本发明属于药学领域；更具体地，本发明涉及一种新化合物，其具有治疗银屑病的用途。
背景技术：
银屑病(Psoriasis)，俗称“牛皮癣”，是一种常见的慢性、复发性、炎症性的皮肤病，其特征是在红斑上反复出现多层银白色干燥鳞屑。中医古称之为“白疕”，古医籍亦有称之为松皮癣，西医称为银屑病。银屑病好发于头皮、四肢伸侧及背部。春冬季节易复发或加重，而夏秋季多缓解。银屑病被世界卫生组织(WHO)列为世界十大顽症之一，在欧美国家的发病率约为2-3％(Schoen and Boehncke，N Engl J Med，2005)。在中国，据不完全统计银屑病的发病率0.5％左右，有银屑病患者约700万。银屑病发病以25-45岁的青壮年为多，约占81％，近年来儿童的发病率也在增加。因其顽固难治，且易反复发作，不仅给患者带来身体痛苦，而且造成了巨大的心理负担，严重影响患者生活质量，是世界皮肤疾病领域的重要研究课题之一。
世界范围内银屑病的治疗花费巨大，尤其是价格昂贵的小分子生物类药物。因此，研究开发价格低、安全性好的治疗银屑病药物势在必行。本发明人多年的研究结果表明：与正常人的皮肤相比，银屑病患者的表皮和真皮内核酸转录因子NF-kappa B的过度活化，导致了TNF-alpha，IL-17和IL-23等炎症因子的大量释放，过量的TNF-alpha，IL-17和IL-23等炎症因子诱发了人类的银屑病(Wang，et al.，J Immunol，2009)。
目前，治疗银屑病的药物中有一种肿瘤坏死因子抑制剂etanercept(依那西普)是美国FDA批准用于银屑病治疗的生物制剂。这种药物为人源化抗体，它的作用机理是阻隔肿瘤坏死因子的受体。由于肿瘤坏死因子在机体正常免疫反应中不可缺少，这种人源化抗体没有选择性地阻挡肿瘤坏死因子会导致用药后的副作用，甚至停药后疾病容易反弹。而且，由于这种药物是抗体、生产成本高、价格昂贵、普通病人很难能承受。另外，乌特津单抗(ustekinumab)用于拮抗IL-23的单克隆抗体在临床上对银屑病有很好的治疗效果，但是生产成本高、价格昂贵。
11-羰基-β-乙酰乳香酸的英文全名是：acetyl-11-keto-β-boswellic acid，简称AKBA，是植物卡式乳香树的胶状树脂-乳香含有的重要成分之一。从天然乳香树提取物中富集纯化AKBA已经描述于国际专利申请WO 03/0746，美国专利20030199581以及国际专利申请WO 03/077860。更高纯度的产品可以通过色谱分离以及重结晶而获得。乳香提取物已经在传统的医药中被用作抗炎剂，如对关节炎以及溃疡性结肠炎患者的治疗。另外乳香酸由于其抗增殖作用而受到关注，乳香酸在体外可以抑制几种白血病细胞株，黑素瘤的生长和细胞凋亡。对乳香酸的研究表明，11羰基-β-乙酰乳香酸显示最显著的5-LOX抑制活性(Sailer，et al.，British J Pharmacology，1996)。AKBA具有如下的结构式：
本发明人多年来一直致力于银屑病发病机理和治疗方法的研究。本发明人已运用银屑病小鼠模型明晰了AKBA治疗银屑病的分子免疫学机理。本发明人将此研究结果于2009年10月发表在The Journal of Immunology(Wang，et al.，J Immunol，2009)，该创新性的研究成果一经发表就受到国际同行的高度关注，并被2009年12月出版的国际权威杂志Nature Reviews Rheumatology作为科研亮点报道。
总的来说，已有的治疗银屑病药物生产成本高、靶向性差，11羰基-β-乙酰乳香酸具有治疗银屑病的用途，然而还需要在此基础上进行进一步的化合物修饰以更大幅度地提高治疗效果。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种新型化合物、其制备方法及其用途。
在本发明的第一方面，提供式(I)所示化合物或其异构体、溶剂合物或前体，或它们的药学上可接受的盐，
其中，R独立地选自：氢、羟基、C1-C4烷基、C2-C4链烯基、C2-C4链炔基、卤素。
在一个优选例中，所述的式(I)所示化合物中，R独立地选自：氢、羟基、C1-C2烷基。
在一个优选例中，所述的式(I)所示化合物中，R是氢。
在本发明的另一方面，提供一种制备式(I)所示化合物的方法，所述方法包括：以11羰基-β-乙酰乳香酸为原料，将其AcO-基团替换为基团；
在一个优选例中，所述方法包括步骤：
(i)以11-羰基-β-乙酰乳香酸为原料，与碱反应获得11-羰基-β-乳香酸；和
(ii)将11-羰基-β-乳香酸与环己甲酰氯反应，获得式(I)所示化合物。
所述的碱包括但不限于：有机碱，例如三乙胺、三丁胺、N-甲基吗啉、N，N-二异丙基乙胺、N-甲基吡咯烷、吡啶、4-(N，N-二甲基氨基)吡啶、吗啉、咪唑、2-甲基咪唑、4-甲基咪唑等；无机碱，例如碱金属氢化物如氢化钠、氢化钾等；氨基钠；正丁基锂；二异丙基氨基锂；碱金属氢氧化物例如氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾和氢氧化铯；碱土金属氢氧化物例如氢氧化铝、氢氧化镁、氢氧化钙等；碱金属碳酸盐例如碳酸钠、碳酸钾、碳酸锂、碳酸铯等；碱土金属碳酸盐例如碳酸镁、碳酸钙等；碱金属碳酸氢盐例如碳酸氢钠、碳酸氢钾等；离子交换树脂，包括与离子例如钠离子、钾离子、锂离子、钙离子、镁离子、取代的或未取代的铵离子等结合的树脂；以及其他适合的碱。
在另一优选例中，所述方法中，步骤(i)包括：在双口瓶中加入acetyl-11-keto-β-boswellic acid(简称AKBA)和氢氧化钾(KOH)，在氮气保护下加入异丙醇作为溶剂；加热回流反应，待反应体系冷却到室温，使用旋转蒸发仪旋干溶剂，得到白色固体，加入二氯甲烷后加入稀盐酸调节混合体系pH值至酸性；用二氯甲烷萃取水相，收集二氯甲烷溶剂，用无水硫酸镁干燥，旋干溶剂得到棕色油状产物，使用石油醚：乙酸乙酯作为洗脱剂，用柱层析法提纯，得到白色固体KBA(11-羰基-β-乳香酸)；步骤(ii)包括：将KBA溶于二氯甲烷(含有4-二甲基吡啶)，加入三乙胺和环己基上取代或非取代的环己甲酰氯，冰浴过夜；反应完全后，用碳酸氢钠溶液处理，并用二氯甲烷萃取，收集二氯甲烷溶剂，用无水硫酸镁干燥混合物，旋干溶剂得到白色固体。用石油醚：乙酸乙酯作为洗脱剂，用柱层析法提纯，得到酰化产物3-o-α-cyclohexanoyl-11-keto-β-boswellic acid。
在本发明的另一方面，提供所述的式(I)所示化合物或其异构体、溶剂合物或前体，或它们的药学上可接受的盐的用途，用于制备治疗TH1和TH17介导的自身免疫性疾病的药物。
在本发明的另一方面，提供所述的式(I)所示化合物或其异构体、溶剂合物或前体，或它们的药学上可接受的盐的用途，用于制备治疗银屑病的药物。
在本发明的另一方面，提供一种用于治疗TH1和TH17介导的自身免疫性疾病或用于治疗银屑病的药物组合物，所述的药物组合物包含：所述的式(I)所示化合物或其异构体、溶剂合物或前体，或它们的药学上可接受的盐；和药学上可接受的载体。
在一个优选例中，所述的式(I)所示化合物或其异构体、溶剂合物或前体，或它们的药学上可接受的盐在药物组合物中是有效量的；较佳地，所述的有效量按照重量含量为0.01-5％；更佳地为0.03-3％；进一步更佳地为0.05-1％。
在另一优选例中，所述的药物组合物是外用剂型；较佳地，所述的药学上可接受的载体包括：甘油、丙二醇、卡波姆、三乙醇胺。
在另一优选例中，所述的药物组合物的pH值为5.5-6.5；较佳地为5.8-6.0。
在本发明的另一方面，提供一种用于治疗TH1和TH17介导的自身免疫性疾病或用于治疗银屑病的药盒，所述的药盒中包括所述的药物组合物。
在本发明的另一方面，提供一种治疗TH1和TH17介导的自身免疫性疾病或治疗银屑病的方法，所述方法包括：给予需要治疗的对象有效量的所述的式(I)所示化合物或其异构体、溶剂合物或前体，或它们的药学上可接受的盐。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1：式(II)化合物的质谱。
图2：式(II)化合物的氢谱。
图3：式(II)化合物的碳谱。
图4：AKBA修饰、制备成式(II)化合物的技术方法及流程。
图5：不同浓度的式(II)化合物(CKBA)与AKBA的体外抑制皮肤角质形成细胞生长的实验，可见式(II)化合物比AKBA更有效抑制角质形成细胞的分裂、增殖。
图6：式(II)化合物抑制TH1和TH17细胞体外分化的实验。
图7：式(II)化合物抑制NF-kappa B的活化。
图8：使用含0.5％(w/w)式(II)化合物(CKBA)的凝胶与含0.5％(w/w)AKBA的凝胶治疗小鼠类银屑病，可见使用CKBA治疗患“银屑病”的小鼠比使用相同浓度AKBA凝胶有更加显著的症状改善。
A，对照(凝胶中不含AKBA或者CKBA)、AKBA凝胶和CKBA凝胶治疗咪喹莫特诱导的“银屑病”小鼠4次；
B，对照、AKBA凝胶和CKBA凝胶治疗咪喹莫特诱导的“银屑病”小鼠4次后皮损处HE照片；
C，对照、AKBA凝胶和CKBA凝胶治疗咪喹莫特诱导的“银屑病”小鼠皮损处皮肤厚度；
D，对照、AKBA凝胶和CKBA凝胶治疗咪喹莫特诱导的“银屑病”小鼠皮损处真皮中炎症细胞的数量(炎症细胞数量/HPF)。HPF，high power field，高倍视野。
图9：使用含0.2％(w/w)式(II)化合物的凝胶治疗小鼠类银屑病的试验，结果可见0.2％(w/w)式(II)化合物可有效治疗小鼠的“银屑病”。
A，对照和CKBA凝胶治疗咪喹莫特诱导的“银屑病”小鼠皮损处皮肤厚度(纵坐标指厚度减少的百分数)；
B，对照和CKBA凝胶治疗咪喹莫特诱导的“银屑病”小鼠皮损处真皮中炎症细胞的数量(炎症细胞数量/HPF)。HPF，high power field，高倍视野。
具体实施方式
本发明首次揭示一种新的五环三萜结构修饰化合物，其能够有效地治疗银屑病，并且其还能选择性抑制TH1和TH17细胞的体外分化，从而可应用于治疗TH1和TH17介导的自身免疫性疾病。
术语
本文所用的术语“烷基”指直链或支链饱和的、含有1-4个碳原子(较佳地1-2个碳原子)的脂族烃类基团。例如，烷基包括但不限于甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，异丁基，叔丁基。
本文所用的术语“链烯基”包括含有至少一个碳碳双键和2-4个碳原子(较佳地2-3个碳原子)的直链和支链烃基。
本文所用的术语“链炔基”包括含有至少一个碳碳三键和2-4个碳原子(较佳地2-3个碳原子)的直链和支链烃基。
本文所用的术语“卤素”指F、Cl、Br、或I。
本文所用的术语“异构体”包括：几何异构体、对映异构体、非对映异构体(如顺反异构体，构象异构体)。
本文所用的的表示方法是本领域人员熟知的，其表示基团R可以取代在环上的任意一个或多个可被取代的位置。并且，在不同的取代位置上，R的选择可以是不同的。
本文所用的术语“溶剂合物”表示携带有溶剂分子的化合物，例如，所述的溶剂合物可以是水合物。
本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。
本发明中，“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)即有合理的效益/风险比的物质。
本发明中，“药学上可接受的载体”是用于将本发明的式(I)化合物、异构体、溶剂合物、前体，或它们的药学上可接受的盐传送给动物或人的药学上或食品上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。载体可以是液体或固体。
化合物
本发明首先提供了一种如结构式(I)所示的化合物：
其中，R独立地选自：氢、羟基、C1-C4烷基、C2-C4链烯基、C2-C4链炔基、卤素。较佳地，R独立地选自：氢、羟基、C1-C2烷基。
本发明还包括上述式(I)化合物的异构体、溶剂合物、前体，或它们的药学上可接受的盐，只要它们也具有与式(I)化合物具有相同或基本相同的功能。所述的“药学上可接受的盐”是指化合物与无机酸、有机酸、碱金属或碱土金属等反应生成的盐。这些盐包括(但不限于)：(1)与如下无机酸形成的盐：如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸；(2)与如下有机酸形成的盐，如乙酸、草酸、丁二酸、酒石酸、甲磺酸、马来酸、或精氨酸。其它的盐包括与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以酯、氨基甲酸酯，或其它常规的“前体药物”的形式。化合物具有一个或多个不对称中心。所以，这些化合物可以作为外消旋的混合物、单独的对映异构体、单独的非对映异构体、非对映异构体混合物、顺式或反式异构体存在。
所述的“化合物的前体”指当用适当的方法服用后，该化合物的前体在病人体内进行代谢或化学反应而转变成结构式(I)的一种化合物，或化学结构式(I)的一个化合物所组成的盐或溶液。
作为本发明的一种优选方式，所述的化合物具有式(II)所示的结构。
式(II)化合物的英文名为3-o-α-cyclohexanoyl-11-keto-β-boswellic acid，简称CKBA。
本领域人员应理解，在得知了本发明化合物的结构以后，可通过多种本领域熟知的方法、利用公知的原料，来获得本发明的化合物，比如化学合成或从生物(如动物或植物)中提取的方法，这些方法均包含在本发明中。
作为本发明的优选方式，提供了一种制备本发明的式(I)所示的化合物的方法，所述方法包括：以11羰基-β-乙酰乳香酸为原料，将其AcO-基团替换为基团。更佳地，制备步骤包括：(i)以11羰基-β-乙酰乳香酸(AKBA)为原料，与碱(如KOH)反应获得11-羰基-β-乳香酸；和(ii)将11-羰基-β-乳香酸与环己甲酰氯反应，获得式(I)所示化合物。其它的制备式(I)化合物的方法也被包含在本发明中，例如可以以11-羰基-β-乳香酸(KBA)为原料，使其与环己甲酰氯反应直接获得式(I)所示化合物。
合成的化合物可以进一步通过柱层析法、高效液相色谱法等方式进一步纯化。
用途
本发明人在研究中发现，本发明的式(I)化合物具有更显着的抑制细胞分裂、增殖能力的作用，对于银屑病有更为显著的治疗作用。另外，本发明的式(I)化合物具有明显的抑制NF-kappa B活化的作用。且，与AKBA相比，本发明的式(I)化合物的药效更为理想。
例如：参与免疫反应的早期和炎症反应各阶段的许多分子都受NF-κB的调控，包括：TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、iNOS、COX2、趋化因子、粘附分子、集落刺激因子等。此外，锌指蛋白A20、血红素加氧酶-1(HO-1)等一些抗炎和与细胞凋亡有关的分子如：肿瘤坏死因子受体相关因子-1(tumour-necrosis factor receptor associated factor-1，TRAF-1)，抗细胞凋亡的蛋白-1和-2(inhibitor of apoptosis 1/2，IAP1/IAP2)，TNF受体相关因子(receptor-associated factors，TRAF1/TRAF2)，Bcl-2同源体A1/Bfl-1和IEX-IL也都受NF-κB的调控。
基于本发明人的新发现，本发明提供了式(I)所示的化合物或其异构体、溶剂合物、前体，或它们的药学上可接受的盐的用途，用于制备治疗治疗TH1和TH17介导的自身免疫性疾病的药物；或用于制备治疗银屑病的药物。所述的TH1和TH17介导的自身免疫性疾病不限于银屑病，例如包括类风湿性关节炎，红斑狼疮，慢性肠炎，多发性脑硬化等。
药物组合物
本发明还提供了一种药物组合物，含有：(a)有效量的式(I)所述的化合物、或其异构体、溶剂合物、前体，或它们的药学上可接受的盐；和(b)药学上可接受的载体或赋形剂。
在本发明中，所述的药物组合物含有按照重量比例为0.01-5％的式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐。较佳的，所述的药物组合物含有按照重量比例为0.03-3％的式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐；更佳地，所述的药物组合物含有按照重量比例为0.05-1％的式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐。
本发明所述的药物组合物的剂型可以是多种多样的，只要是能够使活性成分有效地到达哺乳动物机体的剂型都是可以的。比如可选自：凝胶剂、气雾剂、片剂、胶囊、粉末、颗粒、糖浆、溶液、或悬浮液。根据本发明的化合物所治疗的疾病类型，本领域人员可以选择方便应用的剂型。
从易于制备和给药的立场看，优选的药物组合物是固态组合物，尤其是片剂和固体填充或液体填充的胶囊。本发明的化合物或其药物组合物也可储存在适宜于注射或滴注的消毒器具中。
当用于治疗银屑病时，药物组合物以外用方式给药是优选的。各种适用于配制外用剂型的药学载体均可应用于本发明中。作为本发明的优选方式，所述的药学上可接受的载体包括：甘油、丙二醇、卡波姆和/或三乙醇胺。
作为本发明的一种优选实施方式，制备外用凝胶组合物的步骤为：取有效量的式(I)化合物至容器中，加入无水乙醇使式(I)化合物充分溶解，处方量的卡波姆加入适量水中，过夜、充分溶胀；按照处方量将甘油、丙二醇、溶胀好的卡波姆和防腐剂，与溶好的式(I)的化合物混合并搅拌均匀，用三乙醇胺调节PH值，使组合物pH值为5.8。动物试验证明，所述式(I)化合物的外用凝胶制剂治疗后，可使得银屑病患病皮肤明显趋于正常，皮肤真皮内炎症细胞数量显著减少。
式(I)化合物作为活性成分的有效施用剂量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度而变化。然而，通常当本发明的化合物每天以约5-500mg/kg，较佳地10-300mg/kg，更佳地20-200mg/kg，更佳地50-75mg/kg动物体重的剂量给予时，能得到令人满意的效果，较佳地每天以1-3次分开的剂量给予，或以缓释形式给药。可调节此剂量方案以提供最佳治疗应答。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1：式(II)化合物的制备及鉴定
在100毫升双口瓶中加入8克acetyl-11-keto-β-boswellic acid(简称AKBA)和2.63克氢氧化钾(KOH)，在氮气保护下加入异丙醇50毫升作为溶剂。加热回流反应约6小时，待反应体系冷却到室温，使用旋转蒸发仪旋干溶剂，得到白色固体，加入30毫升二氯甲烷后加入稀盐酸调节混合体系pH值至酸性。用二氯甲烷萃取水相3次(3*15毫升)，收集二氯甲烷溶剂，用无水硫酸镁干燥，旋干溶剂得到棕色油状产物，使用石油醚∶乙酸乙酯(90∶10)作为洗脱剂用柱层析法提纯，得到白色固体KBA 5.8g，产率约为78％。将1克KBA溶于10毫升二氯甲烷(含有2mol％4-二甲基吡啶)，加入1.5当量的三乙胺和1.2当量的环己甲酰氯，冰浴过夜。反应完全后，用10％的碳酸氢钠溶液处理，并用二氯甲烷萃取3次(3*10毫升)，收集二氯甲烷溶剂，用无水硫酸镁干燥混合物，旋干溶剂得到白色固体。用石油醚∶乙酸乙酯(90∶10)作为洗脱剂，用柱层析法提纯，得到酰化产物3-o-α-cyclohexanoyl-11-keto-β-boswellic acid 4g，产率约为55％。
取一定量的式(II)的化合物进行核磁、质谱分析得其分子式为C37H56O5，分子量为581，如图1-4。
实施例2：式(II)的化合物的凝胶的制备
(1)凝胶1
取一定量的式(II)化合物按下列配方制成100克凝胶：式(II)化合物0.2克；甘油2克；丙二醇2克；卡波姆1.5克；2.5ml无水乙醇；防腐剂(杰马BP(SupGuard GM-BP)，万用复方抗菌剂)0.5g；加水至100克；式(II)化合物需先用无水乙醇溶解；卡波姆需加水过夜充分溶胀；将前述化合物混合搅拌均匀后，用三乙醇胺调PH至5.8。获得的凝胶1含有0.2％(w/w)式(II)化合物。
(2)凝胶2
取一定量的式(II)化合物按下列配方制成100克凝胶：式(II)化合物0.5克；甘油2克；丙二醇2克；卡波姆1.5克；2.5ml无水乙醇；防腐剂0.5g；加水至100克；式(II)化合物需先用无水乙醇溶解；卡波姆需加水过夜充分溶胀；将前述化合物混合搅拌均匀后，用三乙醇胺调PH至6.0。获得的凝胶2含有0.5％(w/w)式(II)化合物。
(3)凝胶3
取一定量的具有分子式(II)的化合物按下列配方制成100克凝胶：式(II)化合物0.1克；甘油2克；丙二醇2克；卡波姆1.5克；2.5ml无水乙醇；防腐剂0.5g；加水至100克；式(II)化合物需先用无水乙醇溶解；卡波姆需加水过夜充分溶胀；将前述化合物混合搅拌均匀后，用三乙醇胺调PH至5.9。获得的凝胶3含有0.1％(w/w)式(II)化合物。
(4)凝胶4
取一定量的具有分子式(II)的化合物按下列配方制成100克凝胶：式(II)化合物1克；甘油2克；丙二醇2克；卡波姆1.5克；2.5ml无水乙醇；防腐剂0.5g；加水至100克；式(II)化合物需先用无水乙醇溶解；卡波姆需加水过夜充分溶胀；将前述化合物混合搅拌均匀后，用三乙醇胺调PH至6.0。获得的凝胶3含有1％(w/w)式(II)化合物。
(5)空白凝胶
100克凝胶，包括：甘油2克；丙二醇2克；卡波姆1.5克；2.5ml无水乙醇；防腐剂0.5g；加水至100克，式(II)化合物需先用无水乙醇溶解；卡波姆需加水过夜充分溶胀；将前述化合物混合搅拌均匀后，用三乙醇胺调PH至6.0。该空白凝胶作为动物实验中的对照。
实施例3：体外抑制皮肤角质形成细胞生长的实验
取对数生长期的HaCat角质形成细胞(购自ATCC)种96孔板，每孔2×104个细胞，分别加入呈梯度浓度的式(II)化合物和AKBA，总体积为100毫升，对照组加入终浓度为0.25％的DMSO，空白对照孔仅加入100毫升培养基，每组均设三个复孔。细胞培养箱培养24小时后，每孔加入CCK-8溶液10毫升，将培养板放置于培养箱(37℃，5％CO2条件下)避光孵育4小时取出。酶标仪测定450nm波长处的O.D.值。计算抑制率：抑制率＝【1-(实验组O.D.值/对照组O.D.值)】×100％。
结果如图5，式(II)化合物(CKBA)比AKBA能更加有效地抑制HaCat细胞分裂、增殖。CKBA在较低浓度(20μM)下完全抑制皮肤角质形成细胞的生长，而AKBA则需要在100μM浓度下才能达到相同效果，故CKBA活性极其显著地优于AKBA。
实施例4：抑制TH1和TH17细胞体外分化的实验
取6-8周龄的C57BL/6J小鼠，引颈处死，取其脾脏进行研磨，细胞筛过滤制成单细胞悬液，用CD4-APC，CD25 PerCP-Cy 5.5，CD62L-FITC表面染色后通过流式仪BD FACSAria III分选，分 T cell即CD4+CD25-CD62Lhi+T cells用于TH1、TH17和Treg的诱导分化。加入不同浓度梯度的CKBA进行培养。4天后收集细胞，然后用加有750ng/ml ionomycin和50ng/ml phorbol myristate acetate(PMA)及GolgiPlug的1640完全培养基在5％CO2，37℃培养箱中再培养4-6小时后，用PBS重悬后表面染色，染CD4-APC，4℃染色30min后，PBS重悬洗一遍，破膜20分钟，4℃，用洗液洗一遍染IFN-γ、IL-17A和FoxP3。
用流式细胞仪分析，结果显示2μm的CKBA非常有效地抑制TH1和TH17的体外分化，而对Treg的分化无抑制作用，如图6。
实施例5：凝胶制剂的体内抑制NF-kappa B试验
取20只年龄、性别年龄匹配的Balb/c小鼠(10只空白凝胶对照组，10只CKBA凝胶(实施例2中凝胶2，含0.5％(w/w)式(II)化合物，治疗组)。每天使用咪喹莫特(62.5mg/只/天)涂于小鼠背部造小鼠“银屑病”模型连续7天，第8天分别使用空白凝胶(Control)和CKBA凝胶涂抹小鼠背部，第9天(治疗后24小时)和第10天(治疗后48小时)取皮损部位皮肤提取蛋白，用于Western Blotting分析。
分析磷酸化的IκBα(简称：Phospho-IκB)和磷酸化的p65(简称：Phospho-p65)，结果显示，与对照组相比，涂抹CKBA凝胶(0.5％的式(II)化合物)显著降低了Phospho-IκB、Phospho-p65的生成量，因此有效抑制了NF-kappa B在“银屑病”小鼠皮损处的活化，如图7。
实施例6：0.5％(w/w)凝胶制剂治疗小鼠类银屑病的试验
取30只年龄、性别匹配的Balb/c小鼠(10只空白凝胶对照组，10只AKBA凝胶治疗组和10只CKBA凝胶治疗组)。每天使用咪喹莫特(62.5mg/只/天)涂于小鼠背部造小鼠“银屑病”模型连续7天，8-14天分别使用空白凝胶(Control)，AKBA凝胶(按照0.5％(w/w))和CKBA凝胶(0.5％(w/w))治疗，同时使用咪喹莫特隔天间隔涂抹小鼠背部以维持皮肤炎症，第15天给小鼠的“银屑病”皮损处拍照。随后引颈处死小鼠，剪取皮损处皮肤，4％多聚甲醛固定，制作HE病理切片。从疾病表型及病理切片中表皮面积和真皮炎性细胞的浸润观察，得出式(II)化合物CKBA(按照0.5％(w/w))和AKBA(按照0.5％(w/w))都能有效缓解小鼠银屑病表型(图8A-B)，显著降低皮肤厚度(图8C)以及显著降低炎症细胞数量(图8D)，并且式(II)化合物(CKBA)比AKBA能显著更有效地治疗小鼠的“银屑病”，治疗效果更为理想。
实施例7：0.2％(w/w)凝胶制剂治疗小鼠类银屑病的试验
取30只年龄、性别匹配的Balb/c小鼠(10只空白凝胶对照组，10只AKBA凝胶治疗组和10只CKBA凝胶治疗组)。每天使用咪喹莫特(62.5mg/只/天)涂于小鼠背部造小鼠“银屑病”模型连续7天，8-14天分别使用空白凝胶(Control)，AKBA凝胶(按照0.2％(w/w))和CKBA凝胶(0.2％(w/w))治疗，同时使用咪喹莫特隔天间隔涂抹小鼠背部以维持皮肤炎症，第15天给小鼠的“银屑病”皮损处拍照。随后引颈处死小鼠，剪取皮损处皮肤，4％多聚甲醛固定，制作HE病理切片。
从疾病表型及病理切片中表皮面积和真皮炎性细胞的浸润观察，结果发现，0.2％(w/w)的式(II)化合物(CKBA)可有效地治疗小鼠的“银屑病”，可显著降低皮肤厚度以及显著降低炎症细胞数量，如图9。
上述实例为了说明本发明的技术构思及特点，目的在于让熟悉此项技术的人能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。