一株可制备Ag/AgCl纳米颗粒的硫酸盐还原菌的制作方法与工艺

本发明涉及一株硫酸盐还原菌。

背景技术：
AgCl是一种很重要的光敏材料,当AgCl表面掺杂金属银时,由于其独特的等离子效应，这种复合纳米粒子具有优异的可见光催化性能，提高了处理废水、废气中有机污染物的效率。Ag/AgCl纳米颗粒主要由化学方法合成，不足之处在于需要严格的反应条件和复杂的实验步骤，合成的纳米颗粒粒径很大，稳定性差，形貌也很难控制。而生物法因其成本低廉、条件温和环境友好等优势引起了人们广泛的关注。据报道一些细菌、真菌或植物粉末能够合成Ag/AgCl纳米颗粒。硫酸盐还原菌在生长过程中能够异化硫酸盐缓慢释放还原物质，生成的纳米粒子粒径小，稳定性好，而且硫酸盐还原菌可以反复使用，有利于工业化连续生产。因此，寻找能合成Ag/AgCl纳米颗粒的菌株并应用于生产Ag/AgCl纳米颗粒具有重要的研究价值。

技术实现要素：
本发明提供一株硫酸盐还原菌，可以制备Ag/AgCl纳米颗粒，为Ag/AgCl纳米颗粒的生产和应用提供重要菌源。本发明可制备Ag/AgCl纳米颗粒的硫酸盐还原菌为Garciellasp.wxz01，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰路1号院3号，保藏日期为2014年7月3日，保藏编号为CGMCCNo：9410。本发明Garciellasp.wxz01为短杆菌，菌体长1.0～2.2μm，宽0.4～0.9μm，无鞭毛和芽孢，生长菌落为黑色，多为椭圆形，少量星状，接触空气一段时间后，菌落变为白色，菌体大部分死亡。本发明Garciellasp.wxz01为革兰氏阴性菌，接触酶阴性，明胶液化阳性，淀粉水解阴性，甲基红实验、吲哚实验阳性，伏普实验阴性，硝酸盐还原和柠檬酸盐还原为阳性。可利用蛋白胨、酵母膏、乳酸钠、甲酸钠、葡萄糖、苹果酸、琥珀酸为碳源生长，在酵母膏和蛋白胨中生长最好。Garciellasp.wxz01能以硫酸氨和尿素作为氮源。菌株在pH5.0～pH10.0的条件下生长，最适pH为7.8；10℃以下菌株停止生长，60℃以上不生长，最适生长温度为37℃，属于嗜中温菌。本发明Garciellasp.wxz01通过16SrDNA序列比对分析，与其最相近的种属是Garciellasp.EMZY-1，相似性为99％。通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定，该菌属于梭菌科中的一个新属Garciellasp.。本发明Garciellasp.wxz01在含有硝酸银的改良的Starkey培养基中生长并合成Ag/AgCl纳米颗粒，为生产Ag/AgCl纳米颗粒提供菌源。本发明Garciellasp.wxz01，属于Garciellasp.属，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰路1号院3号，保藏日期为2014年7月3日，保藏编号为CGMCCNo：9410。附图说明图1为本发明菌株Garciellasp.wxz01的PCR扩增电泳图；图2为本发明菌株Garciellasp.wxz01与GenBank中收录的相近菌株的16SrDNA序列进行同源性比对所构建的系统进化树；图3为菌株Garciellasp.wxz01合成的Ag/AgCl纳米颗粒透射电子显微镜图；图4为菌株Garciellasp.wxz01合成的Ag/AgCl纳米颗粒的X射线衍射图。具体实施方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。具体实施方式一：本实施方式可制备Ag/AgCl纳米颗粒的硫酸盐还原菌为Garciellasp.wxz01，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰路1号院3号，保藏日期为2014年7月3日，保藏编号为CGMCCNo：9410。本实施方式Garciellasp.wxz01为短杆菌，菌体长1.0～2.2μm，宽0.4～0.9μm，无鞭毛和芽孢，生长菌落为黑色，多为椭圆形，少量星状，接触空气一段时间后，菌落变为白色，菌体大部分死亡。本实施方式Garciellasp.wxz01为革兰氏阴性菌，接触酶阴性，明胶液化阳性，淀粉水解阴性，甲基红实验、吲哚实验阳性，伏普实验阴性，硝酸盐还原和柠檬酸盐还原为阳性。可利用蛋白胨、酵母膏、乳酸钠、甲酸钠、葡萄糖、苹果酸、琥珀酸为碳源生长，在酵母膏和蛋白胨中生长最好。Garciellasp.wxz01能以硫酸氨和尿素作为氮源。菌株在pH5.0～pH10.0的条件下生长，最适pH为7.8；10℃以下菌株停止生长，60℃以上不生长，最适生长温度为37℃，属于嗜中温菌。本实施方式Garciellasp.wxz01是从大庆油田采油厂含油污水中分离得到的，分离方法按以下步骤进行：取1mL大庆油田采油厂含油污水水样加入到19mL改良的Starkey培养基中，35℃恒温厌氧富集培养至培养基变黑且瓶口处散发出硫化氢的臭鸡蛋味，用润湿的醋酸铅试纸检测有大量H2S生成，得富集培养液。向富集培养液中加入0.5mmol/L的AgNO3避光培养5天，取1mL该培养液接种于含有1.0mmol/LAgNO3的改良的Starkey培养基中避光培养5天，取1mL培养液接种于含有1.5mmol/LAgNO3的改良Starkey培养基中避光培养5天，依据此方法，将AgNO3的浓度逐步提高到3mmol/L。将含有3mmol/LAgNO3的培养液涂布于固体夹层平板，石蜡封口，35℃恒温培养。当夹层中间出现使周围固体培养基变黑的单菌落时，将这些单菌落挑入改良的Starkey培养基中培养。从中挑取长势良好、浓黑色的单菌落，接种于100mL改良的Starkey培养基中，培养至液体培养基变黑，将变黑的菌液继续平板划线，挑取单菌落，作进一步的纯化，得到了菌株Garciellasp.wxz01。改良的Starkey培养基成分：0.5gK2HPO4、1.0gNH4Cl、0.08g无水CaCl2、2.0gNaNO3、2.0gMg(NO3)2·6H2O、1.0g酵母膏、体积浓度60％的乳酸钠溶液5mL，将上述试剂溶解在1000mL水中，调节pH值为8.0，加入500μL刃天青溶液(购买得到)，培养基煮沸后，加入0.5gL-半胱氨酸，通入高纯氮气驱氧，121℃高压灭菌15min。冷却后再加入经过滤除菌的硫酸亚铁铵1g。对分离筛选得到的菌株Garciellasp.wxz01进行分子鉴定，取对数生长期新鲜菌液，离心收集菌体，用试剂盒(购买自北京庄盟生物)按说明书提取菌株DNA，采用细菌通用引物进行PCR扩增，16SrDNA序列的引物为F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，引物由上海生物工程有限公司合成。PCR扩增体系：2μLdNTP(10mmol·L-1)，2μL10×PCRbuffer(含15mmol/LMgCl2)，0.4μLTaq酶，1.0μLDNA，两个引物各1.0μL(10pmol·μL-1)，ddH2O12.6μL。扩增程序：94℃预热3min，94℃变性2min，56℃复性1min，72℃延伸2min，循环次数为30次，最后72℃延伸8min，4℃保存。PCR扩增产物用1.0％的琼脂糖检测。电泳后胶回收PCR产物，如图1所示，将产物连接到T载体后转入E.coliDH-5α，得到带有细菌16SrDNA的转化子，将转化子大肠杆菌送华大基因公司进行测序。利用BLAST将所测得的序列与GenBank数据库中已登录的序列进行同源性序列比对，从数据库中得到相关种属16SrDNA序列信息，利用MEGA5.2进行系统发育分析并构建系统进化树，如图2所示。鉴定结果：菌株Garciellasp.wxz01的16SrDNA序列长度为1390bp，其序列提交至GenBank获得的注册号是KM044264，利用BLAST搜索与所得到的序列相似性高的序列，该菌的序列与Garciellasp.EMZY-1的相似性达到99％，通过MEGA软件构建系统进化树，结合其形态鉴定及生理生化实验结果，确定该菌是硫酸盐还原菌，属于梭菌科中的一个新属Garciellasp.。为验证本实施方式Garciellasp.wxz01的功能，进行以下实验：用注射器吸取10mL菌液接种在含有改良的Starkey培养基的厌氧瓶里，在37℃的恒温培养箱中静置培养5天，然后加入1mL0.1MAgNO3溶液避光培养15天，将培养液在5000rpm的条件下离心收集菌体，利用HITACHIH-7650仪器在80kV下进行成像；结果如图3所示，该细菌合成了Ag/AgCl纳米颗粒，大部分呈球形，小部分有团聚现象，由此可见本实施方式筛选出的菌株，是一株可制备Ag/AgCl纳米颗粒的硫酸盐还原菌。用注射器吸取10mL菌液接种在含有改良的Starkey培养基的厌氧瓶里，在37℃的恒温培养箱中静置培养5天，然后加入1mL0.1MAgNO3溶液避光培养15天，将培养液在5000rpm的条件下离心收集菌体沉淀，然后在真空烘箱中烘干24h，干燥后产物放入马弗炉，400℃煅烧1h，得到粒径为10～40nm的Ag/AgCl纳米颗粒。将得到的Ag/AgCl纳米颗粒直接装载在XRD样品载片上，进行XRD分析。X-射线由功率为1.6KW(40KV，40mM)的铜X-射线管产生。在2θ为20-80度之间进行测量。如图4所示，所得光谱2θ值峰值在27.831°，32.243°，46.233°，54.478°，57.478°，67.471°，74.471°和76.734°对应(111)、(200)、(220)、(311)、(222)、(400)、(311)和(420)面观察到Ag/AgCl衍射峰的存在。