一种高效率、高转化率生产1,3-丙二醇的方法技术领域本发明属于生物工程技术领域，具体地说，是关于一种通过克雷伯氏肺炎杆菌，并适度强化克雷伯氏肺炎杆菌的3-羟基丙酸代谢途径高效率、高转化率生产1,3-丙二醇的方法。
背景技术：
1,3-丙二醇(1,3-porpanediol，简称1,3-PD)是一种重要的化工原料，可用作溶剂、抗冻剂或保护剂、精细化工原料以及新型聚醋——聚对苯二甲酸丙二醇醋(PTT)和聚氨醋的单体。PTT已被证明是一种性能优异的新型聚酯材料。目前1,3-PD生产主要采用生物合成。生物合成法的主要路线是在微生物的作用下将甘油转化为1,3-PD。目前，自然界中能将甘油转化为1,3-PD的微生物大致包括：克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsielapneumoniae)、弗氏柠檬菌(Citrobacterfreundi)、丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)等。研究表明克雷伯氏肺炎杆菌生产1,3-PD的能力最强，国内也有一些相关的生产菌种专利，如：1、周胜等，一种红树林克雷伯氏菌及其在生产1,3-丙二醇中的应用(授权号：CN102604863)；2、刘德华等，一株高产1,3-丙二醇的微生物(公开号：CN103740609A)。但是缺少高转化率高效率的生产菌种依然是制约1,3-PD产业化的主要障碍。克雷伯氏肺炎杆菌中，1,3-PD在的生物合成代谢途径研究表明：①其甘油第一个氧化与还原途径与分配节点具有刚性，这种刚性调节很大程度上和菌种的本身的特性有关；②还原途径上的中间产物3-羟基丙醛的积累是影响1,3-PD的重要因数。目前也有一些解除中间产物3-羟基丙醛积累的研究，如：①过表达1,3-PD氧化还原酶；②过表达3-羟基丙醛脱氢酶等。但是过表达1,3-氧化还原酶对1,3-PD的生产促进作用很小，过表达3-醛基丙醛脱氢酶又会造成3-羟基丙酸(3-HP)的积累，这样很难获高的1,3-PD产量。
技术实现要素：
本申请的发明人在研究中通过选育，获得了一株高产1,3-PD的克雷伯氏肺炎杆菌KlebsielapneumoniaeKG。KlebsielapneumoniaeKG于2014年11月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：湖北省武汉市洪山区八一路，武汉大学，中国典型培养物保藏中心邮政编码：430072)，保藏号CCTCCM2014574。该克雷伯氏肺炎杆菌用于转化甘油生产1,3-丙二醇时相比其他的克雷伯氏菌具有更高的转化效率。进一步适度强化克雷伯氏肺炎杆菌的3-HP代谢途径，适度强化3-HP代谢途径既解决了3-羟基丙醛的积累又避免了过多副产物3-HP的抑制，克服了以往过度表达的缺点。本发明的转化甘油生产1,3-丙二醇的方法，包括种子培养以及发酵罐发酵转化甘油生成1,3-丙二醇，该方法通过克雷伯氏肺炎杆菌CCTCCM2014574，并在克雷伯氏肺炎杆菌中适度强化表达3-羟基丙醛脱氢酶，实现了高效率、高转化率生产1,3-PD。根据本发明，所述适度强化表达是通过Tac启动子的渗漏表达实现的。根据本发明，所述的3-羟基丙醛脱氢酶基因可以来源于克雷伯氏肺炎杆菌，大肠杆菌。相比现有的转化甘油生产1,3-PD的方法，本发明的方法的主要优点包括：产物浓度高，生产强度大，转化率高。附图说明图1:KG菌株的16srDNA的同源性分析具体实施方式以下结合具体实施例，对本发明作进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明，而非用于限定本发明的范围。实例中：LB培养基为：0.5％酵母提取物，1％胰蛋白胨，1％NaCl，pH7.0；固体培养基在此基础上加入1.2％-1.5％的琼脂。斜面培养基为：K2HPO43H2O7g/L，(NH4)2SO41g/L，KH2PO42g/L，MgCl27H2O0.1g/L，酵母膏7g/L，微量元素各0.3mL，调整pH7.0，琼脂2g/L。种子培养基为：K2HPO43H2O7g/L，(NH4)2SO41g/L，KH2PO42g/L，MgCl27H2O0.1g/L，酵母膏7g/L，微量元素各0.3mL，调整pH7.0后加入NaCl调节渗透压。发酵罐培养基为：KCl0.75g/L，NaH2PO41.38g/L，(NH4)2SO45.35g/L，Na2SO40.28g/L，MgSO46H2O0.26g/L，柠檬酸0.42g/L，酵母粉2g/L，微量元素各0.3mL，调整pH7.0。微量元素的配方如下：ZnCl234.2g/L，FeCl36H2O2.7g/L，MnCl24H2O10g/L，CuCl22H2O0.85g/L，CoCl22H2O23.8g/L，H3BO30.31g/L，Na2MoO40.25g/L实施例中，测定发酵液中菌体干重的方法如下：取1.0mL发酵液稀释7～10倍，以去离子水为对照，在721分光光度计上于620nm读取OD。取不同菌浓(即不同620nm吸光值)的菌液10mL，经离心收集菌体，并用去离子水洗涤二遍洗涤，将再次离心收集后的菌体于80℃烘箱中干燥至恒重。称量菌体作出菌体干重与OD620的标准曲线，并回归出关系式。以后菌体的干重根据测定的菌液的OD620值由标准曲线回归关系式计算得出。1,3-丙二醇的生成速率定义为：每小时每升发酵液生成的1,3-丙二醇克数单位为g/L·h。1,3-丙二醇的转化率定义为：消耗每摩尔甘油原料生产的1,3-丙二醇摩尔数。实例中，β-半乳糖糖苷酶的酶活定义为：1U为37℃条件下1分钟催化1nmolONPG的酶量。比酶活单位(U/mg)定义为单位菌体干重(mg)所含有的酶量(U)。实施例1、KG的鉴定用革兰氏阴性肠道微生物理化试剂盒API20E(法国梅里埃)对KG的各项理化指标进行分析。理化鉴定步骤根据API20E操作手册，鉴定结果见表1。对照API20E手册，表明KG属于克雷伯氏肺炎杆菌。表1：API20E理化鉴定结果用细菌16srDNA通用引物27f(AGAGTTTGATCCTGGCTCA)与1394r(TACGGCTACCTTGTTACGAGTT)以KG基因组为模板PCR扩增KG的16srNDA基因，胶回收目的条带，测序后得到KG的16sNDA序列(SEQIDNO.1)。16srNDA的同源比对结果表明KG属于克雷伯氏肺炎杆菌(附图1)。实施例2、KG能高转化率生产1,3-PD将KG与对照菌K.pneumoniaeATCC49790，接入250ml的摇瓶(装液量50ml)进行种子培养20小时，后接入5L发酵罐中(发酵液装液量2L)，按照如下所示的工艺条件控制发酵过程。初始甘油浓度60g/L，发酵温度35℃；通气量1.0vvm；搅拌转速20rpm；在发酵过程中通过加入NaOH溶液控制pH值为5.5～7.5。在发酵的各个时期通过补入不同浓度甘油溶液控制甘油浓度在10～60g/L，发酵30小时结束。发酵结果表2所示：表2：KG与ATCC49790的发酵比较从表2中可以看出，同其他1,3-PD生产菌如ATCC49790相比，KG菌株1,3-PD的转化效率明显高，转化率超过0.6。实施例3、构建含适度表达启动子Tac的表达质粒表达载体骨架选用pET28a，Tac启动子序列取之pGEX-4T-1。用一对含有BglII-EcoRI酶切位点的引物(GGAagatctACGTTATCGACTGCACGG，GGCgaattcCATGAATACTGTTTCCTGT)，将pGEX-4T-1上的Tac启动区域260bp(SEQIDNO.2)扩增出来，并插入到pET28a的BglII-EcoRI酶切位点，替换掉pET28a原有的T7启动子区域构建可在克雷伯氏菌中能适度基因表达的表达载体pETac。为了证明pETac能在克雷伯氏肺炎杆菌中能适度表达基因，用报告基因(lacZ)，对启动子Tac进行分析。lacZ(编码半乳苷酶的基因)来源于大肠杆菌。用含HindIII-XhoI的一对引物(CACaagcttGCGTTTTACAACGTCGTGAC，CCGctcgagTTATTTTTGACACCAGACCA)从大肠杆菌BL21的基因组上pcr扩增出3075bp的lacZ基因并插入到pETac表达载体Tac启动子的下游,构建重组质粒pETac::lacZ，并继续将pETac::lacZ电转至KG中，同时将pET28a电转至KG中作为对照。将获得的转化株在LB培养基中培养12小时后收集菌体测定β-半乳糖糖苷酶活，实验结果如表3所以。表3：各转化株β-半乳糖糖苷酶表达情况Tac启动子是大肠杆菌表达系统中常用的诱导性强启动子，其启动需要IPTG的诱导。本发明发现Tac启动子在克雷伯肺炎杆菌中虽然也能在IPTG诱导下高效表达，但是Tac启动子在克雷伯氏肺炎杆菌中有较大的渗漏表达。在没有IPTG诱导的条件下也能有不错的表达，能作为克雷伯氏菌中适度表达的“组成型”启动子。实施例4、在KG中适度增强3-羟基丙醛脱氢酶高效率的生产1,3-PD克雷伯氏肺炎杆菌中能转化3-羟基丙醛到3-HP的3-羟基丙酸脱氢酶可由来源于克雷伯菌的aldA(SEQIDNO.3),puuC(SEQIDNO.4),ydcW(SEQIDNO.5)；以及来源于大肠杆菌的aldH(SEQIDNO.6),ydcW(SEQIDNO.7)的基因编码。以利用肺炎杆菌的puuC基因适度增强3-羟基丙醛脱氢酶为例。用一对含有HindIII-XhoI酶切位点的引物(CCCaagcttGCATGATGAATTTTCAGCACCT，CCGctcgagGTCAAGACTCCAGGGCAATCC)以KG基因组为模板，pcr扩增puuC基因，并插入到pETac的Tac启动子下游的HindIII-XhoI位点，构建重组质粒pETac::puuC，并进一步将构建好的重组质粒电转至KG中，并筛选获得转化菌株KG/pETac::puuC。以实例2的发酵条件，采用重组菌KG/pETac::puuC进行发酵实验，实验结果如表4所示。表4：适度表达3-羟基丙酸脱氢酶的发酵结果从表3中可以看出，适度强化3-羟基丙酸脱氢酶后(KG/pETac::lacZ，不诱导)，1,3-PD发酵不仅获得了高的转化率，而且生产速度更快、效率更高。过表达3-羟基丙酸脱氢酶会造成3-HP的积累，反而不利于1,3-PD的发酵。<110>华东理工大学<120>一种高效率、高转化率生产1,3-丙二醇的方法<130>2014<160>7<170>PatentInversion3.3<210>1<211>1551<212>DNA<213>K.pneumoniaeKG<400>1acttaaattgaagagtttgatcatggctcagattgaacgctggcggcaggcctaacacat60gcaagtcgagcggtagcacagagagcttgctctcgggtgacgagcggcggacgggtgagt120aatgtctgggaaactgcctgatggagggggataactactggaaacggtagctaataccgc180ataatgtcgcaagaccaaagtgggggaccttcgggcctcatgccatcagatgtgcccaga240tgggattagctagtaggtggggtaacggctcacctaggcgacgatccctagctggtctga300gaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagt360ggggaata...