一种樟芝多糠的提取方法
【专利摘要】本发明涉及一种樟芝多糖的提取方法。所述的提取方法包括以下步骤：先用接肿铲取斜面培养基中培养好的带培养基的樟芝菌装入三角瓶中进行培养；再取培养后的樟芝菌10%-20%接种于发酵罐中进行发酵培养并将培养液过筛，过滤，取滤液粉碎匀浆，水浴浸提，离心，旋转蒸发浓缩，醇析，离心，取沉淀加等量蒸馏水溶解，并加氯仿异戊醇剧烈振荡，上清液加无水乙醇回流提取，离心分离乙醇，将沉淀冷冻干燥，制得樟芝菌多糖干品；将樟芝菌多糖粗品采用中空纤维超滤膜进行过滤，得到不同分子量的多糖体，分别经浓缩干燥后得樟芝多糖的干制品。本发明对样品先后培养、水浴浸提、离心浓缩及回流提取，多糖产量高，提取充分，多糖破坏少，能耗低，无污染。
【专利说明】一种樟芝多糠的提取方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程【技术领域】，具体涉及一种樟芝多糖的提取方法。
【背景技术】
[0002]樟芝(Antrodia)又名牛樟芝、是台湾特有的珍贵药用多孔真菌，据报道。研究显不，樟芝含有多种生物活性物质，如樟芝多糖、三職类、S0D、腺苷、免疫球蛋白，维生素,微量元素、核酸、凝血素、氨基酸、固醇类、木质素和血压稳定物质等，具多有多种生理活性，如保肝、抗肿瘤、抗氧化、提高免疫、抗病原菌及解毒等。在台湾地区，樟芝被广泛用于调血脂、解毒保肝、排毒，至今未有不良反应发生。研究发现，樟芝多糖是樟芝中主要的保健功能因子之一，其具有提高免疫、抗癌、防止动脉粥样硬化及降低心脑血管事件发生等功效。目前，樟芝多糖已引起了国内学者的广泛关注。
[0003]近年来研究发现，樟芝多糖的生理活性与其分子量、分子结构及提取工艺等均密切相关，分离提取工艺可对樟芝多糖的药用价值具有真接的影响，目前樟芝多糖多采用热水提取、醇析等工艺，不仅操作复杂，而且不易获得多糖粗品，且得糖率低，给其工业化应用带来困难。为此，本发明提供一种操作简便、得糖率高、适于工业化生产的樟芝多糖的提取方法。
【发明内容】
[0004]本发明的目的就是针对上述现有技术中存在的缺陷提供一种操作简便、得糖率高、适于工业化生产的樟芝多糖的提取方法
本发明的技术方案如下:
一种樟芝多糖的提取方法，包括以下步骤:
(1)樟芝菌种子液的培养:用接肿铲取l-3cm2的斜面培养基中培养好的带培养基的樟芝菌装入500ml的三角瓶中进行培养；
(2)取步骤(I)中培养后的樟芝菌10%-20%接种于发酵罐中进行发酵培养，将培养液过40目筛，截留的菌丝体再用3倍蒸馏水洗涤过滤，筛下即为樟芝发酵液；
(3)樟芝菌多糖的提取:将步骤(2)中制得的樟芝发酵液过滤滤除菌体，取滤液加2-3倍量蒸馏水于多功能机粉碎匀浆，水浴浸提，离心，取上清液进行旋转蒸发浓缩，取浓缩液在4°C条件下进行醇析，离心，取沉淀加等量蒸馏水溶解后，加2-3倍氯仿异戊醇剧烈振荡，上清液加4-5倍量无水乙醇回流提取3-5次，每次1.5-2h，离心分离乙醇，将沉淀冷冻干燥，制得棒之囷多糖干品；
(4)樟芝多糖粗品处理:将步骤(3)中制得的樟芝菌多糖粗品采用中空纤维超滤膜进行过滤，得到不同分子量的多糖体，分别经浓缩干燥后得樟芝多糖的干制品。
[0005]优选的，步骤(I)中所述的三角瓶中的装液量为100_150ml。
[0006]优选的，步骤(I)中所述的培养温度为25_28°C，培养时间为3_5d。
[0007]优选的，步骤(2)中所述的发酵培养条件为:培养温度25_28°C，转速200_230r/min,培养时间6-8d，通气量120-150L/h，装液量:5_7L。
[0008]优选的，步骤(3)中所述的水浴浸提时水料比为(1-3):1 ;水浴浸提的的时间为1.5-2h，温度为120-135°C ；旋转蒸发浓缩的操作温度为60_65°C。
优选的，步骤(3)中所述的醇析过程中采用的溶剂为无水乙醇。
[0009]优选的，步骤(3)中所述的醇析过程中，所述的浓缩液与溶剂的体积比为(1-1.5):(4-5)。
[0010]优选的，步骤(3)中所述的氯仿异戊醇中，氯仿与异戊醇的体积比为(4-6):(0.8-1.5)。
[0011]优选的，步骤(3)中所述的离心时间为30-60min，离心温度为25_28°C。
[0012]优选的，步骤(4)中所述的超滤过程中压力为0.2-0.5Mpa，所述的中空纤维超滤膜为1000、100、1kDa的三组件中空纤维超滤膜。
[0013]本发明与现有技术相比，具有以下有益效果:
1.本发明先后采用水浴浸提、离心浓缩及无水乙醇回流提取，可对樟芝中多糖进行充分提取；且在水浴浸提时，本发明将水料比控制为(1_3):1，不仅保证了多糖的充分提取，避免了水提液总量增加导致醇沉时多糖的损失，而且也明显降低了后续操作中的能耗。
[0014]2.目前多糖的含量测定多采用HPLC法，本发明中，在多糖的提取前，采用氯仿异戊醇剧烈振荡，可有效去除蛋白沉淀，避免了样品中蛋白质对多糖出峰的影响，保证了 HPLC法测定含量的准确性与灵敏性。
[0015]3.超滤膜具有的微孔不对称性结构，使得大分子微粒流经膜表面，小分子物质流过超滤膜，从而保证大分子及小分子的有效分离，而且可常温操作，耗能低，还具有可连续使用及无污染等优点，可满足工业化大生产的需求。
[0016]4.多糖易溶于热水，难溶于有机溶剂，本发明中，先对样品采用乙醇预处理，可有效去除三萜类等脂溶性物质用大部分色素，同时，还能有效软化和破坏细胞膜，利于多糖的充分提取。
[0017]5.本发明中先取l_3cm2的斜面培养基中培养好的带培养基的樟芝菌装入500ml的三角瓶中进行培养；在进行发酵培养时，接种量为10%_20%，可保证樟芝菌的生长繁殖更有利的进行，从而明显提高其多糖含量。
【具体实施方式】
[0018]本发明通过以下具体实施例更详细的说明本发明，可以使本专业技术人员更全面的了解本发明，但不以任何方式限制本发明。
[0019]实施例1
一种樟芝多糖的提取方法，包括以下步骤:
(1)樟芝菌种子液的培养:用接肿铲取Icm2的斜面培养基中培养好的带培养基的樟芝菌装入装液量为10ml的500ml的三角瓶中进行培养，培养温度为25°C，培养时间为3d ；
(2)取步骤(I)中培养后的樟芝菌10%接种于发酵罐中进行发酵培养，培养温度25°C，转速200r/min，培养时间6d，通气量120_150L/h，装液量:5L ;将培养液过40目筛，截留的菌丝体再用3倍蒸馏水洗涤过滤，筛下即为樟芝发酵液；
(3)樟芝菌多糖的提取:将步骤(2)中制得的樟芝发酵液过滤滤除菌体，取滤液加2-3倍量蒸馏水于多功能机粉碎匀浆，水浴浸提，水浴浸提时水料比为1:1;水浴浸提的的时间为1.5h，温度为120°C ;离心，取上清液进行旋转蒸发浓缩，取浓缩液在4°C条件下进行醇析，离心，取沉淀加等量蒸馏水溶解后，加2倍氯仿异戊醇剧烈振荡，上清液加4倍量无水乙醇回流提取3次，每次1.5h，离心分离乙醇，将沉淀冷冻干燥，制得樟芝菌多糖干品；
(4)樟芝多糖粗品处理:将步骤(3)中制得的樟芝菌多糖粗品采用中空纤维超滤膜进行过滤，得到不同分子量的多糖体，分别经浓缩干燥后得樟芝多糖的干制品。
[0020]步骤(3)中所述的醇析过程中采用的溶剂为无水乙醇。
[0021]步骤(3)中所述的醇析过程中，所述的浓缩液与溶剂的体积比为1: 4。
[0022]步骤(3)中所述的氯仿异戊醇中，氯仿与异戊醇的体积比为4: 0.8。
[0023]步骤(3)中所述的离心时间为30min，离心温度为25°C。
[0024]步骤(4)中所述的超滤过程中压力为0.2Mpa，所述的中空纤维超滤膜为1000、10UOkDa的三组件中空纤维超滤膜。
[0025]实施例2
一种樟芝多糖的提取方法，包括以下步骤:
(1)樟芝菌种子液的培养:用接肿铲取3cm2的斜面培养基中培养好的带培养基的樟芝菌装入装液量为150ml的500ml的三角瓶中进行培养，培养温度为28°C，培养时间为5d ；
(2)取步骤(I)中培养后的樟芝菌20%接种于发酵罐中进行发酵培养，培养温度28°C，转速230r/min，培养时间6_8d，通气量150L/h，装液量:7L ;将培养液过40目筛，截留的菌丝体再用3倍蒸馏水洗涤过滤，筛下即为樟芝发酵液；
(3)樟芝菌多糖的提取:将步骤(2)中制得的樟芝发酵液过滤滤除菌体，取滤液加3倍量蒸馏水于多功能机粉碎匀浆，水浴浸提，水浴浸提时水料比为3:1 ;水浴浸提的的时间为2h，温度为135°C ;离心，取上清液进行旋转蒸发浓缩，取浓缩液在4°C条件下进行醇析，离心,取沉淀加等量蒸馏水溶解后,加3倍氯仿异戊醇剧烈振荡，上清液加5倍量无水乙醇回流提取5次，每次2h，离心分离乙醇，将沉淀冷冻干燥，制得樟芝菌多糖干品；
(4)樟芝多糖粗品处理:将步骤(3)中制得的樟芝菌多糖粗品采用中空纤维超滤膜进行过滤，得到不同分子量的多糖体，分别经浓缩干燥后得樟芝多糖的干制品。
[0026]步骤(3)中所述的醇析过程中采用的溶剂为无水乙醇。
[0027]步骤(3)中所述的醇析过程中，所述的浓缩液与溶剂的体积比为1.5:5。
[0028]步骤(3)中所述的氯仿异戊醇中，氯仿与异戊醇的体积比为6: 1.5。
[0029]步骤(3)中所述的离心时间为60min，离心温度为28°C。
[0030]步骤(4)中所述的超滤过程中压力为0.5Mpa，所述的中空纤维超滤膜为1000、10UOkDa的三组件中空纤维超滤膜。
[0031]实施例3
一种樟芝多糖的提取方法，包括以下步骤:
(1)樟芝菌种子液的培养:用接肿铲取2cm2的斜面培养基中培养好的带培养基的樟芝菌装入装液量为120ml的500ml的三角瓶中进行培养，培养温度为26°C，培养时间为4d ；
(2)取步骤(I)中培养后的樟芝菌15%接种于发酵罐中进行发酵培养,培养温度6°C,转速210r/min，培养时间7d，通气量130L/h，装液量:6L ;将培养液过40目筛，截留的菌丝体再用3倍蒸馏水洗涤过滤，筛下即为樟芝发酵液； (3)樟芝菌多糖的提取:将步骤(2)中制得的樟芝发酵液过滤滤除菌体，取滤液加3倍量蒸馏水于多功能机粉碎匀浆，水浴浸提，水浴浸提时水料比为2:1 ;水浴浸提的的时间为
1.8h，温度为125°C;离心，取上清液进行旋转蒸发浓缩，取浓缩液在4°C条件下进行醇析，离心,取沉淀加等量蒸馏水溶解后,加2倍氯仿异戊醇剧烈振荡，上清液加5倍量无水乙醇回流提取4次，每次1.Sh,离心分离乙醇，将沉淀冷冻干燥，制得樟芝菌多糖干品；
(4)樟芝多糖粗品处理:将步骤(3)中制得的樟芝菌多糖粗品采用中空纤维超滤膜进行过滤，得到不同分子量的多糖体，分别经浓缩干燥后得樟芝多糖的干制品。
[0032]步骤(3)中所述的醇析过程中采用的溶剂为无水乙醇。
[0033]步骤(3)中所述的醇析过程中，所述的浓缩液与溶剂的体积比为1.2:4.5。
[0034]步骤(3)中所述的氯仿异戊醇中，氯仿与异戊醇的体积比为5:1.2。
[0035]步骤(3)中所述的离心时间为30_60min，离心温度为26°C。
[0036]步骤(4)中所述的超滤过程中压力为0.3Mpa，所述的中空纤维超滤膜为1000、10UOkDa的三组件中空纤维超滤膜。
[0037]以上所述实施例只是本发明的较佳实例，并非来限制本发明实施范围，故凡依本发明申请专利范围所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括本发明专利申请范围内。
【权利要求】
1.一种樟芝多糖的提取方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)樟芝菌种子液的培养:用接肿铲取l-3cm2的斜面培养基中培养好的带培养基的樟芝菌装入500ml的三角瓶中进行培养； (2)取步骤(I)中培养后的樟芝菌10%-20%接种于发酵罐中进行发酵培养，将培养液过40目筛，截留的菌丝体再用3倍蒸馏水洗涤过滤，筛下即为樟芝发酵液； (3)樟芝菌多糖的提取:将步骤(2)中制得的樟芝发酵液过滤滤除菌体，取滤液加2-3倍量蒸馏水于多功能机粉碎匀浆，水浴浸提，离心，取上清液进行旋转蒸发浓缩，取浓缩液在4°C条件下进行醇析，离心，取沉淀加等量蒸馏水溶解后，加2-3倍氯仿异戊醇剧烈振荡，上清液加4-5倍量无水乙醇回流提取3-5次，每次1.5-2h，离心分离乙醇，将沉淀冷冻干燥，制得棒之囷多糖干品； (4)樟芝多糖粗品处理:将步骤(3)中制得的樟芝菌多糖粗品采用中空纤维超滤膜进行过滤，得到不同分子量的多糖体，分别经浓缩干燥后得樟芝多糖的干制品。
2.根据权利要求1所述的一种樟芝多糖的提取方法，其特征在于，步骤(I)中所述的三角瓶中的装液量为100-150ml。
3.根据权利要求1所述的一种樟芝多糖的提取方法，其特征在于，步骤(I)中所述的培养温度为25-28°C，培养时间为3-5d。
4.根据权利要求1所述的一种樟芝多糖的提取方法，其特征在于，步骤(2)中所述的发酵培养条件为:培养温度25-28°C，转速200-230r/min，培养时间6_8d，通气量120-150L/h,装液量:5-7L。
5.根据权利要求1所述的一种樟芝多糖的提取方法，其特征在于，步骤(3)中所述的水浴浸提时水料比为(1-3):1 ;水浴浸提的的时间为1.5-2h，温度为120-135°C;旋转蒸发浓缩的操作温度为60-65°C。
6.根据权利要求1所述的一种樟芝多糖的提取方法，其特征在于，步骤(3)中所述的醇析过程中采用的溶剂为无水乙醇。
7.根据权利要求1所述的一种樟芝多糖的提取方法，其特征在于，步骤(3)中所述的醇析过程中，所述的浓缩液与溶剂的体积比为(1-1.5):(4-5)。
8.根据权利要求1所述的一种樟芝多糖的提取方法，其特征在于，步骤(3)中所述的氯仿异戊醇中，氯仿与异戊醇的体积比为(4-6):(0.8-1.5)。
9.根据权利要求1所述的一种樟芝多糖的提取方法，其特征在于，步骤(3)中所述的离心时间为30-60min,离心温度为25_28°C。
10.根据权利要求1所述的一种樟芝多糖的提取方法，其特征在于，步骤(4)中所述的超滤过程中压力为0.2-0.5Mpa，所述的中空纤维超滤膜为1000、100、1kDa的三组件中空纤维超滤膜。
【文档编号】C08B37/00GK104278064SQ201410555913
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2014年10月20日 优先权日:2014年10月20日
【发明者】刘巴宁, 郑安乔 申请人:中山安荞生物科技有限公司