多种蛋白酶缺陷的丝状真菌细胞及其使用方法与流程

技术领域本公开涉及用于在丝状真菌细胞中生产异源蛋白的组合物和方法。

背景技术：
真核蛋白，尤其是治疗性蛋白(例如免疫球蛋白)的翻译后修饰通常是正确的蛋白折叠和功能必需的。因为标准的原核表达系统缺乏这种修饰所需的合适机构，在生产这些治疗性蛋白时必须使用替代的表达系统。即使在真核蛋白不具有翻译后修饰的情况下，原核表达系统通常缺乏正确折叠所需的必要伴侣蛋白。酵母和真菌是用于表达蛋白的具有吸引力的选择，因为它们容易在简单培养基中大规模生长，这允许低生产成本，并且酵母和真菌具有翻译后修饰机构和如在哺乳动物细胞中发现的执行类似功能的伴侣蛋白。此外，可用工具来操作相对简单的酵母和真菌细胞的遗传组成，以及较复杂的真核细胞例如哺乳动物细胞或昆虫细胞(DePourcq等,ApplMicrobiolBiotechnol,87(5):1617-31)。尽管具有这些优势，很多治疗性蛋白仍然在哺乳动物细胞中产生，所述哺乳动物细胞产生的治疗性蛋白具有与天然人蛋白最相似的翻译后修饰，而由酵母和真菌天然产生的翻译后修饰则通常与在哺乳动物细胞中发现的不同。为了解决这种缺陷，正在开发产生的翻译后修饰与在天然人蛋白中发现的那些更加接近的酵母和真菌的新菌株。因此，对使用酵母和真菌细胞来表达更复杂的蛋白质重新燃起兴趣。然而，由于工业上长时期地关注哺乳动物细胞培养技术，真菌细胞表达系统例如木霉(Trichoderma)并不如哺乳动物细胞培养建立得好，因此当表达哺乳动物蛋白时产生很多缺点。因此，本领域仍然需要能够稳定地，优选以高表达水平生产异源蛋白，例如免疫球蛋白的改良丝状真菌细胞，例如木霉真菌细胞。发明简述本文所述的是包括丝状真菌细胞，例如木霉真菌细胞的组合物，所述丝状真菌细胞具有活性降低或不可检测的至少三种蛋白酶，并且具有编码以增加水平表达的异源多肽的重组多核苷酸。本文进一步描述了改进异源多肽稳定性的方法和制备其中蛋白酶活性确实降低的异源多肽的方法。本文进一步描述了包括丝状真菌细胞，例如木霉真菌细胞的组合物，所述丝状真菌细胞具有活性降低或不可检测的一种或多种以下蛋白酶：pep9、amp1、amp2和sep1。因此，一方面包括丝状真菌细胞，其包含蛋白酶活性降低或没有的至少一种内源蛋白酶和编码异源多肽的重组多核苷酸，其中所述细胞具有蛋白酶活性降低或没有的一种或多种以下蛋白酶：pep9、amp1、amp2和sep1。在一个具体的实施方案中，多肽的生产水平比蛋白酶活性没有降低的相应丝状真菌细胞中产生的相同多肽的生产水平至少高两倍。在可以与之前的实施方案组合的另一个方面，它包括活性降低或不可检测的至少三种蛋白酶的丝状真菌细胞，其中所述细胞进一步包含编码异源多肽的重组多核苷酸，所述异源多肽的生产水平比蛋白酶活性没有降低的相应亲本丝状真菌细胞中多肽的生产水平至少高两倍。在某些实施方案中，当细胞是曲霉(Aspergillus)细胞时，其总蛋白酶活性降低至蛋白酶活性没有降低的相应亲本曲霉细胞的总蛋白酶活性的50％或更少。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，丝状真菌细胞的总蛋白酶活性降低至蛋白酶活性没有降低的相应亲本丝状真菌细胞的总蛋白酶活性的49％或更少、40％或更少、31％或更少、6％或更少。在某些实施方案中，至少三种蛋白酶的表达水平降低或消除。在某些实施方案中，编码所述三种蛋白酶的基因各自包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，三个蛋白酶编码基因是pep1、tsp1和slp1。在其他实施方案中，三个蛋白酶编码基因是gap1、slp1和pep1。在某些实施方案中，真菌细胞具有活性降低或不可检测的四种内源蛋白酶；编码所述四种蛋白酶的基因各自包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，四个蛋白酶编码基因是pep1、tsp1、slp1和gap1。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，三个或四个蛋白酶编码基因选自pep1、pep2、pep3、pep4、pep5、pep8、pep11,pep12、tsp1、slp1、slp2、slp3、slp7、gap1和gap2。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，三个或四个蛋白酶编码基因选自pep1、pep3、pep4、tsp1、slp1、slp2、gap1和gap2。在某些实施方案中，三个或四个蛋白酶编码基因选自pep1、pep2、pep3、pep4、pep5、gap1、gap2、slp1、slp2和tsp1。在其他实施方案中，真菌细胞具有活性降低或不可检测的五种内源蛋白酶；编码所述五种蛋白酶的基因各自包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，五个蛋白酶编码基因是pep1、tsp1、slp1、gap1和pep4。在其他实施方案中，五个蛋白酶编码基因是pep1、tsp1、slp1、gap1和gap2。在某些实施方案中，真菌细胞具有活性降低或不可检测的六种内源蛋白酶；编码所述六种蛋白酶的基因各自包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变。在某些实施方案中，细胞具有六个蛋白酶编码基因，其各自包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，并且六个蛋白酶编码基因是pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2和pep4。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，真菌细胞具有活性降低或不可检测的3-6种蛋白酶，所述3-6种蛋白酶各自选自pep1、pep2、pep3、pep4、pep5、tsp1、slp1、slp2、slp3、gap1和gap2。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，细胞具有七个蛋白酶编码基因，其各自包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，并且七个蛋白酶编码基因是pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4和pep3。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，细胞具有八个蛋白酶编码基因，其各自包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，并且八个蛋白酶编码基因是pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3和pep5。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，真菌细胞具有活性降低的其他蛋白酶，编码所述其他蛋白酶的基因包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，并且所述其他蛋白酶选自pep7、pep8、pep11,pep12、tpp1、gap2、slp3、slp5、slp6、slp7和slp8。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，细胞具有八个蛋白酶编码基因，其各自包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，并且八个蛋白酶编码基因是：a)pep1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、amp1，b)pep1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、amp2，c)pep1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、sep1，d)pep1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep9，或e)pep1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2。任选地，在可以与之前的实施方案组合的一个具体实施方案中，细胞进一步包含降低或消除tsp1蛋白酶活性的突变。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，细胞具有九个蛋白酶编码基因，其各自包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，并且九个蛋白酶编码基因是pep1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2和sep1。任选地，在可以与之前的实施方案组合的一个具体实施方案中，细胞进一步包含降低或消除tsp1蛋白酶活性的突变。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，细胞具有十个蛋白酶编码基因，其各自包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，并且十个蛋白酶编码基因是pep1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1和slp8。任选地，在可以与之前的实施方案组合的一个具体实施方案中，细胞进一步包含降低或消除tsp1蛋白酶活性的突变。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，细胞具有11个蛋白酶编码基因，其各自包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，并且11个蛋白酶编码基因是pep1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8和amp2。任选地，在可以与之前的实施方案组合的一个具体实施方案中，细胞进一步包含降低或消除tsp1蛋白酶活性的突变。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，细胞具有12个蛋白酶编码基因，其各自包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，并且12个蛋白酶编码基因是pep1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2和slp7。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，细胞具有至少13种蛋白酶活性降低或没有的蛋白酶，编码所述13种蛋白酶的基因各自包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，并且13种蛋白酶是-pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、pep9；-pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、slp7；-pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、slp3。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，细胞具有至少14种蛋白酶活性降低或没有的蛋白酶，编码所述14种蛋白酶的基因各自包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，并且14种蛋白酶是pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、pep9、slp2；在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，细胞具有至少15种蛋白酶活性降低或没有的蛋白酶，编码所述15种蛋白酶的基因各自包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，并且15种蛋白酶是-pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、pep9、slp2、mp1；或-pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、pep9、slp2、mp5。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，细胞具有至少16种、至少17种、至少18中、至少19种、或至少20种或更多种蛋白酶活性降低或没有的蛋白酶，并且所述细胞包含至少一个降低或消除选自以下的相应蛋白酶活性的突变：-天冬氨酸蛋白酶pep6、pep10、pep13、pep14或pep16；-slp样蛋白酶slp57433、slp35276、slp60791或slp109276；-gap样蛋白酶gap3或gap4；-sedolisin样蛋白酶sed2、sed3或sed5；-选自蛋白酶65735、蛋白酶77577、蛋白酶81087、蛋白酶56920、蛋白酶122083、蛋白酶79485、蛋白酶120998或蛋白酶61127的A组蛋白酶；-选自蛋白酶21659、蛋白酶58387、蛋白酶75159、蛋白酶56853、或蛋白酶64193的B组蛋白酶；-选自蛋白酶82452、蛋白酶80762、蛋白酶21668、蛋白酶81115、蛋白酶812141、或蛋白酶23475的C组蛋白酶；-选自蛋白酶121890、蛋白酶22718、蛋白酶47127、蛋白酶61912、蛋白酶80843、蛋白酶66608、蛋白酶72612或蛋白酶40199的D组蛋白酶；或-选自蛋白酶22210、蛋白酶111694、蛋白酶82577的E组蛋白酶。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，异源多肽是哺乳动物多肽。在某些实施方案中，哺乳动物多肽是糖基化的。在某些实施方案中，哺乳动物多肽选自免疫球蛋白、抗体及其抗原结合片段、生长因子、干扰素、细胞因子和白细胞介素。在某些实施方案中，哺乳动物多肽是免疫球蛋白或抗体，或其Fc片段。在某些实施方案中，哺乳动物多肽选自胰岛素样生长因子1(IGF1)、人生长激素(hGH)和干扰素α2b(IFNα2b)。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，异源多肽是非哺乳动物多肽。在某些实施方案中，非哺乳动物多肽是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、葡聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、磷脂酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、谷氨酰胺转胺酶或木聚糖酶。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，真菌细胞进一步包含活性降低或不可检测的甘露糖基转移酶ALG3。在某些实施方案中，编码ALG3的基因包含降低或消除相应活性的突变。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，真菌细胞进一步包含编码α-1,2-甘露糖苷酶的多核苷酸。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，真菌细胞包含使活性需要降低的蛋白酶表达降低的突变。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，突变是编码蛋白酶的基因内的缺失。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，突变是编码蛋白酶催化结构域的基因部分的缺失。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，真菌细胞在编码蛋白酶催化结构域的基因部分具有点突变。在其他实施方案中，一种或多种蛋白酶的蛋白酶活性降低或消除由对以下具有特异性的RNAi构建体造成：i)一种蛋白酶或ii)选自pep型蛋白酶、胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶、gap型蛋白酶、sedolisin蛋白酶和slp型蛋白酶的两种或多种蛋白酶。在某些实施方案中，RNAi构建体对slp2、slp3、slp5和/或slp6具有特异性。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，真菌细胞进一步包含N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域和N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域。在某些实施方案中，N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域和N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域由多核苷酸编码。在某些实施方案中，N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域由第一多核苷酸编码，和N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域由第二多核苷酸编码。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，真菌细胞进一步包含编码甘露糖苷酶II和/或半乳糖基转移酶的多核苷酸。在某些实施方案中，真菌细胞包含选自以下的酶：α-1,2-甘露糖苷酶、N-乙酰葡糖胺基转移酶I、N-乙酰葡糖胺基转移酶II、甘露糖苷酶II和/或半乳糖基转移酶，所述酶进一步包含靶向肽，例如用于正确定位相应酶的异源靶向肽。在某些实施方案中，靶向肽选自SEQIDNO：589-594。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，真菌细胞是木霉真菌细胞、毁丝霉(Myceliophthora)真菌细胞、曲霉(Aspergillus)真菌细胞、链孢霉(Neurospora)真菌细胞、镰刀菌(Fusarium)或青霉(Penicillium)真菌细胞，或金孢霉(Chrysosporium)真菌细胞。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，真菌细胞里氏木霉(Trichodermareesei)。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，真菌细胞对于pep4蛋白酶是野生型。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，真菌细胞对于tsp1蛋白酶是野生型。另一个方面包括通过以下改进异源多肽稳定性的方法：a)提供任何之前的实施方案的丝状真菌细胞；和b)培养所述细胞以表达异源多肽，其中所述异源多肽与其中蛋白酶活性没有降低(例如，不包含编码蛋白酶的基因的突变)的相应亲本丝状真菌细胞中产生的异源多肽相比稳定性增加。另一个方面包括通过以下制备异源多肽的方法：a)提供任何之前的实施方案的丝状真菌细胞；b)培养所述宿主细胞以表达异源多肽；和c)纯化异源多肽。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，丝状真菌细胞进一步包含载体蛋白。在某些实施方案中，载体蛋白是CBH1。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，在包含蛋白酶抑制剂的培养基中培养。在某些实施方案中，在具有一种或两种选自SBTI和糜蛋白酶抑制剂的蛋白酶抑制剂的培养基中培养。在某些实施方案中，蛋白酶活性根据本发明进一步用共表达或共培养例如SBTI或BBI(例如，如WO2005047302所描述)、或slp抑制剂，如WO2009071530所描述的pepc抑制剂来降低或消除。在某些实施方案中，根据所述方法产生的异源多肽是糖基化的哺乳动物多肽，优选抗体或其Fc糖基化片段，并且多肽的总N-聚糖的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或100％(摩尔％)由Man3GlcNAc2N-聚糖或Man5GlcNAc2N-聚糖组成。在其他实施方案中，根据所述方法产生的异源多肽是糖基化的哺乳动物多肽，优选抗体或其Fc糖基化片段，并且多肽的总N-聚糖的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或100％(摩尔％)由复合型N-聚糖，例如G0、G1或G2糖型或其岩藻糖基化形式FG0、FG1和FG2组成。在某些实施方案中，根据所述方法产生的异源多肽是糖基化的哺乳动物多肽，优选抗体或其Fc糖基化片段，并且多肽的总N-聚糖的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或100％(摩尔％)由杂合型N-聚糖组成。在某些实施方案中，根据所述方法产生的异源多肽是糖基化的哺乳动物多肽，优选抗体或其Fc糖基化片段，并且多肽的总N-聚糖的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或100％(摩尔％)由G1或G2N-聚糖组成。另一个方面包括通过如上所述的方法可获得的异源多肽，优选抗体或其Fc糖基化片段。另一个方面包括木霉真菌细胞或密切相关的属，包括毁丝霉真菌细胞、曲霉真菌细胞、链孢霉真菌细胞、青霉真菌细胞、镰刀菌真菌细胞或金孢霉真菌细胞，所述真菌细胞具有活性降低或不可检测的选自pep1、pep2、pep3、pep4、pep5、tsp1、slp1、slp2、gap1和gap2的至少三种蛋白酶，其中所述细胞进一步包含编码哺乳动物多肽的重组多核苷酸，所述哺乳动物多肽以比相应亲本真菌细胞中多肽的生产水平高至少2倍的水平产生。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，木霉细胞或密切相关的属的真菌细胞进一步包含活性降低或不可检测的一种或多种选自以下的蛋白酶：pep9、amp1、amp2和sep1。在某些实施方案中，至少三种蛋白酶的表达水平在木霉或密切相关的属的真菌细胞中降低或消除。在某些实施方案中，编码至少三种蛋白酶的基因各自包含在木霉或密切相关的属的细胞中降低或消除相应蛋白酶活性的突变。在某些实施方案中，木霉或密切相关的属的真菌细胞包括三个蛋白酶编码基因，所述基因具有降低或消除蛋白酶活性的突变，其选自gap1、slp1和pep1。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，木霉或密切相关的属的真菌细胞中的哺乳动物多肽是抗体或其抗原结合片段、或免疫球蛋白，且至少三种蛋白酶选自pep1、pep3、pep4、tsp1、slp1、slp2、gap1和gap2。在某些实施方案中，木霉或密切相关的属的真菌细胞包含四个蛋白酶编码基因，其各自包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，具有这种突变的四个蛋白酶编码基因是pep1、tsp1、slp1和gap1。在某些实施方案中，木霉或密切相关的属的真菌细胞包含五个蛋白酶编码基因，其各自包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，具有这种突变的五个蛋白酶编码基因是pep1、tsp1、slp1、gap1和pep4。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，木霉真菌细胞中的哺乳动物多肽是生长因子、干扰素、细胞因子或白细胞介素，活性降低的三种蛋白酶选自pep1、pep2、pep3、pep4、pep5、pep8、pep11,pep12、gap1、gap2、slp1、slp2、slp7和任选的tsp1。在某些实施方案中，木霉或密切相关的属的真菌细胞包含五个蛋白酶编码基因，其各自包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，具有这种突变的五个蛋白酶编码基因是pep1、tsp1、slp1、gap1和gap2。在某些实施方案中，木霉或密切相关的属的真菌细胞包含六个蛋白酶编码基因，其各自包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，具有这种突变的六个蛋白酶编码基因是pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2和pep4。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，木霉或密切相关的属的真菌细胞包含七个蛋白酶编码基因，其各自包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，具有这种突变的七个蛋白酶编码基因是pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4和pep3。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，木霉或密切相关的属的真菌细胞包含八个蛋白酶编码基因，其各自包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，具有这种突变的八个蛋白酶编码基因是pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3和pep5。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，木霉或密切相关的属的真菌细胞包含八个蛋白酶编码基因，其各自包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，具有这种突变的八个蛋白酶编码基因选自(i)pep1、slp1、gap1、gap2、pep3、pep4、pep5、amp1，(ii)pep1、slp1、gap1、gap2、pep3、pep4、pep5、amp2，(iii)pep1、slp1、gap1、gap2、pep3、pep4、pep5、sep1，(iv)pep1、slp1、gap1、gap2、pep3、pep4、pep5、pep9，或(v)pep1、slp1、gap1、gap2、pep3、pep4、pep5、pep2。在这种实施方案中，细胞可以进一步包含降低或消除tsp1蛋白酶活性的其他突变。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，木霉或密切相关的属的真菌细胞包含九个蛋白酶编码基因，其各自包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，具有这种突变的九个蛋白酶编码基因是pep1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1。在这种实施方案中，细胞可以进一步包含降低或消除tsp1蛋白酶活性的其他突变。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，木霉或密切相关的属的真菌细胞包含十个蛋白酶编码基因，其各自包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，具有这种突变的十个蛋白酶编码基因是pep1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8。在这种实施方案中，细胞可以进一步包含降低或消除tsp1蛋白酶活性的其他突变。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，木霉或密切相关的属的真菌细胞包含11个蛋白酶编码基因，其各自包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，具有这种突变的11个蛋白酶编码基因是pep1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2。在这种实施方案中，细胞可以进一步包含降低或消除tsp1蛋白酶活性的其他突变。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，木霉或密切相关的属的真菌细胞包含12个蛋白酶编码基因，其各自包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，具有这种突变的12个蛋白酶编码基因是pep1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、slp7。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，木霉或密切相关的属的真菌细胞具有至少13种蛋白酶活性降低或没有的蛋白酶，编码所述13种蛋白酶的基因各自包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，且所述13种蛋白酶是-pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、pep9；-pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、slp7；-pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、slp3。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，木霉或密切相关的属的真菌细胞具有至少14种蛋白酶活性降低或没有的蛋白酶，编码所述14种蛋白酶的基因各自包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，且所述14种蛋白酶是pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、pep9、slp2；在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，木霉或密切相关的属的真菌细胞具有至少15种蛋白酶活性降低或没有的蛋白酶，编码所述15种蛋白酶的基因各自包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，并且15种蛋白酶是-pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、pep9、slp2、mp1；或-pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、pep9、slp2、mp5。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，木霉或密切相关的属的真菌细胞进一步包含活性降低或不可检测的一种或多种其他蛋白酶。在某些实施方案中，木霉或密切相关的属的真菌细胞中一种或多种其他蛋白酶的表达水平降低或消除。在某些实施方案中，编码木霉或密切相关的属的真菌细胞中一种或多种其他蛋白酶的基因具有降低或消除相应蛋白酶活性的突变。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，编码一种或多种其他蛋白酶的基因选自pep7、pep8、pep11、pep12、tpp1、gap2、slp3、slp5、slp6、slp7和slp8。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，一种或多种其他蛋白酶编码基因选自-天冬氨酸蛋白酶pep6、pep10、pep13、pep14或pep16；-slp样蛋白酶slp57433、slp35276、slp60791或slp109276；-gap样蛋白酶gap3或gap4；-sedolisin样蛋白酶sed2、sed3或sed5；-选自蛋白酶65735、蛋白酶77577、蛋白酶81087、蛋白酶56920、蛋白酶122083、蛋白酶79485、蛋白酶120998或蛋白酶61127的A组蛋白酶；-选自蛋白酶21659、蛋白酶58387、蛋白酶75159、蛋白酶56853、或蛋白酶64193的B组蛋白酶；-选自蛋白酶82452、蛋白酶80762、蛋白酶21668、蛋白酶81115、蛋白酶812141、或蛋白酶23475的C组蛋白酶；-选自蛋白酶121890、蛋白酶22718、蛋白酶47127、蛋白酶61912、蛋白酶80843、蛋白酶66608、蛋白酶72612或蛋白酶40199的D组蛋白酶；或-选自蛋白酶22210、蛋白酶111694、蛋白酶82577的E组蛋白酶。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，木霉或密切相关的属的真菌细胞进一步包含活性降低或不可检测的ALG3。在某些实施方案中，编码木霉或密切相关的属的真菌细胞中ALG3的基因包含降低或消除相应活性的突变。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，木霉或密切相关的属的真菌细胞进一步包含编码α-1,2-甘露糖苷酶的多核苷酸。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，突变降低或消除木霉或密切相关的属的真菌细胞中的基因的表达。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，突变是木霉或密切相关的属的真菌细胞中的基因缺失。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，突变是木霉或密切相关的属的真菌细胞中编码蛋白酶的催化结构域的基因部分的缺失。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，突变是木霉或密切相关的属的真菌细胞中编码蛋白酶的催化结构域的基因部分的点突变。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，木霉或密切相关的属的真菌细胞进一步包含N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域和N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域。在某些实施方案中，N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域和N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域由木霉或密切相关的属的真菌细胞的多核苷酸编码。在某些实施方案中，N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域由第一多核苷酸编码，和N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域由木霉或密切相关的属的真菌细胞的第二多核苷酸编码。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，木霉真菌细胞进一步包含编码甘露糖苷酶II的多核苷酸。在某些实施方案中，蛋白酶各自与选自SEQIDNO：1、17、37、58、66、82、98、118、129、166和182的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性。在某些实施方案中，木霉真菌细胞的总蛋白酶活性降低至蛋白酶活性没有降低的相应的木霉亲本细胞的总蛋白酶活性的49％或更少、40％或更少、31％或更少、6％或更少。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，所述细胞进一步包含编码哺乳动物多肽的重组多核苷酸，所述哺乳动物多肽以比相应的亲本木霉真菌细胞中多肽的生产水平高至少2倍的水平产生。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，哺乳动物多肽以相应的亲本木霉真菌细胞中全长形式多肽的生产水平更高的水平，以全长形式产生。另一个方面包括通过以下改进异源多肽稳定性的方法：a)提供任何之前的实施方案的木霉真菌细胞；和b)培养所述细胞以表达异源多肽，其中所述异源多肽与不包含编码蛋白酶的基因突变的宿主细胞相比稳定性增加。另一个方面包括通过以下制备异源多肽，例如免疫球蛋白或抗体或其糖基化的Fc片段的方法：a)提供任何之前的实施方案的木霉或密切相关的属的真菌细胞；b)培养所述宿主细胞以表达异源多肽；和c)纯化异源多肽。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，丝状真菌细胞进一步包含载体蛋白。在某些实施方案中，载体蛋白是CBH1。附图说明图1是描述显示制备10倍蛋白酶缺失菌株M633(48-70C；M659是重新纯化的M633)的Southern印迹分析。图A描绘期望的sep1ORF信号：来自M124(Δ0)和M574(Δ9)的7.5kb，没有来自转化体的信号。图B描绘期望的sep15’侧翼信号：来自M124的7.5kb，来自转化体的3.1kb，来自pTTv225的3.9kb。图C描绘期望的sep13’侧翼信号：来自M124的7.5kb，来自转化体的3.9kb，来自pTTv225的3.9kb。图2是描述显示制备11倍蛋白酶缺失菌株M750(54-131-2)的Southern印迹分析。图A描绘期望的slp8ORF信号：来自M124(Δ0)和M659(Δ10)的5.6kb，没有来自转化体的信号。在所有样品中看见的微弱信号模式是非特异性背景。图B描绘期望的slp85’侧翼信号：来自M659的5.6kb，来自转化体的2.9kb，来自pTTv330的6.7kb。图C描绘期望的slp83’侧翼信号：来自M659的5.6kb，来自转化体的4.2kb，来自pTTv330的6.7kb。菌株M751(54-159-1)用两个探针显示多个信号，表明数个缺失盒被整合入基因组，以及还推测有基因组重排。图3是描述显示制备12倍蛋白酶缺失菌株M893(59-6A)的Southern印迹分析。图A描绘期望的amp2ORF信号：来自M124(Δ0)和M750(Δ11)的5.5kb，没有来自转化体的信号。图B描绘期望的amp25’侧翼信号：来自M124和M750的5.5kb，来自转化体的3.6kb，来自pTTv327的6.6kb。在所有样品中看见的约7kb的信号是非特异性背景。图C描绘期望的amp23’侧翼信号：来自M124和M750的5.5kb，来自转化体的4.5kb，来自pTTv327的6.6kb。图4描述9倍蛋白酶缺失菌株的24孔培养。在不含硫酸铵但含有柠檬酸二铵、100mMPIPPS、20g/L麦糟提取物、40g/L乳糖，pH4.5的TrMM中于28℃振摇生长培养物。从0.5μl培养物上清液中免疫印迹干扰素α2b的表达。图5描述表达干扰素的9种蛋白酶缺失菌株的发酵罐培养。在添加有20g/L酵母提取物、40g/L纤维素、80g/L纤维二糖、40g/L山梨糖，pH4.5的TrMM中生长菌株。免疫印迹从0.1μl上清液中检测干扰素α2b。用标准量的50、100和200ng干扰素生成标准曲线。图6是描述显示在Triab125和Triab126发酵罐中培养的M674的上清液中干扰素α2b生产水平的免疫印迹。图7描述slp2沉默菌株和对照M577菌株的24孔培养。在不含硫酸铵但含有柠檬酸二铵、100mMPIPPS、20g/L麦糟提取物、40g/L乳糖，pH4.5的TrMM中于28℃振摇生长培养物。从0.5μl培养物上清液中免疫印迹干扰素α2b的表达。图8描述在使用20g/L酵母提取物、40g/L纤维素、80g/L纤维二糖、40g/L山梨糖，pH4.5的TrMM的发酵罐中菌株M960和M961的培养，其中温度在48h从28℃变为22℃。免疫印迹从0.5μl上清液中检测干扰素α2b。干扰素标准是400、200、100、50和25ng。图9描述选择的丝状真菌细胞的amp1和amp2的系统发生树。图10描述选择的丝状真菌细胞的sep1的系统发生树。图11描述选择的丝状真菌细胞的pep9的系统发生树。图12用蛋白酶抑制剂处理的24孔培养中的FGF21生产。用FGF21标准曲线通过免疫印迹分析第6天的上清液样品。第一抗体和参考材料由Novartis提供。使用前将第一抗体在TBST中稀释至2μg/ml。将山羊抗兔第二抗体(Biorad山羊抗兔AP#170-6518)在TBST中以1:10000稀释。图13从第4-6天的M393对照菌株和新FGF21转化体检测FGF21和CBHI表达的免疫印迹。新转化体来自M1076转化。在约60kD检测到CBHI载体，且FGF21游离产物在10kD。图14使用抗FGF21抗体从含有和不含抑制剂的菌株M1200和M1205的培养物的发酵样品检测FGF21表达的免疫印迹。在各印迹中包括标准量的FGF21用于定量。将上清液稀释使在每条泳道上样0.1μl。图15从含有和不含蛋白酶抑制剂处理的24孔培养中生长的M1200菌株检测FGF21表达的免疫印迹。使用的胃酶抑素、糜蛋白酶抑制剂、1,10-邻菲咯啉的最终浓度是10μM，且使用的SBTI是0.1mg/ml。每个孔中上样带有橙色LSB的2μl培养物上清液。一般使用抗FGF21全抗体来检测所产生的FGF21的全部形式，但在右下的印迹中，使用N末端抗体来检测包含N末端的形式。在右下的印迹中，还使用抗CBHI抗体来检测。图16从含有和不含蛋白酶抑制剂处理的24孔培养中生长的M1200菌株检测FGF21表达的免疫印迹。使用的胃酶抑素、糜蛋白酶抑制剂、1,10-邻菲咯啉的最终浓度是10μM，且使用的SBTI是0.1mg/ml。每个孔中上样带有橙色LSB的2μl培养物上清液。使用抗FGF21全抗体和C末端抗体来特异性检测FGF21蛋白的C末端和全部形式。在左边的印迹中，使用抗CBHI抗体来检测。图17显示在24孔培养中表达的MAB01重链的免疫印迹。将0.5μl的各上清液上样至4-15％凝胶。用TBST中以1:10000稀释的抗IgG重链AP偶联物(Sigma#A3188)来检测。用PromegaAP底物来显色。图18显示MAB01重链的免疫印迹。将0.5μl的各上清液上样至4-15％凝胶。用TBST中以1:30000稀释的抗人Fc抗体IRDye700DX偶联物(Rockland#609-130-003)来检测重链。用OdysseyCLx近红外热像仪(Li-Cor)来检测700nm的荧光。图19显示适合缺失的蛋白酶亚组的系统发生树。图20图示描绘来自各蛋白酶缺失上清液和亲本菌株M124的培养物上清液的归一化的蛋白酶活性数据。前5个菌株在pH5.5测量蛋白酶活性，后3个缺失菌株在pH4.5测量蛋白酶活性。将蛋白酶活性比对绿色荧光酪蛋白。6倍蛋白酶缺失菌株仅有野生型亲本菌株的6％，7倍蛋白酶缺失菌株的蛋白酶活性比6倍蛋白酶缺失菌株的活性少约40％。发明详述本发明涉及在具有活性降低或没有的至少三种蛋白酶的丝状真菌细胞中生成重组异源多肽的改进的方法。本发明进一步涉及具有活性降低或没有的一种或多种选自以下蛋白酶的丝状真菌细胞中生成重组异源多肽的改进的方法：pep9、amp1、amp2和sep1。本发明部分基于以下出乎意料的发现：在丝状真菌细胞中降低特定内源蛋白酶组合的活性增加各种重组表达的异源蛋白，例如免疫球蛋白和生长因子的表达和稳定性。当其他人已经创建具有一种或多种蛋白酶失活的木霉真菌细胞时，它们没有提供哪种蛋白酶与增加特定蛋白类型，例如哺乳动物蛋白的表达和稳定性最相关的指导。例如，WO2011/075677公开了在木霉中可以敲除的某些蛋白酶，甚至公开了多种蛋白酶缺陷的木霉真菌细胞。然而，WO2011/075677没有提供关于以下的任何指导：哪种蛋白酶对哺乳动物蛋白，例如免疫球蛋白或生长因子的表达和稳定性具有不利影响，因为它没有描述任何哺乳动物蛋白表达的实施例。此外，WO2011/075677仅仅公开了在单个蛋白酶缺陷的三种不同真菌菌株的每一个中单个真菌蛋白的异源表达。因此，本领域技术人员可能认为WO2011/075677教导了各单个蛋白酶的失活足以生产异源蛋白。Yoon等(2009,Appl.MicrobiolBiotechnol82:691-701,2010:Appl.MicrobiolBiotechnolDOI10.1007/s00253-010-2937-0)报道了构建五倍和十倍蛋白酶基因破坏体用于在米曲霉(Aspergillusoryzae)中生产异源蛋白。尽管破坏的蛋白酶基因数量多，10倍蛋白酶破坏细胞仅仅将凝乳酶的产量提高了3.8倍。VandenHombergh等报道了黑曲霉(Aspergillusniger)的三倍蛋白酶基因破坏体。尽管数据表达蛋白酶活性降低，它没有描述任何产生哺乳动物蛋白的实施例。WO2002068623进一步报道了黑曲霉的amp1、sep1和pep9蛋白酶，WO2012048334报道了嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)的amp2、sep1和pep9蛋白酶。其他报道描述了丝状真菌菌株中sep1蛋白酶的克隆和表征(WO2011077359,WO2009144269,WO200762936andWO2002045524)。Pep9的克隆和表征还描述于WO2012032472和WO2006110677。申请人出乎意料地表明，在丝状真菌细胞，例如木霉真菌细胞中，多种蛋白酶与总蛋白酶活性的降低、异源蛋白生产的增加和表达后异源蛋白的稳定有关。特别地，发明人已经通过纯化这些蛋白酶并测定哪种具有与降解异源蛋白例如哺乳动物蛋白最相关的活性鉴定了在木霉真菌细胞中实际表达的蛋白酶(与仅在基因组中编码相反)。此外，发明人证实，缺失负责特定蛋白酶活性的基因实现了总蛋白酶活性的明显降低，这与在包含这种缺失的丝状真菌细胞中产生的蛋白质的数量和质量上蛋白稳定性的增加有关，造成细胞中全长异源蛋白的生产增加。还发现，工程化以降低至少三种蛋白酶基因的活性的木霉真菌细胞引起全长哺乳动物蛋白，例如抗体、治疗性蛋白或抗体变体如Fab或单域抗体生产的出乎意料的协同性增加。换言之，产生的全长哺乳动物蛋白的量比仅包含一个或两个蛋白酶基因缺失的木霉真菌细胞中产生的量的总和更多。因此，与WO2011/075677相反，发明人表明，丝状真菌细胞，例如木霉真菌细胞中完整异源蛋白的生产可以通过降低或消除细胞中至少三种蛋白酶的活性来获得。因此，本公开的某些方面提供通过具有活性降低或没有的至少三种蛋白酶来生产增加水平的异源蛋白的丝状真菌细胞，其中细胞进一步包含编码异源多肽的重组多核苷酸，所述异源多肽的生产水平比蛋白酶活性没有降低的相应亲本丝状真菌细胞中多肽的生产水平至少高两倍。换言之，通过比较具有活性降低的至少三种蛋白酶的丝状真菌细胞中异源蛋白的生产水平和不具有这种活性降低的丝状真菌细胞中异源蛋白的生产水平可以确定期望的异源蛋白生产水平的增加，否则与表现出增加水平的细胞相同。本公开的其他方面提供通过以下改进异源多肽稳定性的方法：a)提供本公开的具有活性降低或没有的至少三种蛋白酶的丝状真菌细胞，其中所述细胞进一步包含编码异源多肽的重组多核苷酸；和b)培养所述细胞以表达异源多肽，其中所述异源多肽与不包含编码蛋白酶的基因突变的宿主细胞相比稳定性增加。本公开的其他方面还提供通过以下制备异源多肽的方法：a)提供本公开的具有活性降低或没有的至少三种蛋白酶的丝状真菌细胞，其中所述细胞进一步包含编码异源多肽的重组多核苷酸；b)培养所述宿主细胞以表达异源多肽；和c)纯化异源多肽。本公开的某些方面还提供通过具有活性降低或没有的至少三种选自pep1、pep2、pep3、pep4、pep5、pep8、pep11、pep12、tsp1、slp1、slp2、gap1和gap2的蛋白酶来生产哺乳动物多肽水平增加的木霉真菌细胞，其中所述细胞进一步包含编码哺乳动物多肽的重组多核苷酸，所述哺乳动物多肽的生产水平比蛋白酶活性没有降低的相应亲本木霉真菌细胞中多肽的生产水平至少高两倍。换言之，通过比较具有活性降低的至少三种蛋白酶的木霉真菌细胞中异源蛋白的生产水平和不具有这种活性降低的木霉真菌细胞中异源蛋白的生产水平可以确定期望的异源蛋白生产水平的增加，否则与表现出增加水平的细胞相同。本公开的某些方面还提供通过具有活性降低或没有的至少一种或多种选自pep9、amp1、amp2、mp1、mp2、mp3、mp4、mp5和sep1的蛋白酶来生产哺乳动物多肽水平增加的木霉真菌细胞。本公开的其他方面提供通过以下改进哺乳动物多肽稳定性的方法：a)提供本公开的具有活性降低或没有的至少三种蛋白酶的木霉真菌细胞，其中所述细胞进一步包含编码哺乳动物多肽的重组多核苷酸；和b)培养所述细胞以表达哺乳动物多肽，其中所述哺乳动物多肽与不包含编码蛋白酶的基因突变的宿主细胞相比稳定性增加。本公开的其他方面提供通过以下改进哺乳动物多肽稳定性的方法：a)提供本公开的具有活性降低或没有的至少一种或多种选自pep9、amp1、amp2、mp1、mp2、mp3、mp4、mp5和sep1的蛋白酶的木霉真菌细胞，其中所述细胞进一步包含编码哺乳动物多肽的重组多核苷酸；和b)培养所述细胞以表达哺乳动物多肽，其中所述哺乳动物多肽与不包含编码蛋白酶的基因突变的宿主细胞相比稳定性增加。本公开的其他方面还提供通过以下制备哺乳动物多肽的方法：a)提供本公开的具有活性降低或没有的至少三种蛋白酶的木霉真菌细胞，其中所述细胞进一步包含编码哺乳动物多肽的重组多核苷酸；b)培养所述宿主细胞以表达哺乳动物多肽；和c)纯化哺乳动物多肽。定义如本文所使用，“免疫球蛋白”是指包含共价偶联在一起的重链和轻链，且能够特异性结合抗原的多聚体蛋白质。免疫球蛋白分子是大分子家族，其包括几种类型的分子，例如IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。如本文所使用，“抗体”是指完整的免疫球蛋白分子及其能够结合抗原的片段。这些包括杂合(嵌合)抗体分子(参见例如Winter等Nature349:293-99225,1991；和U.S.PatNo.4,816,567226)；F(ab’)2和F(ab)片段和Fv分子、非共价的异源二聚体[227,228]；单链Fv分子(scFv)(参见例如Huston等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:5897-83,1988)；二聚体和三聚体的抗体片段构建体；微抗体(minibody)(参见例如Pack等Biochem31,1579-84,1992；和Cumber等J.Immunology149B,120-26,1992)；人源化的抗体分子(参见例如Riechmann等Nature332,323-27,1988；Verhoeyan等Science239,1534-36,1988；和GB2,276,169)和从这些分子获得的任何功能性片段；以及通过非常规方法例如噬菌体展示获得的抗体。优选的，抗体是单克隆抗体。获得单克隆抗体的方法是本领域公知的。如本文所使用，“肽”或“多肽”是包括多个连续聚合的氨基酸残基的氨基酸序列。为本发明的目的，肽通常是包括最多50个氨基酸残基的那些分子，多肽包括超过50个氨基酸残基。肽或多肽可以包括修饰的氨基酸残基、不是由密码子编码的天然存在的氨基酸残基和非天然存在的氨基酸残基。如本文所使用，“蛋白质”可以是指任何大小的肽或多肽。本发明的蛋白酶在此所述的发明涉及通过在细胞中发现的具有活性降低或不可检测的至少三种蛋白酶来产生增加水平的异源多肽，例如哺乳动物多肽的丝状真菌细胞，例如木霉真菌细胞。在表达异源蛋白的丝状真菌细胞中发现的这种蛋白酶通常催化所表达的重组蛋白的明显降解。因此，通过降低或消除表达异源蛋白的丝状真菌细胞中的蛋白酶活性，增加了所表达蛋白的稳定性，从而增加多肽的生产水平，在某些情况下，还改进所产生蛋白的质量(例如全长而不是降解的)。蛋白酶包括但不限于天冬氨酸蛋白酶、胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、金属蛋白酶和sedolisin蛋白酶。可以从丝状真菌细胞鉴定、分离并测试这些蛋白酶以确定其活性降低是否会影响丝状真菌细胞中重组多肽的生产。鉴定和分离蛋白酶的方法是本领域公知的，包括但不限于亲和层析、酶谱分析和凝胶电泳。然后可以通过以下来测试所鉴定的蛋白酶：从表达重组多肽，例如异源或哺乳动物多肽的丝状真菌细胞中删除编码所鉴定的蛋白酶的基因，并测定所述删除是否造成细胞总蛋白酶活性的降低(例如降低至相应亲本丝状真菌细胞总蛋白酶活性的49％或更少、或31％或更少)，以及所表达的重组多肽的生产水平增加(例如比在相应亲本丝状真菌细胞中的生产水平高两倍)。删除基因、测量总蛋白酶活性以及测量所产生蛋白的水平的方法是本领域公知的，包括在本文中所述的方法。“相应亲本丝状真菌细胞”是指其中蛋白酶活性没有降低或消除的相应细胞。天冬氨酸蛋白酶天冬氨酸蛋白酶是利用天冬氨酸残基来水解多肽和蛋白质中的肽键的酶。通常，天冬氨酸蛋白酶在其活性位点包含两种高度保守的天冬氨酸残基，其在酸性pH下活性最佳。来自真核生物(例如木霉真菌)的天冬氨酸蛋白酶包括胃蛋白酶、组织蛋白酶和肾素。这些天冬氨酸蛋白酶具有两个结构域的结构，其被认为来自祖先基因复制。与这种复制事件一致的是，尽管这两个结构域的序列已经开始变得不同，各个结构域的总体折叠是相似的。各个结构域提供一个催化的天冬氨酸残基。活性位点位于由天冬氨酸蛋白酶的两个结构域形成的裂缝内。真核天冬氨酸蛋白酶进一步包括保守的二硫键，其可有助于将多肽鉴定为天冬氨酸蛋白酶。在木霉真菌细胞中已经鉴定了15种天冬氨酸蛋白酶：pep1(tre74156)、pep2(tre53961)、pep3(tre121133)、pep4(tre77579)、pep5(tre81004)、pep6(tre68662)、pep7(tre58669)、pep8(tre122076)、pep9(tre79807)、pep10(tre78639)、pep11(121306)、pep12(tre119876)、pep13(tre76887)、pep14(trel08686)和pep16(tre110490)。Pep1合适的pep1蛋白酶的实例包括但不限于，里氏木霉pep1(SEQIDNO:1)、哈茨木霉有性型(Hypocrealixii)gill1558498(SEQIDNO:2)、棘孢木霉(Trichodermaasperellum)gil47027997(SEQIDNO:3)、深绿木霉(Trichodermaatroviride)jgilTriat2l297887(SEQIDNO:4)、绿木霉(Trichodermavirens)jgilTriviGv29_8_2l81777(SEQIDNO:5)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)jgilTrire2lafm:Afu5gl3300(SEQIDNO:6)、米曲霉gil94730408(SEQIDNO:7)、金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)gil322712783(SEQIDNO:8)、小麦赤霉菌(Gibberellazeae)gil46126795(SEQIDNO:9)、镰孢霉(Fusariumvenenatum)gill8448713(SEQIDNO:10)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)gil342879173(SEQIDNO:11)、蓝菌属真菌(Grosmanniaclavigera)gil320591399(SEQIDNO:12)、黄萎病病原菌(Verticilliumalboatrum)gil302422750(SEQIDNO:13)、球毛壳菌(Chaetomiumglobosum)gill16182964(SEQIDNO:14)、粗糙链孢霉(Neurosporacrassa)gil85110723(SEQIDNO:15)、四孢链孢菌(Neurosporatetrasperma)gil336463990(SEQIDNO:16)、嗜热毁丝霉gi367030924(SEQIDNO:491),产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)gi255953325(SEQIDNO:492)、黑曲霉gi350639535(SEQIDNO:493)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)gi67541436(SEQIDNO:494)及其同源物。因此，在某些实施方案中，本公开的蛋白酶(通常是pep1蛋白酶)的氨基酸序列与选自SEQIDNO：1-16、SEQIDNO：491-494的氨基酸序列具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在一些实施方案中，蛋白酶与选自SEQIDNO：1-16、SEQIDNO：491-494的氨基酸序列具有100％一致性。在一些实施方案中，pep1是里氏木霉pep1。由里氏木霉pep1编码的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。在其他实施方中，本公开的蛋白酶的氨基酸序列与SEQIDNO：1具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在进一步的实施方案中，蛋白酶与SEQIDNO：1具有100％一致性。Pep2合适的pep2蛋白酶的实例包括但不限于，里氏木霉pep2(SEQIDNO:182)、深绿木霉jgilTriat2H42040(SEQIDNO:183)、绿木霉jgilTriviGv29_8_2l53481(SEQIDNO:184)、蛹虫草(Cordycepsmilitaris)CM01gil346326575(SEQIDNO:185)、粗糙链孢霉gi85111370(SEQIDNO:495)及其同源物。因此，在某些实施方案中，本公开的蛋白酶(通常是pep2蛋白酶)的氨基酸序列与选自SEQIDNO：182-185、SEQIDNO：495的氨基酸序列具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在一些实施方案中，蛋白酶与选自SEQIDNO：182-185、SEQIDNO：495的氨基酸序列具有100％一致性。在一些实施方案中，pep2是里氏木霉pep2。由里氏木霉pep2编码的氨基酸序列如SEQIDNO：182所示。在其他实施方中，本公开的蛋白酶的氨基酸序列与SEQIDNO：182具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在进一步的实施方案中，蛋白酶与SEQIDNO：182具有100％一致性。Pep3合适的pep3蛋白酶的实例包括但不限于，里氏木霉pep3(SEQIDNO:17)、深绿木霉jgilTriat2(SEQIDNO:18)、绿木霉jgilTriviGv29_8_2(SEQIDNO:19)、哈茨木霉有性型gill45583125(SEQIDNO:20)、棘孢木霉gil51860175(SEQIDNO:21)、黑曲霉gil317025164(SEQIDNO:22)、烟曲霉gill59122534(SEQIDNO:23)、黑曲霉gill34054572(SEQIDNO:24)、蛹虫草gil346318620(SEQIDNO:25)、苹果炭疽菌(Glomerellagraminicola)gil310800156(SEQIDNO:26)、尖孢镰刀菌gil342871221(SEQIDNO:27)、蓝菌属真菌gil320591121(SEQIDNO:28)、灰霉病菌(Botryotiniafuckeliana)gil12002205(SEQIDNO:29)、太瑞斯梭孢壳霉(Thielaviaterrestris)gil346997107(SEQIDNO:30)、油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)gill56055954(SEQIDNO:31)、球毛壳菌gill16197829(SEQIDNO:32)、四孢链孢菌gil336472132(SEQIDNO:33)、粗糙链孢霉gil85102020(SEQIDNO:34)、费氏新萨托菌(Neosartoryafischeri)gil119467426(SEQIDNO:35)、马尔尼菲青霉菌(Penicilliummarneffei)gil212534792(SEQIDNO:36)、嗜热毁丝霉gi367025909(SEQIDNO:496)、产黄青霉gi255947264(SEQIDNO:497)、米曲霉391870123(SEQIDNO:498)及其同源物。因此，在某些实施方案中，本公开的蛋白酶(通常是pep3蛋白酶)的氨基酸序列与选自SEQIDNO：17-36、SEQIDNO：496-498的氨基酸序列具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在一些实施方案中，蛋白酶与选自SEQIDNO：17-36、SEQIDNO：496-498的氨基酸序列具有100％一致性。在一些实施方案中，pep3是里氏木霉pep3。由里氏木霉pep3编码的氨基酸序列如SEQIDNO：17所示。在其他实施方中，本公开的蛋白酶的氨基酸序列与SEQIDNO：17具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在进一步的实施方案中，蛋白酶与SEQIDNO：17具有100％一致性。Pep4合适的pep4蛋白酶的实例包括但不限于，里氏木霉pep4(SEQIDNO:37)、绿木霉jgilTriviGv29_8_2(SEQIDNO:38)、深绿木霉jgilTriat2(SEQIDNO:39)、黄绿木霉(Trichodermaaureoviride)gill93735605(SEQIDNO:40)、黑曲霉gil145232965(SEQIDNO:41)、烟曲霉gil70999520(SEQIDNO:42)、棒曲霉(Aspergillusclavatus)gil121705756(SEQIDNO:43)、鞭毛藻丛赤壳菌(Nectriahaematococca)gil302899226(SEQIDNO:44)、苹果炭疽菌gil310796316(SEQIDNO:45)、蛹虫草gil346322842(SEQIDNO:46)、小麦赤霉菌gil46138535(SEQIDNO:47)、金龟子绿僵菌gil322708430(SEQIDNO:48)、尖孢镰刀菌gil342882947(SEQIDNO:49)、黑僵菌(Metarhiziumacridum)gil322700747(SEQIDNO:50)、棉花黄萎病菌(Verticilliumdahliae)gil346973691(SEQIDNO:51)、灰霉病菌gill54309857(SEQIDNO:52)、球毛壳菌gill16203505(SEQIDNO:53)、太瑞斯梭孢壳霉gil347001590(SEQIDNO:54)、稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)gil39973863(SEQIDNO:55)、黑孢块菌(Tubermelanosporum)gil296417651(SEQIDNO:56)、粗糙链孢霉gil85094599(SEQIDNO:57)、嗜热毁丝霉gi367031892gi255947264(SEQIDNO:499)、产黄青霉gi255936729gi255947264(SEQIDNO:500)、米曲霉gil69770745gi255947264(SEQIDNO:501)、构巢曲霉gi67524891gi255947264(SEQIDNO:502)及其同源物。因此，在某些实施方案中，本公开的蛋白酶(通常是pep4蛋白酶)的氨基酸序列与选自SEQIDNO：37-57、SEQIDNO：499-502的氨基酸序列具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在一些实施方案中，蛋白酶与选自SEQIDNO：37-57、SEQIDNO：499-502的氨基酸序列具有100％一致性。在一些实施方案中，pep4是里氏木霉pep4。由里氏木霉pep4编码的氨基酸序列如SEQIDNO：37所示。在其他实施方中，本公开的蛋白酶的氨基酸序列与SEQIDNO：37具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在进一步的实施方案中，蛋白酶与SEQIDNO：37具有100％一致性。Pep5合适的pep5蛋白酶的实例包括但不限于，里氏木霉pep5(SEQIDNO:58)、绿木霉jgilTriviGv29_8_2(SEQIDNO:59)、深绿木霉jgilTriat2l277859(SEQIDNO:60)、黑僵菌gil322695806(SEQIDNO:61)、尖孢镰刀菌gill56071418(SEQIDNO:62)、蛹虫草gil346324830(SEQIDNO:63)、小麦赤霉菌gil46124247(SEQIDNO:64)、棉花黄萎病菌gil346978752(SEQIDNO:65)、嗜热毁丝霉gi367019798(SEQIDNO:503)及其同源物。因此，在某些实施方案中，本公开的蛋白酶(通常是pep5蛋白酶)的氨基酸序列与选自SEQIDNO：58-65、SEQIDNO：503的氨基酸序列具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在一些实施方案中，蛋白酶与选自SEQIDNO：58-65、SEQIDNO：503的氨基酸序列具有100％一致性。在一些实施方案中，pep5是里氏木霉pep5。由里氏木霉pep5编码的氨基酸序列如SEQIDNO：58所示。在其他实施方中，本公开的蛋白酶的氨基酸序列与SEQIDNO：58具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在进一步的实施方案中，蛋白酶与SEQIDNO：58具有100％一致性。Pep7合适的pep7蛋白酶的实例包括但不限于，里氏木霉pep7(SEQIDNO:186)、深绿木霉jgilTriat2(SEQIDNO:187)、绿木霉jgilTriviGv29_8_2(SEQIDNO:188)、苹果炭疽菌gil310800487(SEQIDNO:189)、黑僵菌gil322700577(SEQIDNO:190)、太瑞斯梭孢壳霉gil347003264(SEQIDNO:191)、鹅掌柄孢壳(Podosporaanserine)gil171680938(SEQIDNO:192),嗜热毛壳菌(Chaetomiumthermophilum)gil340905460(SEQIDNO:193)、棉花黄萎病菌gil346975960(SEQIDNO:194)、嗜热毁丝霉gil347009870gi367026634(SEQIDNO:195)、粗糙链孢霉gil85090078(SEQIDNO:196)、稻瘟病菌gil39948622(SEQIDNO:197)、球毛壳菌gill16191517(SEQIDNO:198)、稻瘟病菌gil39970765(SEQIDNO:199)、构巢曲霉gi67522232(SEQIDNO:504)、黑曲霉gi350630464(SEQIDNO:505),米曲霉gi317138074及其同源物。因此，在某些实施方案中，本公开的蛋白酶(通常是pep7蛋白酶)的氨基酸序列与选自SEQIDNO：186-199、SEQIDNO：504-506的氨基酸序列具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在一些实施方案中，蛋白酶与选自SEQIDNO：186-199、SEQIDNO：504-506的氨基酸序列具有100％一致性。在一些实施方案中，pep7是里氏木霉pep7。由里氏木霉pep7编码的氨基酸序列如SEQIDNO：186所示。在其他实施方中，本公开的蛋白酶的氨基酸序列与SEQIDNO：186具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在进一步的实施方案中，蛋白酶与SEQIDNO：186具有100％一致性。Pep8合适的pep8蛋白酶的实例包括但不限于，里氏木霉pep8EGR48424(SEQIDNO:507)、绿木霉EHK19238(SEQIDNO:508)、深绿木霉EHK40047(SEQIDNO:509)、四孢链孢菌EG053367(SEQIDNO:510)、嗜热毁丝霉XP_003658897(SEQIDNO:511)、粗糙链孢霉XP_965343(SEQIDNO:512)、金龟子绿僵菌EFZ03501(SEQIDNO:513)、太瑞斯梭孢壳霉XP_003656869(SEQIDNO:514)、尖孢镰刀菌EGU79769(SEQIDNO:515),和小麦赤霉菌XP_381566(SEQIDNO:516)、稻瘟病菌XP_°°3714540.1(SEQIDNO:517)、产黄青霉XP_002557331(SEQIDNO:518)、米曲霉XP_001822899.1(SEQIDNO:519)、构巢曲霉XP_664091.1(SEQIDNO:520)、黑曲霉EHA24387.1(SEQIDNO:521)及其同源物。因此，在某些实施方案中，本公开的蛋白酶(通常是pep8蛋白酶)的氨基酸序列与选自SEQIDNO：507-521的氨基酸序列具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在一些实施方案中，蛋白酶与选自SEQIDNO：507-521的氨基酸序列具有100％一致性。在一些实施方案中，pep8是里氏木霉pep8。由里氏木霉pep8编码的氨基酸序列如SEQIDNO：507所示。在其他实施方中，本公开的蛋白酶的氨基酸序列与SEQIDNO：507具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在进一步的实施方案中，蛋白酶与SEQIDNO：507具有100％一致性。Pep9合适的pep9蛋白酶的实例包括但不限于，里氏木霉pep979807(SEQIDNO:750)、绿木霉158334(SEQIDNO:751)、深绿木霉90832(SEQIDNO:752)、苹果炭疽菌XP_384573.1(SEQIDNO:753)、粗糙链孢霉XP_001727974.1(SEQIDNO:754)、嗜热毁丝霉XP_003667167.1(SEQIDNO:528)、米曲霉XP_001821372.2(SEQIDNO:529)、黑曲霉ABM05950.1(SEQIDNO:755)、烟曲霉XP_752122.1(SEQIDNO:756)、构巢曲霉XP_662026.1(SEQIDNO:757)、威斯康星青霉(PenicilliumWisconsin)XP_002565726.1(SEQIDNO:758)及其同源物。因此，在某些实施方案中，本公开的蛋白酶(通常是pep9蛋白酶)的氨基酸序列与选自SEQIDNO：750-758的氨基酸序列具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在一些实施方案中，蛋白酶与选自SEQIDNO：750-758的氨基酸序列具有100％一致性。在一些实施方案中，pep9是里氏木霉pep9。由里氏木霉pep9编码的氨基酸序列如SEQIDNO：750所示。在其他实施方中，本公开的蛋白酶的氨基酸序列与SEQIDNO：750具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在进一步的实施方案中，蛋白酶与SEQIDNO：750具有100％一致性。Pep11合适的pep11蛋白酶的实例包括但不限于，里氏木霉pep11EGR49498(SEQIDNO:522)、绿木霉EHK26120(SEQIDNO:523)、深绿木霉EHK41756(SEQIDNO:524)、假禾谷镰刀菌(Fusariumpseudograminearum)EKJ74550(SEQIDNO:525)、黑僵菌EFY91821(SEQIDNO:526)和小麦赤霉菌XP_384151(SEQIDNO:527)、嗜热毁丝霉XP_003667387.1(SEQIDNO:528)、粗糙链孢霉XP_960328.1(SEQIDNO:529)及其同源物。因此，在某些实施方案中，本公开的蛋白酶(通常是pep11蛋白酶)的氨基酸序列与选自SEQIDNO：522-529的氨基酸序列具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在一些实施方案中，蛋白酶与选自SEQIDNO：522-529的氨基酸序列具有100％一致性。在一些实施方案中，pep11是里氏木霉pep11。由里氏木霉pep11编码的氨基酸序列如SEQIDNO：522所示。在其他实施方中，本公开的蛋白酶的氨基酸序列与SEQIDNO：522具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在进一步的实施方案中，蛋白酶与SEQIDNO：522具有100％一致性。Pep12合适的pep12蛋白酶的实例包括但不限于，里氏木霉pep12EGR52517(SEQIDNO:530)、绿木霉pep12EHK18859(SEQIDNO:531)、深绿木霉pep12EHK45753(SEQIDNO:532)、假禾谷镰刀菌pep12EKJ73392(SEQIDNO:533)、小麦赤霉菌pep12XP_388759(SEQIDNO:534)和金龟子绿僵菌pep12EFY95489(SEQIDNO:535)、粗糙链孢霉XP_964574.1(SEQIDNO:536、嗜热毁丝霉XP_003659978.1(SEQIDNO:537)及其同源物。因此，在某些实施方案中，本公开的蛋白酶(通常是pep12蛋白酶)的氨基酸序列与选自SEQIDNO：530-537的氨基酸序列具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在一些实施方案中，蛋白酶与选自SEQIDNO：530-537的氨基酸序列具有100％一致性。在一些实施方案中，pep12是里氏木霉pep12。由里氏木霉pep12编码的氨基酸序列如SEQIDNO：530所示。在其他实施方中，本公开的蛋白酶的氨基酸序列与SEQIDNO：530具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在进一步的实施方案中，蛋白酶与SEQIDNO：530具有100％一致性。Pep6、pep10、pep13、pep14和pep16其他天冬氨酸蛋白酶包括但不限于，里氏木霉pep6_(Tre68662,SEQIDNO:880)、pep10_(Tre78639,SEQIDNO:881)、pep13_(Tre76887,SEQIDNO:882)、pep14_(Trel08686,SEQIDNO:883)或pep16_(Trel10490,SEQIDNO:884)及其同源物。因此，在某些实施方案中，本公开的蛋白酶(通常是pep6、pep10、pep13、pep14、pep16蛋白酶)的氨基酸序列与选自SEQIDNO：880-884的氨基酸序列具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在某些实施方案中，蛋白酶与选自SEQIDNO：880-884的氨基酸序列具有100％一致性。胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶是底物特异性与胰蛋白酶相似的酶。胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶利用丝氨酸残基来水解多肽和蛋白质中的肽键。通常，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶切割带正电的氨基酸残基后面的肽键。来自真核生物(例如木霉真菌)的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶包括胰蛋白酶1、胰蛋白酶2和消旋胰蛋白酶(mesotrypsin)。这些胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶通常包含形成电荷接替的三种氨基酸残基(例如组氨酸、天冬氨酸和丝氨酸)的催化三元组，所述电荷接替使活性位点丝氨酸亲核。真核胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶进一步包括由甘氨酸和丝氨酸的主链酰胺氢原子形成的“氧离子洞”，其可有助于将多肽鉴定为胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶。在木霉真菌细胞中已经鉴定的一种胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶是tsp1(tre73897)。如下所讨论，已经证实tsp1对重组多肽，例如免疫球蛋白的表达具有显著影响。如在WO2013/102674的实施例3所述，从木霉中纯化丝氨酸蛋白酶，其显示具有降解哺乳动物蛋白质的多种蛋白酶活性。在这些活性中，tsp1被鉴定为胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶。然后从木霉真菌细胞中删除tsp1蛋白酶基因，显示删除tsp1实现了总蛋白酶活性的显著降低，从而造成细胞产生的哺乳动物蛋白质的稳定性增加。合适的tsp1蛋白酶的实例包括但不限于，里氏木霉tsp1(SEQIDNO:66)、深绿木霉jgilTriat2l298187(SEQIDNO:67)、jgilTriviGv29_8_2(SEQIDNO:68)、哈茨木霉有性型gil145583579(SEQIDNO:69)、哈茨木霉有性型gil63025000(SEQIDNO:70)、油菜菌核病菌gil156052735(SEQIDNO:71)、灰霉病菌gill54314937(SEQIDNO:72)、小麦颖枯病菌(Phaeosphaerianodorum)gill69605891(SEQIDNO:73)、油菜茎基溃疡病菌(Leptosphaeriamaculans)gil312219044(SEQIDNO:74)、棉花黄萎病菌gil37992773(SEQIDNO:75)、玉米圆斑病菌(Cochlioboluscarbonum)gill072114(SEQIDNO:76)、黑僵菌gil322695345(SEQIDNO:77)、金龟子绿僵菌gil4768909(SEQIDNO:78)、gil464963(SEQIDNO:79)、小麦赤霉菌gil46139299(SEQIDNO:80),金龟子绿僵菌(SEQIDNO:81)、构巢曲霉gi67523821(SEQIDNO:538)及其同源物。因此，在某些实施方案中，本公开的蛋白酶(通常是tsp1蛋白酶)的氨基酸序列与选自SEQIDNO：66-81、SEQIDNO：538的氨基酸序列具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在一些实施方案中，蛋白酶与选自SEQIDNO：66-81、SEQIDNO：538的氨基酸序列具有100％一致性。在一些实施方案中，tsp1是里氏木霉tsp1。由里氏木霉tsp1编码的氨基酸序列如SEQIDNO：66所示。在其他实施方中，本公开的蛋白酶的氨基酸序列与SEQIDNO：66具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在进一步的实施方案中，蛋白酶与SEQIDNO：66具有100％一致性。枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶是底物特异性与枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)相似的酶。枯草杆菌蛋白酶利用丝氨酸残基来水解多肽和蛋白质中的肽键。通常，枯草杆菌蛋白酶是包含三种氨基酸天冬氨酸、组氨酸和丝氨酸的催化三元组的丝氨酸蛋白酶。这些催化残基排列与来自地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)的原型枯草杆菌蛋白酶共有。来自真核生物(例如木霉真菌)的枯草杆菌蛋白酶包括弗林蛋白酶、MBTPS1和TPP2。真核胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶在氧阳离子洞中进一步包括天冬氨酸残基。枯草杆菌蛋白酶slp7也与sedolisin蛋白酶tpp1相似。在木霉真菌细胞中已经鉴定了7种枯草杆菌蛋白酶：slp1(tre51365)、slp2(tre123244)、slp3(tre123234)、slp5(tre64719)、slp6(tre121495)、slp7(tre123865)和slp8(tre58698)。Slp1合适的slp1蛋白酶的实例包括但不限于，里氏木霉slp1(SEQIDNO:82)、深绿木霉jgilTriat2(SEQIDNO:83)、深绿木霉jgilTriat2(SEQIDNO:84)、绿木霉jgilTriviGv29_8_2(SEQIDNO:85)、哈茨木霉有性型gil145583581(SEQIDNO:86)、黑僵菌gil322694632(SEQIDNO:87)、尖孢镰刀菌gil342877080(SEQIDNO:88)、小麦赤霉菌gil46139915(SEQIDNO:89)、羊茅香柱菌(Epichloefestucae)gil170674476(SEQIDNO:90)、鞭毛藻丛赤壳菌(gil302893164(SEQIDNO:91)、孢子粪壳菌(Sordariamacrospore)gil336266150(SEQIDNO:92)、苹果炭疽菌gil310797947(SEQIDNO:93)、四孢链孢菌gil336469805(SEQIDNO:94)、粗糙链孢霉gil85086707(SEQIDNO:95)、稻瘟病菌gil145608997(SEQIDNO:96)、球毛壳菌gil116208730(SEQIDNO:97)、嗜热毁丝霉gi367029081(SEQIDNO:539)及其同源物。因此，在某些实施方案中，本公开的蛋白酶(通常是slp1蛋白酶)的氨基酸序列与选自SEQIDNO：82-97、SEQIDNO：539的氨基酸序列具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在一些实施方案中，蛋白酶与选自SEQIDNO：82-97、SEQIDNO：539的氨基酸序列具有100％一致性。在一些实施方案中，slp1是里氏木霉slp1。由里氏木霉slp1编码的氨基酸序列如SEQIDNO：82所示。在其他实施方中，本公开的蛋白酶的氨基酸序列与SEQIDNO：82具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在进一步的实施方案中，蛋白酶与SEQIDNO：82具有100％一致性。Slp2合适的slp2蛋白酶的实例包括但不限于，里氏木霉slp2(SEQIDNO:98)、深绿木霉jgilTriat2(SEQIDNO:99)、绿木霉jgilTriviGv29_8_2(SEQIDNO:100)、哈茨木霉有性型gill15111226(SEQIDNO:101)、烟曲霉gil70997972(SEQIDNO:102)、鞭毛藻丛赤壳菌gil302915240(SEQIDNO:103)、小麦赤霉菌gil46105128(SEQIDNO:104)、粉棒束孢(Isariafarinose)gil68165000(SEQIDNO:105)、苹果炭疽菌gil310797854(SEQIDNO:106)、羊茅香柱菌gill70674491(SEQIDNO:107)、黑僵菌gil322697754(SEQIDNO:108)、枝顶孢霉属(Acremoniumsp.)F11177gill47225254(SEQIDNO:109)、有毛长喙壳霉(Ophiostomapiliferum)gill5808807(SEQIDNO:110)、四孢链孢菌gil336463649(SEQIDNO:111)、嗜热毛壳菌gil340992600(SEQIDNO:112)、黄绿绿僵菌(Metarhiziumflavoviride)gil254351265(SEQIDNO:113)、鹅掌柄孢壳gill71680111(SEQIDNO:114)、稻瘟病菌gil39943180(SEQIDNO:115)、油菜菌核病菌gill56058540(SEQIDNO:116)、柄篮状菌(Talaromycesstipitatus)gil242790441(SEQIDNO:117)、嗜热毁丝霉gi367021472(SEQIDNO:540)、黑曲霉gil45237646(SEQIDNO:541)、米曲霉gil69780712(SEQIDNO:542)、产黄青霉gi255955889(SEQIDNO:543)、构巢曲霉gi259489544(SEQIDNO:544)、粗糙链孢霉gi85084841(SEQIDNO:545)及其同源物。因此，在某些实施方案中，本公开的蛋白酶(通常是slp2蛋白酶)的氨基酸序列与选自SEQIDNO：98-117、SEQIDNO：540-545的氨基酸序列具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在一些实施方案中，蛋白酶与选自SEQIDNO：98-117、SEQIDNO：540-545的氨基酸序列具有100％一致性。在一些实施方案中，slp2是里氏木霉slp2。由里氏木霉slp2编码的氨基酸序列如SEQIDNO：98所示。在其他实施方中，本公开的蛋白酶的氨基酸序列与SEQIDNO：98具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在进一步的实施方案中，蛋白酶与SEQIDNO：98具有100％一致性。Slp3合适的slp3蛋白酶的实例包括但不限于，里氏木霉slp3(SEQIDNO:166)、深绿木霉jgilTriat2(SEQIDNO:167)、绿木霉jgilTriviGv29_8_2(SEQIDNO:168)、康氏肉座菌(Hypocreakoningii)gil124295071(SEQIDNO:169)、Purpureocilliumlilacinumgill30750164(SEQIDNO:170)、金龟子绿僵菌gill6215677(SEQIDNO:171)、洛斯里被毛孢(Hirsutellarhossiliensis)gil90655148(SEQIDNO:172)、膨胀弯颈霉(Tolypocladiuminflation)gil18542429(SEQIDNO:173)、厚垣普奇尼亚菌有性型(Metacordycepschlamydosporia)gil19171215(SEQIDNO:174)、蛹虫草gil346321368(SEQIDNO:175)、镰刀菌属gil628051(SEQIDNO:176)、四孢链孢菌gil336471881(SEQIDNO:177)、球毛壳菌gill16197403(SEQIDNO:178)、粗糙链孢霉gil85084841(SEQIDNO:179)、尖孢镰刀菌gil56201265(SEQIDNO:180)、小麦赤霉菌gil46114268(SEQIDNO:181)、嗜热毁丝霉gi367026259(SEQIDNO:546)、构巢曲霉gi67538776(SEQIDNO:547)、米曲霉gil69771349(SEQIDNO:222)、黑曲霉gi470729(SEQIDNO:223)及其同源物。因此，在某些实施方案中，本公开的蛋白酶(通常是slp3蛋白酶)的氨基酸序列与选自SEQIDNO：166-181、SEQIDNO：546-547、SEQIDNO：222-223的氨基酸序列具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在一些实施方案中，蛋白酶与选自SEQIDNO：166-181、SEQIDNO：546-547、SEQIDNO：222-223的氨基酸序列具有100％一致性。在一些实施方案中，slp3是里氏木霉slp3。由里氏木霉slp3编码的氨基酸序列如SEQIDNO：166所示。在其他实施方中，本公开的蛋白酶的氨基酸序列与SEQIDNO：166具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在进一步的实施方案中，蛋白酶与SEQIDNO：166具有100％一致性。Slp5合适的slp5蛋白酶的实例包括但不限于，里氏木霉slp5(SEQIDNO:200)、深绿木霉jgilTriat2(SEQIDNO:201)、绿木霉jgilTriviGv29_8_2(SEQIDNO:202)、哈茨木霉有性型gill18161442(SEQIDNO:203)、尖孢镰刀菌gil342883549(SEQIDNO:204)、小麦赤霉菌gil46135733(SEQIDNO:205)、苹果炭疽菌gil310796396(SEQIDNO:206)、鞭毛藻丛赤壳菌gil302927954(SEQIDNO:207)、蛹虫草gil346319783(SEQIDNO:208)、粗糙链孢霉gil85094084(SEQIDNO:209)、四孢链孢菌gil336467281(SEQIDNO:210)、棉花黄萎病菌gil346971706(SEQIDNO:211)、太瑞斯梭孢壳霉gil347001418(SEQIDNO:212)、稻瘟病菌gill45605493(SEQIDNO:213)、嗜热毁丝霉gi367032200(SEQIDNO:548)、产黄青霉gi62816282(SEQIDNO:549)及其同源物。因此，在某些实施方案中，本公开的蛋白酶(通常是slp5蛋白酶)的氨基酸序列与选自SEQIDNO：200-213、SEQIDNO：548-549的氨基酸序列具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在一些实施方案中，蛋白酶与选自SEQIDNO：200-213、SEQIDNO：548-549的氨基酸序列具有100％一致性。在一些实施方案中，slp5是里氏木霉slp5。由里氏木霉slp5编码的氨基酸序列如SEQIDNO：200所示。在其他实施方中，本公开的蛋白酶的氨基酸序列与SEQIDNO：200具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在进一步的实施方案中，蛋白酶与SEQIDNO：200具有100％一致性。Slp6合适的slp6蛋白酶的实例包括但不限于，里氏木霉slp6(SEQIDNO:214)、深绿木霉jgilTriat2(SEQIDNO:215)、绿木霉jgilTriviGv29_8_2(SEQIDNO:216)、绿色肉座菌(Hypocreavirens)gil29421423(SEQIDNO:217)、哈茨木霉有性型gil145583127(SEQIDNO:218)、哈氏木霉(Trichodermahamatum)gil30144643(SEQIDNO:219)、烟曲霉gil2295(SEQIDNO:220)、土曲霉(Aspergillusterreus)gill15391147(SEQIDNO:221)、米曲霉gil169771349(SEQIDNO:222)、黑曲霉gil470729(SEQIDNO:223)、苹果炭疽菌gil310794714(SEQIDNO:224)、小麦赤霉菌gil46114946(SEQIDNO:225)、尖孢镰刀菌gil342873942(SEQIDNO:226)、鞭毛藻丛赤壳菌gil302884541(SEQIDNO:227)、费氏新萨托菌gill19500190(SEQIDNO:228)、黄萎病病原菌gil302413161(SEQIDNO:229)、苹果炭疽菌gil310790144(SEQIDNO:230)、粗糙链孢霉gi85090020(SEQIDNO:550)及其同源物。因此，在某些实施方案中，本公开的蛋白酶(通常是slp6蛋白酶)的氨基酸序列与选自SEQIDNO：214-230、SEQIDNO：550的氨基酸序列具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在一些实施方案中，蛋白酶与选自SEQIDNO：214-230、SEQIDNO：550的氨基酸序列具有100％一致性。在一些实施方案中，slp6是里氏木霉slp6。由里氏木霉slp6编码的氨基酸序列如SEQIDNO：214所示。在其他实施方中，本公开的蛋白酶的氨基酸序列与SEQIDNO：214具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在进一步的实施方案中，蛋白酶与SEQIDNO：214具有100％一致性。Slp7合适的slp7蛋白酶的实例包括但不限于，里氏木霉slp7(SEQIDNO:231)、深绿木霉jgilTriat2(SEQIDNO:232)、绿木霉jgilTriviGv29_8_2(SEQIDNO:233)、金龟子绿僵菌gil322710320(SEQIDNO:234)、鞭毛藻丛赤壳菌gil302915000(SEQIDNO:235)、嗜热毁丝霉gil347009020、gi367024935(SEQIDNO:236)、小麦赤霉菌gil46137655(SEQIDNO:237)、太瑞斯梭孢壳霉gil346996549(SEQIDNO:238)、稻瘟病菌gil145610733(SEQIDNO:239)、构巢曲霉gi67541991(SEQIDNO:551)、产黄青霉gi255933786(SEQIDNO:552)、黑曲霉gi317036543(SEQIDNO:553)、米曲霉gil69782882(SEQIDNO:554)、粗糙链孢霉gi85109979(SEQIDNO:555)及其同源物。因此，在某些实施方案中，本公开的蛋白酶(通常是slp7蛋白酶)的氨基酸序列与选自SEQIDNO：231-239、SEQIDNO：551-555的氨基酸序列具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在一些实施方案中，蛋白酶与选自SEQIDNO：231-239、SEQIDNO：551-555的氨基酸序列具有100％一致性。在一些实施方案中，slp7是里氏木霉slp7。由里氏木霉slp7编码的氨基酸序列如SEQIDNO：231所示。在其他实施方中，本公开的蛋白酶的氨基酸序列与SEQIDNO：231具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在进一步的实施方案中，蛋白酶与SEQIDNO：231具有100％一致性。Slp8合适的slp8蛋白酶的实例包括但不限于，里氏木霉slp8(SEQIDNO:240)、深绿木霉jgilTriat2H98568(SEQIDNO:241)、绿木霉jgilTriviGv29_8_2l33902(SEQIDNO:242)及其同源物。因此，在某些实施方案中，本公开的蛋白酶(通常是slp7蛋白酶)的氨基酸序列与选自SEQIDNO：240-242的氨基酸序列具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在一些实施方案中，蛋白酶与选自SEQIDNO：240-242的氨基酸序列具有100％一致性。在一些实施方案中，slp8是里氏木霉slp8。由里氏木霉slp8编码的氨基酸序列如SEQIDNO：240所示。在其他实施方中，本公开的蛋白酶的氨基酸序列与SEQIDNO：240具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在进一步的实施方案中，蛋白酶与SEQIDNO：240具有100％一致性。Slp样蛋白酶其他slp样蛋白酶包括但不限于，slp57433(Tre57433SEQIDNO:885)、slp35726_(Tre35726SEQIDNO:886)、slp60791_(Tre60791SEQIDNO:887)或slpl09276_(Trel09276SEQIDNO:888)及其同源物。因此，在某些实施方案中，本公开的蛋白酶(通常是slp57433、slp35726、slp60791或slpl09276蛋白酶)的氨基酸序列与选自SEQIDNO：885-888的氨基酸序列具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在某些实施方案中，蛋白酶与选自SEQIDNO：885-888的氨基酸序列具有100％一致性。谷氨酸蛋白酶谷氨酸蛋白酶是水解多肽和蛋白质中的肽键的酶。谷氨酸蛋白酶对胃蛋白酶抑制剂A不敏感，因此有时也称为胃蛋白酶抑制剂不敏感的酸性蛋白酶。尽管之前将谷氨酸蛋白酶与天冬氨酸蛋白酶分为一组并通常合称为酸性蛋白酶，最近发现谷氨酸蛋白酶与天冬氨酸蛋白酶的活性位点残基非常不同。在木霉真菌细胞中已经鉴定了两种谷氨酸蛋白酶：gap1(tre69555)和gap2(tre106661)。Gap1合适的gap1蛋白酶的实例包括但不限于，里氏木霉gap1(SEQIDNO:118)、深绿木霉jgilTriat2l40863(SEQIDNO:119)、绿木霉jgilTriviGv29_8_2l192684(SEQIDNO:120)、黄曲霉(Aspergillusflavus)gil238499183(SEQIDNO:121)、黑曲霉gill45251555(SEQIDNO:122),土曲霉gill15491521(SEQIDNO:123)、gil37154543(SEQIDNO:124)、gil48425531(SEQIDNO:125)、gil351873(SEQIDNO:126)、太瑞斯梭孢壳霉gil346997245(SEQIDNO:127)、产黄青霉gil255940586(SEQIDNO:128)、嗜热毁丝霉gi367026504(SEQIDNO:574)、米曲霉gi317150886(SEQIDNO:575)、粗糙链孢霉gi85097968(SEQIDNO:576)、黑曲霉gil31056(SEQIDNO:577)、产黄青霉gi255930123(SEQIDNO:578)、黑曲霉gil45236956(SEQIDNO:579)、米曲霉gil69772955(SEQIDNO:580)、黑曲霉gil45249222(SEQIDNO:581)、构巢曲霉gi67525839(SEQIDNO:582)、米曲霉gil69785367(SEQIDNO:583)、产黄青霉gi255955319(SEQIDNO:584)、嗜热毁丝霉gi367019352(SEQIDNO:585)、米曲霉gi391863974(SEQIDNO:586)、嗜热毁丝霉gi367024513(SEQIDNO:587)及其同源物。因此，在某些实施方案中，本公开的蛋白酶(通常是gap1蛋白酶)的氨基酸序列与选自SEQIDNO：118-128、SEQIDNO：574-587的氨基酸序列具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在一些实施方案中，蛋白酶与选自SEQIDNO：118-128、SEQIDNO：574-587的氨基酸序列具有100％一致性。在一些实施方案中，gap1是里氏木霉gap1。由里氏木霉gap1编码的氨基酸序列如SEQIDNO：118所示。在其他实施方中，本公开的蛋白酶的氨基酸序列与SEQIDNO：118具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在进一步的实施方案中，蛋白酶与SEQIDNO：118具有100％一致性。Gap2合适的gap2蛋白酶的实例包括但不限于，里氏木霉gap2(SEQIDNO:129)、深绿木霉jgilTriat2l298116(SEQIDNO:130)、绿木霉jgilTriviGv29_8_2l30331(SEQIDNO:131)、jgilTriviGv29_8_2l225131(SEQIDNO:132)、黄曲霉gil238499183(SEQIDNO:133)、黑曲霉gill45251555(SEQIDNO:134)、构巢曲霉gil67901056(SEQIDNO:135)、棒曲霉gill21711990(SEQIDNO:136)、烟曲霉gil70986250(SEQIDNO:137)、马尔尼菲青霉菌gil212534108(SEQIDNO:138)、柄篮状菌gil242789335(SEQIDNO:139)、蓝菌属真菌gil320591529(SEQIDNO:140)、费氏新萨托菌gill19474281(SEQIDNO:141)、马尔尼菲青霉菌gil212527274(SEQIDNO:142)、产黄青霉gil255940586(SEQIDNO:143)、gill31056(SEQIDNO:144)、嗜热毁丝霉gi367030275(SEQIDNO:588)及其同源物。因此，在某些实施方案中，本公开的蛋白酶(通常是gap2蛋白酶)的氨基酸序列与选自SEQIDNO：129-144、SEQIDNO：588的氨基酸序列具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在一些实施方案中，蛋白酶与选自SEQIDNO：129-144、SEQIDNO：588的氨基酸序列具有100％一致性。在一些实施方案中，gap2是里氏木霉gap2。由里氏木霉gap2编码的氨基酸序列如SEQIDNO：129所示。在其他实施方中，本公开的蛋白酶的氨基酸序列与SEQIDNO：129具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在进一步的实施方案中，蛋白酶与SEQIDNO：129具有100％一致性。其他gap样蛋白酶包括但不限于，gap3(Tre70927SEQIDNO:889)、或gap4_(Tre57575SEQIDNO:890)及其同源物。因此，在某些实施方案中，本公开的蛋白酶，通常是gap3或gap4蛋白酶的氨基酸序列与选自SEQIDNO：889或SEQIDNO：890的氨基酸序列具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在一些实施方案中，蛋白酶与选自SEQIDNO：889-889的氨基酸序列具有100％一致性。Sedolisin蛋白酶Sedolisin蛋白酶是利用丝氨酸残基来水解多肽和蛋白质中的肽键的酶。Sedolisin蛋白酶通常包含独特的丝氨酸、谷氨酸和天冬氨酸催化三元组。Sedolisin蛋白酶也在氧离子洞中包含天冬氨酸残基。来自真核生物(例如木霉真菌)的sedolisin蛋白酶包括三肽基肽酶。合适的tpp1蛋白酶的实例包括但不限于，里氏木霉tpp1(SEQIDNO:145)、深绿木霉jgilTriat2l188756(SEQIDNO:146)、绿木霉jgilTriviGv29_8_2l217176(SEQIDNO:147)、烟曲霉gil70993168(SEQIDNO:148)、米曲霉gill69776800(SEQIDNO:149)、黑曲霉gill45236399(SEQIDNO:150)、棒曲霉gill21708799(SEQIDNO:151)、黑曲霉gill45239871(SEQIDNO:152)、棒曲霉gill21714541(SEQIDNO:153)、土曲霉gill15387645(SEQIDNO:154)、烟曲霉gil70982015(SEQIDNO:155)、油菜菌核病菌gill56045898(SEQIDNO:156)、灰霉病菌(Botryotiniafuckeliana)gill54321758(SEQIDNO:157)、费氏新萨托菌gilll9499774(SEQIDNO:158)、柄篮状菌gil242798348(SEQIDNO:159)、马尔尼菲青霉菌gil212541546(SEQIDNO:160)、小麦赤霉菌gil46114460(SEQIDNO:161)、尖孢镰刀菌gil342890694(SEQIDNO:162)、蓝菌属真菌gil320592937(SEQIDNO:163)、黄萎病病原菌gil302406186(SEQIDNO:164)、棉花黄萎病菌gil346971444(SEQIDNO:165)、烟曲霉CAE51075.1(SEQIDNO:556)、米曲霉XP_001820835.1(SEQIDNO:557)、产黄青霉XP_002564029.1(SEQIDNO:558)、构巢曲霉XP_664805.1(SEQIDNO:559)、产黄青霉XP_002565814.1(SEQIDNO:560)、嗜热毁丝霉XP_003663689.1(SEQIDNO:561)、粗糙链孢霉XP_958412.1(SEQIDNO:562)、黑曲霉XP_001394118.1(SEQIDNO:563)、烟曲霉CAE17674.1(SEQIDNO:564)、黑曲霉XP_001400873.1(SEQIDNO:565)、烟曲霉CAE46473.1(SEQIDNO:566)、米曲霉XP_002373530.1(SEQIDNO:567)、构巢曲霉XP_660624.1(SEQIDNO:568)、产黄青霉XP_002562943.1(SEQIDNO:569)、烟曲霉CAE17675.1(SEQIDNO:570)、烟曲霉EAL86850.2(SEQIDNO:571)、粗糙链孢霉XP_961957.1(SEQIDNO:572)、米曲霉BAB97387.1(SEQIDNO:573)及其同源物。因此，在某些实施方案中，本公开的蛋白酶(通常是tpp1蛋白酶)的氨基酸序列与选自SEQIDNO：556-573的氨基酸序列具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在一些实施方案中，蛋白酶与选自SEQIDNO：556-573的氨基酸序列具有100％一致性。在一些实施方案中，tpp1是里氏木霉tpp1。由里氏木霉tpp1编码的氨基酸序列如SEQIDNO：145所示。在其他实施方中，本公开的蛋白酶的氨基酸序列与SEQIDNO：145具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在进一步的实施方案中，蛋白酶与SEQIDNO：145具有100％一致性。其他sedolisin样蛋白酶包括但不限于，sed2(Tre70962,SEQIDNO:891)、sed3_(Tre81517SEQIDNO:892)或sed5_(Trel11838SEQIDNO:893)及其同源物。因此，在某些实施方案中，本公开的蛋白酶(通常是sed2、sed3或sed5蛋白酶)的氨基酸序列与选自SEQIDNO：891-893的氨基酸序列具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在一些实施方案中，蛋白酶与选自SEQIDNO：891-893的氨基酸序列具有100％一致性。氨肽酶蛋白酶氨肽酶催化氨基酸从蛋白质或肽底物的氨基末端的切割。它们在动物和植物界广泛分布，并且在很多亚细胞器、细胞质以及膜成分中发现。这些肽酶中的很多，但不是所有，是锌金属酶。Amp2是双功能性酶。它是具有氨肽酶活性的白三烯A4水解酶(EC3.3.2.6)。在木霉真菌细胞中已经鉴定了两种氨肽酶：ampl(tre81070)和amp2(trel08592)。Amp1合适的amp1蛋白酶的实例包括但不限于，里氏木霉amp181070(SEQIDNO:759)、绿木霉74747(SEQIDNO:760)、深绿木霉(SEQIDNO:761)、禾谷镰刀菌(F.graminicola)XP_386703.1(SEQIDNO:762)、构巢曲霉CBF75094.1(SEQIDNO:763)、黑曲霉EHA21022.1(SEQIDNO:764)、米曲霉XP_001727175.1(SEQIDNO:765)、烟曲霉XP_749158.1(SEQIDNO:766)、嗜热毁丝霉XP_003667354.1(SEQIDNO:767)、禾谷镰刀菌XP_385112.1(SEQIDNO:768)、产黄青霉XP_002567159.1(SEQIDNO:769)、烟曲霉XP_748386.2(SEQIDNO:770)、米曲霉XP_001819545.1(SEQIDNO:771)、构巢曲霉XP_681714.1(SEQIDNO:772)、粗糙链孢霉(SEQIDNO:773)、嗜热毁丝霉XP_003665703.1(SEQIDNO:774)及其同源物。因此，在某些实施方案中，本公开的蛋白酶(通常是amp1蛋白酶)的氨基酸序列与选自SEQIDNO：759-774的氨基酸序列具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在一些实施方案中，蛋白酶与选自SEQIDNO：759-774的氨基酸序列具有100％一致性。在一些实施方案中，amp1是里氏木霉amp1。由里氏木霉amp1编码的氨基酸序列如SEQIDNO：759所示。在其他实施方中，本公开的蛋白酶的氨基酸序列与SEQIDNO：759具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在进一步的实施方案中，蛋白酶与SEQIDNO：759具有100％一致性。Amp2合适的amp2蛋白酶的实例包括但不限于，里氏木霉amp2108592(SEQIDNO:775)、绿木霉73611(SEQIDNO:776)、深绿木霉284076(SEQIDNO:777)、禾谷镰刀菌XP_390364.1(SEQIDNO:778)、粗糙链孢霉XP_960660.1(SEQIDNO:779)、嗜热毁丝霉XP_003662184.1(SEQIDNO:780)、米曲霉(XP_001826499.2(SEQIDNO:781)、黑曲霉XP_001390581.1(SEQIDNO:782)、构巢曲霉XP_663416.1(SEQIDNO:783)、烟曲霉XP_755088.1(SEQIDNO:784)、产黄青霉XP_002558974.1(SEQIDNO:785)及其同源物。因此，在某些实施方案中，本公开的蛋白酶(通常是amp2蛋白酶)的氨基酸序列与选自SEQIDNO：775-785的氨基酸序列具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在一些实施方案中，蛋白酶与选自SEQIDNO：775-785的氨基酸序列具有100％一致性。在一些实施方案中，amp2是里氏木霉amp2。由里氏木霉amp2编码的氨基酸序列如SEQIDNO：775所示。在其他实施方中，本公开的蛋白酶的氨基酸序列与SEQIDNO：775具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在进一步的实施方案中，蛋白酶与SEQIDNO：775具有100％一致性。Sep蛋白酶Sep蛋白酶是属于S28亚型的丝氨酸蛋白酶。它们具有丝氨酸、天冬氨酸和组氨酸的催化三元组：丝氨酸作为亲核剂、天冬氨酸作为亲电剂，和组氨酸作为基础。这些丝氨酸蛋白酶包括几种真核酶，例如溶酶体Pro-X羧肽酶、二肽基-肽酶II和胸腺特异性的丝氨酸蛋白酶。合适的sep1蛋白酶的实例包括但不限于，里氏木霉sep1124051(SEQIDNO:786)、绿木霉39211(SEQIDNO:787)、深绿木霉296922(SEQIDNO:788)、黑曲霉CAK45422.1(SEQIDNO:789)、烟曲霉EDP53789.1(SEQIDNO:790)、粗糙链孢霉XP.958301.1(SEQIDNO:791)、嗜热毁丝霉XP_003664601.1(SEQIDNO:792)、禾生球腔菌(M.graminicola)XP_384993.1(SEQIDNO:793)、嗜热毁丝霉XP_003658945.1(SEQIDNO:794)、禾谷镰刀菌XP_382380.1(SEQIDNO:795)、黑曲霉XP_001395660.1(SEQIDNO:796)、嗜热毁丝霉XP_003659734.1(SEQIDNO:797)、粗糙链孢霉XP_964374.1(SEQIDNO:798)、烟曲霉XP_756068.1(SEQIDNO:799)、米曲霉EIT77098.1(SEQIDNO:800)、产黄青霉XP_002560028.1(SEQIDNO:801)、米曲霉EIT71569.1(SEQIDNO:802)、构巢曲霉CBF79006.1(SEQIDNO:803)、黑曲霉XP_001400740.2(SEQIDNO:804)、米曲霉BAE57999.1(SEQIDNO:805)及其同源物。因此，在某些实施方案中，本公开的蛋白酶(通常是sep1蛋白酶)的氨基酸序列与选自SEQIDNO：786-805的氨基酸序列具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在一些实施方案中，蛋白酶与选自SEQIDNO：786-805的氨基酸序列具有100％一致性。在一些实施方案中，sep1是里氏木霉sep1。由里氏木霉sep1编码的氨基酸序列如SEQIDNO：786所示。在其他实施方中，本公开的蛋白酶的氨基酸序列与SEQIDNO：786具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在进一步的实施方案中，蛋白酶与SEQIDNO：786具有100％一致性。锌金属酶锌金属酶是催化活性需要锌的蛋白酶。在木霉真菌细胞中已经鉴定了五种锌金属酶：mpl(tre122703)、mp2(tre122576)、mp3(tre4308)、mp4(tre53343)、mp5(tre73809)。mpl、mp2、mp3、mp4和mp5合适的mpl、mp2、mp3、mp4和mp5蛋白酶的实例包括但不限于，里氏木霉mpl(SEQIDNO:875)、里氏木霉mp2(SEQIDNO:876)、里氏木霉mp3(SEQIDNO:877)、里氏木霉mp4(SEQIDNO:878)、里氏木霉mp5(SEQIDNO:879)。因此，在某些实施方案中，本公开的蛋白酶(通常是mpl、mp2、mp3、mp4或mp5蛋白酶)的氨基酸序列与选自SEQIDNO：875-879的氨基酸序列具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在一些实施方案中，蛋白酶与选自SEQIDNO：875-879的氨基酸序列具有100％一致性。其他蛋白酶其他合适的蛋白酶的实例包括但不限于，-里氏木霉A组蛋白酶，选自：蛋白酶65735(SEQIDNO:894)、蛋白酶77577(SEQIDNO:895)、蛋白酶81087(SEQIDNO:896)、蛋白酶56920(SEQIDNO:900)、蛋白酶l22083(SEQIDNO:911)、蛋白酶79485(SEQIDNO:910)、蛋白酶120998(SEQIDNO:901)或蛋白酶61127(SEQIDNO:912)；-里氏木霉B组蛋白酶，选自：蛋白酶21659(SEQIDNO:905)、蛋白酶58387(SEQIDNO:921)、蛋白酶75159(SEQIDNO:918)、蛋白酶56853(SEQIDNO:914)或蛋白酶64193(SEQIDNO:908)；-里氏木霉C组蛋白酶，选自：蛋白酶82452(SEQIDNO:906),蛋白酶80762(SEQIDNO:913)、蛋白酶21668(SEQIDNO:919)、蛋白酶81115(SEQIDNO:907)、蛋白酶82141(SEQIDNO:902)、蛋白酶23475(SEQIDNO:909)；-里氏木霉D组蛋白酶，选自：蛋白酶121890(903)、蛋白酶22718(SEQIDNO:904)、蛋白酶47127(SEQIDNO:899)、蛋白酶61912(SEQIDNO:920)、蛋白酶80843(SEQIDNO:897)、蛋白酶66608(SEQIDNO:923)、蛋白酶72612(SEQIDNO:898)、蛋白酶40199(SEQIDNO:917)；或-里氏木霉E组蛋白酶，选自：蛋白酶22210(SEQIDNO:915)、蛋白酶111694(SEQIDNO:916)、蛋白酶82577(SEQIDNO:922)，及其同源物。因此，在某些实施方案中，本公开的蛋白酶的氨基酸序列与选自SEQIDNO：894-923的氨基酸序列具有50％或更多一致性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)。在某些实施方案中，蛋白酶与选自SEQIDNO：894-923的氨基酸序列具有100％一致性。同源蛋白酶本公开的其他实施方案涉及降低与本公开的蛋白酶同源的蛋白酶的活性。如本文所使用，“同源性”是指参考序列和至少第二序列的片段之间的序列相似性。可以通过本领域已知的任何方法，通过使用BLAST工具将参考序列与单个第二序列或序列片段或与序列数据库相比较来鉴定同源性。如下所述，BLAST将基于百分比一致性和相似性来比较序列。如本文所使用，在两个或更多个核苷酸或氨基酸序列的情况下，术语“相同”或百分比“一致性”是指相同的两个或更多个序列或子序列。当用以下序列比较算法之一或通过人工比对和目视检查在比较窗口或指定区域上进行最大对应的比较和比对时，如果两个序列具有特定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(例如在指定区域上或当没有指定时在整个序列上29％一致性，任选地30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％一致性)，两个序列“基本上相同”。任选地，一致性在长度至少为约50个核苷酸(或10个氨基酸)的区域，或更优选在长度为100-500或1000或更多个核苷酸(或20、50、200或更多个氨基酸)的区域内存在。对于序列比较，通常一个序列作为参考序列，测试序列与其比较。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机，如有必要指定子序列坐标，并指定序列对比程序的参数。可以使用默认的程序参数，或可以指定其他参数。然后序列比较算法根据程序参数计算测试序列相对于参考序列的百分比序列一致性。当比较两个序列的一致性时，序列不需要是连续的，但任何空位将会遭受罚分，降低总的百分比一致性。对于blastn，默认参数是空位开放罚分＝5，空位延伸罚分＝2。对于blastp，默认参数是空位开放罚分＝11，空位延伸罚分＝1。如本文所使用，“比较窗口”包括具有包含但不限于20-600个，通常约50至约200个，更通常约100至约150个连续位置数任意之一的片段，其中在两个序列最佳比对后将序列与具有相同数目的连续位置的参照序列相比较。用于比较的序列的比对方法是本领域公知的。用于比较的序列的最佳比对可以通过例如以下来进行：Smith和Waterman的局部同源性算法(1981)、Needleman和Wunsch(1970)JMolBiol48(3):443-453的同源性比对算法、Pearson和Lipman(1988)ProcNatlAcadSciUSA85(8):2444-2448的相似性检索方法、这些算法的计算机实现(WisconsinGeneticsSoftwarePackage,GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.,Madison,Wl的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或人工比对和目视检查[参见例如Brent等,(2003)CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,Inc.(RingbouEd)]。适于测定百分比序列一致性和序列相似性的算法的两个实例是BLAST和BLAST2.0算法，其分别描述于Altschul等(1997)NucleicAcidsRes25(17):3389-3402和Altschul等(1990)J.MolBiol215(3)-403-410。公众可从国家生物技术信息中心获得进行BLAST分析的软件。这种算法涉及首先通过鉴定查询序列中的短字长W来鉴定高得分序列对(HSP)，当与数据库序列中的相同字长比对时，所述高得分序列对符合或满足某些正值阈值T。T是指邻域字得分阈值(Altschul等，以上)。这些初始邻域字点击是开始检索以寻找包含它们的更长HSP的种子。字点击沿着各序列以累积比对得分可以增加到的地方向两个方向延伸。对于核酸序列，累积得分利用参数M(配对残基对的奖励得分；总是>0)和N(不配对残基的罚分；总是<0)来计算。对于氨基酸序列，利用评分矩阵类计算累积得分。当累积得分从它的最大所得值下降数量X时，当累积得分由于一个或多个负分残基比对的累积变成0或以下时，或当到达任一序列的末端时，字点击在各方向上的延伸停止。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏性和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)默认使用的字长(W)是11，期望值(E)是10，M＝5，N＝-4，且比较两条链。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认使用的字长(W)是3，期望值(E)是10，以及BLOSUM62评分矩阵[参见Henikoff和Henikoff,(1992)ProcNatlAcadSciUSA89(22):10915-10919]比对(B)是50，期望值(E)是10，M＝5，N＝-4，且比较两条链。BLAST算法还进行两个序列之间相似性的统计学分析(参见例如Karlin和Altschul,(1993)ProcNatlAcadSciUSA90(12):5873-5877)。BLAST算法提供的相似性的一个度量是最小和概率(P(N))，其提供两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生配对的可能性的指示。例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中，最小和概率小于约0.2，更优选小于约0.01，最优选小于约0.001，则认为该核酸与参考序列相似。除以上所述的序列一致性百分比之外，两个核酸序列或多肽基本上相同的另一个指示是由第一个核酸编码的多肽与针对由第二个核酸编码的多肽的抗体具有免疫交叉反应，如下所述。因此，例如当两个肽的差别仅在于保守性替换时，多肽通常与第二个多肽基本上相同。两个核酸序列基本上相同的另一个指示是两个分子或其补体在严格条件下彼此杂交，如下所述。两个核酸序列基本上相同的再一个指示是可用相同引物来扩增序列。如在本文所公开，本公开的蛋白酶还可以包括由上述蛋白酶基因编码的蛋白酶的保守性修饰变体。如本文所使用，“保守性修饰变体”包括编码氨基酸序列的单个替换、缺失或添加，其结果是用化学相似的氨基酸替换一个氨基酸。提供功能相似的氨基酸的保守性替换表是本领域公知的。这种保守性修饰变体是本公开之外的多态性变体、种间同源物和等位基因且不排除本公开的多态性变体、种间同源物和等位基因。以下八组包含彼此是保守性替换的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L),蛋氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、蛋氨酸(M)(参见例如Creighton,Proteins(1984))。选择的丝状真菌的天冬氨酸、枯草杆菌、谷氨酸和sedolisin蛋白酶的系统发生树描述于WO2013/102674。用于降低本发明蛋白酶活性的方法本公开的进一步方面涉及降低表达异源多肽，例如哺乳动物多肽的丝状真菌细胞中发现的蛋白酶的活性。可以通过本领域技术人员已知的任何方法来降低丝状真菌细胞中发现的蛋白酶的活性。在一些实施方案中，通过降低蛋白酶的表达，例如通过启动子修饰或RNAi来实现蛋白酶活性的降低。在其他实施方案中，通过修饰编码蛋白酶的基因来实现蛋白酶活性的降低。这种修饰的实例包括但不限于敲除突变、截断突变、点突变、错义突变、替换突变、移码突变、插入突变、重复突变、扩增突变、易位突变或反转突变和引起相应蛋白酶活性降低的那些。在编码蛋白酶的目标基因中产生至少一个突变的方法是本领域公知的，包括但不限于随机诱变和筛选、定点诱变、PCR诱变、插入诱变、化学诱变和辐射。在某些实施方案中，修饰蛋白酶编码基因的一部分，例如编码催化结构域的区域、编码区或表达编码区所需的控制序列。这种基因的控制序列可以是启动子序列或其功能性部分，即足以影响基因表达的部分。例如，启动子序列可以失活，造成启动子不表达，或可以用弱启动子替换天然启动子序列以降低编码序列的表达。用于可能修饰的其他控制序列包括但不限于前导序列、前肽序列、信号序列、转录终止子和转录激活因子。还可以利用基因删除技术来修饰表达重组多肽的丝状真菌细胞中存在的本公开的蛋白酶编码基因以消除或降低基因表达。基因删除技术能够部分或完全去除基因，从而消除它们的表达。在这些方法中，可以通过使用构建成连续包含基因侧翼的5’和3’区的质粒的同源重组完成基因删除。还可以通过在基因或基因的转录或翻译所需的其控制序列中引入、替换和/或去除一个或多个核苷酸来修饰表达重组多肽的丝状真菌细胞中存在的本公开的蛋白酶编码基因。例如，可以插入或去除核苷酸以引入终止密码子、去除起始密码子或使开放阅读框移位。这些修饰可以通过本领域已知的方法完成，包括但不限于定点诱变和peR产生的诱变(参见例如Botstein和Shortie,1985,Science229:4719；Lo等,1985,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA81:2285；Higuchi等,1988,NucleicAcidsResearch16:7351；Shimada,1996,Meth.Mol.Bioi.57:157；Hoetal.,1989,Gene77:61；Horton等,1989,Gene77:61；以及Sarkar和Sommer,1990,BioTechniques8:404)。此外，可以通过基因破坏技术在基因中插入破坏性核酸构建体来修饰表达重组多肽的丝状真菌细胞中存在的本公开的蛋白酶编码基因，所述构建体包含与该基因同源的核酸片段，该片段将产生重复的同源区域并将构建体DNA整合到重复区域之间。如果插入的构建体将基因的启动子和编码区隔开或打断编码序列，从而产生无功能的基因产物，则这种基因破坏可以消除基因表达。破坏性构建体可以是简单的伴随有与基因同源的5’和3’区的可选择标记基因。可选择标记能够鉴定包含被破坏的基因的转化体。还可以通过基因转化方法来修饰表达重组多肽的丝状真菌细胞中存在的本公开的蛋白酶编码基因(参见例如Iglesias和Trautner,1983,MolecularGeneralGenetics189:573-76)。例如，在基因转化中，体外诱变对应于该基因的核酸序列以产生缺陷的核酸序列，然后将其转化进木霉菌株以产生缺陷基因。通过同源重组，缺陷的核酸序列替代内源基因。也可以期望缺陷的核酸序列还包含用于选择包含缺陷基因的转化体的标记。还可以通过已建立的反义技术来修饰表达重组多肽的丝状真菌细胞中存在的本公开的蛋白酶编码基因，所述反义技术使用与基因的核酸序列互补的核酸序列(参见例如Parish和Stoker,1997,FEMSMicrobiologyLetters154:151-157)。具体地，可以通过引入与基因的核酸序列互补的可以在菌株中转录并能够与细胞产生的mRNA杂交的核酸序列来降低或灭活丝状真菌细胞的基因表达。在允许互补反义核酸序列与mRNA杂交的条件下，翻译蛋白的量由此降低或消除。此外，还可以通过已建立的RNA干扰(RNAi)技术来修饰表达重组多肽的丝状真菌细胞中存在的本公开的蛋白酶编码基因(参见例如WO2005/056772和WO2008/080017)。还可以使用本领域公知的方法通过随机或特异性诱变来修饰表达重组多肽的丝状真菌细胞中存在的本公开的蛋白酶编码基因，所述方法包括但不限于化学诱变(参见例如Hopwood,TheIsolationofMutantsinMethodsinMicrobiology(J.R.NorrisandD.W.Ribbons,eds.)pp.363-433,AcademicPress,NewYork,251970)。基因修饰可以通过以下进行：将丝状真菌细胞进行诱变，筛选其中基因表达降低或失活的突变细胞。特异性或随机诱变可以例如通过以下进行：使用合适的物理或化学诱变剂、使用合适的寡核苷酸、使DNA序列进行peR产生的诱变或它们的任意组合。物理和化学诱变剂的实例包括但不限于紫外线(UV)辐射、羟胺、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、N-甲基-N’-亚硝基胍(NTG)、O-甲基羟胺、亚硝酸、甲基磺酸乙酯(EMS)、亚硫酸氢钠、甲酸和核苷酸类似物。当使用这些试剂时，一般通过以下进行诱变：在合适条件下在选择的诱变剂存在下孵育待诱变的木霉细胞，然后选择基因表达降低或没有基因表达的突变体。在某些实施方案中，本公开的蛋白酶编码基因中的至少一个突变或修饰造成改性蛋白酶的蛋白酶活性不可检测。在其他实施方案中，本公开的蛋白酶编码基因中的至少一个突变或修饰造成改性蛋白酶的蛋白酶活性比相应的未改性蛋白酶少至少25％、至少50％、至少75％、至少90％、至少95％、至少95％、至少100％、至少200％、至少300％、至少400％、至少500％、至少600％、至少700％、至少800％、至少900％、至少1000％或更高百分比。例如，在某些实施方案中，在木霉细胞中，本公开的蛋白酶编码基因中的至少一个突变或修饰造成总蛋白酶活性降低至相应的亲本木霉细胞的总蛋白酶活性的49％或更少，通常在至少2个不同蛋白酶基因中具有突变，或31％或更少，通常在至少3个不同蛋白酶基因中具有突变，或13％或更少，通常在至少4个不同蛋白酶基因中具有突变，或10％或更少，通常在至少5个不同蛋白酶基因中具有突变，或6.3％或更少，通常在至少6个不同蛋白酶基因中具有突变，或5.5％或更少，通常在至少7个不同蛋白酶基因中具有突变。本发明的异源蛋白本发明进一步涉及通过降低细胞中的蛋白酶活性增加表达异源多肽的丝状真菌细胞中这种异源多肽的生产。如本文所用，“异源多肽”是指在本公开的丝状真菌细胞中不是天然存在(即内源)的多肽，或与内源型多肽相比在丝状真菌细胞中以升高的水平表达的多肽。在某些实施方案中，异源多肽是哺乳动物多肽。在其他实施方案中，异源多肽是非哺乳动物多肽。哺乳动物多肽本公开的哺乳动物多肽可以是具有目标生物活性的任何哺乳动物多肽。如本文所用，“哺乳动物多肽”是在哺乳动物中天然表达的多肽，从在哺乳动物中天然表达的多肽衍生的多肽或其片段。哺乳动物多肽还包括保留生物活性的肽和寡肽。本公开的哺乳动物多肽还可以包括组合以形成编码产物的两种或更多种多肽。本公开的哺乳动物多肽还可以进一步包括融合多肽，其包含来自至少两种不同多肽的部分或完整氨基酸序列的组合。哺乳动物多肽还可以包括任何公开的哺乳动物多肽的天然存在的等位基因和工程化变体和杂合哺乳动物多肽。哺乳动物动态可以是天然糖基化的多肽或天然非糖基化的多肽。合适的哺乳动物多肽的实例包括但不限于免疫球蛋白、抗体、抗原、抗菌肽、酶、生长因子、激素、干扰素、细胞因子、白细胞介素、免疫调节剂、神经递质、报告基因、报告蛋白、结构蛋白和转录因子。合适的哺乳动物多肽的具体实例包括但不限于免疫球蛋白、免疫球蛋白重链、免疫球蛋白轻链、单克隆抗体、杂合抗体、F(ab')2抗体片段、F(ab)抗体片段、Fv分子、单链Fv抗体、二聚抗体片段、三聚抗体片段、功能性抗体片段、免疫粘附素、胰岛素样生长因子1、生长激素、胰岛素、干扰素α2b、成纤维细胞生长因子21、人血清白蛋白、骆驼抗体和/或抗体片段、单域抗体、多聚单域抗体和促红细胞生成素。合适的哺乳动物蛋白的其他实例包括但不限于氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶、连接酶、氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、葡糖醛酸酯酶、卤素过氧化物酶、转化酶、脂肪酶、氧化酶、磷脂酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、尿激酶、白蛋白、胶原蛋白、原弹性蛋白和弹性蛋白。非哺乳动物多肽本公开的非哺乳动物多肽可以是具有目标生物活性的任何非哺乳动物多肽。如本文所用，“非哺乳动物多肽”是在非哺乳动物的生物，例如真菌细胞中天然表达的多肽，从在非哺乳动物的生物中天然表达的多肽衍生的多肽或其片段。非哺乳动物多肽还包括保留生物活性的肽和寡肽。本公开的非哺乳动物多肽还可以包括组合以形成编码产物的两种或更多种多肽。本公开的非哺乳动物多肽还可以进一步包括融合多肽，其包含来自至少两种不同多肽的部分或完整氨基酸序列的组合。非哺乳动物多肽还可以包括任何公开的非哺乳动物多肽的天然存在的等位基因和工程化变体和杂合非哺乳动物多肽。合适的非哺乳动物多肽的实例包括但不限于氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质蛋白酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、葡聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、磷脂酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶和木聚糖酶。异源多肽生产用包含具有降低活性的至少三种蛋白酶的本公开的丝状真菌细胞，使用本领域已知的方法通过在用于生产异源多肽的营养培养基中培养细胞来生产目标异源多肽。例如，可以在合适的培养基中，在允许多肽表达和/或分离的条件下，在实验室或工业发酵罐中通过摇瓶培养、小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的程序，在包含碳源和氮源和无机盐的合适的营养培养基中进行培养。可以从商业供货商获得或根据发表的组合物(例如在美国模式培养物保藏中心的目录中)制备合适的培养基。可以从培养基中直接回收分泌的多肽。如果多肽不是分泌的，可以从细胞裂解物中获得多肽。可以用本领域已知的对异源多肽具有特异性的方法检测包含具有降低活性的至少三种蛋白酶的本公开的丝状真菌细胞产生的目标异源多肽。这些检测方法可以包括但不限于使用特异性抗体、高效液相色谱、毛细管色谱、酶产物的形成、酶底物的消失和SDS-PAGE。例如，可以使用酶分析来测定酶的活性。对于很多酶，用于测定酶活性的程序是本领域已知的(参见例如O.Schomburg和M.Salzmann(eds.),EnzymeHandbook,Springer-Verlag,NewYork,1990)。可以通过本领域已知的方法分离所得异源多肽。例如，可以通过常规程序从培养基中分离目标异源多肽，所述常规程序包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发和沉淀。然后通过本领域已知的各种程序进一步纯化分离的异源多肽，所述程序包括但不限于色谱(例如离子交换、亲和性、疏水性、色谱聚焦和尺寸排阻)、电泳方法(例如准备的等电位焦距(IEF))、不同溶解度(例如硫酸铵沉淀)或提取(参见例如ProteinPurification,J.-C.JansonandLarsRyden,editors,VCHPublishers,NewYork,1989)。制备编码异源多肽的多核苷酸用本领域已知的合适方法制备本公开的异源多核苷酸序列，包括但不限于直接化学合成或克隆。对于直接化学合成，形成核苷酸聚合物通常涉及将3'-封闭和5'-封闭的核苷酸单体添加至延伸核苷酸链的末端5'-羟基，其中所述添加通过延伸链的末端5'-羟基的亲核性攻击添加单体(通常是磷酸衍生物，例如磷酸三酯、亚磷酰胺等)的3'-位来实现。这种方法是本领域普通技术人员已知的，且描述于相关文本和文献(例如Matteucci等,(1980)TetrahedronLett21:719-722；美国专利号4,500,707；5,436,327；和5,700,637)。此外，可以通过以下从天然来源中分离所需序列：使用合适的限制性酶分裂DNA，用凝胶电泳分离片段，然后用本领域普通技术人员已知的技术(例如使用聚合酶链式反应，PCR；例如美国专利号4,683,195)从凝胶回收所需的核酸序列。可以将本公开的各异源多核苷酸整合入表达载体。“表达载体”或“载体”是指转导、转化或感染宿主细胞，从而造成细胞表达除细胞中天然的之外的核酸和/或蛋白质(或以不是细胞天然的方式表达)的化合物和/或组合物。“表达载体”包含待通过宿主细胞表达的核酸序列(通常是RNA或DNA)。任选地，表达载体还包括有助于实现核酸进入宿主细胞的物质，例如病毒、脂质体、蛋白包被等。考虑用于本公开的表达载体包括其中可以插入核酸序列(与任何优选或所需的操作元件一起)的那些。此外，表达载体必须能够转移入细胞并在其中复制。优选的表达载体是质粒，尤其是具有完整记录的限制性位点且包含核酸序列转录优选或所需的操作元件的那些。这种质粒以及其他表达载体是本领域公知的。单个多核苷酸的整合可以通过已知的方法完成，其包括例如使用限制性酶(例如BamHI、EcoRI、HhaI、XhoI、XmaI等)来切割表达载体如质粒中的特异性位点。限制性酶产生可以退火为多核苷酸的单链末端，所述多核苷酸具有或合成以具有与切割的表达载体的末端互补的序列。使用合适的酶，例如DNA连接酶进行退火。本领域普通技术人员将理解，表达载体和所需的多核苷酸通常用相同的限制性酶切割，从而确保表达载体的末端和多核苷酸的末端彼此互补。此外，可以使用DNA接头以促进核酸序列连接至表达载体。还可以通过使用本领域已知的方法组合一系列的单个多核苷酸(例如美国专利号4,683,195)。例如，初始可以在单独的PCR中制备各所需多核苷酸。然后，设计特异性引物使PCR产物末端包含互补序列。当将PCR产物混合、变性并再退火时，在3’端具有配对序列的链重叠并互相作为引物。用DNA聚合酶延伸该重叠，产生其中原始序列被“拼接”在一起的分子。以这种方式，可以将一系列单个多核苷酸“拼接”在一起并随后同时转导入宿主细胞。因此，多个多核苷酸中的每一个的表达均受影响。然后将单个多核苷酸或“拼接的”多核苷酸整合入表达载体。本公开不限制将多核苷酸整合入表达载体的方法。本领域普通技术人员熟知将多核苷酸整合入表达载体所需的步骤。典型的表达载体包含所需的多核苷酸，前面是一个或多个调节区，和核糖体结合位点，例如大肠杆菌(E.coli)中长度为3-9个核苷酸且位于起始密码子上游3-11个核苷酸的核苷酸序列。参见Shine和Dalgarno(1975)Nature254(5495):34-38和Steitz(1979)BiologicalRegulationandDevelopment(ed.Goldberger,R.R),1:349-399(Plenum,NewYork)。如本文所用，术语“可操作连接”是指其中控制序列相对于DNA序列或多核苷酸的编码区位于合适位置，使得控制序列指引多肽表达的构型。调节区包括例如包含启动子和操作子的那些区域。启动子可操作连接至所需多核苷酸，从而通过RNA聚合酶启动多核苷酸的转录。操作子是与启动子相邻的核酸序列，其包含阻遏蛋白可以结合的蛋白结合结构域。在缺乏阻遏蛋白的情况下，转录通过启动子启动。当存在时，对操作子的蛋白结合结构域具有特异性的阻遏蛋白结合操作子，从而抑制转录。以这种方式，基于所用的特定调节区和相应阻遏蛋白的存在或缺乏来完成转录控制。实例包括乳糖启动子(当与乳糖接触时，Lad阻遏蛋白改变构型，从而阻止Lad阻遏蛋白结合操作子)和色氨酸启动子(当与色氨酸复合时，TrpR阻遏蛋白具有结合操作子的构型；当缺乏色氨酸时，TrpR阻遏蛋白具有不结合操作子的构型)。另一个实例是tac启动子(参见deBoer等,(1983)ProcNatlAcadSciUSA80(l):21-25)。本领域普通技术人员将理解，在本公开中可以使用这些和其他表达载体，且本公开在这方面没有限制。尽管可以使用任何合适的表达载体来整合所需序列，容易获得的表达载体包括但不限于：质粒，例如pSC1O1、pBR322、pBBR1MCS-3、pUR、pEX、pMR100、pCR4、pBAD24、pUC19、pRS426；噬菌体，例如MI3噬菌体和λ噬菌体。当然，这种表达载体仅适于特定的宿主细胞。然而，本领域普通技术人员通过常规实验容易地确定任何具体的表达载体是否适合任何给定的宿主细胞。例如，可以将表达载体引入宿主细胞，然后监测其活性和载体中包含的序列的表达。此外，可以参考描述表达载体及其对任何特定宿主细胞的适用性的相关的文本和文献。为本发明的目的，包括本文所述的所需异源多肽、酶和一种或多种催化结构域的表达的合适的表达载体包括以下表达载体：其包含编码所需异源多肽、酶、或与组成型或诱导型启动子可操作连接的催化结构域的多核苷酸。用于与这种多核苷酸可操作连接的特别合适的启动子的实例包括来自以下基因的启动子：gpdA、cbh1、米曲霉TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定α-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)glaA、米黑根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、构巢曲霉乙酰胺酶、米曲霉乙酰胺酶、尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶、真菌内源α-L-阿拉伯糖酶(abnA)、真菌α-L-阿拉伯呋喃糖酶A(abfA)、真菌α-L-阿拉伯呋喃糖酶B(abfB)、真菌木聚糖酶(xlnA)、真菌植酸酶、真菌ATP合成酶、真菌亚单元9(oliC)、真菌磷酸丙糖异构酶(tpi)、真菌乙醇脱氢酶(adhA)、真菌α-淀粉酶(amy)、真菌淀粉葡萄糖苷酶(glaA)、真菌乙酰胺酶(amdS)、真菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gpd)、酵母乙醇脱氢酶、酵母乳糖酶、酵母3-磷酸甘油酸激酶、酵母磷酸丙糖异构酶、细菌α-淀粉酶、细菌Spo2和SSO。这种合适的表达载体和启动子的实例还描述于其全文通过引用并入本文的WO2012/069593。包含本发明丝状真菌细胞产生的异源多肽的药物组合物在另一个方面，本发明提供组合物，例如药物组合物，其包含由本公开的丝状真菌细胞产生的一种或多种目标异源多肽，例如哺乳动物多肽，所述丝状真菌细胞具有活性降低的至少三种蛋白酶且进一步包含编码异源多肽的重组多核苷酸，其与药学上可接受的载体一起配制。本发明的药物组合物可以以联合疗法，即与其他试剂组合施用。例如，联合疗法可以包括目标哺乳动物多肽和至少一种其他治疗剂。如本文所用，“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延缓剂等。优选地，载体适于静脉内、肌内、皮下、胃肠外、脊髓或表皮施用(例如通过注射或输注)。取决于施用途径，可以用材料包衣活性物质，例如目标哺乳动物多肽以保护该化合物不受酸和可能使该化合物失活的其他天然条件的作用。本发明的药物组合物可以包括一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”是指保留亲本化合物的所需生物活性且不引入任何不良毒理作用的盐(参见例如Berge,S.M.,等(1977)J.Pharm.Sci.66:1-19)。这种盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括衍生自无毒无机酸(例如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等)的那些以及衍生自无毒有机酸(例如脂族单-和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳酸、脂族和芳族磺酸等)的那些。碱加成盐包括衍生自碱土金属(例如钠、钾、镁、钙等)的那些以及衍生至无毒有机胺(例如N,N’-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等)的那些。本发明的药物组合物还可以包括药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。可以在本发明的药物组合物中使用的合适的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油例如橄榄油和可注射的有机酯例如油酸乙酯。可以例如通过使用包衣材料例如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持所需的粒径和通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。这些组合物还可以包括辅剂例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过灭菌程序和引入各种抗细菌及和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚山梨酸等来确保预防微生物的存在。还希望在组合物中引入等渗剂，例如糖、氯化钠等。此外，可以通过引入延迟吸收的试剂例如硬脂酸铝和明胶来延长可注射药物形式的吸收。药学上可接受的载体包括无菌水性溶液或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。这种药学上活性物质的介质和试剂的使用是本领域已知的。除了与活性化合物不相容，预期在本发明的药物组合物中使用任何常规介质或试剂。还可以在组合物中加入补充的活性化合物。治疗性组合物通常在制备和储存条件下必须无菌和稳定。可以将组合物配制成溶液、微乳剂、脂质体或适于药物高浓度的其他有序结构。载体可以是溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)和它们的合适混合物。可以例如通过使用包衣材料例如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持所需的粒径和通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。在很多情况下，优选在组合物中引入等渗剂，例如例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化钠等。可以通过在组合物中引入延迟吸收的试剂例如硬脂酸盐和明胶来延长可注射组合物的吸收。可以通过以下制备无菌可注射溶液：在合适的溶剂中加入所需量的活性化合物和如有需要，以上所列成分的一种或组合，然后灭菌微滤。通常通过在无菌介质中加入活性化合物来制备分散体，所述无菌介质包括基础的分散介质和来自以上所列的所需的其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，某些制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，产生活性成分和来自之前其无菌过滤溶液的任何其他所需成分的粉末。可以与载体材料组合以产生单剂量形式的活性成分的量将根据治疗的受试者和特定的施用模式变化。可以与载体材料组合以产生单剂量形式的活性成分的量通常是产生治疗效果的组合物的量。通常，在100的百分比中，该量是约0.01％-约99％的活性成分，优选约0.1％-约70％，最优选约1％-约30％的活性成分，其与药学上可接受的载体组合。调节剂量方案以提供最佳理想反应(例如治疗性反应)。例如，可以施用单次推注，可以在随时间施用几次分开的剂量或剂量可以根据治疗情况的紧急状态所指出按比例减少或增加。将胃肠外组合物配制成剂量单元形式以方便施用和剂量均匀是尤其有利的。本文所用的剂量单元形式是指适于待治疗受试者的单一剂量的物理上离散的单元；各单元包含计算以产生所需的治疗效果的预先确定量的活性化合物和所需的药学载体。本发明的剂量单元形式的规格由以下决定并直接取决于：(a)活性化合物的独特性质和待获得的具体治疗效果；和(b)现有技术中将这种活性化合物复合用于治疗个体敏感性的局限性。对于施用目标哺乳动物多肽，尤其当哺乳动物多肽是抗体时，剂量为约0.001-100mg/kg，更通常为0.01-5mg/kg宿主体重。例如，剂量可以为0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重、10mg/kg体重或在1-10mg/kg范围内。示范性的治疗方案涉及每周施用一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3个月一次或每3-6个月一次。抗体的某些剂量方案可以包括通过静脉内施用1mg/kg体重或3mg/kg体重，其中用以下给药方案之一提供抗体：(i)每四周6次剂量，然后每三个月；(ii)每三周；(iii)一次3mg/kg体重，接着每三周1mg/kg体重。或者，可以将目标哺乳动物多肽以缓释制剂施用，这种情况下所需的施用频率减少。剂量和频率根据患者中施用物质的半衰期而变化。总体上，人抗体显示最长的半衰期，其次是人源化抗体、嵌合抗体和非人抗体。施用的剂量和频率可以根据治疗是预防性或治疗性而变化。在预防性应用中，在长时间段内以相对频繁的间隔和相对少的剂量施用。一些患者在其余生持续接受治疗。在治疗性应用中，有时需要相对较高的剂量和相对较短的间隔，直到疾病进展降低或终止，优选直到患者显示疾病症状部分或完全缓解。然后，患者可以施用预防性方案。本公开的药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化以获得对特定患者、组合物和施用模式有效实现所需治疗反应而不会对患者有毒的活性成分的量。所学剂量水平将取决于各种药代动力学因素，包括所用的本发明的具体组合物或其酯、盐或酰胺的活性、施用途径、施用时间、所用的具体化合物的排泄率、治疗持续时间、与所用的具体组合物一起使用的其他药物、化合物和/或材料、治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康和以前的病史，以及医疗领域公知的类似因素。优选本公开的免疫球蛋白的“有效治疗剂量”造成疾病症状严重度降低、疾病无症状期的频率和持续时间增加，或预防由患病引起的损伤或残疾。例如，对于肿瘤治疗，与未治疗受试者相比，“有效治疗剂量”优选抑制细胞生长或肿瘤增长至少约20％、更优选至少约40％，甚至更优选至少约60％、还更优选至少约80％。可以在预测人肿瘤疗效的动物模型系统中评估化合物抑制肿瘤生长的能力。或者，可以通过检测化合物抑制能力评估组合物的这种性质，这种抑制可通过技术人员已知的分析体外检测。治疗有效量的治疗性化合物可以降低受试者的肿瘤大小、或缓解症状。本领域普通技术人员能够根据以下因素确定这种量：受试者的大小、受试者症状的严重度，以及选择的具体组合物或施用途径。可以使用一种或多种本领域已知的各种方法通过一种或多种施用途径施用本公开的组合物。技术人员将理解，施用途径和/或模式将根据所需结果而变化。本发明的结合部分的某些施用途径包括静脉内、肌内、皮内、腹腔内、皮下、脊髓或其他胃肠外施用途径(例如通过注射或输注)。如本文所使用，短语“胃肠外施用”是指除肠内和局部施用之外的其他施用模式，通常通过注射，其包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹腔内、经气管、皮下、表皮下、关节内、被膜下、蛛网膜下、椎管内、硬膜外和胸骨内注射和输注。或者，根据本公开的哺乳动物多肽可以通过非胃肠外途径施用，例如局部、表皮或粘膜施用途径，如鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部。活性化合物可以与保护化合物不被快速释放的载体一起制备，例如控释制剂，其包括植入物、透皮贴剂和微包封的递送系统。可以使用生物可降解的生物相容的聚合物，例如乙烯-醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、多正酯类和聚乳酸。用于制备这种制剂的很多方法已经获得专利或一般是本领域技术人员已知的(参见例如SustainedandControlledReleaseDrugDeliverySystems,J.R.Robinson,ed.,MarcelDekker,Inc.,NewYork,1978)。可以使用本领域已知的医疗设备施用治疗性组合物。例如，在一些实施方案中，可以使用无针皮内注射设备，例如在美国专利号5,399,163、5,383,851、5,312,335、5,064,413、4,941,880、4,790,824或4,596,556中公开的设备施用本发明的治疗性组合物。用于本发明的公知的植入物和分子的实例包括：美国专利号4,487,603，其公开了用于以控制的速率分配用药的可植入微型输注泵；美国专利号4,486,194，其公开了用于通过皮肤施用药物的治疗设备；美国专利号4,447,233，其公开了用于以精确的输注速度递送药物的医疗输注泵；美国专利号4,447,224，其公开了用于连续药物递送的可变流量植入式输注装置；美国专利号4,439,196，其公开了具有多室隔室的渗透性药物递送系统和美国专利号4,475,196，其公开了渗透性药物递送系统。在某些实施方案中，根据本公开的哺乳动物多肽的用途是用于治疗可用治疗性抗体治疗的任何疾病。本发明的丝状真菌细胞本发明还涉及通过以下增加丝状真菌细胞中异源多肽，例如哺乳动物多肽的生产水平：降低或消除表达异源多肽且催化异源多肽降解的细胞中的至少三种蛋白酶活性。降低或消除表达异源多肽的丝状真菌细胞中的蛋白酶活性增加所表达的重组多肽的稳定性，造成异源多肽的生产水平增加。可以通过例如修饰编码蛋白酶的基因来降低丝状真菌细胞中发现的蛋白酶的活性。“丝状真菌细胞”包括来自真菌亚门(Eumycota)和卵菌亚门(Oomycota)的所有丝状形式的细胞(如Hawksworth等在AinsworthandBisby'sDictionaryofTheFungi,8thedition,1995,CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UK中所定义)。丝状真菌细胞的特征通常在于由甲壳质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其它复合多糖组成的菌丝壁。营养生长是通过菌丝伸长，且碳代谢是专性好氧的。相反，酵母例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的营养生长是通过单细胞菌体出芽，且碳代谢可以是发酵的。本公开可以使用任何丝状真菌细胞，只要它在用核酸序列转化后和/或修饰或突变以降低蛋白酶活性后仍然存活。优选地，必要核酸序列的转导、随后蛋白(例如哺乳动物蛋白)的表达或所得中间体不会对丝状真菌细胞产生不利影响。合适的丝状真菌细胞的实例包括但不限于来自枝顶孢霉、曲霉、镰刀菌、腐质霉属(Humicola)、毛霉菌属(Mucor)、毁丝霉属、链孢霉属、青霉属、柱霉属(Scytalidium)、梭孢壳菌属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)或木霉菌株的细胞。在某些实施方案中，丝状真菌细胞来自木霉属、支顶孢霉、曲霉、短梗霉(Aureobasidium)、隐球菌(Cryptococcus)、金孢霉、Chrysosporiumlucknowense、黑粉酵母(Filibasidium)、镰刀菌、赤霉菌(Gibberella)、梨孢菌(Magnaporthe)、毛霉菌、毁丝霉、漆斑菌(Myrothecium)、新考玛脂霉(Neocallimastix)、链孢霉、拟青霉(Paecilomyces)、青霉属、瘤胃壶菌(Piromyces)、裂褶菌(Schizophyllum)、踝节菌(Talaromyces)、嗜热子囊菌(Thermoascus)、梭孢壳菌或弯颈霉菌株。本公开的曲霉属真菌细胞可以包括但不限于棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉、棒曲霉、黄曲霉、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、烟曲霉、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉或土曲霉。本公开的链孢霉真菌细胞可以包括但不限于粗糙链孢霉。在某些实施方案中，丝状真菌细胞不是曲霉细胞。在某些实施方案中，丝状真菌细胞选自木霉(里氏木霉)、链孢霉(粗糙链孢霉)、青霉(产黄青霉)、曲霉(构巢曲霉、黑曲霉和米曲霉)、毁丝霉(嗜热毁丝霉)和金孢霉(C.lucknowense)。在一个优选的实施方案中，丝状真菌细胞是木霉真菌细胞。本公开的木霉真菌细胞可以来自野生型木霉菌株或其突变体。合适的木霉真菌细胞的实例包括但不限于哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、康氏木霉(Trichodermakoningii)、长梗木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉、深绿木霉、绿木霉、绿色木霉(Trichodermaviride)；和它们另外的有性形式(即肉座菌属)。破坏基因和培养丝状真菌细胞的一般方法，例如对于青霉，描述于Kopke等(2010)ApplEnvironMicrobiol.76(14):4664-74.doi:10.1128/AEM.00670-10；对于曲霉，描述于Maruyama和Kitamoto(2011),TargetedGeneDisruptioninKojiMoldAspergillusoryzae,inJamesA.Williams(ed.),StrainEngineering:MethodsandProtocols,MethodsinMolecularBiology,vol.765,DOI10.1007/978-1-61779-197-0_27；对于链孢霉，描述于Collopy等(2010)High-throughputconstructionofgenedeletioncassettesforgenerationofNeurosporacrassaknockoutstrains.MethodsMolBiol.2010；638:33-40.doi:10.1007/978-1-60761-611-5_3；和对于毁丝霉和金孢霉，描述于PCT/NL2010/000045和PCT/EP98/06496。丝状真菌细胞成分本公开的某些方面涉及具有活性降低或不可检测的至少三种蛋白酶且具有编码异源多肽的重组多核苷酸的丝状真菌细胞，所述异源多肽的生产水平增加，例如水平增加至少2倍。本公开的其他方面涉及具有蛋白酶活性降低或不可检测的至少两种、三种或四种选自pep9、amp1、amp2和sep1的蛋白酶的木霉或密切相关的属的真菌细胞。本公开的其他方面涉及具有蛋白酶活性降低或不可检测的至少一种或多种选自pep9、amp1、amp2、mp1、mp2、mp3、mp4、mp5和sep1的蛋白酶的木霉或密切相关的属的真菌细胞。本公开的其他方面涉及具有蛋白酶活性降低或不可检测的至少两种、三种或四种选自pep1、pep2、pep3、pep4、pep5、pep8、pep11,pep12、tsp1、slp1、slp2、slp3、slp7、gap1和gap2的蛋白酶的木霉或密切相关的属的真菌细胞，其中所述细胞进一步包含编码哺乳动物多肽的重组多核苷酸，所述哺乳动物多肽以比相应亲本木霉真菌细胞中多肽的生产水平高至少2倍的水平产生。在某些实施方案中，丝状真菌细胞或木霉真菌细胞具有活性降低或没有的至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种、至少11种、至少12种或更多种蛋白酶。降低的蛋白酶表达本公开的丝状真菌细胞或木霉真菌细胞中至少三种蛋白酶的活性降低可以是蛋白酶表达降低或消除的结果。在一些实施方案中，至少三种蛋白酶表达的降低或消除是对催化结构域、编码区或表达编码各蛋白酶的基因的编码区所需的控制序列的修饰的结果。在其他实施方案中，蛋白酶表达的降低或消除是在基因或编码各蛋白酶的基因的转录或翻译所需的其控制序列中引入、替换和/或去除一个或多个核苷酸的结果。在一些实施方案中，蛋白酶表达的降低或消除是引入、重组、或用异源启动子替换蛋白酶的内源启动子或其部分的结果。本文的“异源启动子”是指可操作连接的启动子DNA序列，其对于蛋白酶不是天然的。在一些实施方案中，与其中蛋白酶通过其内源启动子表达的相应亲本丝状真菌细胞的活性相比，异源启动子降低蛋白酶活性。如果删除蛋白酶影响真菌的生长、产孢或功能，选择异源启动子使得蛋白酶在例如细胞的必要阶段(如产孢期)表达，但与其中蛋白酶通过其内源启动子表达的相应亲本菌株相比，蛋白酶的表达在异源蛋白生产期间降低或消除。在一些实施方案中，异源启动子是组成型启动子或诱导型启动子。在一些实施方案中，异源启动子选自包含黄素的单加氧酶基因(Tre76230)、RNA聚合酶基因(Tre49048)和slp8蛋白酶基因(Tre58698)。在一些实施方案中，具有异源启动子的降低或消除的蛋白酶是slp2，例如木霉真菌细胞或密切相关的属中的slp2。在一些具体的实施方案中，用选自以下的异源启动子替换例如木霉或密切相关的属中的slp2的内源启动子：包含黄素的单加氧酶基因(Tre76230)、RNA聚合酶基因(Tre49048)和slp8蛋白酶基因(Tre58698)。更多细节如实施例41所示。在一些实施方案中，本发明的丝状真菌细胞包含至少一种具有异源启动子且蛋白酶活性降低或没有的内源蛋白酶，和编码异源多肽的重组多核苷酸，其中所述细胞具有蛋白酶活性降低或没有的一种或多种以下蛋白酶：pep9、amp1、amp2、mp1、mp2、mp3、mp4、mp5和sep1，和任选的一种或多种选自以下的其他蛋白酶：pep1、pep2、pep3、pep4、pep5、pep8、pep11,pep12、tsp1、slp1、slp2、slp3、slp7、gap1和gap2。在进一步的实施方案中，蛋白酶表达的降低或消除是在编码各蛋白酶的基因中插入破坏性核酸构建体的结果，所述构建体各自包含与各基因同源的将在同源区产生重复并在重复区整合构建体DNA的核酸片段。在其他实施方案中，蛋白酶表达的降低或消除是编码各蛋白酶的基因的基因转化的结果。还在其他实施方案中，蛋白酶表达的降低或消除是通过对编码各蛋白酶的各基因具有特异性的反义多核苷酸或RNAi构建体的结果。在一个实施方案中，RNAi构建体对编码天冬氨酸蛋白酶如pep型蛋白酶、胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶如tsp1、谷氨酸蛋白酶如gap型蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶如slp型蛋白酶或sedolisin蛋白酶如tpp1或slp7蛋白酶具有特异性。在一个实施方案中，RNAi构建体对编码slp型蛋白酶的基因具有特异性。在一个实施方案中，RNAi构建体对编码slp2、slp3、slp5或slp6的基因具有特异性。在一个实施方案中，RNAi构建体对两种或更多种蛋白酶具有特异性。在一个实施方案中，所述两种或更多种蛋白酶是任何一种pep型蛋白酶、任何一种胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶、任何一种slp型蛋白酶、任何一种gap型蛋白酶、任何一种金属蛋白酶和/或任何一种sedolisin蛋白酶。在一个实施方案中，所述两种或更多种蛋白酶是slp2、slp3、slp5和/或slp6。在一个实施方案中，RNAi构建体包含表22.2中的任何一个核酸序列。在一些实施方案中，编码蛋白酶的基因包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变。在其他实施方案中，突变降低或消除各蛋白酶的表达。在进一步的实施方案中，突变是降低或消除相应蛋白酶活性的敲除突变、截断突变、点突变、错义突变、替换突变、移码突变、插入突变、重复突变、扩增突变、易位突变、反转突变。在一些实施方案中，突变是蛋白酶编码基因的缺失。在其他实施方案中，突变是蛋白酶编码基因中编码蛋白酶催化结构域的部分的缺失。还在其他实施方案中，突变是蛋白酶编码基因中编码蛋白酶催化结构域的部分的点突变。破坏丝状真菌细胞的蛋白酶基因的另一种方法包括CRISPR-CAS系统，或规律成簇间隔短回文重复。CRISPR-Cas系统是基因剪辑(沉默、增强或改变特定基因)的新技术。通过插入包含cas9基因的质粒和特定设计的CRISPR，可以在任何所需位点切割生物的基因组。Cas9基因来源于酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)的II型细菌CRISPR系统。基因产物(即CAS9核酸酶)与靶向CRISPR引导RNA的特定基因组复合，且具有DNA切割活性的高位点特异性。最近已经表明，CAS9在各种异源生物中可以作为RNA-引导的内切核酸酶发挥功能(Mali等2013:RnaguidedhumangenomeengineeringviaCas9.Science339:823-826；Cong等2013:MultiplexgenomeengineeringusingCRISPR-Cassystems.Science339:819-823；Jiang等2013:RNA-guidededitingofbacterialgenomesusingCRISPR-Cassystems.NatBiotechnol31:233-239；Jinek等2013:RNAprogrammedgenomeeditinginhumancells.eLife2:e00471；Hwang等2013:EfficientgenomeeditinginzebrafishusingaCRISPR-Cassystem.NatBiotech31:227-279.DiCarlo等2013:GenomeengineeringinSaccharomycescerevisiaeusingCRISPR-Cassystems.NAR41:4336-4343)。通常从RNA聚合酶III转录的启动子(最常用的是酵母的SNR52snoRNA启动子和植物和动物中的U3/U6snoRNA启动子)开始进行引导RNA的合成。认为RNA聚合酶II转录的启动子由于转录后修饰、5'加帽、5'/3'UTR和聚A尾不适于引导RNA的合成。然而，最近发现，如果引导RNA序列两侧有自处理核酶序列，则可以使用RNA聚合酶II型启动子。然后初级转录体进行自催化裂解，产生所需的gRNA序列(Gao和Zhao2014:Selfprocessingofribozyme-flankedRNAsintoguideRNA'sinvitroandinvivoforCRISPR-mediatedgenomeediting.JournalofIntegrativePlantBiologye-publicationaheadofprint；March2014)。实施例21例证了破坏各种蛋白酶编码基因的方法，其影响和/或阻碍里氏木霉中异源蛋白的有效生产。表21.1所示的引导RNA序列及其用于破坏木霉细胞中相应蛋白酶基因的用途也是本发明的一部分。蛋白酶基因的组合本公开的丝状真菌细胞或木霉真菌细胞可以包含至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种或更多种天冬氨酸蛋白酶、胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、谷氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。在某些实施方案中，蛋白酶由pep型蛋白酶基因、gap型蛋白酶基因、slp型蛋白酶基因、amp型蛋白酶基因、sep型蛋白酶基因和mp型蛋白酶基因编码。在一些实施方案中，pep型蛋白酶基因选自pep1、pep2、pep3、pep4、pep5、pep6、pep8、pep9、pep10、pep11和pep12、pep13、pep14、pep16。在其他实施方案中，gap型蛋白酶基因选自gap1和gap2。在其他实施方案中，gap型蛋白酶基因选自gap1、gap2、gap3和gap4。在进一步的实施方案中，slp型蛋白酶基因选自slp1、slp2、slp3和slp7；或选自slp1、slp2、slp3、slp5、slp6、slp7和slp8；或选自slp1、slp2、slp3、slp5、slp6、slp7和slp8和slp57433、slp35726、slp60791或slp109276。在某些优选的实施方案中，slp型蛋白酶基因是slp1。在某些实施方案中，amp型蛋白酶选自amp1和amp2。在进一步的实施方案中，sep型蛋白酶选自sep1、sed2、sed3和sed5。在进一步的实施方案中，mp型金属蛋白酶选自mp1、mp2、mp3、mp4和mp5。在其他实施方案中，蛋白酶由选自pep9、amp1、amp2、sep1、pep1、pep2、pep3、pep4、pep5、pep7、pep8、pep11、pep12、tsp1、slp1、slp2、slp3、slp5、slp6、slp7、slp8、gap1、gap2和tpp1的基因编码。在一些实施方案中，丝状真菌细胞，例如木霉细胞具有表达水平降低或没有的至少两种、三种或至少四种选自以下第一组的蛋白酶：pep9、amp1、amp2和sep1，任选地与以下选自第二组蛋白酶编码基因组合：pep1、pep2、pep3、pep4、pep5、pep8、pep11、pep12、tsp1、slp1、slp2、slp3、slp7、gap1和gap2。在一些实施方案中，丝状真菌细胞，例如木霉细胞具有表达水平降低或没有的一种或多种选自以下的蛋白酶：pep9、amp1、amp2、mp1、mp2、mp3、mp4、mp5和sep1，任选地与以下选自第二组蛋白酶编码基因组合：pep1、pep2、pep3、pep4、pep5、pep8、pep11、pep12、tsp1、slp1、slp2、slp3、slp7、gap1和gap2。在某些实施方案中，丝状真菌细胞，例如木霉细胞具有表达水平降低或没有的至少三种选自pep1、tsp1和slp1的蛋白酶编码基因。在其他实施方案中，丝状真菌细胞，例如木霉细胞具有表达水平降低或没有的至少三种选自gap1、slp1和pep1的蛋白酶编码基因。在一些实施方案中，丝状真菌细胞，例如木霉细胞具有表达水平降低或没有的蛋白酶编码基因slp2、pep1和gap1。在一些实施方案中，丝状真菌细胞，例如木霉细胞具有表达水平降低或没有的蛋白酶编码基因slp2、pep1、gap1和pep4。在一些实施方案中，丝状真菌细胞，例如木霉细胞具有表达水平降低或没有的蛋白酶编码基因slp2、pep1、gap1、pep4和slp1。在一些实施方案中，丝状真菌细胞，例如木霉细胞具有表达水平降低或没有的蛋白酶编码基因slp2、pep1、gap1、pep4、slp1和slp3。在一些实施方案中，丝状真菌细胞，例如木霉细胞具有表达水平降低或没有的蛋白酶编码基因slp2、pep1、gap1、pep4、slp1、slp3和pep3。在一些实施方案中，丝状真菌细胞，例如木霉细胞具有表达水平降低或没有的蛋白酶编码基因slp2、pep1、gap1、pep4、slp1、slp3、pep3和pep2。在一些实施方案中，丝状真菌细胞，例如木霉细胞具有表达水平降低或没有的蛋白酶编码基因slp2、pep1、gap1、pep4、slp1、slp3、pep3、pep2和pep5。在一些实施方案中，丝状真菌细胞，例如木霉细胞具有表达水平降低或没有的蛋白酶编码基因slp2、pep1、gap1、pep4、slp1、slp3、pep3、pep2、pep5和tsp1。在一些实施方案中，丝状真菌细胞，例如木霉细胞具有表达水平降低或没有的蛋白酶编码基因slp2、pep1、gap1、pep4、slp1、slp3、pep3、pep2、pep5、tsp1和slp7。在一些实施方案中，细胞，例如木霉细胞具有蛋白酶活性降低或没有的至少12种蛋白酶，编码所述12种蛋白酶的各基因包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，所述12种蛋白酶是pep1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、slp7。在其他实施方案中，细胞例如木霉细胞具有：(i)蛋白酶活性降低或没有的至少13种蛋白酶，编码所述13种蛋白酶的各基因包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，所述13种蛋白酶是-pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、pep9；-pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、slp7；或-pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、slp3；(ii)所述细胞具有蛋白酶活性降低或没有的至少14种蛋白酶，编码所述14种蛋白酶的各基因包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，所述14种蛋白酶是pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、pep9、slp2；(iii)所述细胞具有蛋白酶活性降低或没有的至少15种蛋白酶，编码所述15种蛋白酶的各基因包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，所述15种蛋白酶是-pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、pep9、slp2、mp1；或-pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、pep9、slp2、mp5。在其他实施方案中，本发明的丝状真菌细胞例如木霉细胞具有蛋白酶活性降低或没有的至少16种、至少17种、至少18种、至少19中或至少20种或更多种蛋白酶，且在以上记载的蛋白酶中具有13个、14个或15个突变，且进一步包含一个或多个其他突变，各其他突变降低或消除相应的其他蛋白酶活性，所述其他蛋白酶选自：-天冬氨酸蛋白酶pep6、pep10、pep13、pep14或pep16；-slp样蛋白酶slp57433、slp35276、slp60791或slp109276；-gap样蛋白酶gap3或gap4；-sedolisin样蛋白酶sed2、sed3或sed5；-选自蛋白酶65735、蛋白酶77577、蛋白酶81087、蛋白酶56920、蛋白酶122083、蛋白酶79485、蛋白酶120998或蛋白酶61127的A组蛋白酶；-选自蛋白酶21659、蛋白酶58387、蛋白酶75159、蛋白酶56853、或蛋白酶64193的B组蛋白酶；-选自蛋白酶82452、蛋白酶80762、蛋白酶21668、蛋白酶81115、蛋白酶812141、或蛋白酶23475的C组蛋白酶；-选自蛋白酶121890、蛋白酶22718、蛋白酶47127、蛋白酶61912、蛋白酶80843、蛋白酶66608、蛋白酶72612或蛋白酶40199的D组蛋白酶；或-选自蛋白酶22210、蛋白酶111694、蛋白酶82577的E组蛋白酶。在一些实施方案中，丝状真菌细胞，例如木霉细胞具有表达水平降低或没有的蛋白酶编码基因slp2、pep1、gap1、pep4、slp1、slp3、pep3、pep2、pep5、tsp1、slp7和slp8。在一些实施方案中，丝状真菌细胞，例如木霉细胞具有表达水平降低或没有的蛋白酶编码基因slp2、pep1、gap1、pep4、slp1、slp3、pep3、pep2、pep5、tsp1、slp7、slp8和gap2。在某些实施方案中，丝状真菌细胞具有蛋白酶活性降低的至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种或更多种蛋白酶，其中具有野生型活性的相应蛋白酶的氨基酸序列与选自SEQIDNO:1-16；17-36；37-57；58-65；66-81；82-97；98-117；118-128；129-144；166-181；182-185；491-588,SEQIDNO750-805或SEQIDNO：875-923的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致性。在其中丝状真菌细胞是具有蛋白酶活性降低的一种或多种蛋白酶的木霉真菌细胞的实施方案中，其中具有野生型活性的相应蛋白酶的氨基酸序列与SEQIDNO:1、17、37、58、66、82、98、118、129、166、182、507、522、530、750、759、775、SEQIDNO:786或SEQIDNO：875-923的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致性。同源多肽本公开的丝状真菌细胞或木霉真菌细胞包含编码异源多肽的重组多核苷酸。在某些实施方案中，异源多肽是哺乳动物多肽。在其他实施方案中，异源多肽是非哺乳动物多肽。在其中丝状真菌细胞包含编码哺乳动物多肽的重组多核苷酸的实施方案中，所述哺乳动物多肽可以是非糖基化的哺乳动物多肽、糖基化的哺乳动物多肽或其组合，包括但不限于免疫球蛋白、抗体、生长因子和干扰素。在一些实施方案中，哺乳动物多肽是免疫球蛋白或抗体。在其中丝状真菌细胞包含编码免疫球蛋白或抗体的重组多核苷酸的实施方案中，所述丝状真菌细胞例如木霉真菌细胞可以具有表达降低或没有的至少两种、三种或至少四种选自pep9、amp1、amp2和sep1的蛋白酶编码基因，任选地与至少三种或四种选自pep1、pep3、pep4、pep8、pep11、pep12、tsp1、slp1、slp2、slp7、gap1和gap2的蛋白酶组合。在其中丝状真菌细胞包含编码免疫球蛋白或抗体的重组多核苷酸的实施方案中，例如木霉细胞，所述细胞具有表达水平降低或没有的一种或多种选自pep9、amp1、amp2、mp1、mp2、mp3、mp4、mp5和sep1的蛋白酶，任选地与一种或多种选自pep1、pep2、pep3、pep4、pep5、pep8、pep11、pep12、tsp1、slp1、slp2、slp3、slp7、gap1和gap2的其他蛋白酶编码基因组合。在某些优选的实施方案中，细胞例如木霉真菌细胞包含编码免疫球蛋白或抗体的重组多核苷酸，且具有表达降低或没有的蛋白酶编码基因pep1、tsp1、slp1和gap1。在其他实施方案中，细胞包含编码免疫球蛋白或抗体的重组多核苷酸，且具有表达降低的蛋白酶编码基因pep1、tsp1、slp1、gap1和pep4。在其他实施方案中，细胞包含编码免疫球蛋白或抗体的重组多核苷酸，且具有表达降低的蛋白酶编码基因slp1、slp2和slp3。在其他实施方案中，细胞包含编码免疫球蛋白或抗体的重组多核苷酸，且具有表达降低的蛋白酶编码基因slp1、slp2、slp3和tsp1。在其他实施方案中，细胞包含编码免疫球蛋白或抗体的重组多核苷酸，且具有表达降低的蛋白酶编码基因slp1、slp2、slp3、tsp1和pep1。在其他实施方案中，细胞包含编码免疫球蛋白或抗体的重组多核苷酸，且具有表达降低的蛋白酶编码基因slp1、slp2、slp3、tsp1、pep1和gap1。在其他实施方案中，细胞包含编码免疫球蛋白或抗体的重组多核苷酸，且具有表达降低的蛋白酶编码基因slp1、slp2、slp3、tsp1、pep1、gap1和pep4。在其他实施方案中，细胞包含编码免疫球蛋白或抗体的重组多核苷酸，且具有表达降低的蛋白酶编码基因slp1、slp2、slp3、tsp1、pep1、gap1、pep4和pep3。在其他实施方案中，细胞包含编码免疫球蛋白或抗体的重组多核苷酸，且具有表达降低的蛋白酶编码基因slp1、slp2、slp3、tsp1、pep1、gap1、pep4、pep3和pep2。在其他实施方案中，细胞包含编码免疫球蛋白或抗体的重组多核苷酸，且具有表达降低的蛋白酶编码基因slp1、slp2、slp3、tsp1、pep1、gap1、pep4、pep3、pep2和pep5。在一些实施方案中，细胞例如木霉细胞包含编码免疫球蛋白或抗体的重组多核苷酸，且具有蛋白酶活性降低或没有的至少12种蛋白酶，编码所述12种蛋白酶的各基因包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，所述12种蛋白酶是pep1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、slp7。在其他实施方案中，细胞例如木霉细胞包含编码免疫球蛋白或抗体的重组多核苷酸，且具有：(i)蛋白酶活性降低或没有的至少13种蛋白酶，编码所述13种蛋白酶的各基因包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，所述13种蛋白酶是-pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、pep9；-pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、slp7；或-pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、slp3；(ii)蛋白酶活性降低或没有的至少14种蛋白酶，编码所述14种蛋白酶的各基因包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，所述14种蛋白酶是pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、pep9、slp2；或(iii)蛋白酶活性降低或没有的至少15种蛋白酶，编码所述15种蛋白酶的各基因包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，所述15种蛋白酶是-pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、pep9、slp2、mp1；或-pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、pep9、slp2、mp5。在其他实施方案中，丝状真菌细胞例如木霉细胞包含编码免疫球蛋白或抗体的重组多核苷酸，且具有蛋白酶活性降低或没有的至少16种、至少17种、至少18种、至少19中或至少20种或更多种蛋白酶，且在以上记载的蛋白酶中具有13个、14个或15个突变，且进一步包含一个或多个其他突变，所述各其他突变降低或消除相应的其他蛋白酶活性，所述其他蛋白酶选自：-天冬氨酸蛋白酶pep6、pep10、pep13、pep14或pep16；-slp样蛋白酶slp57433、slp35276、slp60791或slp109276；-gap样蛋白酶gap3或gap4；-sedolisin样蛋白酶sed2、sed3或sed5；-选自蛋白酶65735、蛋白酶77577、蛋白酶81087、蛋白酶56920、蛋白酶122083、蛋白酶79485、蛋白酶120998或蛋白酶61127的A组蛋白酶；-选自蛋白酶21659、蛋白酶58387、蛋白酶75159、蛋白酶56853、或蛋白酶64193的B组蛋白酶；-选自蛋白酶82452、蛋白酶80762、蛋白酶21668、蛋白酶81115、蛋白酶812141、或蛋白酶23475的C组蛋白酶；-选自蛋白酶121890、蛋白酶22718、蛋白酶47127、蛋白酶61912、蛋白酶80843、蛋白酶66608、蛋白酶72612或蛋白酶40199的D组蛋白酶；或-选自蛋白酶22210、蛋白酶111694、蛋白酶82577的E组蛋白酶。在其他实施方案中，丝状真菌细胞包含编码生长因子、干扰素、细胞因子或白细胞介素的重组多核苷酸。在其中丝状真菌细胞例如木霉真菌细胞包含编码生长因子、干扰素、细胞因子、人血清白蛋白或白细胞介素的重组多核苷酸的实施方案中，所述丝状真菌细胞可以具有表达降低或没有的至少两种、三种或四种选自pep9、amp1、amp2和sep1的蛋白酶，任选地与至少三种或四种选自pep1、pep3、pep4、pep8、pep11、pep12、tsp1、slp1、slp2、slp7、gap1和gap2，的蛋白酶，或至少三种或至少四种选自pep1、pep2、pep3、pep4、pep5、pep8、gap1、gap2、slp1、slp2、slp7和tsp1的蛋白酶编码基因组合。在其中丝状真菌细胞包含编码生长因子、干扰素、细胞因子、人血清白蛋白或白细胞介素的重组多核苷酸的实施方案中，例如木霉细胞，所述细胞具有表达水平降低或没有的一种或多种选自pep9、amp1、amp2、mp1、mp2、mp3、mp4、mp5和sep1的蛋白酶，任选地与第二组选自pep1、pep2、pep3、pep4、pep5、pep8、pep11、pep12、tsp1、slp1、slp2、slp3、slp7、gap1和gap2的蛋白酶编码基因组合。在某些实施方案中，细胞包含编码生长因子、干扰素、细胞因子、人血清白蛋白或白细胞介素的重组多核苷酸，且具有表达降低的蛋白酶编码基因pep1、tsp1、slp1、gap1和gap2。在某些实施方案中，细胞包含编码生长因子、干扰素、细胞因子、人血清白蛋白或白细胞介素的重组多核苷酸，且具有表达降低的蛋白酶编码基因slp1、slp2、pep1、gap1、pep4、slp7、pep2、pep3、pep5、tsp1和gap2。在其他实施方案中，细胞例如木霉真菌细胞包含编码生长因子、干扰素、细胞因子、人血清白蛋白或白细胞介素的重组多核苷酸，且具有表达降低的蛋白酶编码基因pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2和pep4。在进一步的实施方案中，细胞包含编码生长因子的重组多核苷酸，且具有表达降低的选自pep1、pep2、pep3、pep4和pep5的pep型蛋白酶基因。在某些优选的实施方案中，生长因子是IGF-1或干扰素是干扰素-α2b。在某些实施方案中，细胞包含编码生长因子、干扰素、细胞因子、人血清白蛋白或白细胞介素的重组多核苷酸，且具有表达降低的蛋白酶编码基因pep1、gap1和pep4。在某些实施方案中，细胞包含编码生长因子、干扰素、细胞因子、人血清白蛋白或白细胞介素的重组多核苷酸，且具有表达降低的蛋白酶编码基因pep1、gap1、pep4和slp7。在某些实施方案中，细胞包含编码生长因子、干扰素、细胞因子、人血清白蛋白或白细胞介素的重组多核苷酸，且具有表达降低的蛋白酶编码基因pep1、gap1、pep4、slp7和slp2。在某些实施方案中，细胞包含编码生长因子、干扰素、细胞因子、人血清白蛋白或白细胞介素的重组多核苷酸，且具有表达降低的蛋白酶编码基因pep1、gap1、pep4、slp7、slp2和pep2。在某些实施方案中，细胞包含编码生长因子、干扰素、细胞因子、人血清白蛋白或白细胞介素的重组多核苷酸，且具有表达降低的蛋白酶编码基因pep1、gap1、pep4、slp7、slp2、pep2和pep3。在某些实施方案中，细胞包含编码生长因子、干扰素、细胞因子、人血清白蛋白或白细胞介素的重组多核苷酸，且具有表达降低的蛋白酶编码基因pep1、gap1、pep4、slp7、slp2、pep2、pep3和pep5。在某些实施方案中，细胞包含编码生长因子、干扰素、细胞因子、人血清白蛋白或白细胞介素的重组多核苷酸，且具有表达降低的蛋白酶编码基因pep1、gap1、pep4、slp7、slp2、pep2、pep3、pep5和slp1。在某些实施方案中，细胞包含编码生长因子、干扰素、细胞因子、人血清白蛋白或白细胞介素的重组多核苷酸，且具有表达降低的蛋白酶编码基因pep1、gap1、pep4、slp7、slp2、pep2、pep3、pep5、slp1和tsp1。在一些实施方案中，细胞例如木霉细胞包含编码生长因子、干扰素、细胞因子、人血清白蛋白或白细胞介素的重组多核苷酸，且具有蛋白酶活性降低或没有的至少12种蛋白酶，编码所述12种蛋白酶的各基因包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，所述12种蛋白酶是pep1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、slp7。在其他实施方案中，细胞例如木霉细胞包含编码生长因子、干扰素、细胞因子、人血清白蛋白或白细胞介素的重组多核苷酸，且具有：(i)蛋白酶活性降低或没有的至少13种蛋白酶，编码所述13种蛋白酶的各基因包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，所述13种蛋白酶是-pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、pep9；-pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、slp7；或-pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、slp3；(ii)蛋白酶活性降低或没有的至少14种蛋白酶，编码所述14种蛋白酶的各基因包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，所述14种蛋白酶是pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、pep9、slp2；或(iii)蛋白酶活性降低或没有的至少15种蛋白酶，编码所述15种蛋白酶的各基因包含降低或消除相应蛋白酶活性的突变，所述15种蛋白酶是-pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、pep9、slp2、mp1；或-pep1、tsp1、slp1、gap1、gap2、pep4、pep3、pep5、pep2、sep1、slp8、amp2、pep9、slp2、mp5。在其他实施方案中，丝状真菌细胞例如木霉细胞包含编码生长因子、干扰素、细胞因子、人血清白蛋白或白细胞介素的重组多核苷酸，且具有蛋白酶活性降低或没有的至少16种、至少17种、至少18种、至少19中或至少20种或更多种蛋白酶，且在以上记载的蛋白酶中具有13个、14个或15个突变，且进一步包含一个或多个其他突变，所述各其他突变降低或消除相应的其他蛋白酶活性，所述其他蛋白酶选自：-天冬氨酸蛋白酶pep6、pep10、pep13、pep14或pep16；-slp样蛋白酶slp57433、slp35276、slp60791或slp109276；-gap样蛋白酶gap3或gap4；-sedolisin样蛋白酶sed2、sed3或sed5；-选自蛋白酶65735、蛋白酶77577、蛋白酶81087、蛋白酶56920、蛋白酶122083、蛋白酶79485、蛋白酶120998或蛋白酶61127的A组蛋白酶；-选自蛋白酶21659、蛋白酶58387、蛋白酶75159、蛋白酶56853、或蛋白酶64193的B组蛋白酶；-选自蛋白酶82452、蛋白酶80762、蛋白酶21668、蛋白酶81115、蛋白酶812141、或蛋白酶23475的C组蛋白酶；-选自蛋白酶121890、蛋白酶22718、蛋白酶47127、蛋白酶61912、蛋白酶80843、蛋白酶66608、蛋白酶72612或蛋白酶40199的D组蛋白酶；或-选自蛋白酶22210、蛋白酶111694、蛋白酶82577的E组蛋白酶。在某些实施方案中，哺乳动物多肽的生产水平比不含降低的蛋白酶活性的相应亲本丝状真菌细胞中的多肽生产水平高至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少75倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍或更多倍。在其他实施方案中，哺乳动物多肽以全长版生产，且生产水平高于相应亲本丝状真菌细胞中全长版多肽的生产水平。在其中丝状真菌细胞包含编码非哺乳动物多肽的重组多核苷酸的实施方案中，所述非哺乳动物多肽可以是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、葡聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、磷脂酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、谷氨酰胺转胺酶或木聚糖酶。在其中丝状真菌细胞包含编码非哺乳动物多肽的重组多核苷酸的实施方案中，所述丝状真菌细胞可以具有表达降低或不可检测的至少两种、三种或四种选自pep9、amp1、amp2、mp1、mp2、mp3、mp4、mp5和sep1的蛋白酶，任选地与至少三种、至少四种、至少五种或至少六种选自pep1、pep2、pep3、pep4、pep5、pep8、pep11、pep12、tsp1、slp1、slp2、slp3、slp7、gap1和gap2的蛋白酶编码基因组合。在某些实施方案中，非哺乳动物多肽的生产水平比相应亲本丝状真菌细胞中的多肽生产水平高至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少75倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍或更多倍。在其他实施方案中，非哺乳动物多肽以全长版生产，且生产水平高于相应亲本丝状真菌细胞中全长版多肽的生产水平。降低的其他蛋白酶的活性在一些实施方案中，本公开的丝状真菌细胞或木霉真菌细胞还具有活性降低的一种或多种其他蛋白酶。在某些实施方案中，一种或多种其他蛋白酶的表达水平降低。在某些优选的实施方案中，编码一种或多种其他蛋白酶的各基因包含降低相应蛋白酶活性的突变。所述一种或多种其他的蛋白酶编码基因可以是pep7、tpp1、gap2、slp3、slp5、slp6、slp7、slp8，或选自以下的编码蛋白酶的基因：-天冬氨酸蛋白酶pep6、pep10、pep13、pep14或pep16；-slp样蛋白酶slp57433、slp35276、slp60791或slp109276；-gap样蛋白酶gap3或gap4；-sedolisin样蛋白酶sed2、sed3或sed5；-选自蛋白酶65735、蛋白酶77577、蛋白酶81087、蛋白酶56920、蛋白酶122083、蛋白酶79485、蛋白酶120998或蛋白酶61127的A组蛋白酶；-选自蛋白酶21659、蛋白酶58387、蛋白酶75159、蛋白酶56853、或蛋白酶64193的B组蛋白酶；-选自蛋白酶82452、蛋白酶80762、蛋白酶21668、蛋白酶81115、蛋白酶812141、或蛋白酶23475的C组蛋白酶；-选自蛋白酶121890、蛋白酶22718、蛋白酶47127、蛋白酶61912、蛋白酶80843、蛋白酶66608、蛋白酶72612或蛋白酶40199的D组蛋白酶；或-选自蛋白酶22210、蛋白酶111694、蛋白酶82577的E组蛋白酶。在某些实施方案中，当丝状真菌细胞是曲霉细胞时，总蛋白酶活性降低至蛋白酶活性没有降低的相应亲本曲霉细胞的总蛋白酶活性的50％或更少。在某些实施方案中，本公开的细胞例如木霉细胞中的总蛋白酶活性降低至蛋白酶活性没有降低的相应亲本丝状真菌细胞的总蛋白酶活性的49％或更少、31％或更少、13％或更少、10％或更少、6.3％或更少或5.5％或更少。其他重组修饰在某些实施方案中，本公开的丝状真菌细胞或木霉真菌细胞还具有活性降低的长醇-P-Man:Man(5)GlcNAc(2)-PP-长醇甘露糖基转移酶。长醇-P-Man:Man(5)GlcNAc(2)-PP-长醇甘露糖基转移酶(EC2.4.1.130)将α-D-甘露糖残基从长醇磷酸D-甘露糖转移至膜脂连接的寡糖中。通常，长醇-P-Man:Man(5)GlcNAc(2)-PP-长醇甘露糖基转移酶由alg3基因编码。因此，在某些实施方案中，丝状真菌细胞具有活性降低的ALG3，该活性由alg3基因编码。在一些实施方案中，alg3基因包含降低相应ALG3活性的突变。在某些实施方案中，将alg3基因从丝状真菌细胞中删除。在其他实施方案中，本公开的丝状真菌细胞或木霉真菌细胞进一步包含编码编码α-1,2-甘露糖苷酶的多核苷酸。编码α1,2-甘露糖苷酶的多核苷酸可以是宿主细胞中内源的，或它对于宿主细胞可以是异源的。这些多核苷酸在表达高甘露聚糖的丝状真菌细胞中尤其有用，所述高甘露聚糖从高尔基转移至ER而没有经过有效的外切-α-2-甘露糖苷酶的切割。α-1,2-甘露糖苷酶可以是属于糖苷水解酶家族47(cazy.org/GH47_all.html)的甘露糖苷酶I型酶。在某些实施方案中，α-1,2-甘露糖苷酶是列于cazy.org/GH47_characterized.html的酶。具体地，α-1,2-甘露糖苷酶可以是切割糖蛋白的ER型酶，例如在ERα-甘露糖苷酶EC3.2.1.113酶亚族中的酶。此类酶的实例包括人α-2-甘露糖苷酶1B(AAC26169)、哺乳动物ER甘露糖苷酶的组合或丝状真菌酶，例如α-1,2-甘露糖苷酶(MDS1)(里氏木霉AAF34579；MarasM等JBiotech.77,2000,255,或Trire45717)。对于ER/高尔基表达，甘露糖苷酶的催化结构域通常与靶向肽，例如HDEL、KDEL，或一部分ER或早期高尔基蛋白融合，或与动物或植物甘露糖苷酶I的内源ER靶向结构一起表达，参见例如Callewaert等2001UseofHDEL-taggedTrichodermareeseimannosyloligosaccharide1,2-a-D-mannosidaseforN-glycanengineeringinPichiapastoris.FEBSLett503:173-178。在进一步的实施方案中，本公开的丝状真菌细胞例如木霉真菌细胞还包含N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域和N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域。这种催化结构域有助于在非哺乳动物中表达复合型N-聚糖。N-乙酰葡糖胺基转移酶I(GlcNAc-TI；GnTI；EC2.4.1.101)催化UDP-N-乙酰基-D-氨基葡萄糖+3-(α-D-甘露糖基)-β-D-甘露糖基-R<＝>UDP+3-(2-(N-乙酰基-β-D-葡糖胺基)-α-D-甘露糖基)-β-D-甘露糖基-R的反应，其中R代表聚糖受体中N-连接的寡糖的剩余部分。N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域是能够催化该反应的N-乙酰葡糖胺基转移酶I的任何部分。N-乙酰葡糖胺基转移酶II(GlcNAc-TII；GnTII；EC2.4.1.143)催化UDP-N-乙酰基-D-氨基葡萄糖+6-(α-D-甘露糖基)-β-D-甘露糖基-R<＝>UDP+6-(2-(N-乙酰基-β-D-葡糖胺基)-α-D-甘露糖基)-β-D-甘露糖基-R的反应，其中R代表聚糖受体中N-连接的寡糖的剩余部分。N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域是能够催化该反应的N-乙酰葡糖胺基转移酶II的任何部分。N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域和N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域可在国际专利公布说明书WO2012/069593中发现。N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域和N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域可以由单个多核苷酸编码。在某些实施方案中，所述单个多核苷酸编码包含N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域和N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域的融合蛋白。或者，N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域可以由第一多核苷酸编码，且N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域可以由第二多核苷酸编码。在其中丝状真菌细胞或木霉真菌细胞包含N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域和N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域的实施方案中，所述细胞还可以包含编码甘露糖苷酶II的多核苷酸。甘露糖苷酶II酶能够切割GlcNAcMan5中的Man5结构以产生GlcNAcMan3，且如果与GnTII催化结构域的作用结合，产生G0；且与半乳糖基转移酶催化结构域的作用结合，产生G1和G2。在某些实施方案中，甘露糖苷酶II型酶属于糖苷水解酶家族38(cazy.org/GH38_all.html)。此类酶的实例包括人酶ACM50302、果蝇(D.melanogaster)酶(VandenElsenJ.M.等(2001)EMBOJ.20:3008-3017)、具有根据PDB参照1HTY3D结构的那些、以及参照PDB催化结构域的其他酶。对于ER/高尔基表达，甘露糖苷酶的催化结构域通常与N-末端靶向肽相融合，例如使用国际专利公开号WO2012/069593中所列的靶向肽或SEQIDNO：589-594。用甘露糖苷酶II型甘露糖苷酶的催化结构域转化后，选择有效产生GlcNac2Man3、GlcNac1Man3或G0的菌株。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，丝状真菌细胞进一步包含编码UDP-GlcNAc转运子的多核苷酸。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，丝状真菌细胞进一步包含编码β-1,4-半乳糖基转移酶的多核苷酸。通常，β-1,4-半乳糖基转移酶属于CAZy糖基转移酶家族7(cazy.org/GT7_all.html)。有用的β4GalT酶的实例包括β4GalT1，例如牛(Bostaurus)酶AAA30534.1(ShaperN.L.等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83(6),1573-1577(1986))、人酶(GuoS.等Glycobiology2001,11:813-20)和小家鼠(Musmusculus)酶AAA37297(Shaper,N.L.等1998J.Biol.Chem.263(21),10420-10428)。在其中丝状真菌细胞包含编码半乳糖基转移酶的多核苷酸的本发明的某些实施方案中，丝状真菌细胞还包含编码UDP-Gal4异构酶和/或UDP-Gal转运子的多核苷酸。在其中丝状真菌细胞包含编码半乳糖基转移酶的多核苷酸的本发明的某些实施方式中，在培养宿主细胞时，乳糖可以代替葡萄糖用作碳源。培养基的pH可以为4.5-7.0或5.0-6.5。在其中丝状真菌细胞含有编码半乳糖基转移酶的多核苷酸和任选的编码UDP-Gal4异构酶和/或UDP-Gal转运子的多核苷酸的本发明的某些实施方式中，可以将二价阳离子如Mn2+、Ca2+或Mg2+添加到细胞培养基中。在可以与之前的实施方案组合的某些实施方案中，宿主细胞中α-1,6-甘露糖基转移酶的活性水平与野生型宿主细胞中的活性水平相比降低。在某些实施方案中，丝状真菌的och1基因的表达水平与野生型丝状真菌细胞中的表达水平相比降低。另一个方面包括在丝状真菌细胞中生产Man3GlcNAc2N-聚糖(例如Manα3[Manα6]Manβ4GlcNAcβ4GlcNAc)的方法，包括以下步骤：提供具有编码异源多肽且与野生型丝状真菌细胞中的活性水平相比活性水平降低的alg3甘露糖基转移酶的重组多核苷酸的丝状真菌细胞，和培养所述丝状真菌细胞以生产Man3GlcNAc2聚糖，其中所述Man3GlcNAc2聚糖占丝状真菌细胞分泌的中性N-聚糖的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％(mol％)。在某些实施方案中，Man3GlcNAc2N-聚糖占异源多肽的总N-聚糖的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％(mol％)。另一个方面包括在丝状真菌细胞中生产复合型N-聚糖(例如包含末端GlcNAc2Man3结构的N-聚糖)，例如GlcNAc2Man3GlcNAc2{例如G0，即GlcNAcβ2Manα3(GlcNAcβ2Manα6)Manβ4GlcNAcβ4GlcNAc