物中的任何一个优先地以游离的、或溶解的形式获得，例如不附着或结合到表达宿主的表面（例如在噬菌体展示中的情况）。本发明还涉及对根据本发明的纤溶酶原变体或纤溶酶变体进行编码的一种或多种分离的核酸序列。本发明还涉及包括这种核酸的一种或多种重组载体。本发明还涉及用这种核酸或用这种重组载体转化的一种或多种宿主细胞。实例实例1.纤溶酶原变体的构建、表达和纯化以及激活为纤溶酶。表达载体使用购自于Invitrogen公司（InvitrogenCorporation）（Carlsbad（卡尔斯巴德），California（加利福尼亚））的pPICZαA分泌型载体来指导重组人类微纤溶酶原在巴斯德毕赤酵母中的表达和分泌。这个载体包含酿酒酵母α-因子前多肽原的分泌信号。XhoI识别序列存在于α-因子分泌信号的COOH-末端，刚好在Lys-Arg位点上游，该Lys-Arg位点被Kex2裂解以将分泌信号从成熟蛋白质中去除。可以使用此XhoI限制性酶切位点来克隆具有Kex2裂解位点的感兴趣流的基因，这是通过合成在其5’端具有XhoI和Kex2识别位点的该基因完成的。然后将带有天然NH2-末端的感兴趣的重组基因进行表达。设计的紧接着pPICZαA载体中的α-因子分泌信号的下游的是多克隆位点，该多克隆位点具有协助异源基因克隆的限制性内切酶EcoRI、SfiI、KpnI、SacII以及XbaI的识别位点。基因合成为了改善人类微纤溶酶原在巴斯德毕赤酵母中的表达，考虑了巴斯德毕赤酵母的偏爱密码子使用，从头合成对人类微纤溶酶原及其变体进行编码的基因。为了设计密码子优化的基因序列，将人类微纤溶酶原氨基酸序列（序列ID号：19）输入到由DNA2.0（MenloPark（门洛帕克），California（加利福尼亚））研发的并且在因特网上是免费可获得的程序基因设计者（GeneDesigner）中。使用由该程序提供的巴斯德毕赤酵母密码子使用表将这个序列回译为DNA序列。然后对这个核苷酸序列进行人工检查并且进行调节以更好地符合大肠杆菌的密码子使用。此外，当可能时，去除6个碱基对的回文序列和核苷酸重复。在5’端添加一个XhoI限制性酶切位点和Kex2裂解位点，并且在3’端添加一个XbaI限制性酶切位点。所得序列披露于国际专利申请号PCT/EP2010/059902中。为了改变氨基酸残基，通过在野生型微纤溶酶原序列或在变体微纤溶酶原序列（其中特异性自催化裂解位点已经改变）中使用来自于安捷伦公司（Agilent）（LaJolla（拉荷亚），California（加利福尼亚））的快速改变II定点诱变试剂盒（QuikChangeIISiteDirectedMutagenesisKit）而产生的定点诱变来引入突变（参见国际专利申请号PCT/EP2010/059902）。用定点诱变混合物将大肠杆菌菌株TOP10（Invitrogen）进行转化并且选择抗氨苄青霉素的克隆。所得质粒克隆的序列测定确认了靶标微纤溶酶原编码区的精确诱变连同在编码区中的不想要的突变的不存在。使用以下引物用于定点诱变：Glu138Gln突变GTTCGGTGCTGGTCTGTTGAAACAGGCACAATTACCTGTGATTG（正义；序列ID号：20）和CAATCACAGGTAATTGTGCCTGTTTCAACAGACCAGCACCGAAC)（反义；序列ID号：21）在一个第一变体中，位置138处的谷氨酸被谷氨酰胺取代。Glu138是由位置481-483处的密码子GAA编码。核苷酸GAA（位置481-483）变成了CAG，使微纤溶酶原蛋白质中的Glu138变成Gln（核苷酸序列在序列ID号：22中，而推导的氨基酸序列在序列ID号：23中）。在第二变体中，在变体微纤溶酶原（其中位置147处的赖氨酸已经被谷氨酸取代）中如上在位置138处的谷氨酸被谷氨酰胺取代（核苷酸序列在序列ID号：24中，而推导的氨基酸序列在序列ID号：25中）。在第三变体中，在变体微纤溶酶原（其中位置147处的赖氨酸已经被组氨酸取代并且位置158处的精氨酸已经被组氨酸取代）中如上在位置138处的谷氨酸被谷氨酰胺取代（核苷酸序列在序列ID号：26中，而推导的氨基酸序列在序列ID号：27中）。微纤溶酶原变体的表达以及激活为纤溶酶激活之前，将来自巴斯德毕赤酵母上清液的微纤溶酶原突变体通过免疫亲和直接进行纯化。将一种鼠抗人微纤溶酶抗体（使用微纤溶酶作为抗原在Balb/c小鼠中培养；由在ThromboGenicsN.V.公司可获得的杂交瘤细胞系5D10A4生产）根据来自于通用电器医疗集团（GEHealthcare）的方案n°71500015AD偶联在琼脂糖小珠上。遵循此方案，将7.5mL的免疫亲和树脂从45mg的抗体中进行制备并且将其填充在XK16/20柱中。将粗上清液200mL-400mL（0.2μ过滤自毕赤酵母培养物/pH6.0）直接装载在5D10A4亲和柱上。在一个洗涤步骤之后（100mMKH2PO4，0.5MNaCl，pH6.2，10柱体积），将该微纤溶酶原变体用0.2M的pH3.0的甘氨酸-HCl缓冲液进行洗脱并且将该洗脱物进行中和，并用25mM的pH7.2的磷酸钠缓冲液进行透析）。基本上遵循在WO02/50290的实例2中概述的步骤对这些微纤溶酶变体进行激活。作为举例，上述突变体微纤溶酶原E138Q和对应的被激活的微纤溶酶示于图3中。上述野生型和变体微纤溶酶原种类的氨基酸序列和核苷酸序列列于此后。序列ID号：19-野生型人类微纤溶酶原氨基酸序列apsfdcgkpqvepkkcpgrvvggcvahphswpwqvslrtrfgmhfcggtlispewvltaahcleksprpssykvilgahqevnlephvqeievsrlfleptrkdiallklsspavitdkvipaclpspnyvvadrtecfitgwgetqgtfgagllkeaqlpvienkvcnryeflngrvqstelcaghlaggtdscqgdsggplvcfekdkyilqgvtswglgcarpnkpgvyvrvsrfvtwiegvmrnn序列ID号：22-具有Glu138Gln取代的微纤溶酶原变体（突变密码子为粗斜体加下划线，XhoI和XbaI加下划线）CTCGAGAAAAGAGCACCTTCATTCGACTGTGGTAAGCCTCAGGTCGAACCTAAGAAGTGTCCAGGTCGTGTTGTCGGTGGCTGTGTGGCTCATCCTCATTCTTGGCCTTGGCAAGTGTCTCTTAGAACTAGATTTGGTATGCACTTCTGTGGTGGCACCTTGATCTCACCTGAATGGGTCTTAACCGCAGCTCATTGTCTGGAGAAGTCACCACGTCCATCTTCATACAAGGTCATCCTTGGCGCACATCAGGAAGTCAATCTTGAGCCTCATGTTCAGGAGATCGAAGTCTCTCGTTTGTTCTTGGAACCAACTCGTAAAGACATTGCTCTTCTGAAGCTGTCATCTCCTGCCGTGATTACCGACAAGGTAATTCCTGCCTGCTTGCCTAGTCCTAATTACGTCGTTGCCGACCGTACCGAATGCTTCATTACTGGTTGGGGTGAGACTCAAGGTACGTTCGGTGCTGGTCTGTTGAAACAGGCACAATTACCTGTGATTGAGAACAAGGTTTGTAACAGATACGAGTTCCTGAATGGTCGTGTTCAGTCCACTGAGTTGTGTGCAGGTCACCTTGCAGGTGGTACTGATAGTTGTCAAGGTGATTCTGGTGGACCACTGGTGTGCTTCGAGAAGGATAAGTACATCTTACAAGGTGTTACGTCTTGGGGTCTTGGATGTGCTCGTCCTAACAAGCCAGGTGTCTACGTCAGAGTCTCCAGATTCGTAACTTGGATCGAAGGTGTCATGCGTAACAACTAATCTAGA序列ID号：23-序列ID号：22的推导的氨基酸序列（加下划线的N-末端氨基酸“LEKR”是由引入的XhoI+Kex2裂解位点编码的；引入的氨基酸突变以粗体/斜体指示并且加下划线）LEKRAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKQAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN序列ID号：24-具有Glu138Gln和Lys147Glu取代的微纤溶酶原变体（突变密码子为粗斜体加下划线，XhoI和XbaI加下划线）CTCGAGAAAAGAGCACCTTCATTCGACTGTGGTAAGCCTCAGGTCGAACCTAAGAAGTGTCCAGGTCGTGTTGTCGGTGGCTGTGTGGCTCATCCTCATTCTTGGCCTTGGCAAGTGTCTCTTAGAACTAGATTTGGTATGCACTTCTGTGGTGGCACCTTGATCTCACCTGAATGGGTCTTAACCGCAGCTCATTGTCTGGAGAAGTCACCACGTCCATCTTCATACAAGGTCATCCTTGGCGCACATCAGGAAGTCAATCTTGAGCCTCATGTTCAGGAGATCGAAGTCTCTCGTTTGTTCTTGGAACCAACTCGTAAAGACATTGCTCTTCTGAAGCTGTCATCTCCTGCCGTGATTACCGACAAGGTAATTCCTGCCTGCTTGCCTAGTCCTAATTACGTCGTTGCCGACCGTACCGAATGCTTCATTACTGGTTGGGGTGAGACTCAAGGTACGTTCGGTGCTGGTCTGTTGAAACAGGCACAATTACCTGTGATTGAGAACGAAGTGTGTAACAGATACGAGTTCCTGAATGGTCGTGTTCAGTCCACTGAGTTGTGTGCAGGTCACCTTGCAGGTGGTACTGATAGTTGTCAAGGTGATTCTGGTGGACCACTGGTGTGCTTCGAGAAGGATAAGTACATCTTACAAGGTGTTACGTCTTGGGGTCTTGGATGTGCTCGTCCTAACAAGCCAGGTGTCTACGTCAGAGTCTCCAGATTCGTAACTTGGATCGAAGGTGTCATGCGTAACAACTAATCTAGA序列ID号：25-序列ID号：24的推导的氨基酸序列（加下划线的N-末端氨基酸“LEKR”是由引入的XhoI+Kex2裂解位点编码的；引入的氨基酸突变以粗斜体加下划线指示）LEKRAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKQAQLPVIENEVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN序列ID号：26–具有Glu138Gln、Lys147His和Arg158His取代的微纤溶酶原变体（突变密码子为粗斜体加下划线，XhoI和XbaI加下划线）CTCGAGAAAAGAGCACCTTCATTCGACTGTGGTAAGCCTCAGGTCGAACCTAAGAAGTGTCCAGGTCGTGTTGTCGGTGGCTGTGTGGCTCATCCTCATTCTTGGCCTTGGCAAGTGTCTCTTAGAACTAGATTTGGTATGCACTTCTGTGGTGGCACCTTGATCTCACCTGAATGGGTCTTAACCGCAGCTCATTGTCTGGAGAAGTCACCACGTCCATCTTCATACAAGGTCATCCTTGGCGCACATCAGGAAGTCAATCTTGAGCCTCATGTTCAGGAGATCGAAGTCTCTCGTTTGTTCTTGGAACCAACTCGTAAAGACATTGCTCTTCTGAAGCTGTCATCTCCTGCCGTGATTACCGACAAGGTAATTCCTGCCTGCTTGCCTAGTCCTAATTACGTCGTTGCCGACCGTACCGAATGCTTCATTACTGGTTGGGGTGAGACTCAAGGTACGTTCGGTGCTGGTCTGTTGAAACAGGCACAATTACCTGTGATTGAGAACCACGTGTGTAACAGATACGAGTTCCTGAATGGACACGTGCAGTCCACTGAGTTGTGTGCAGGTCACCTTGCAGGTGGTACTGATAGTTGTCAAGGTGATTCTGGTGGACCACTGGTGTGCTTCGAGAAGGATAAGTACATCTTACAAGGTGTTACGTCTTGGGGTCTTGGATGTGCTCGTCCTAACAAGCCAGGTGTCTACGTCAGAGTCTCCAGATTCGTAACTTGGATCGAAGGTGTCATGCGTAACAACTAATCTAGA序列ID号：27-序列ID号：26的推导的氨基酸序列（加下划线的N-末端氨基酸“LEKR”是由引入的XhoI+Kex2裂解位点编码的；引入的氨基酸突变以粗斜体下加划线指示）LEKRAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKQAQLPVIENHVCNRYEFLNGHVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN微纤溶酶变体的自溶速率常数和动力学参数对于不同的微纤溶酶突变体获得的kcat/Km和自溶速率常数值列于下表2中。这些值基本上是遵循在国际专利申请号PCT/EP2010/059902的实例3和4中描述的方法来获得的。表2.实例2.纤溶酶变体在体外或体内模型中的治疗功效2.1纤溶酶变体对脑梗塞大小的作用本发明的纤溶酶变体在减少脑梗塞大小中的功效可以在例如描述于WO00/18436的实例2中的、或根据Welsh（威尔士）等人（1987,JNeurochem（《神经化学》）49,846-851）的鼠类脑梗塞模型中进行。在WO00/18436的实例5中证明了野生型纤溶酶对脑梗塞大小的有益作用。对本发明的任何纤溶酶变体进行类似的实验，并且对这些纤溶酶变体的有益作用进行测量并与野生型纤溶酶的有益作用进行比较。2.2纤溶酶变体的体内溶解血栓活性可以使用兔子体外循环溶解血栓模型（WO02/50290的实例6；Hotchkiss（霍奇基斯）等人，1987,ThrombHaemost（《血栓形成和止血杂志》）58,107-摘要377）、铜线圈诱导的狗冠状动脉回旋支血栓形成模型（WO02/50290的实例8；Bergmann（伯格曼）等人，1983,Science（《科学》）220,1181-1183）或兔子颈静脉血栓形成模型（Collen（科伦）等人，1983,JClinInvest（《临床研究杂志》）71,368-376）来确定本发明的纤溶酶变体的体内溶解血栓活性。使用如描述于WO00/18436的实例7和9中的和由Collen（科伦）等人（1983）描述的这些模型来证明野生型纤溶酶对溶解血栓的有益作用。对本发明的任何的纤溶酶变体进行类似的实验，并且对这些纤溶酶变体的有益作用进行测量并与野生型纤溶酶的有益作用进行比较。2.3纤溶酶变体的体外溶解血栓活性在WO01/36609的实例6中描述了外周动脉闭塞（PAO）的一个体外模型，并且在此模型中证明了野生型纤溶酶的溶解血栓功效。对本发明的任何纤溶酶变体进行类似的实验，并且对这些纤溶酶变体对外周动脉闭塞的溶解血栓的有益作用进行测量并与野生型纤溶酶的有益作用进行比较。2.4由纤溶酶变体诱导的眼睛玻璃体液化和玻璃体后脱离WO2004/052228的实例5披露了用于确定微纤溶酶的功效、连同微纤溶酶对猪尸眼中的玻璃体的液化的功效的测定。WO2004/052228的实例6披露了用于确定微纤溶酶的功效、连同微纤溶酶对人类的尸眼中的玻璃体后脱离（PVD）的功效的测定。在类似的死后模型中证明由本发明的纤溶酶变体对玻璃体液化和PVD的诱导。2.5由纤溶酶变体诱导的体内PVDWO2004/052228的实例7披露了用于确定微纤溶酶的功效、连同微纤溶酶对体内猫模型中的PVD的诱导功效的测定。在类似的体内模型中证明由本发明的纤溶酶变体对PVD的诱导。