一般而言，本发明涉及生物分子的分析方法，更详细地，涉及分析生物分子的生物学意义，利用在核酸中与靶核酸的特定区域完整地互补结合的寡核苷酸，通过一次检查在生物试样中分析生物分子的方法及装置，上述核酸包含与多种靶分子相结合的分析配体及核酸等的靶核酸。
背景技术：
：生物分子为组成生物试样的多种蛋白质、核酸、脂质及碳化物等的物质，虽然分析这些生物分子的技术以及在生物试样中将生物分子的定量状态进行综合化的信息，即，生产生物分子的实验方案(profile)的技术随着物理学、生物化学及生物信息学的发展而被广泛开发，但由于现有方法或设备的使用及维护费、容易性、准确度、灵敏性、检测时间及过程的自动化等的问题，对有效的新方法及设备的需要非常高。生物分子分析及实验方案生产的技术其本身并不是最终的目标，而是用于达成目标的一种手段，但由于能够有用地使用在微生物、细胞、组织等中，因此被广泛地应用在医学、兽医学、环境工程、食品工程、农业等。包含核酸、蛋白质及有机物质等的生物分子的实验方案利用物理性质、化学性质，并通过多种方法被生产出来，上述核酸、蛋白质及有机物质的组成是作为生物试样的组织、细胞块、细胞及微生物等。用于分析利用生物试样中的生物分子的实验方案的生物学意义的临床决策支持系统(CDSS，ClinicalDecisionSupportSystem)，在患者诊疗中支持医生进行有关诊断和治疗的决策(DecisionMaking)的过程的系统。临床决策支持系统大体上分成事例基础机器学习推理系统(CaseBasedMachineLearningInferenceSystem)和专家系统(ExpertSystem)。事例基础机器学习推理系统能够收集判定患有疾病的患者的临床信息(ClinicalInformation)及生物学信息，即生物分子的实验方案数据之后，利用机器学习并通过现有的临床信息和生物学信息等，来对疾病进行推理或判别。专家系统依据由医学专家预先制定的规则(Rule)来诊断疾病。若对最具代表性的生物分子的遗传物质的核酸及蛋白质进行观察，遗传信息以组成染色体的脱氧核糖核酸(DNA，Deoxyribonucleicacid)的非常长的分子形态被存储，上述染色体包含约30亿个组成人体基因组的核苷酸。在染色体中核苷酸的序列对于决定各个体的特性起到主要的作用。多数的普通疾病根据在个体之间的人体基因组的核苷酸序列中的变形。属于同种的生物体个体的基因组中所包含的遗传密码相互不一致，并存在称作多态性(polymorphism)的碱基序列上的差异。众所周知，多态性中1个以上的碱基被缺失(deletion)或插入(insertion)、特定碱基序列被反复(repeat)等。一个碱基被置换成另一个碱基被命名为单个碱基多态性(SNP，Singlenucleotidepolymorphism，以下简称为“SNP”)。作为许多SNP的基因型分析化学(genotypingchemistries)已提出了聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-restrictionfragmentlengthpolymorphismanalysis)、单链构象多态性检测(single-strandconformationpolymorphismdetection)、双脱氧微测序(dideoxyminisequencing)、寡核苷酸连接分析(oligonucledtideligationassays)、等位基因特异性核酸扩增(AS-PCR，allele-specificpolymerasechainreaction，以下简称为“AS-PCR”)、连接酶链式反应(ligasechainreaction)、引物-所需核苷酸结合分析(primer-requirednucleotideincorporationassays)及荧光能量转移-基础分析(fluorescenceenergytransfer-basedassays)等(Landegren，U.，etal.，1998，GenomeRes，8：769-776；Gut，I.G.，2001，HumMutat，17：475-492；Shi，M.M.，2001，ClinChem，47：164-172)。上述目录以外，最近添加的有能够准确直接地决定短的单脱氧核糖核酸片段的质量的质谱分析法(massspectrometry)(RossPetal.，2000，BioTechniques，29：620-629)和寡核苷酸微阵列-基础分析(Oligonucleotidemicroarray-basedanalysis)(Wang，D.G.etal.，1998，Science，280：1077-1082)。等位基因特异性杂交(allelicspecifichybridization)为美国昂飞公司的全基因组SNP阵列(AffymetrixwholegenomeSNParray)(KomuraD.，etal.，2006，GenomeRes.2006；16：1575-84.6)、爱达荷公司的高分辨率熔解曲线分析系统(IdahoHi-ResMeltingcurveanalysissystem)(GrahamR.，etal.，2005，ClinChem.51：1295-8)、动态等位基因特异性杂交(DASH，dy-namicallele-specifichybridization)(PrinceJ.A.，etal.，2001，GenomeRes.11：152-62)及亿明达公司的金门SNP基因型分型陈列(IlluminaGoldenGateSNPGenotypingArrays)(GundersonK.L.，etal.，2005，NatGenet.37：549-54)，荧光共振能量转移(FRET，fluorescenceresonanceenergytransfer)为托曼(TaqMan)(HollowayJ.W.，etal.，1999，HumMutat.14：340-7)，分子信标检测(Molecularbeaconsassays)为(BarreiroL.B.，etal.，2009，MethodsMolBiol.578:255-76)，以及应用AS-PCR的延伸(extension)技术为亿明达(Illumina)公司的英菲(Infinium)微珠芯片(OliphantA.，etal.，2002，Biotechniques.Suppl：56-8，60-1)、贝克曼公司的基因组GenomeLabSNPstream系统(BeckmanGenomeLabSNPstreamsystem)(BellP.A.，etal.，2002，Biotechniques.2002；Suppl：70-2，74，76-7)以及西格诺公司的分子量阵列SNP系统(SequenomMassARRAYSNPsystem)(HayesB.J.，etal.2007，Bioinformatics.2007；23：1692-3)等。用于SNP鉴定的上述方法，根据特定目的存在相对的优点和缺点，因此不能够断定地说哪种方法比其它方法更优越。一方面，脱氧核糖核酸-基础微阵列技术作为能够分析特定基因或基因簇的存在、量或者表达模式的简单的方法而备受瞩目。(chenaetal.，1995，Science，270：467-470；DeRisietal.，1996，NatureGenetics14：457-460)。各个细胞中存在5万至10万个左右的基因，但细胞选择性地使用基因。其中相当数量为用于细胞本身的生命维持活动或者日常活动的基因。将这些基因称作为持家基因(housekeepinggene；以下简称为HKG)。并且，根据说明特定基因的功能，或者探索特定功能的基因，或者制定特定条件的生物体的表达方式以及除上述之外的多种分子生物学目的，内源性标准表达基因存在为了比较特定或者多个基因表达量而开发的利用信使核糖核酸(messengerRNA；以下简称为mRNA)的定量分析的多种基因表达检测法，其方法有从传统的反转录聚合酶链式反应(RT-PCR，reversetranscriptasepolymerasechainreaction；以下称为RT-PCR)到最近开发的实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR，quantitativerealtimePCR；以下称为qRT-PCR)、基因表达系列分析(SAGE，serialanalysisofgeneexpression；以下称为SAGE)及微阵列(Microarray)等。但是，由于现有脱氧核糖核酸微阵列仅仅是通过杂交方式来检测靶序列，会发生交叉反应(crossreaction)引起的假阳性(falsepositives)问题，因此存在需要改善杂交信号的可靠性的问题。并且，由于现有微阵列的情况下，通过杂交方式进行检测，杂交后存在需要困难的清洗过程的问题，且杂交前必须需要将靶序列制备成单链的过程。一方面，最近发表的芯片上的聚合酶链式反应(on-chipPCR)是通过杂交方式或者探针延伸(probeextension)方式来检测的，因此如现有微阵列一样是异质性检测系统(heterogenousassaysystem)，且存在不能实时检测并无法准确地定量的问题。并且，最近通过对蛋白质组的高通量筛选(HighThroughputScreening)技术开发并使用了蛋白质芯片(Proteinchip)或者适配体芯片(Aptamerchip)(Smithetal.，MolCellProtomics，11-18.2003；andMcCauleyetal.，AnalBiochem，319(2)，244-250.2003)。这些高通量筛选使用的载体有载玻片、生物传感器的检测表面、微珠、纳米粒子等。并且，分析实验方案来决定有用的生物分子，并将其进行分离后，通过基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF，MatrixAssistedLaserDesorption/Ionization-TimeOfFlight)等来执行确认这些组成成分的方法等。最近通过表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(SELDI-TOFMS，Surface-enhancedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry)对蛋白质实验方案进行许多研究(Adametal.，CancerResearch，62，3609-3614.2002；Lietal.，ClinicalChemistry，48，1296-1304.2002；andPetricoinetal.，TheLancet，359，572-577.2002)。作为又一接近方法，已开发了利用DNA和核酸聚合酶(polymerase)来扩增信号的技术的免疫PCR(IPCR，immuno-PCR)方法(Sanoetal.，Science258，120-122.1992)。如上所述，免疫分析法在检测灵敏度的提高及多重分析能力的提高方面再一次得到了发展，但仍然面临着节省分析费用、缩短分析时间、提高灵敏性及增加再现性的技术问题。虽然本发明者提出了生产对于蛋白质组的实验方案的反转指数式富集的配体系统进化技术(reverse-SELEX)(参照韩国专利登录第10-0670799号)、适配体基础核酸芯片(参照韩国专利登录第10-0464225号)、利用适配体基础核酸芯片的生物学意义分析技术(参照韩国专利登录第10-0923048号)及基因变异分析方法(韩国专利申请第10-2013-0118222号)等，但是存在不能在生物试样中通过一次检查来分析蛋白质和核酸的问题，因此本发明用于为了解决上述问题而提出。整体分析生物试样的生物分子的研究为医学上分析有关疾病的生物分子的实验方案，从而将上述研究使用于用来查明能够诊断疾病的生物分子、能够分析治疗结果的生物分子、疾病发病及进行中起重要作用的生物分子、对疾病的灵敏度有关的生物分子以及新药开发的靶分子。克服各个单独分析上述现有生物分子的技术的问题，为了开发通过进一步改善的有效性及灵敏性来实时分析生物分子的技术而研究的结果，开发出如本申请能够通过一次检查而分析多种种类的生物分子的方法，从而达成本发明的目的。最终，整体分析生物试样的生物分子的研究为医学上分析有关疾病的生物分子的实验方案，从而能够将上述研究使用于用来查明能够诊断疾病的生物分子、能够分析治疗结果的生物分子、疾病发病及进行中起重要作用的生物分子、对疾病的灵敏度有关的生物分子以及新药开发的靶分子。技术实现要素：技术问题为了达成上述目的，本发明提供利用寡核苷酸的生物分子的分析方法及装置，其特征在于，通过核酸分析方法分析所要分析的试样中的包含蛋白质的两个或者两个以上的生物分子。并且，本发明提供利用寡核苷酸的生物分子的分析方法及装置，通过上述方法分析生物试样中包含的生物分子的生物学意义，其特征在于，包括：在组成上述试样的上述生物分子中准备受体及核酸的步骤，使上述受体和分析配体发生反应来形成受体-分析配体复合物的步骤，在作为所要分析的上述核酸的靶核酸和作为上述受体-分析配体复合物的寡核苷酸的靶核酸中制备靶核酸脱氧核糖核酸的步骤，以及分析上述靶核酸脱氧核糖核酸的步骤。并且，本发明提供核酸芯片，其特征在于，上述核酸芯片用于分析生物试样中包含的受体及核酸的生物学意义，并通过一次检查来分析生物试样中的生物分子。并且，本发明提供利用寡核苷酸的生物分子的分析方法及装置，其特征在于，上述生物试样选自由细菌、真菌类、病毒、细胞株、组织组成的组中的一种以上。本发明的目的在于，提供利用寡核苷酸的生物分子的分析方法及装置，且利用它们能够从有效生成的结合信息中分析包含有关生物分子的疾病信息的各种生物学意义。解决问题的手段本发明的术语生物分子作为担当组成生物体的功能的特殊分子，最主要的是蛋白质、核酸、多糖类及脂质等的体积大的巨大分子和作为低分子物质的氨基酸、核苷酸、单糖类、维生素等的有机物质、铁、铜等的金属、无机离子等。配体作为与受体相结合的物质，代表性的有抗体、肽、核酸及适配体等。受体可以是蛋白质、缩氨酸、核酸、碳水化合物、脂质(lipid)、多糖类、糖蛋白、激素、受体、抗原、抗体、病毒、病原菌、毒性物质、基质、代谢物、过渡态类似物(transitionstateanalog)、辅因子(cofactor)、抑制剂、药、染料、营养素、生长因子、细胞、组织等，可以不受限制地使用几乎所有的化学或者生物学的效应物(effector)，意味着可被检测出的任何大小分子的靶分子。提出受体包含一个或者一个以上的对配体特异性的分子或者分子簇的结构，上述分子或者分子簇结合配体和受体并相互作用或者与受体相联合来作用于受体的功能，使它们发生变化或者无效化。抗体是与抗原进行特异性结合来发生抗原-抗体反应的物质。适配体(aptamer)表示具有能够从低分子化合物开始到蛋白质在多种种类的受体中通过高的亲和性和特异性来结合的特征的小(20～60核苷酸)单链核酸(DNA或者RNA)碎片。分析配体为与特定配体连接有设计的寡核苷酸的结构体。上述寡核苷酸能够用作通过核酸分析方法来分析作为与配体相结合的受体的生物分子的用途。分析配体的寡核苷酸的结构由以下的通式(I)来表示：5’-P1α-T-P3β-3’(I)在上述通式(I)中，P1为信号引物对中与正向引物完整的互补结合的区域，T为作为与捕获探针完整地互补结合的区域，为了识别靶单链核酸而被利用且能够设计成适合于杂交反应中使用的探针。P3为信号引物对中与正向引物完整地互补结合的区域。α及β表示核苷酸的个数，且α及β为8-30的整数。靶核酸表示从上述所要分析的试样中被分离的核酸以及与从上述所要分析的试样中被分离的受体相结合的适配体，且提出包含与上游寡核苷酸的至少一部分互补结合的区域及与下游寡核苷酸的至少一部分互补结合的碱基序列的多核苷酸。在个别实施方式中，该靶核酸能够在与两个寡核苷酸完整地互补结合的区域中具有延伸区域或者切口(nick)。靶核酸能够包含单链核酸或双链核酸DNA或RNA。并且，靶核酸DNA表示直接结合有上游寡核苷酸及下游寡核苷酸的模板DNA。为达成上述目的，本发明提供利用寡核苷酸的生物分子的分析方法及装置，其特征在于，通过核酸分析方法分析所要分析的试样中的包含蛋白质的两个或者两个以上的生物分子。试样中存在包含与配体相结合的蛋白质的许多生物分子。由此，生物分子形成生物分子-配体复合物，从而能够通过配体信号进行检测，且基于上述功能开发了生物分子分析技术。本发明提供利用寡核苷酸的生物分子的分析方法及装置，通过如下方法分析生物试样中包含的适配体的受体及核酸的生物学意义，其特征在于，包括：在组成上述试样的上述生物分子中准备受体及核酸的步骤；使上述受体和分析配体发生反应来形成受体-分析配体复合物的步骤；在作为所要分析的上述核酸的靶核酸和作为上述受体-分析配体复合物的寡核苷酸的靶核酸中制备靶核酸脱氧核糖核酸的步骤；以及分析上述靶核酸脱氧核糖核酸的步骤。图1为表示从生物试样中分离核酸及蛋白质，上述蛋白质与分析配体发生反应来制备蛋白质-分析配体复合物，从核酸中分离RNA及DNA后，制备包含所要分析的靶核酸的靶核酸DNA，借助与这些靶核酸的特定区域完整地互补结合的寡核苷酸来分析生物分子，并在生物试样中决定生物分子的生物学意义的整体流程图。图2为表示从生物试样中分离的受体和分析配体的结构体，且分析配体由指示配体和配体的碱基序列及通用PCR引物组成。根据本发明的优选的实例，优选地，能够优选地在由细胞组成的生物试样中溶解细胞来制备作为受体的生物分子，并执行追加的步骤，可通过公知方法来分离DNA及RNA等的核酸。使所准备的上述生物分子和适配体发生反应来制备生物分子-分析配体复合物，并能够借助多种方法来分离所制备的复合物。优选地，所制备的生物分子-分析配体复合物的分离方法如下：首先，使生物分子与载体相结合后，使分析配体发生反应来形成生物分子-分析配体复合物，执行清洗步骤来去除未结合分析配体，并准备纯化的复合物。所分离的上述RNA、DNA及上述生物分子-分析配体复合物等的核酸能够作为所要分析的靶核酸并通过普通的核酸分析方法来进行靶核酸的定量分析及变异分析。并且，由所分析的结果可知，在包含生物分子的生物试样中决定生物分子的生物学意义。本发明提供利用寡核苷酸的生物分子的分析方法及装置，其特征在于，进行上述特定核酸的定量分析、变异分析及甲基化有无分析。上述特定核酸变异作为基因变异具有单碱基多态性(SNP，SingleNucleotidePolymorphism)和结构变异(StructuralVariation)等。基因变异被公知为决定表现型(phenotype)的变化，对疾病的敏感性，并且对治疗药剂的反应的差异等个体之间的差异，且特别是将参与疾病发生和进行过程的变异称作疾病相关基因变异(Disease-associatedGeneticVariants)。SNP为表示DNA碱基序列中一个碱基序列(A、T、G、C)的差异的基因改变或变异。结构变异表示如缺失、倒位、添加、复制等的DNA结构变异。并且，对于本发明，细胞内核酸的甲基化有无分析能够包含在核酸处理重亚硫酸盐(bisulfite)来产生的核酸的核苷酸变异。在上述核酸处理重亚硫酸盐，使没有甲基化的胞嘧啶(cytosine)残基变异成尿嘧啶(uracil)残基，而甲基化胞嘧啶残基以没变异的状态存在。能够分析这些重亚硫酸盐(bisulfite)的处理前后的核苷酸变化，且能够通过这些变化来确定核酸的甲基化有无。本发明提供利用寡核苷酸的生物分子的分析方法及装置，其特征在于，适配体受体定量分析的内部质量控制物质利用所要分析的生物试样中不包含的物质。优选地，普通的定性定量分析的情况下，进行各种实验、检测时，为了比较通过所要分析的生物试样中包含的生物分子进行内部质量控制。理想的上述质量控制用物质为所要分析的试样中始终适量存在的物质，当不是上述情况时，能够使用试样中不包含的物质的外来物质，优选地，在所要分析的试样为生物试样的情况下，能够由上述生物试样中不包含的外来生物分子组成。质量控制如管理用试样不使用外部基准，并表示分析通过每次的测定而获得的一组的检查结果来控制测定值的精密度的内部质量控制。优选地，在内部质量控制用物质分析人源生物试样的情况下，本发明能够通过人源生物试样中不包含的生物分子来分析植物特异生物分子。目前已结束了人体基因组项目及植物之一的拟南芥(Arabidopsisthaliana)基因组项目，并报告植物特异蛋白质。为了分析人源生物试样，本发明中作为基准物质能够使用植物特异蛋白质。本发明提供利用寡核苷酸的生物分子的分析方法及装置，其特征在于，定量分析靶核酸或者分析靶核酸的碱基序列。分析上述靶核酸的方法可以是聚合酶链式反应(PCR，polymeraschainreaction)、连接酶链式反应(LCR，ligasechainreaction)、链替代扩增反应(SDA，stranddisplacementamplification)、转录介导扩增(TMA，transcription-mediatedamplification)、支链脱氧核糖核酸(bDNA，branchedDNA)、侵入方法及滚环扩增(RCA，rollingcircleamplification)等。优选地，对上述靶核酸能够将由LCR组成的双链核酸当作模板而发生PCR，来分析生成的扩增产物。本发明提供利用寡核苷酸的生物分子的分析方法及装置，其特征在于，制备并分析上述靶核酸的方法包括：制备向上述靶核酸相同的方向完整地互补结合的上游寡核苷酸及下游寡核苷酸的步骤；使上述靶核酸、上述上游寡核苷酸和下游寡核苷酸发生反应来制备完整的双链核酸的步骤；将完整的上述双链核酸当作模板来使用信号引物，并标记及扩增，来制备靶探针的步骤；以及，分析在使上述靶探针与捕获探针发生杂交反应而组成的产物中产生的信号的步骤。如本发明所述，提及靶核酸时的“互补结合的碱基序列”为表示允许寡核苷酸的杂交的充分长度的核苷酸，互补的碱基序列在长度为约6个核苷酸至约1000个核苷酸的范围内，优选的范围为约8个至30个核苷酸，最佳的范围为10个至25个核苷酸。本发明中，在向上述靶核酸相同的方向完整地互补结合的寡核苷酸中，位于上游的寡核苷酸称作上游寡核苷酸，位于下游的称作下游寡核苷酸。本发明的“上游寡核苷酸”优选的长度为6个至100个，更优选的为8个至30个及最优选的为20个核苷酸。本发明的“下游寡核苷酸”的3’区域对靶核酸至少发生部分性的互补，优选的为8个至80个及最优选的为10个至20个核苷酸。“捕获探针”表示在反应中利用在确认多核苷酸以和/或追踪多核苷酸的来源的独特的核苷酸序列。捕获探针序列能够位于信号引物的5末端或者3末端。捕获探针碱基序列能够在大小及组成中进行广泛的多变。以下的参考资料提出特定具体例中选择适合的一系列的捕获探针碱基序列的方针(美国专利第5635400号；Brenneretal，2000，PNAS.，97:1665-1670；Shoemakeretal，1996，NatureGenetics，14:450-456；欧洲专利公开0799897A1；美国专利第5981179号)。并且，与此类似的，在特定具体例中捕获探针碱基序列能够拥有4个至36个核苷酸，或者6个至30个核苷酸，或者8个至20个核苷酸范围的长度。并且，本发明的捕获探针的碱基序列可以是靶核酸的特异碱基序列。本发明提供利用寡核苷酸的生物分子的分析方法及装置，其特征在于，为了上述靶核酸定量分析，上述上游寡核苷酸由作为与正向信号引物完整地互补结合的碱基序列的区域和作为与上述靶核酸完整地互补结合的碱基序列的区域等组成，下游寡核苷酸由与上述靶核酸完整地互补结合的碱基序列的区域、与捕获探针完整地互补结合的碱基序列的区域、与反向信号引物完整地互补结合的碱基序列的区域等组成。图3为表示从生物试样中分离的核糖核酸进行反转录来形成的核酸中由上游寡核苷酸和下游寡核苷酸形成双链核酸后，进行定量分析的方法的图。并且，为了上述靶核酸定量分析，本发明的制备上述上游寡核苷酸及下游寡核苷酸的步骤，上述上游寡核苷酸的结构为由(i)在信号引物对中正向引物被完整地互补结合的区域及(ii)与杂交的靶核酸实质性地互补杂交的序列区域等组成的寡核苷酸。在上述内容中，本发明的特征在于，上述上游寡核苷酸由以下的通式(II)来表示：5’-P1α-Hβ-3’(II)在上述通式(II)中，P1为在信号引物对中与正向引物完整地互补结合的区域，H为与杂交的靶核酸实质性地互补杂交序列的区域。α及β为表示核苷酸的个数，且α及β为8-30的整数。作为上述上游寡核苷酸能够在上述特定靶核酸中利用完整的(perfectly)互补序列，但是在不妨碍特异性杂交的范围内也能够利用实质的(substantially)互补序列。优选地，上述上游寡核苷酸包含能够被包含本发明的特定靶核酸的10个至30个的连续核苷酸残基的序列杂交的序列。下游寡核苷酸的结构为(i)与上述靶核酸向上述上游寡核苷酸相同的方向完整地互补结合的区域、(ii)与上述捕获探针完整地互补结合的区域及(iii)在信号引物对中与反向引物完整地互补结合的区域等。在上述内容中，本发明的特征在于，上述下游寡核苷酸由以下的通式(III)来表示：5’-Hα-Tβ-P3γ-3’(III)上述通式(III)中，H为在上述靶核酸中从使上述上游寡核苷酸的3’末端结合的位置之后的碱基序列完整地互补结合的区域，T作为与捕获探针完整地互补结合的区域，为了识别靶单链核酸而被利用，且能够设计成适用于杂交反应中使用的探针。P3为在信号引物对中与反向引物完整地互补结合的区域。α、β及γ作为核苷酸的个数是8-30的整数。本发明提供利用寡核苷酸的生物分子的分析方法及装置，其特征在于，为了分析上述靶核酸变异，上述上游寡核核苷酸由与正向信号引物完整地互补结合的碱基序列的区域、与上述靶核酸完整地互补结合的碱基序列以及在3’末端中能够区分上述靶核酸的变异核苷酸的碱基序列的区域等组成，下游寡核苷酸由与上述靶核酸完整地互补结合的碱基序列的区域、与上述捕获探针完整地互补结合的碱基序列的区域、与反向信号引物完整地互补结合的碱基序列的区域等组成。图4示出了从生物试样中分离核酸及受体，并从核酸及受体-分析配体复合物等的核酸中制备靶核酸，从而利用与这些靶核酸的特定区域完整地互补结合的寡核苷酸，来分析靶核酸变异分析的整体流程图。图5示出了从生物试样中分离的核酸处理重亚硫酸盐(bisulfite)，来制备靶核酸脱氧核糖核酸后，利用这些靶核酸的特定区域中完整地互补结合的寡核苷酸来进行核酸甲基化有无分析的整体流程图。并且，本发明为了靶核酸变异分析，在对于本发明的制备上述上游寡核苷酸及下游寡核苷酸的步骤，上述上游寡核苷酸的结构为(i)在信号引物对中与正向引物完整地互补结合的区域(P1)，(ii)与靶核酸具有完整的互补杂交序列的变异相邻区域(H)，以及(iii)相当于核苷酸变异的变异区域(V)，且具有核苷酸变异信息的上游寡核苷酸为两种或者两种以上的寡核苷酸等。在上述内容中，本发明的特征在于，上述上游寡核苷酸由以下的通式(IV)来表示：5’-P1α-Hβ-Vγ-3’(IV)上述通式(IV)中，P1为在信号引物对中使正向引物完整地互补结合的区域，H为与杂交的靶核酸具有完整的互补杂交序列的变异相邻特异区域，V为相当于核苷酸变异的变异相邻特异区域。α、β及γ表示核苷酸的个数，且α及β为8～30的整数，γ为1～3的整数。作为上述上游寡核苷酸，在包含上述SNP的序列中可利用完整的(perfectly)互补的序列，但是在不妨碍特异性杂交的范围内，也能够利用实质的(substantially)互补的序列。优选地，上述上游寡核苷酸包含能够在包含本发明的SNP的10-30个连续核苷酸残基的序列中进行杂交的序列。更优选地，上述上游寡核苷酸的3’-末端具有与上述SNP碱基互补的碱基。通常，通过杂交形成的双链体(duplex)的稳定性具有根据末端的序列的一致而确定的倾向，因此若在3’-末端具有与SNP碱基互补的碱基的上游寡核苷酸中的末端区域不杂交，则这些双链体能够在严格的条件下解体。下游寡核苷酸的结构如下：(i)与上述靶核酸向上游寡核苷酸相同的方向完整地互补结合的区域(H)；(ii)与上述捕获探针完整地互补结合的区域(T)；以及(iii)在信号引物对中与反向引物完整地互补结合的区域(P3)等。在上述内容中，本发明的特征在于，上述下游寡核苷酸由以下的通式(V)来表示：5’-Hα-Tβ-P3γ-3’(V)上述通式(IV)中，H为与上述靶核酸完整地互补结合的变异的特异区域，T为作为与捕获探针完整地互补结合的区域，用于识别具有变异相关核苷酸的单链核酸而使用，能够设计成适用于杂交反应中使用的探针。P3为在信号引物对中与反向引物完整地互补结合的区域。α、β及γ作为核苷酸的个数是8-30的整数。上述上游寡核苷酸及下游寡核苷酸通过该
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所公知的(如化学合成)任意的适合方法来合成及制备的。上述上游寡核苷酸及下游寡核苷酸也能够通过商业供应商而便于利用。本发明利用的上游寡核苷酸及下游寡核苷酸在模板的一部位杂交或者退火，来形成双链结构。形成这些双链结构的适合的核酸杂交的条件公开在JosephSambrook，等，MolecularCloning，ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.(2001)以及Haymes，B.D.，等，NucleicAcidHybridization，APracticalApproach，IRLPress，Washington，D.C.(1985)。本发明中，退火在靶核苷酸序列与信号引物之间能够进行特异性结合的苛刻条件下执行。用于退火的苛刻条件为序列-依赖性且随着周围环境的变数而存在多种。如此扩增的靶核酸为一个分子上包含多靶部位的靶核酸分子，且能够利用上述靶核酸分子的同时，分析多靶部位。本发明提供利用寡核苷酸的生物分子的分析方法及装置，其特征在于，在上述靶核酸、上述上游寡核苷酸和下游寡核苷酸发生杂交反应来形成的部分双链核酸中两个寡核苷酸之间具有延伸区域的情况下发生延伸反应，并发生连接反应来形成完整的双链核酸。如本发明使用的，“延伸区域”提及通过核酸聚合活性充分允许寡核苷酸的延伸的长度的核苷酸。“延伸区域”存在于靶及模板核酸的几个模式。在存在的情况下，“延伸区域”处于靶或者模板核酸的上游寡核苷酸及下游寡核苷酸之间。"延伸区域"是长度为约一个核苷酸至约1000个核苷酸，优选的范围为约1个至100个核苷酸，更优选的范围为3个至50个，以及最佳的长度为3个至10个的核苷酸范围。延伸反应(extension)是指利用聚合酶在上述延伸区域中追加核苷酸，从而延伸引物的反应。若延伸与核酸完整地互补结合的寡核苷酸，则这个核酸起到用于延伸反应的模板作用。本发明特征在于，DNA聚合酶为选自由TaqDNA聚合酶以及PfuDNA聚合酶组成的组中，且并不局限于上述组，若是耐热(thermostable)DNA聚合酶，则都可使用。连接反应(ligation)是指与上游寡核苷酸的3末端或者所延伸的上游寡核苷酸的3末端和下游寡核苷酸以酶催化的方式进行连接。本发明特征在于，连接酶选自由大肠杆菌(E.coli，Escherichiacoli)DNA连接酶、TaqDNA连接酶、T4DNA连接酶及Amp连接酶(ligase)组成的组中。本发明提供利用寡核苷酸的生物分子的分析方法及装置，其特征在于，上述靶核酸和上述上游寡核苷酸与下游寡核苷酸发生杂交反应来形成的部分双链核酸在两个寡核苷酸之间具有切口(nick)的情况下，发生连接反应来形成完整的双链核酸。上述连接反应是指能够利用连接酶(ligase)催化核苷酸序列的连接的反应。使特定长度的2种寡核苷酸并排完整地互补结合于靶核酸后，使这时形成的双螺旋的切口(nick)部位利用DNA连接酶，并通过以常规核酸的连接原理为根据的常规连接反应，使2种寡核苷酸以单链状态的方式连接的反应。因此，作为引导核酸的连接的连接酶可不限定地使用本领域中通常使用的酶。在上述连接反应中使用的酶的特征在于，其选自由大肠杆菌(E.coli，Escherichiacoli)DNA连接酶、TaqDNA连接酶、T4DNA连接酶及Amp连接酶组成的组中，且并不限定于上述组，若是具有DNA结合活性的连接酶，则能够使用任何连接酶。并且，上述连接酶反应不仅能够进行单一靶基因检测或者变异检测，还可以使用识别多个靶的多个寡核苷酸，通过一次反应执行。在这种情况下，本发明特征在于，各个连接酶寡核苷酸碱基序列中，选定符合各个变异位置的连接酶和寡核苷酸，使得与靶核酸杂交的部分的解链温度(Tm，meltingtemperature)值的误差在5以内。本发明提供利用寡核苷酸的生物分子的分析方法，其特征在于，使上述靶核酸、上述上游寡核苷酸与下游寡核苷酸发生杂交反应形成的上述部分双链核酸发生连接反应，来两次或者两次以上反复地执行形成上述完整的双链核酸的反应。本发明提供利用寡核苷酸的生物分子的分析方法及装置，其特征在于，上述信号引物由作为含有标记物质的通用PCR引物的正向引物和由通用PCR引物组成的反向引物组成。在上述内容中，本发明的特征在于，上述信号引物(signalprimers)由以下的通式(VI)及通式(VII)来表示:正向引物：5’-X-P-3’(VI)；反向引物：5’-P-3’(VII)。在通式(VI)及通式(VII)中，X为作为能够检测的标记物质，为了生物分子的定量分析从而对照组试样中所制备的靶探针和使用于从实验组试样中所制备的靶探针的标记物质有所不同，且优选地，前者还可以为Cy3，后者还可以为Cy5。并且，为了核酸的变异分析，上述引物的5’最末端利用作为荧光报道分子或者具有物理特征的报道分子等的标记物质来识别有关变异的核苷酸的种类，即，用于识别变异类型而使用，优选地，荧光分析根据核苷酸变异，野生型(wildtype)能够利用Cy3、突变型(mutationtype)能够利用Cy5来标记。P是上游寡核苷酸及下游寡核苷酸中与信号引物完整地互补结合的区域。在上述信号引物对中，正向引物(P1或者P2)由碱基序列组成，上述碱基序列在上述上游寡核苷酸的结构中完整地互补结合于使信号引物结合的区域的碱基序列，且优选地，可以是通用PCR引物(universalPCRprimer)，根据靶核酸的核苷酸变异，在上述信号引物的5’末端中选定荧光报道分子或者具有物理特征的报道分子等的标记物质(X)并结束杂交反应，当决定核苷酸变异时，使用从标记物质中产生的信号。并且，在上述信号引物对中，反向引物(P3)由碱基序列组成，上述碱基序列在上述下游寡核苷酸的结构中完整地互补结合于使信号引物结合的区域的碱基序列，且优选地，可以是通用PCR引物(universalPCRprimer)。通用PCR引物通常作为大量使用于碱基序列决定或者PCR等的碱基序列的寡核苷酸，而大量存在于商业克隆载体。本发明提供利用寡核苷酸的生物分子的分析方法，其特征在于，上述捕获探针由与具有上述靶探针的标记物质的单链核酸和完整地互补结合的碱基序列组成。本发明提供利用寡核苷酸的生物分子的分析方法，其特征在于，上述捕获探针由与存在于具有靶探针的标记物质的单链核酸的反向下游寡核苷酸的特异碱基序列完整地互补结合的碱基序列组成。上述捕获探针(captureprobes)结合于上述扩增产物来起到识别这些的作用，且在将上述靶核酸当做模板并利用信号引物来发生扩增反应而制备的扩增产物中，基于引物结合区域(T)，上述捕获探针能够由与具有包含标记物质的单链核酸互补的碱基序列的单链核酸、寡核苷酸及核酸肽(PNA，peptidenucleicacid)等制备。本发明提供利用寡核苷酸的生物分子的分析方法，其特征在于，上述靶探针由从对照组试样中制备的对照靶探针及从实验组试样中制备的分析靶探针构成。根据本发明，当要从对照组和实验组试样中分离生物分子来进行定量分析的情况下，从对照组试样中分离的生物分子中制备靶核酸DNA后，将其当做模板并利用信号引物发生PCR来制备对照靶探针，以及将从实验组试样中制备的靶核酸DNA当做模板发生PCR来制备分析靶探针。混合这些所制备的对照靶探针和分析靶探针来准备靶探针。能够将使用于对照靶探针的制备的信号引物的标记物质和使用于对照靶探针的制备的信号引物的标记物质变成相互不同。优选地，前者能够使用Cy3荧光物质，后者能够使用Cy5荧光物质。本发明提供利用寡核苷酸的生物分子的分析方法，其特征在于，上述捕获探针与载体相结合。本发明提供利用寡核苷酸的生物分子的分析方法，其特征在于，上述载体包括载玻片、生物传感器的检测表面、微珠、纳米粒子等。图6为具有固定于载玻片底物的上述捕获探针和标记物质的靶探针进行杂交并进行清洗后，分析所产生的信号来分析生物分子的图。优选地，捕获探针能够结合于载玻片或者生物传感器的检测表面等，且以可结合的方式能够变形，这些变形能够在寡核苷酸的5’的最末端结合C1～C20烷基，且为了容易地进行与载玻片或者检测表面的结合，能够添加硫醇等的物质。但是，这些变形根据目的能够进行适当的变化。如上所述，固定有捕获探针的支架为微阵列的一种，能够意味着生物传感器检测表面，且可以是可测定结合有靶物质而产生的变化，来检测靶物质的所有支架。尤其，能够分析结合于捕获探针的标记物质的荧光物质来测定荧光变化。优选地，这里可利用作为现有的固体支架的载玻片。上述内容中，在上述杂交反应中杂交(退火)温度为40℃至70℃，更优选为45℃至68℃，进一步更优选为50℃至65℃，最优选为60℃至65℃。杂交条件可参考JosephSambrook，etal.，MolecularCloning，ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.(2001)以及Haymes，B.D.，etal.，NucleicAcidHybridization，APracticalApproach，IRLPress，Washington，D.C.(1985)中公开的事项来决定。利用于杂交的苛刻条件(stringentcondition)能够调整温度、离子强度(缓冲液浓度)及有机溶剂之类的化合物的存在等来决定。这些苛刻的条件能够根据杂交的序列来决定。例如，上述苛刻条件中高苛刻条件意味着在0.5MNaHPO4、7％的十二烷基硫酸钠(SDS，sodiumdodecylsulfate)、1mM的EDTA中以65℃条件来进行杂交，在0.1x标准枸椽酸盐水(SSC，standardsalinecitrate)/0.1％的十二烷基硫酸钠中以68℃条件来进行清洗。并且，高苛刻条件意味着在6x标准枸椽酸盐水/0.05％的焦磷酸钠中以48℃条件来进行清洗。低苛刻条件意味着例如，在0.2x标准枸椽酸盐水/0.1％的十二烷基硫酸钠中以42℃条件来进行清洗。在上述微阵列中，上述捕获探针被用作杂交阵列因素(hybridizablearrayelement)且固定于底物(substrate)上。优选的底物作为适合的坚固性或者半-坚固性载体，例如，包括：薄膜、过滤器、芯片、载玻片、晶片、纤维、磁性微珠或者非磁性微珠、凝胶、管材、板、高分子、微小粒子及毛细管。上述捕获探针排列且固定于上述底物上。如上所述的固定化通过化学结合方法或者UV之类的共价键方法来执行。例如，上述捕获探针能够结合于玻璃表面，使得包含环氧化合物或者醛基，并且，能够在聚赖氨酸涂敷表面上通过UV进行结合。并且，上述杂交阵列因素能够通过连接子(例：乙二醇低聚物及二元胺)结合于底物。上述内容中，设备根据信号的种类而确定，且在杂交反应之后，检测通过杂交反应而产生的杂交信号，上述设备用于测量从具有结合于上述捕获探针的扩增产物的标记物质和变异相关核苷酸的单链核酸产生的信号。杂交信号能够以多种方法来实施，例如，根据结合于捕获探针的标记的种类。一方面，适用于本发明的微阵列的试样DNA能够进行标记(labeling)，并与微阵列上的捕获探针进行杂交。杂交条件具有多种方法。杂交程度的检测及分析根据标记物质多样地实施。结合于上述捕获探针的标记物质能够提供用于检测杂交与否的信号，且上述标记物质能够连接于寡核苷酸。虽然适合的标记包括荧光团(例如：荧光素(fluorescein)、藻红蛋白(phycoerythrin)、罗丹明、丽丝胺(lissamine)，并且Cy3和Cy5(法玛西亚(Pharmacia)))、发色团、化学发光团、磁性粒子、放射性同位素(P32及S35)、质量标记、电子密集粒子、酶(碱性磷酸酶或者辣根过氧化物酶)、辅因子、对酶的基质、重金属(例如，金)，并且，如抗体、链霉亲和素、生物素、异羟基洋地黄毒甙元和螯合基具有特定结合伙伴的半抗原，但并不限定于上述物质。标记能够通过本领域通常实施的多种方法来执行，例如，切口平移(nicktranslation)方法、随机引发方法(MultiprimeDNAlabellingsystemsbooklet，“Amersham”(1989))及连环方法(Maxam&Gilbert，1989，MethodsinEnzymology，65：499)。标记提供根据荧光、放射性、发色测定、重量测定、X-线衍射或者吸收、磁性、酶活性、质谱分析、结合亲和度、杂交高频、纳米晶体而进行检测的信号。上述内容中，上述微阵列的制备方法通过该
技术领域：
公开的任意适合的方法来合成及制备的。并且，微阵列制备设备能够通过商业供应商来便利地使用。能够利用现有公开的多种方法(M.schena，1999，DNAmicroarray；apracticalapproach，Oxford)来使捕捉探针有规律地制备核酸芯片。本发明提供利用寡核苷酸的生物分子的分析方法及装置，其特征在于，上述标记物质使用选自生物素(Biotin)、Cy2、绿色荧光蛋白、YO-PRO-1、YOYO-1、钙黄绿素、异硫氰酸荧光素、FlourX、ALEXA488、罗丹明110、ABI5-FAM、俄勒冈绿500、俄勒冈绿488、RiboGreen、罗丹明绿、罗丹明123、镁绿、钙绿、TO-PRO-1、TOTO-1、ABIJOE、氟硼二吡咯530/550、Dil、氟硼二吡咯TMR、氟硼二吡咯558/568、氟硼二吡咯564/570、Alexa546、四甲基异硫氰酸罗丹明、镁橙、藻红蛋白R&B、罗丹明标记鬼笔环肽、钙橙、派洛宁Y、罗丹明B、ABITAMRA、玫瑰红、Cy3.5、ABIROX、钙红、Alexa594、德克萨斯红、尼罗红、YO-PRO-3、YOYO-3、红藻蓝素、C-藻蓝素、TOPRO-3、TOTO-3、DiDDilC(5)、氧杂羰花青(Thiadicarbocyainie)、Cy5.5、Cy5或者Cy3的荧光染料。本发明提供利用寡核苷酸的生物分子的分析方法及装置，其特征在于，在固着上述捕获探针的底物使上述标记的扩增产物发生杂交反应来分析信号的方法包括：制备上述捕获探针已点样(spotting)的芯片(chip)的步骤；使上述靶探针与固定于芯片表面的探针之间发生杂交(hybridization)反应并进行清洗(washing)的步骤；利用对荧光染料特异性的波长的激光(laser)来扫描(scanning)芯片，并根据杂交反应结果来测定荧光强度，从而同时分析靶核酸量以及变异的步骤。本发明提供用于分析生物试样包含的受体及核酸的生物学意义的利用寡核苷酸来分析生物试样包含的受体及核酸的试剂盒。本发明提供利用寡核苷酸的生物分子的分析装置，其特征在于，生物分子分析系统通过利用寡核苷酸的生物分子分析方法来执行，并包括：试样处理装置，从包含上述生物分子的试样中准备上述受体及核酸，扩增装置，由制备上述靶核酸并扩增其上述靶核酸的模块以及分析上述所扩增的产物的模块构成。为了更有效地测定本发明的生物分子分析方法，对于包括从包含生物分子的试样中分离适配体受体和核酸的试样处理装置，以及由制备上述靶核酸并扩增上述靶核酸的模块以及分析上述所扩增的产物的模块构成的扩增装置的利用寡核苷酸的生物分子的分析装置，本发明的系统能够由试样处理装置以及扩增装置构成，并组合这些来运行，上述试样处理装置由混合腔室、溶解腔室及反应腔室构成。认为含有感兴趣对象的生物分子的样品的分析伴随着一系列的样品准备的步骤，且在由混合腔室和溶解腔室构成的试样处理装置中执行。在这些步骤能够包括过滤、细胞溶解、RNA、DNA及受体的纯化、受体-分析配体复合物的制备以及与试剂的混合。为了对生物分子分析结果有把握，进而对样品准备过程的污染的控制非常有用。为了核酸扩增反应而调配样品，并提供验证样品调配的有效性的方法。认为样品含有选自由细胞、孢子、微生物及病毒组成的组中的靶实体，且这个靶实体包含至少一个靶生物分子。上述方法包括向具备用于混合样品与样品调配对照组的混合腔室的装置内引入样品的步骤。样品调配对照组选自由细胞、孢子、微生物及病毒组成的组中，这些样品调配对照组包含质量控制物质。上述装置还具备溶解腔室和反应腔室。样品在混合腔室中与样品调配对照组进行混合。上述方法还包括：在溶解腔室中溶解处理样品调配对照组及样品内存在的情况下的靶实体来纯化生物分子的步骤；形成受体-分析配体复合物的步骤；在反应腔室内将在溶解腔室内游离的RNA、DNA及受体-分析配体复合物在核酸扩增条件下暴露的步骤；以及，检测至少一个质量控制物质的存在与否的步骤。质量控制物质的肯定的检测表示对样品调配过程满足，相反，若无法检测质量控制物质，则表示不适当地制备了样品。本发明提供为了核酸扩增反应而调配样品，并验证上述样品调配的有效性的扩增装置。认为样品包含选自由细胞、孢子、微生物及病毒组成的组中的靶实体，上述靶实体含有至少一个靶生物分子。上述装置包括具有第1腔室的本体，上述第1腔室能够收容将要与样品混合的样品调配对照组。样品调配对照组选自由细胞、孢子、微生物及病毒组成的组中，这些样品调配对照组包含质量控制物质。上述本体还包括溶解腔室，上述溶解腔室用于溶解处理存在于样品内的情况下的靶实体及样品调配对照组，从中游离生物分子并分离RNA、DNA和受体。上述本体还包括使所游离的适配体受体和适配体发生反应来形成受体-适配体复合物的分析配体反应腔室。上述本体还包括为了扩增及检测而维持核酸的反应腔室。上述装置还包括至少一个流量控制器，上述至少一个流量控制器引导与样品调配对照组混合的样品，使得上述样品从第1腔室流到溶解腔室内，且使在溶解腔室中游离的生物分子流到反应腔室内。在各别实施例中，当样品通过溶解腔室进行流动时，溶解腔室收容捕获存在于样品内的情况下的靶实体及样品调配对照组的酶，至少一个过滤器以及固体物质，且上述装置还包括至少一个收容通过溶解腔室流动且已使用的样品流体的废弃腔室，且上述至少一个流量控制器还能够引导通过溶解腔室流动且已使用的样品流体，以便上述样品流体流到废弃腔室。在各别实施例中，上述装置还包括超声波变换器，上述超声波变换器为了给溶解腔室提供超声波，结合于溶解腔室的壁面。在各别实施例中，上述装置还包括微珠，上述微珠为了破裂样品调配对照组及靶实体，位于溶解腔室内。本发明的又一实施方式中，本发明提供决定溶解过程的有效性的方法。这个方法包括将包含选自由细胞、孢子、微生物及病毒组成的组中的靶实体的样品与样品调配对照组进行混合的步骤。靶实体包含至少一个质量控制物质。样品调配对照组选自由细胞、孢子、微生物及病毒组成的组中，该样品调配对照组包含质量控制物质。使样品调配对照组和存在于样品内的情况下的靶实体的混合物进行溶解处理。上述方法还包括检测质量控制物质的存在与否的步骤，使得决定溶解处理当中生物分子是否从样品调配对照组中游离。质量控制物质的肯定的检测表示对样品制备过程满足，相反，若无法检测质量控制物质，则表示不适当地制备了样品。在各别实施例中，上述方法在溶解处理之前，包括如下步骤：为了利用固体物质捕获样品调配对照组及存在于样品内的情况下的靶实体，与样品调配对照组混合的样品通过收容固体物质的腔室而流动的步骤。在各别实施例中，在混合样品和样品调配对照组之前，样品能够进行预过滤。在各别实施例中，溶解处理包括将样品调配对照组及靶实体在超声波能量之下暴露的步骤。在各别实施例中，为了破裂样品调配对照组及靶实体，溶解处理还包括搅拌微珠的步骤。在各别实施例中，样品调配对照组为孢子。在各别实施例中，混合步骤还包括分析含有样品调配对照组的干燥微珠的步骤。在各别实施例中，溶解处理包括与化学溶解剂相接触的步骤。在各别实施例中，标记核酸序列扩增标记核酸序列(例如，利用PCB)，并检测所扩增的标记核酸序列，进而执行检测。在各别实施例中，标记核酸序列决定从能够结合于标记核酸序列的探针的信号是否超过阈值，进而执行检测。扩增装置的反应容器的反应腔室内的反应混合物在核酸扩增条件下暴露。利用反应的RNA或者DNA模板的扩增已被公知(美国专利第4，683，195号；美国专利第4，683，202号；PCRProtocols：AGuidetoMethodsandApplications(Inniset.al.，，1990))。DNA的核酸扩增使DNA发生热变性，并在与将要扩增的DNA片段一侧相接的序列退火2个寡核苷酸引物，且伴随着循环反复，上述循环反复由利用DNA聚合酶使所退火的引物发生延伸而实现。引物交配于靶序列的相对的链(strand)的同时，被定向成使根据聚合酶的DNA合成经过引物之间的区域来执行，进而将DNA片段的量有效地提高了2倍。并且，扩张产物具有补充性且能够结合引物，因此各个连续的循环将在前一个循环中所合成的DNA的量实质地提高了2倍。其以每个循环2n(这里n为循环数)的比率带来特定靶片段的指数积累。如扩增反应及连接酶链式反应(LCR，ligasechainreaction)的方法可使用从mRNA、互补脱氧核糖核酸(cDNA，complementarydeoxyribonucleicacid)、基因组文库或者互补脱氧核糖核酸文库中直接使靶DNA序列的核酸序列用于扩增中。等温扩增反应已被公知，且能够根据本发明的方法来使用。核酸扩增反应优选地能够使用使反应容器内的反应混合物以扩增反应中所需的温度进行加热和/或冷却的热处理装置来执行。上述热处理装置还包括一个以上的检测机构，上述检测机构用于检测样品调配对照组的标记核酸序列及样品中用于测试的一个以上的靶核酸序列。可使用内置有用于扩增及检测反应容器内的核酸序列的光学检测仪的合适的热处理装置(美国专利第6，369，893号；美国专利第6，391，541号)。并且，为了控制反应混合物的温度，并在上述反应混合物中检测核酸序列，已有适合于本发明的许多其他公知的方法。并且，优选地，使用探针来检测样品调配对照组的质量控制物质及样品中用于测试的一个以上的质量控制物质。反应容器优选地具备一个以上的透明或者透光性壁面，上述壁面使能够通过光学检测的探针的信号通过。优选地，捕获探针能够使用于检测及定量化核酸序列。使用核酸捕获探针的分析法存在许多种。这些捕获探针中一部分在与其他分子或者一部分(moiety)的相互作用中根据变化而生成具有荧光源的荧光发光中的变化的信号。作为用于扩增产物的检测的其他优选的方法，荧光探针由根据全部的荧光报道染料(fluorescentreporterdye)而标记化的寡核苷酸组成。捕获探针的分裂产生报道染料的荧光强度的增加。为了在样品内确认靶生物分子的检测或者靶生物分子的缺乏，需要控制样品调配的污染。这就是样品调配对照组需要接受与样品内的靶实体(例如，含有生物分子的靶细胞、孢子、病毒或者微生物)同样的处理的理由。若检测出样品调配对照组的质量控制物质，则视为满足的样品调配。若不能够检测质量控制物质的存在，则视为不适当的样品调配，且对于靶核酸序列的测试结果视为“未定”。优选地，在质量控制物质的存在与否为从能够结合于靶探针的捕获探针的信号检测阈值，例如，将分析法看作有效需要满足或者超过的预先设定的荧光发光的阈值。流体控制装置能够根据需要的协议由电脑来控制。若使用单个阀块，则仅仅因为一个失败要素而能够产生高制备收率。流体控制及处理结构部件的组合能够获得紧凑的装置(例如，小型整块式)，使成形及组装的自动化容易进行。如前所述，这些系统能够有利地包括稀释及混合能力、中间清洗能力及强力的加压能力。系统内的流体路径通常被关闭，以最小化系统内的流体的污染并容易地进行这些流体的收容及控制。反应容器能够便利地分离及更换，且能够在各别实施例中废弃。本发明提供用于分析包含于生物试样的适配体的受体及核酸的生物学意义的利用寡核苷酸来分析生物试样中的适配体的受体及核酸的核酸芯片。本发明提供生物分子的分析方法及装置，其特征在于，用于利用上述生物分子信息数据的生物学意义分析的结构包括：接收所输入的患者组的上述生物分子信息和对照组的上述生物分子信息数据，并构建数据库的模块；利用所输入的上述信息数据，在分析系统中执行预处理的模块；借助上述预处理的结果来生成患者模型的模块；加载所生成的上述模型并适用在入院的患者来执行盲测(Blindtest)诊断的模块；以及，通过交叉验证来评价系统功能的模块。本发明中，虽然利用上述生物分子信息数据的生物学意义预测系统作为示例性的诊断，但不限定于上述诊断。通过本发明生成的许多生物分子信息数据能够利用具有高层次特征的庞大数量的信息来生成与细胞、组织或者疾病有关的多种信息。在利用所输入的上述数据在分析系统中执行预处理的模块中，为了找出对患者状态产生影响的特征并提高分类性能的多变量分析方法正确地治疗和诊断而找出重要变数来缩小层次，或者通过特性的变形来找出主要特质的特征选择(FeatureSelection)程序。特征提取根据具体地是否将类别信息使用于学习而存在无监督学习(UnsupervisedLearning)方式或者监督学习(SupervisedLearning)方式。无监督学习方式中主要使用的主成分分析(PCA，PrincipalComponentAnalysis)或者独立成分分析(ICA，IndependentComponentAnalysis)能够考虑变数的特性来提取特质。监督方式为利用类别信息和变数之间的统计上显著性或者变数之间的相互关系来选择变数的方式。这个方式能够在规定的特质集合中向前(Forward)或者向后(Backward)依次添加或者删除特质的同时，通过适用于分类器的功能来计算出主要特质。根据上述预处理的结果而执行学习来生成患者模型的模块为将所选择的特质通过适合的分类器(Classifier)按各类别进行分类的程序。本发明使用了人工神经网络(ArtificialNeuralNetwork)，但因为根据输入和输出来决定动作的特性，而应用在模式识别、函数逼近、分类技术等各种领域。人工神经网络的结构由多个层(layer)、节点(nodes)、神经网络之间连接加权值构成。本发明使用的神经网络层之间连接方式为前馈(Feed-forward)方式。根据输入模式利用对各节点的神经网络连接加权值和激活函数来计算出输出值。当通过所生成的结合信息来处理一件事时，推定的值和实际结果值不同的情况下，将所计算出的值与实际结果值进行比较的同时，反复执行较少误差的过程来找出的方式。本发明提供生物分子的分析方法及装置，其特征在于，生成上述患者模型的方法选自由线性模型(linearmodels)、支持向量机(supportvectormachines)、神经网络(neuralnetworks)、分类回归树(classificationandregressiontrees)、集成学习法(ensemblelearningmethods)、判别分析(discriminantanalysis)、最邻近法(nearestneighbormethod)、贝叶斯网络(Bayesiannetworks)、独立成分分析(independentcomponentsanalysis)组成的组中。对于准确而综合的原理(Mechanism)没有被证明的大多数疾病可以说基于事例的诊断的重要性非常大。但是，局限于特定机器学习技术而发明的现有事例基础机器学习推理系统由于准确度低，因此持续地要求已改善的系统的开发。并且，现有的系统只开发成利用所有已学习的临床检查项目的疾病鉴别器，且没有提供能够使用各疾病的临床检查项目的重要度或者优先顺序。本发明涉及一种利用用于支援医生的准确的疾病诊断的事例基础机器学习推理的疾病诊断及检查项目选定系统，且涉及一种根据患者的事例数据库(Database)通过作为由已训练的人工神经网络(NeuralNetwork)构成的机器学习机的疾病鉴别器，分析新患者的检查信息来判别疾病，为了根据预防诊断的各疾病的最终判别而选择最少的重要检查项目来提供的系统。通过机器学习推理的疾病诊断技术各别地适用于机器学习技术而构成。生成上述患者的模型的方法存在线性模型(linearmodels)、支持向量机(supportvectormachines)、神经网络(neuralnetworks)、分类回归树(classificationandregressiontrees)、集成学习法(ensemblelearningmethods)、判别分析(discriminantanalysis)、最邻近法(nearestneighbormethod)、贝叶斯网络(Bayesiannetworks)、独立成分分析(independentcomponentsanalysis)等。在本系统的结构及实务中的应用可分成2种结构，只为诊断的独立(standalone)形态的诊断系统和现有医院信息系统，即，能够与由医嘱传输系统(OCS，OrderCommunicationSyste)、医学影像归档与通信系统(PACS，PictureArchivingandCommunicationSystems)、实验室信息系统(LIS，LaboratoryInformationManagementSystem)等相连接的组合的系统结构。为了与组合的系统相连动需要依据健康信息交换第七层协议(HL7，HealthLevelSeven)及医疗数字影像传输协议(DICOM，DigitalImagingandCommunicationsinMedicine)的规章来构建系统。本系统作为初期模型与病人监护系统(PMS，PatientMonitoringSystem)相连动，进而提高了诊断的准确度。并且，不仅是病人监护系统，而且还开发成与医嘱传输系统、电子病历(EMR，ElectronicMedicalRecord)、医学影像归档与通信系统等多种医疗信息系统相连动的系统，进而能够开发成包含有多种疾病因子且更准确的诊断系统。本发明提供利用寡核苷酸的生物分子的分析方法及装置，其特征在于，上述生物试样选自由细菌、真菌类、病毒、细胞株、组织组成的组中的一种以上。有益效果本发明提供一种方法，利用寡核苷酸来分析生物分子，进而能够在生物试样中确认生物分子的生物学意义，且能够通过荧光学以较高的灵敏度来进行检测。尤其，能够通过一次检查来分析多种生物分子，进而在生物试样中有效地决定表现型的变化、对疾病的敏感性而且对治疗药剂的反应的差异等个人之间的差异。附图说明图1为从生物试样中分离核酸及蛋白质后，从包含蛋白质和分析配体发生反应而制备的蛋白质-分析配体复合物及核酸中分离的RNA以及DNA等的靶核酸的核酸中制备所要分析的靶核酸DNA，通过与靶核酸的特定区域完整地互补结合的寡核苷酸来分析生物分子，并分析生物学意义的整体流程图。图2为从生物试样中分离的受体和分析配体复合物。图3为将从生物试样中分离的RNA进行反转录后，将互补脱氧核糖核酸作为对象进行RNA定量分析的图。图4为通过与从生物试样中分离的靶核酸的特定区域完整地互补结合的寡核苷酸来进行靶核酸变异分析的整体流程图。图5为进行从生物试样中分离的靶核酸甲基化有无分析的整体流程图。图6为通过分析使具有标记物质的靶探针与阵列上的捕获探针进行杂交而产生的信号来分析生物分子的相关图。图7为在阵列上与白介素17(IL17，interleukin17)及白介素17受体A(IL17RA)相应的适配体、mRNA、DNA变异以及与甲基化有无相应的捕获探针的配置图。图8为为了分析与白介素17及白介素17受体A相应的蛋白质、mRNA、DNA变异及甲基化有无，利用寡核苷酸来制备部分双链核酸以及完整的双链核酸后，将它们当做模板并利用信号引物发生PCR，进行标记及扩增而获得的靶探针与固着于阵列的上述捕获探针进行杂交来形成的图像。具体实施方式以下，参照附图和实施例详细说明本发明的基准物质及核酸芯片的制备方法，以及由利用它们的两个或者两个以上的生物分子组成的生物试样中存在的生物分子的分析方法。以下的具体例只是示例性地说明本发明，并不限定本发明的范围。本发明中使用的特定生物分子为白介素17(IL17，interleukin17)及白介素17受体A(IL17RA，Interleukin17receptorA)，且利用阵列通过一次检查来分析它们的蛋白质、mRNA及DNA变异。白介素17作为CD4+T细胞的Th17细胞生产的细胞因子，例如，具有以登录代码(Accessioncode)AAH67505或者NP002181表示的氨基酸序列的蛋白质。白介素17也被称作白介素17A或者细胞毒性T淋巴细胞抗原-8(CTLA-8，CytotoxicTlymphocytesantigen-8)。白介素17受体意味着结合有白介素17的细胞表面蛋白质。作为白介素17受体家族已公知的有IL-17RA、IL-17RB、IL-17RC、IL-17RD、IL-17RE。本发明的“白介素17介导炎症性疾病”包括呼吸道疾病、消化系统疾病、皮肤血管疾病或者代谢性疾病、骨关节病及脑神经疾病等，上述疾病不仅是通过Th17细胞产生，而且还通过从γ/δT细胞、NK细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等的免疫细胞或者炎性细胞中分泌的白介素17而产生或者恶化。具体地，上述呼吸道疾病包括鼻炎、鼻息肉、鼻窦炎、气喘、气管炎、慢性阻塞性肺疾患、支气管扩张症、细支气管炎、肺炎、纤维化肺、肺癌等，上述消化系统疾病包括口腔炎、食道炎、胃炎、胃溃疡、炎症性肠炎、过敏性大肠综合征、胆管炎、胰腺炎、口腔癌、食道癌、胃癌、大肠癌、胆道癌、胆囊癌、胰腺癌等。并且，上述血管或者代谢性疾病包括动脉硬化症、糖尿、痛风等，上述骨关节病包括类风湿性关节炎、骨关节炎、骨质疏松症等。上述脑神经疾病包括血管性痴呆、阿尔茨海默病、脑退行性疾病等。定量分析的蛋白质及RNA定量分析的对象为白介素17及白介素17受体A，且为能够从基因库(GenBank)数据系统(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中获得的白介素17及白介素17受体A基因的碱基序列信息(白介素17的登记号为NM_002190，以及，白介素17受体A的登记号：NM_014339)。DNA变异分析将白介素17及白介素17受体A的SNP当做对象，且对上述内容的信息搜集于http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp。核酸甲基化与否分析执行白介素17启动子-144位子(Thomas，R.M.，etal.，2012，JBiolChem.287(30):25049-59.)。(表1)靶核酸特定区域(H)的碱基序列(表2)捕获探针及捕获探针的互补碱基序列(指示配体的拉链码(zip-code)碱基序列)(表3)通用引物的碱基序列正向引物(5'→3')反向引物(5'→3')P1：5-ACTTCGTCAGTAACGGAC-3P3：5-GTCTGCCTATAGTGAGTC-3P2：5-GAGTCGAGGTCATATCGT-3实施例1.准备生物分子从由细胞或者细胞组成的组织试样中利用AllPrepDNA/RNA/ProteinMinikit(凯杰(Qiagen)公司，美国)来分离生物分子。本发明将人类的软骨组织(普诺生(Promocell)公司，德国)当做生物试样使用。利用制造商提供的缓冲液来溶解软骨组织后，将所溶解的试样处理在色谱柱后，通过离心分离使DNA结合于色谱柱膜，并获得过滤的溶液。存在于色谱柱膜的DNA分离为清洗具有DNA的色谱柱并从膜中提取DNA后，通过离心分离来获得DNA。将所获得的上述溶液在制造商提供的色谱柱中进行处理，并从过滤的溶液中进行沉淀及离心分离来获得蛋白质。并且，清洗存在于色谱柱中的DNA并提取DNA后，通过离心分离来获得。实施例2.分析配体的制备2-1.抗体及适配体分析配体为了在上述软骨组织中进行特定蛋白质的定量分析，购买了用于制备上述蛋白质-抗体分析配体复合物的白介素17(商品目录编号BAF317)及白介素17受体A(商品目录编号BAF177)生物素-抗体(安迪生物科技有限公司(R&DSystems).美国)。为了在上述软骨组织中进行特定蛋白质的定量分析，用于制备上述蛋白质-适配体复合物而使用的适配体作为与白介素17(韩国专利，第10-1276519-0000号)及白介素17受体A(Chen，L.，etal.，2011，OsteoarthritisandCartilage19；711～718)特异性地结合的单链核酸，碱基序列提出在(表4)。有机合成白介素17及白介素17受体A生物素-适配体来进行准备(百奥尼(Bioneer)公司.韩国)。(表4)白介素17及白介素17受体A适配体的碱基序列为了蛋白质定量分析的分析配体的生物素-寡核苷酸的结构由以下的通式(I)来表示。5’-生物素-P1-T-P3-3’(I)上述通式(I)中，P1为与具有检测信号的正向引物互补结合的区域，T作为与捕获探针互补结合的区域，为了识别配体所结合的靶蛋白质或相关的单链核酸而使用，且能够设计成适用于在杂交反应中使用的探针。P3为在信号引物对中与反向引物互补结合的区域。通过抗生物素蛋白(avidin)使所准备的上述生物素-抗体及生物素-适配体与生物素-寡核苷酸相连接，来制备结构体，且将前者称为抗体分析配体或者将后者称为适配体分析配体。2-2.上游及下游寡核苷酸2-2-1.核酸定量分析本发明的特征在于，用于核酸定量分析的上述上游寡核苷酸的结构由以下的通式(II)来表示：5’-P1-H-3’(II)上述通式(II)中，P1为与具有检测信号的正向引物互补结合的区域，H为与杂交的靶核酸互补杂交的序列区域。本发明的特征在于，上述下游寡核苷酸的结构由以下的通式(III)来表示：5’-H-T-P3-3’(III)上述通式(III)中，H为在上述靶核酸中从使上述上游寡核苷酸的3'末端结合的位置的下游序列进行互补结合的区域，T作为与捕获探针互补结合的区域，为了识别靶核酸或相关的单链核酸而使用，且能够被设计成适应于在杂交反应中使用的探针。P3为在信号引物对中与反向引物互补结合的区域。上述通式(II)和通式(III)的H是由β-actin、IL17及IL17RmRNA等的特异性碱基序列构成，如(表1)所示，而T如(表2)所示，P1和P3如(表3)所示，参阅上述序列对用于核酸变异分析的上、下游寡核苷酸进行了有机合成(百奥尼(Bioneer)公司，韩国)2-2-2.核酸变异分析为了靶核酸变异分析，上述上游寡核苷酸的结构由以下的通式(IV)来表示。5’-P1-H-V-3’(IV)上述通式(IV)中，P1为具有检测信号的正向引物互补结合的区域，H为具有与靶核酸互补杂交的序列的区域，V为与编译序列互补杂交的变异序列的特异区域。上述寡核苷酸可由2个或者2个以上构成。上述下游寡核苷酸的结构由以下的通式(V)来表示。5’-H-T-P2-3’(V)上述通式(V)中，H为在靶核酸的变异特异区域下游与靶核酸互补杂交的序列区域，T作为与捕获探针互补结合的区域，用于识别具有变异的靶核酸或相关的单链核酸而使用，且能够被设计成适用于在杂交反应中使用的探针。P2为在信号引物对中与反向引物完整地互补结合的区域。上述通式(IV)和通式(V)的H中的IL17的SNP、IL17R的SNP及白介素17等如(表1)所示，T如(表2)所示，P如(表3)所示，参阅上述序列对用于核酸变异分析的上、下游寡核苷酸进行了有机合成(百奥尼(Bioneer)公司，韩国)。实施例3.质量控制单链核酸的制备基准物质由从http://genomics.msu.edu/plant_specific/中确保的A、B、C、D及E等5个种类植物特异蛋白质组成(参照表5)。(表5)植物特异蛋白质选定的5个植物特异蛋白质利用大肠杆菌表达系统来表达相应的蛋白质后，分离所表达的蛋白质并通过标准指数式富集的配体系统进化(SELEX，SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment)方法(Ellington，A.D.andJ.W.Szostak.1990.InvitroselectionofRNAmoleculesthatbindspecificligands.Nature346:818-822；Gold，L.，P.Allen，J.Binkley，D.Brown，D.Schneider，S.R.Eddy，C.Tuerk，L.Green，S.Macdougal，andD.Tasset.1993.RNA：theshapeofthingstocome，pp.497-510.In：R.F.GestelendandJ.F.Atkins(eds.).TheRNAWorld，ColdSpringHarborPress，ColdSpringHarbor，N.Y.)来确保结合于基准物质的单链核酸。将上述单链核酸命名为质量控制单链核酸，且利用它们的碱基序列来制备了与质量控制单链核酸相应的生物素-质量控制单链核酸，以及利用(实施例2)的通式1制备了生物素-寡核苷酸。使生物素-质量控制单链核酸通过抗生物素蛋白连接生物素-寡核苷酸来制备的结构体称作质量控制配体。实施例4.核算试样的准备4-1.蛋白质4-1-1.抗体分析配体将装有从所准备的上述软骨组织中分离的100μl的蛋白质溶液的微量测试孔板(microtiterwell)在4℃温度下搁置一夜或者在37℃温度下将0.05M碳酸酯缓冲溶液(pH9.6)涂敷了2小时。在100μl的生物素-抗体(10μg/ml)中添加抗生物素蛋白(7.2μg/ml)的状态下，在腔室内放置30分钟后，添加上述生物素-寡核苷酸来制备抗体-抗生物素蛋白-寡核苷酸结构体，且将其称作抗体分析配体。将这些孔板在磷酸盐缓冲生理盐水中利用3％的脱脂奶粉、0.1mM的乙二胺四乙酸、0.02％的叠氮化钠进行嵌段(180μl/孔)，利用磷酸盐缓冲生理盐水-吐温(tween)20清洗2次后，添加100μl的抗体分析配体(10μg/ml)并在37℃温度下培养2小时。将这些孔板利用吐温-磷酸盐缓冲生理盐水在5分钟内清洗5次后，为了除去非特异性结合的生物素-寡核苷酸利用蒸馏水在5分钟内清洗了4次。将各孔板中的内容物即蛋白质-抗体分析配体复合物转移到500μl的微量离心(Eppendorf)管中保管，并将其当作用于蛋白质定量分析的核酸试样来使用。4-1-2.适配体分析配体在上述所准备的生物素-白介素17适配体(10/)100及生物素-白介素17受体A适配体(10/)100中各添加抗生物素蛋白(7.2/)的状态下，在腔室内放置30分钟，添加上述准备的生物素-寡核苷酸(10/)来制备适配体-抗生物素蛋白-寡核苷酸结构体，且将其称作适配体分析配体。将从所准备的上述软骨组织中分离的蛋白质溶液处理并固定在硝化纤维(nitrocellulose)盘后，在SELEX缓冲液中将附着有上述蛋白质的盘和白介素17及白介素17受体A适配体分析配体进行30分钟的处理，来形成了蛋白质-适配体分析配体复合物，并执行清洗而去除非特异性结合的适配体，来准备纯化的蛋白质-适配体分析配体复合物，且为了蛋白质的定量分析将其用作核酸试样。4-2.核糖核酸为了特定核糖核酸的定量分析及变异分析，将从软骨组织中纯化的总10ng的RNA、dT20引物(百奥尼(Bioneer)株式会社，100pmoles/20μl反应液)、MMLV反转录酶(百奥尼(Bioneer)株式会社，200U/20μl反应液)、2μl的10x反应缓冲溶液、RNasin(普洛麦格公司(Promega)，15U/20μl反应液)及三甲铵乙内酯(西格玛(Sigma)公司，500mM/20μl反应液)进行混合来制备反转录反应液。利用所制备的反转录反应液，在作为现有的单一温度条件的42℃及52℃温度下，进行10分钟、20分钟、40分钟、60分钟的反应和在37℃温度下将2分钟作为一周期、在50℃温度下将3分钟作为一周期，通过2次、4次、8次、12次循环反应，在37℃温度下将1分钟、在47℃温度下将3分钟、在55℃温度下将1分钟作为一周期通过2次、4次、8次、12次循环反应来执行反转录反应。将所生成的cDNA当作核酸试样来使用。4-3.脱氧核糖核酸变异为了在上述软骨组织中分析特定脱氧核糖核酸的甲基化有无而利用试剂盒，从软骨组织中提取基因组DNA，并利用纳米微滴(NanoDrop)来测定上述基因组DNA的浓度，将其当作用于DNA变异分析的核酸试样来使用。4-4.甲基化为了在上述软骨组织中分析特定DNA的甲基化有无而使用试剂盒，从软骨组织中提取基因组DNA，并利用纳米微滴来测定上述基因组DNA的浓度。之后，将提取的约1～2μg左右的DNA与0.5N浓度的氢氧化钠进行混合在16℃，并使其在37℃温度下发生15分钟反应，来使DNA变形成单链形态。之后，添加3.5M浓度的硫酸氢钠(Sodiumbisulfate)和0.01M浓度的对苯二酚(Hydroquinone)试剂，并在56℃温度下发生16小时化学反应。之后，执行利用乙醇的沉淀反应，并只浓缩变换的DNA来进行纯度分离，利用50℃的去离子水进行溶解后，添加氢氧化钠使其变成0.1M浓度，并在常温下发生15分钟反应，进而执行胞核嘧啶的脱硫反应，并再一次通过乙醇沉淀反应来进行浓缩，最终在30℃的去离子水中进行溶解并在20℃下保管，且使用于分析甲基化有无的核酸试样。实施例5.扩增用核酸试样的制备在利用上述软骨组织制备并包含靶核酸的RNA的核酸试样、基因组DNA的核酸试样、及蛋白质-分析配体复合物等中，按照如下所述的方式制备各个扩增用核酸试样进行混合，并作为扩增反应中所使用的反应溶液使用。将在(实施例4)中为了蛋白质定量分析而获得的连接有寡核苷酸的蛋白质-分析配体复合物直接作为扩增用核酸试样使用。将在(实施例4)中为了RNA定量分析而分离的RNA发生反转录反应而变换维cDNA的核酸试样、、为了DNA变异分析而被分离的基因组DNA的核算试样、以及为了甲基化有无分析而反映基因组DNA的甲基化信息的发生碱基序列变化的用于甲基化有无分析的核酸试样，通过如下所述的方式制备了扩增用核算试样。使上述核酸试样的混合物和上述上、下游寡核苷酸发生杂交反应来制备部分双链核酸，接着，执行将部分双链核酸变换成完整的双链核酸的连接反应来制备上述靶核酸DNA。接下来，在反应溶液中使用PCR设备，并在95℃温度下进行5分钟的变性后，执行10次如下的步骤：在95℃温度下进行1分钟、在70℃温度下进行1分钟、在68℃温度下进行1分钟、在66℃温度下进行1分钟，并且，在64℃温度下进行3分钟的循环。10-ml的反应溶液由20mM的三羟甲基氨基甲烷(TrisHCl，TrisHydroxyMethylAminomethan)(pH7.6)、25mM的乙酸钠(sodiumacetate)、10mM的乙酸镁(magnesiumacetate)、1mM的二硫苏糖醇(dithiothreitol)、1mM的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+，Nicotinamideadeninedinucleotide)、0.1％的聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)、在实施例2中所准备的上游寡核苷酸和下游寡核苷酸(每个500pM)、1单位(unit)的水生栖热菌(Taq，(Thermusaquaticus)DNA连接酶(ligase)(纽英伦生物技术股份有限公司(NewEnglandBiolabs)，马萨诸塞州(MA)，美国(USA))、上述内容中所准备的100μg的核酸试样混合物组成。实施例6.扩增反应扩增反应在如下的反应溶液中利用PCR设备，并在95℃温度下进行3分钟的变性后，执行42次如下的循环：在95℃温度下进行10秒、在56℃温度下进行10秒，以及在72℃温度下进行20秒。上述25-ml的反应溶液由10mM的三羟甲基氨基甲烷(pH8.6)、50mM的氯化钾(KCl)、2.5mM的氯化镁(MgCl2)、5％(V/V)的甘油(glycerin)、1U的TaqDNA聚合酶(polymerase)、1皮摩尔(pmol)的正向信号引物(野生型靶核酸分析时仅使用P1，变异把核算分析时使用P1和P2)、20皮摩尔的反向信号引物(P3)及2毫升(ml)的实施例3的反应溶液等组成。为了野生型靶核酸分析的引物，由与分析配体或上游寡核苷酸的P1区域互不结合并生成检测信号的Cy3标记物质与所标记的正向引物以及P3区域互补结合的反向引物组成。在用于变异靶核酸分析的引物中，正向引物由2个或2个以上的与标记为用于对非变异靶核酸进行扩增的Cy3的P1区域互补结合的正向引物以及与标记为Cy5的P2区域互补结合的正向引物组成，而上述反向引物由P3区域通用的引物组成。这些PCR引物的碱基序列如(表2)所示。实施例7.阵列的制备上述捕获探针为了识别靶核酸，提出了具有与靶核酸相应的碱基序列的低聚物(表3)，并根据图4将通过有机合成(百奥尼(Bioneer)公司)而制备的捕获探针固定在阵列中。当设计上述下游寡核苷酸时，使得(表3)中的捕获探针指示与(表4)中的下游寡核苷酸完整地互补结合的靶核酸的特定区域。若具体地观察，使得(表1)的1号种类捕获探针指示与(表2)的顺序号1的β-actinmRNA的下游寡核苷酸完整地互补结合的区域，使得作为(表1)的3号种类捕获探针指示与(表2)的顺序号3的白介素17mRNA的下游寡核苷酸完整地互补结合的区域。利用作为涂敷有γ-氨基丙基硅烷(GAPS，GammaAminoPropylSilane)的载玻片的UltraGAPSTM包被玻片(CoatedSlide)(康宁公司(Corning))来制备以规定规则固着有捕捉单链核酸的核酸芯片。核酸芯片的制备使用作为针式(pin)方法的微陈列系统(Microarrayersystem，跟拍(GenPak)公司)，点距(spotspacing)使中心距(center-to-center)成为150um。将各个捕捉单链核酸溶解在标准溶液来调节浓度。此时，微阵列内的湿度维持在70％，并执行点样(spotting)。将所点样的载玻片在加湿腔室(humidifiedchamber)中放置24～48小时后，在紫外线链结箱(UVcrosslinker)中执行烘烤(baking)过程。通过被广泛公知的方法，将捕捉单链核酸固定在载玻片后，对载玻片立即进行离心分离来进行干燥后，在光线屏蔽的情况下进行保管。上述阵列的制备方法中的底物为由玻璃制备的载玻片。此时，底物可使用由胺基或者醛基等涂敷的载玻片。例如，利用作为涂敷有γ-氨基丙基硅烷(GAPS，GammaAminoPropylSilane)的载玻片的UltraGAPSTM包被玻片(康宁公司)来制备使上述捕获探针以规定规则排列并固着的阵列。上述微阵列的制备可使用微阵列系统(Microarrayersystem)，将各个捕获探针溶解在缓冲液中来调节浓度，此时，将微阵列内的湿度维持在70％至80％来执行点样(spotting)。将所点样的载玻片放置在加湿腔室后，在紫外线链结箱中执行烘烤过程。如上述本发明的微阵列中，通过被广泛公知的方法，将捕捉单链核酸固定在载玻片后，对载玻片立即进行离心分离来进行干燥后，到使用前，以光线屏蔽的状态进行保管。实施例8.微阵列杂交及分析将包含上述(表1)中的靶核酸的特定区域的碱基序列和与捕获探针完整地互补结合的区域的靶探针处理在本发明的微阵列的捕获探针，并在60℃温度下杂交4～12小时，在42℃温度下利用0.1x标准枸椽酸盐水溶液进行清洗。此时，杂交溶液包含1M的氯化钠、0.3M的柠檬酸钠(sodiumcitrate)、0.5％的十二烷基硫酸钠或者100/鲑鱼精DNA、0.2％的牛血清白蛋白或者单链核酸。执行杂交(Hybridization)后，将微阵列利用清洗溶液进行清洗。此时，清洗溶液的组合如下：例如，1X标准枸椽酸盐水+0.2％十二烷基硫酸钠、1X标准枸椽酸盐水+0.2％十二烷基硫酸钠、0.5X标准枸椽酸盐水+0.2％十二烷基硫酸钠、0.01X标准枸椽酸盐水+0.2％十二烷基硫酸钠顺序的步骤，且每个步骤在42℃温度下执行30分钟。实施例9.核酸芯片的点探索及分析完成上述实施例6的清洗后，将载玻片通过离心分离进行干燥后，利用具有适当波长激光(Cy5，635nm)的激光扫描仪(laserscanner，GenePix4000，奥松(Axon)公司)来进行探索，上述激光用于激发(excitation)所使用的荧光染料。荧光图像以多图像标记图像文件(TIFF，multi-imageTagedimagefile)形式进行存储后，通过适当的图像分析(imageanalysis)软件(GenePixPro3.0，Axon公司)来进行分析。每个点(spot)信号强度(signalintensity，单位：quanta)使用减去周围背景的基本信号的信号，此时，背景信号是指由特定点的周围中的4个点的周边信号构成的局部背景(localbackground)。当点具有的像素(pixel)的90％以上示出超过背景信号+2标准偏差(S.D.，standarddeviation)的信号强度时，包括数据分析，若不满足上述条件，则分类成不包括数据的点(badspot)，通常不包含分析。根据标记效率(Labelingefficient)的偏差(variation)利用内标准(IS，internalstandard)的信号来进行平准化(举例来说，归一化强度(NormalizedIntensity)＝探针强度(ProbeIntensity)/内部标准强度(ISintensity))，单标记(monolabeling)的情况下，通过Cy5信道的信号强度(signalintensity)来记录其结果，当点样(spotting)为2倍以上的情况下使用平均值。在靶单链核酸的信号强度(S，signalintensity)中，对点具有的像素(pixel)测出各个信号强度后，使用它们的中值(median)(像素的中值(medianvalueofpixel-by-pixel))。信号强度利用内标准并根据标记效率来平准化偏差。S’(标准值(normalizedvalue))＝S(Cy5-参考值(reference))×(Cy5-内标准)。能够通过上述方法来查明像素密度的分析结果和实际试样量之间的关系，进而确认其相互关系。观察作为能够通过上述实验来获得的一例的图6，能够通过微阵列上的点荧光程度，在生物试样中进行蛋白质定量分析、mRNA定量分析、DNA变异分析及DNA甲基化有无分析等。图7是为了分析与白介素17及白介素17受体A相应的蛋白质、mRNA及DNA变异，而利用寡核苷酸来制备部分双链核酸及完整的双链核酸后，将上述部分双链核酸及完整的双链核酸当做模板并通过信号引物发生PCR，使标记及扩增而获得的靶探针与固着于微阵列的上述捕获探针进行杂交来形成的图像。图8中，根据由捕获探针和具有标记物质的靶探针形成的双链的性质而多样地示出点的荧光程度，且上述荧光程度在由单捕获探针构成的点中根据具有标记物质的靶探针的信号而被决定。生物分子中，具有通过靶核酸发生PCR来获得的扩增产物中起源的标记物质的靶探针和微阵列捕获探针的碱基序列对单链核酸-捕获探针的双链稳定性产生影响，且具有微阵列的点中的标记物质的靶探针的量对荧光程度产生影响。因此，在图8中，生物分子的定量分析的荧光程度表示具有标记物质的靶探针的量，具有上述标记物质的靶探针的量表示与生物试样中的靶核酸相应的生物分子的量。并且，使从对照组试样和实验组试样中分离的靶核酸通过相互不同的标记物质来准备靶探针的情况下，优选地，前者为通过Cy3来标记的信号引物，后者为通过Cy5来标记的信号引物，即，所形成的点呈蓝色-黄色-红色的彩色光谱是因为与捕获探针结合的标记有Cy-3的靶探针和标记有Cy-5的靶探针的比率不同而产生的现象，且特定点的彩色光谱的程度相当于对照组试样和实验组试样中存在的特定生物分子的形式。核酸变异的分析情况能够从点的彩色光谱中确认在生物试样中与靶核酸相应的特定基因变异，上述生物试样包含与点相应的靶核酸。仅在与靶核酸的特定区域的变异核苷酸完整地互补结合的情况下，生成扩增产物，并生成将上述扩增产物当做模板的靶探针，因此，分析最终形成的点的彩色光谱来确认微阵列的所有点的程度，进而能够在生物试样中确认特定基因的变异。即，在图7中，红色点为通过Cy5标记物质而产生的，其与变异相关信号引物P2相应，由此，能够获知在生物试样中存在与阵列上的捕获探针相应的SNP。在甲基化有无中，与甲基化特异上游寡核苷酸相应的信号引物P1被标记成Cy3，并且与非甲基化上游寡核苷酸相应的信号引物P2被标记成Cy5，在图7中白介素17甲基化点呈蓝色，进而能够获知本实验中试用的试样的白介素17启动-144位子胞核嘧啶被甲基化。实施例10.包含大肠菌的细胞外分子的生物分子分析11-1.进行AmpR基因分析的寡核苷酸的制备用于分析质粒pUC19中的AmpR基因的寡核苷酸的结构根据上述通式(IV)和通式(V)将上述上游寡核苷酸及下游寡核苷酸设计成如(表6)所示，来进行有机合成(百奥尼(Bioneer)公司，韩国)(表6)用于分析AmpR基因的寡核苷酸项目碱基序列(5'→3')上游寡核苷酸(野生型)5-GCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATG-3上游寡核苷酸(变异型)5-GCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATA-3下游寡核苷酸5-CCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGT-310-2.细胞表面分子分析配体的制备本发明人公开的大肠菌结合单链核酸(参考韩国专利第10-0730359号)的碱基序列如同(表7)，且基于(表7)，生物素-单链核酸配体及生物素-寡核苷酸根据通式(I)并参照(表2)及(表3)而设计，进而进行有机合成(百奥尼(Bioneer)公司，韩国)。(表7)与大肠菌表面分子相结合的适配体的碱基序列顺序号碱基序列(5'→3')1cgcaguuugcgcgcguuccaaguucucucaucacggaaua2acacugcgugcuuacgacuucuggucccaucauucggcua3aguucgaugagggugacaccgccaggaguguuugcuagac4acccgucgauaaugacugaacuuccucuaucuuaaagggg5ggguaaggggauguuucugggauucaagcgccugauucug6ucuguauuuguacgcaccgaagauaagagagggaguggau7caugggcgggccgcggucuauucgggauuauugcggaucc8ucagggugugaaguucuuccgcgcuaguggcuuguauguu8gucgggguugcaaggcgucguagcguguauuugugauggu10gcguaugggcgggucauuaggacaauuuaaccacucgcga11auugucugugugacuagucggucuagugugggggagaaga12uuaccacugaguuaauuuguacggucugcgguguacuuua13gcuaucaauauuauagaggcggucgggguagugucaucgu14uaggagagcgggagcugagaacuuagaggcgccgauacac15gacguauuacaguuaaguuggcgccauucgauuucugauc16auaccagcuuauucaauuauaccagcuuauucaauuuugu17ccguaaguccggucuuccuugcugagucgcccuuucaggu18uugguggggagggccaguuaggucuaauuuccgacgcgca在所准备的上述生物素-大肠菌适配体(10μg/μl)中分别添加100μl的抗生物素蛋白(7.2μg/μl)，并在腔室常温下放置30分钟后，添加上述准备生物素-寡核苷酸(10μg/μl)来制备适配体-抗生物素蛋白-寡核苷酸结构体，且将其称作适配体分析配体。10-3.从大肠菌-分析配体复合物中分离及分析生物分子使大肠菌和适配体分析配体胶发生反应后，对大肠菌-适配体分析配体复合物进行清洗及分离。从获得的上述大肠菌-分析配体复合物中分离包含与pUC19质粒及大肠菌表面结合的单链核酸等的总核酸。将所分离的总核酸作为靶核酸并通过(实施例5)的方法来制备靶核酸DNA。通过(实施例6)的方法来进行标记及扩增，来分析在(实施例7)中所制备的微阵列。确认了大肠菌的表面生物分子的实验方案及AmpR基因。产业上可利用性利用本发明的寡核苷酸，通过一次检查来分析生物试样中的生物分子，进而能够确认生物试样的生物分子的生物学意义，且能够在荧光学上以较高的灵敏度来进行检测。因此，本发明通过一次检查来分析多种生物分子，进而能够提供在生物试样中有效地决定表现型的变化、对疾病的敏感性且对治疗药剂的反应的差异等个人之间的差异的方法，由此，对人类克服疾病做出很大贡献，且在经济层面上对医疗产业具有非常有用的效果。当前第1页1 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