技术领域本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种异戊二烯合成酶基因及其应用。
背景技术：
自然界中,异戊二烯主要是由某些植物叶片排放至大气中的，而工业生产中，目前异戊二烯主要是由石油裂解物C5馏分萃取蒸馏而来。然而随着石油资源日益枯竭及不可再生，天然植物释放的异戊二烯收集又事倍功半，通过微生物工程菌生产异戊二烯成为一种可持续发展的必然趋势。据报道，每年植物释放到大气中的异戊二烯达到5百万吨，细菌自身又不具有异戊二烯合成酶基因，因此植物是异戊二烯合成酶(ISPS)很好来源。利用基因工程技术开展异戊二烯合成酶基因研究已取得了一些进展，研究人员分离鉴定得到了少量的异戊二烯合成酶基因，但国内尚未有这方面的报道。2000年，MillerB首次在杨树(白杨×颤杨)中获得了全长IspS基因，并且在大肠杆菌中得到了7.7nmol/mgDCW的异戊二烯(MillerBetal.Planta.2001213(3):483-7)；2005年,Sasaki克隆得到了白杨的IspS基因(SasakiKetal.FEBSLett.2005579(11):2514-8)；ThomasD.Sharkey于2005年克隆得到蒙大拿葛IspScDNA全长(SharkeyTDetal.PlantPhysiol.2005137(2):700-12.)，随后又扩充了数个杨柳科IspS基因，并且得到了刺槐的IspScDNA全长序列(SharkeyTDetal,Evolution201367(4):1026-1040)。可见国内外目前获得的异戊二烯合成酶大多限于杨柳科和豆科植物，豆科植物关于异戊二烯合成酶基因的研究主要集中在葛根、刺槐上,杨柳科的相关研究主要集中在杨属，而在禾本科毛竹中并无研究报道，基因库中也没有毛竹异戊二烯合成酶基因。
技术实现要素：
本发明就是为了解决利用工程菌合成异戊二烯效率不高的技术问题，提供一种具有较高合成效率的异戊二烯合成酶基因及应用。为达到上述目的，一种异戊二烯合成酶基因，其是如下(a)或(b)的基因：(a)所述基因cDNA的核苷酸序列如序列表的序列1所示；(b)所述基因是编码如下蛋白质的基因：序列表的序列2所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有异戊二烯合成酶活性的由序列表的序列2所示氨基酸序列组成的蛋白质衍生的蛋白质。本发明同时提供一种异戊二烯合成酶基因表达的蛋白质，其是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由序列表的序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)在(a)中的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有异戊二烯合成酶活性的由(a)衍生的蛋白质；序列表的序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质是由序列表的序列1所示碱基序列编码。本发明还提供一种异戊二烯合成酶基因的原核表达载体。本发明还提供异戊二烯合成酶基因原核表达载体的产异戊二烯工程菌。本发明同时提供产异戊二烯工程菌在制备异戊二烯中的应用。本发明的有益效果：根据植物在自然界异戊二烯的释放速率，本发明选择了释放量较高的毛竹异戊二烯合成酶基因进行了分离鉴定和克隆，成功构建异戊二烯生产菌株，为生物法生产异戊二烯寻找到一个高效的异戊二烯合成酶。本发明利用基因工程手段，克隆得到了毛竹基因PHIspS，应用到大肠杆菌中，使用气相色谱进行检测，大肠杆菌具备生产异戊二烯的能力，本发明对于使用微生物进行异戊二烯大规模工业生产提供了一个高效有效的酶。附图说明图1是毛竹总RNA的琼脂糖电泳结果；图2是毛竹PHIspS基因片段的琼脂糖电泳结果；图3是毛竹PHIspS基因3’-RACE的琼脂糖电泳结果；图4是毛竹PHIspS基因5’-RACE的琼脂糖电泳结果；图5是毛竹PHISPS氨基酸序列BlastP分析结果图；图6是RACE原理图；图7是毛竹PHISPS蛋白在大肠杆菌中表达的SDS-PAGE结果；图8是异戊二烯标准品的气相色谱结果；图9是毛竹PHIspS基因在大肠杆菌中应用的气相检测结果；图10是毛竹PHISPS蛋白经过取代突变之后在大肠杆菌中应用的气相检测结果；图11是毛竹PHISPS蛋白经过添加突变之后在大肠杆菌中应用的气相检测结果；图12是毛竹PHISPS蛋白经过缺失突变之后在大肠杆菌中应用的气相检测结果。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中，大肠杆菌BW25113(BabaTetal.MolSystBiol.2006；2:2006.0008.)是一株非病原菌，遗传背景清楚，世代时间短、容易培养且培养基原料低廉。大肠杆菌BW25113公众可从中国科学院微生物研究所获得，以上所述生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。实施例1：基因片段的获得1.提取毛竹叶片总RNA采集毛竹叶片，使用RNeasyPlantMiniKit(Qiagen公司)提取杨树叶片总RNA，按照试剂盒说明方法进行，进行电泳(图1)验证RNA提取质量，可见RNA完整性良好，可以进行后续实验。2.RT-PCR以Oligo(dT)20做为反转录引物，按照反转录试剂盒SuperScript.IIIFirst-StrandSynthesisSystemforRT-PCR(Invitrogen公司)说明将核酸反转录为cDNA；反应体系如下：RNA1μg10mMdNTP1μlOligo(dT)20(0.5μg/μl)1μl65℃5min，置于冰上1min，加入下面的10μl的mix50℃50min，85℃15min加入1μlRNaseH，37℃20min反应完毕，加入100μl水稀释cDNA，得到cDNA第一链。3.简并引物设计根据杨柳科及豆科植物的已知氨基酸序列的保守区，并且参考所有已知IspS的核酸序列及单萜合成酶的核酸序列设计的简并引物PHF1及PHR1：PHF1：5'ATCATHGAYGAYATHTAYGAYGT3'PHR1：5'TCRTTGCANARNCKRAARAT3'4.简并PCR反应反应体系反应条件：扩增出479bp左右的片段(图2)，扩增产物于1.5％琼脂糖凝胶上电泳，产物单一明亮。备注：所示明亮单一条带为PHF1和PHR1引物组扩增产物，Marker为TAKARA100bpDNALadder。5.连接T载体，Sanger测序将单一明亮的条带回收，连接PMD18-T(TAKARA公司)载体，转化至trans5α(TransGen公司)感受态细胞，第二天选择白斑进行验证，选取阳性克隆，送至生工Sanger测序。6.测序及序列分析，测序结果氨基酸序列经过Blast，结果显示与二穗短柄草的假想蛋白有63％的同源性，与高粱的IspS有57％同源性，与二穗短柄草的月桂烯合成酶有50％同源性，可以证明此序列为禾本科IspS基因，。核酸序列进行翻译后氨基酸序列如SEQIDNo.4所示。实施例2：PHIspS基因编码区全长的获得获得cDNA全长的方法为SMARTer-RACE，使用PCRcDNASynthesisKit(Clontech公司)进行，以下使用的引物及试剂除GSP均为PCRcDNASynthesisKit内提供，按照试剂盒说明方法进行。1.RACE-ReadycDNA的制备RACE-ReadycDNA第一链的反转录体系如下：2.基因特异性引物的设计：根据已经获得的PHIspS片段的序列设计基因特异性引物(GSP)，RACE-ReadycDNA做模版，GSP及通用引物(UniversalPrimerMix，UPM)做引物进行扩增，可以得到3’-RACEcDNA片段及5’-RACEcDNA片段。引物位置如图6所示,中间黑色部分为简并PCR获得序列，两侧黑色部分为通用引物序列，白色部分为需要得到的未知序列部分。共8个GSP序列，如下表：3.3’-RACEcDNA末端序列的获得使用毛竹的3’-RACE-ReadycDNA为模版，UPM与GSP为引物进行扩增反应体系：反应条件：3’-RACE的琼脂糖凝胶检测结果如图(图3)：得到一个单一明亮的毛竹DNA扩增条带，连接T载体，转化感受态细胞，挑选阳性克隆Sanger测序，得到3’端cDNA序列。4.5’-RACEcDNA末端序列的获得使用毛竹的5’-RACE-ReadycDNA为模版，UPM与GSP为引物进行扩增.反应体系：反应条件：5’-RACE的琼脂糖凝胶检测结果如图(图4)：由图可见得到单一明亮的扩增条带，选择其一连接T载体，转化感受态细胞，挑选阳性克隆Sanger测序，得到5’端cDNA序列。5.全长序列的获得根据3’-RACE及5’-RACE测序结果，进行序列比对，得到该基因cDNA全长序列(SEQIDNo.1所示序列)，对DNA、氨基酸序列进行分析：该基因有1731bp，编码576个氨基酸，有ATG起始密码子和TGA终止密码子，说明该基因的完整性；其编码的氨基酸含有一个IspS高度保守标签序列DDXXD区域，同时也包含了RRX8W保守区域。利用BLAST软件在NCBI中进行同源比对，结果如图5，显示该基因为Isoprenoid_Biosyn_C1superfamily成员，与二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon])Alpha-terpineolsynthase(alpha-松油醇合成酶)同源性为60％，与节节麦(Aegilopstauschii)的月桂烯合成酶有59％同源性，与乌拉图小麦(Triticumurartu)的月桂烯合成酶有56％同源性，说明我们得到的是禾本科异戊二烯合成酶基因，简写为PHIspS基因，得到了编码PHISPS蛋白的氨基酸序列(SEQIDNo.2所示序列)。实施例3：大肠杆菌异戊二烯生产菌株的构建全长引物PHFa及PHRa序列如下：PHFa：5'TTAACCATGGTAACAACGCGGCGTGCGGC3'PHRa：5'ATATGGTACCCTAGAAGCCTGAACTGCCGTGCT3'1.大肠杆菌表达载体pBAD-PHIspS构建将使用引物PHFa及PHRa获得的PHIspS基因片段进行NcoI和KpnI(TAKARA公司)双酶切，并将pBAD-HisB表达载体(购自Invitrogen公司)进行NcoI和KpnI双酶切，PHIspS基因连接至pBAD-HisB载体后转化至trans5α感受态细胞，选取阳性克隆进行测序，pBAD-PHIspS的核苷酸序列是SEQIDNo.5。2.异戊二烯生产菌株MV/pPHIspS的构建将构建好的pBAD-PHIspS与质粒p1及p2共转化至BW25113宿主得到异戊二烯生产菌株MV/pPHIspS。并且构建对照菌株MV/pBAD,方法为将pBAD-HisB与质粒p1及p2共转至BW25113宿主，得到无异戊二烯合成酶基因的对照菌株MV/pBAD。上述异戊二烯生产菌的构建方法中，p1，p2包含异戊二烯合成途径-甲羟戊酸(MVA)途径基因。其中p1由MvaE(乙酰辅酶A乙酰转移酶)基因、MvaS(HMG-乙酰辅酶A合成酶)基因及MVK(甲羟戊酸激酶)基因组成，所述MvaE基因编码由SEQIDNo.8所示的氨基酸序列组成的蛋白质；所述MvaS基因编码由SEQIDNo.9所示的氨基酸序列组成的蛋白质；所述MVK基因编码由SEQIDNo.10所示的氨基酸序列组成的蛋白质。p2由PMK(磷酸甲羟戊酸激酶)基因、MVD(焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶)基因及idi(异戊二烯焦磷酸异构酶)基因组成，所述PMK基因编码由SEQIDNo.11所示的氨基酸序列组成的蛋白质；所述MVD基因编码由SEQIDNo.12所示的氨基酸序列组成的蛋白质；所述idi基因编码由SEQIDNo.13所示的氨基酸序列组成的蛋白质。其中，p1为链霉素抗性阿拉伯糖诱导型表达载体，p1的核苷酸序列是SEQIDNo.6，包含MVA上游途径基因表达盒，MVA上游途径基因表达盒的核苷酸序列是SEQIDNo.6的第1307-5821位，SEQIDNo.6的第89-964位为阿拉伯糖启动子，SEQIDNo.6的第5930-6087位为TrrnB终止子，SEQIDNo.6的第1307-3729位是MvaE基因的编码序列，SEQIDNo.6的第3730-4904位是MvaS基因的编码序列，SEQIDNo.6的第4905-5821位是MVK基因的编码序列。P2为氯霉素抗性阿拉伯糖诱导型表达载体，p2的核苷酸序列是SEQIDNo.7，包含MVA下游途径基因表达盒，MVA下游途径基因表达盒的核苷酸序列是SEQIDNo.7的第1309-4442位，SEQIDNo.6的第89-964位为阿拉伯糖启动子，SEQIDNo.6的第4569-4726位为TrrnB终止子，SEQIDNo.6的第1309-2661位是PMK基因的编码序列，SEQIDNo.6的第2677-3864位是MVD基因的编码序列，SEQIDNo.6的第3894-4442位是idi基因的编码序列。实施例4：PHIspS基因在大肠杆菌中的应用1、ISPS蛋白表达上述大肠杆菌工程菌MV/pPHIspS，使用L-arab诱导之后，蛋白表达结果SDS-PAGE如图所示(图7)，可见不含异戊二烯合成酶的大肠杆菌宿主本身不表达异戊二烯合成酶ISPS，PHIspS基因的转入使宿主细胞表达ISPS蛋白。备注：图为PHISPS蛋白在大肠杆菌工程菌中表达情况。2、大肠杆菌发酵产物的检测将上述2个菌株进行发酵，方法如下：将工程菌以百分之一的接种量转接到30mL(500mL三角瓶)含有链霉素、氯霉素及氨苄抗性的阿拉伯糖自诱导培养基(ZYM)中，30℃，280rpm培养20h后。4℃，4000rpm离心收集菌液，用含有4％葡萄糖的M9培养基重悬至60OD菌体浓度，取1mL重悬菌液置于20mL顶空瓶内，37℃，280rpm震荡培养30h。含有链霉素、氯霉素及氨苄的自诱导培养基自诱导培养基ZYM配方如下：100mLA+2mLB+2mLC+200μLD+100μLE(以下均为质量百分比浓度)；A.ZY：1％胰蛋白胨，0.5％酵母粉；B.50×M：1.25MNa2HPO4，1.25MKH2PO4，2.5MNH4Cl和0.25MNa2SO4；C.50×5052：25％甘油，2.5％葡萄糖，10％乳糖；D.1MMgSO4；E.1000×微量元素：50MmFeCl3，20mMCaCl2，10mMMnCl2，10mMZnSO4，CoCl2、NiCl2、Na2Mo4、Na2SeO3和H3BO3各2mM；链霉素:终浓度50mg/L、氯霉素终浓度34mg/L、氨苄终浓度100mg/L。M9培养基配方如分子克隆实验指南(科学出版社)第三版1595页所示。反应结束后，进行气相色谱(GC)分析，使用的气相色谱分析仪为Agilent7890AGCSysytem及Agilent7697AheadspaceSampler顶空进样器，气相分离柱为HP-5。顶空取样方法如下，Time：GCcycletime20min，Vialequibtime6min；Temperature(℃)：Oven51,Loop/Valve55,Transferline60。GC方法如下：流速：2mL/min，0min～4min50℃，4min～8.5min50～280℃，8.5min～10.6min280℃。此方法下异戊二烯标准品(Sigma公司)出峰时间为1.75min(图8)，大肠杆菌工程菌MV/pPHIspS及阴性对照菌株MV/pBAD的GC色谱图(图9)，可见MV/pPHIspS在1.75min的保留峰，而对照没有。可见未加入PHIspS基因的菌株不具备异戊二烯生产能力，转入PHIspS基因后使得大肠杆菌具备了生产异戊二烯的能力，大肠杆菌中产量可达0.68mg/L。实施例5：经过氨基酸突变的PHISPS蛋白在大肠杆菌中的应用对PHISPS蛋白进行取代、添加和缺失突变，使用实施例3构建的pBAD-PHIspS为模版，按照FastMutagenesisSystem(TransGen公司)试剂盒说明进行突变。1、PHISPS蛋白的氨基酸突变氨基酸的取代突变：将30位氨基酸R突变为A，即将核酸序列78-90位的CGG突变为GCG，使用突变引物为1F和1R；氨基酸的添加突变：30位氨基酸R后面添加一个氨基酸A，即将核酸序列90位之后添加GCG碱基，使用的突变引物为2F和2R；氨基酸的缺失突变：将30位氨基酸R去掉，即将核酸序列78-90位碱基CGG去掉，使用的突变引物为3F和3R。突变引物序列如下：编号序列1FCGTGCGGCGCTGCACCAGGTGGCGTGCTCCTCAGCGCCGGAGCG1RCGCTCCGGCGCTGAGGAGCACGCCACCTGGTGCAGCGCCGCACG2FCGTGCGGCGCTGCACCAGGTGCGGGCGTGCTCCTCAGCGCCGGAGCG2RCGCTCCGGCGCTGAGGAGCACGCCCGCACCTGGTGCAGCGCCGCACG3FCGTGCGGCGCTGCACCAGGTGTGCTCCTCAGCGCCGGAGCG3RCGCTCCGGCGCTGAGGAGCACACCTGGTGCAGCGCCGCACG备注：有下划线碱基为突变碱基PCR体系PCR条件电泳检测取10μlPCR产物，1％琼脂糖凝胶电泳检测。观察到目的条带大小正确，可用DMT酶消化及转化反应。PCR产物的消化加1μlDMT酶于PCR产物中，混匀，37℃孵育1h。转化a.加入2-5μlDMT酶消化产物于50μlDMT感受态细胞中(在感受态细胞刚刚解冻时加入产物)，轻弹混匀，冰浴30分钟。b.42℃准确热激45秒，立即置于冰上2min。c.加250μl平衡至室温的SOC，225转，37℃培养1小时。d.取200μl菌液铺板，培养过夜(为得到较多的克隆，4000rpm离心1min，弃掉部分上清，保留100-150μl，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板，培养过夜)用对照质粒模板(4.5Kb)检验突变效率，在含氨苄的平板上涂8μl500mMIPTG，40μl40mg/mlX-gal，突变成功的菌落呈蓝色。挑选蓝色菌落进行质粒抽提(PlasmidMiniKit1，OMEGA公司)，Sanger测序。得到正确突变克隆，取代突变株命名为pBAD-PHIspSc1，添加突变株命名为pBAD-PHIspSc2，取代突变株命名为pBAD-PHIspSc3。2、异戊二烯生产菌株MV/pPHIspSc的构建将构建好的pBAD-PHIspSc1与质粒p1及p2共转化至BW25113宿主得到异戊二烯生产菌株MV/pPHIspSc1；将构建好的pBAD-PHIspSc2与质粒p1及p2共转化至BW25113宿主得到异戊二烯生产菌株MV/pPHIspSc2；将构建好的pBAD-PHIspSc3与质粒p1及p2共转化至BW25113宿主得到异戊二烯生产菌株MV/pPHIspSc3。3、大肠杆菌发酵产物的检测具体检测方法同实施例4所述方法。MV/pPHIspSc1得到的气相检测结果如图10，MV/pPHIspSc2得到的气相检测结果如图11，MV/pPHIspSc3得到的气相检测结果如图12所示，可见MV/pPHIspSc1、MV/pPHIspSc2及MV/pPHIspSc3菌株同样具备生产异戊二烯的能力，产量分别达到0.28mg/L，0.22mg/L及0.42mg/L。